專利名稱：一種提高植物乳桿菌耐酸性的方法
技術領域：
本發明涉及植物乳桿菌，特別是一種提高植物乳桿菌耐酸性的方法。
背景技術：
乳酸菌是人體腸道中最重要的益生菌，其數量和組成對維持健康腸道環境和提高免疫功能起著關鍵作用。其主要作用在于可抑制有害菌群、維持腸道菌群平衡、保護腸粘膜屏障、代謝產生有機酸，降低腸道pH，促進腸道蠕動，腹瀉便秘雙重調節。
乳酸菌在生產、保存及被服用過程中，都會面臨各種環境壓力，包括溫度、酸、滲透壓、氧、高壓及饑餓等惡劣條件的影響。這些因素都會影響菌的存活，從而影響其生理活性。雖然乳酸菌自身具有較強的耐酸性，大多數能在pH3的條件下生長，但在pH3以下的條件下就表現出敏感性，而且隨著酸度的進一步增加，死亡率會急劇上升。因此提高乳酸菌對環境酸壓力的耐受能力具有十分重要的現實意義。
目前，國內外對乳酸菌耐酸能力的提高方法主要集中在耐酸菌株的篩選上。江川等采用模擬人體胃酸環境(pH＝3)方法從104株人胃腸道源乳桿菌中篩選得到3株具有較強耐酸性能菌株。
發明內容
本發明的目的是提供一種提高植物乳桿菌耐酸性的方法，它將為乳酸菌耐酸性提高提供一個具現實意義的方法，從而提高產品品質，延長產品貨架壽命。
為解決上述技術問題，本發明是這樣實現的一種提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于該植物乳桿菌為植物乳桿菌LP-Onlly，在發酵培養基中添加弱酸或弱酸鹽以提高植物乳桿菌細胞耐酸性。
該植物乳桿菌已于2004年12月6日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC(地址中國北京市海淀區中關村一條13號，中國科學院微生物研究所)保藏，并收到保藏登記號CGMCC NO 1258。其分類命名為植物乳桿菌，拉丁名Lactobacillusplantarum。植物乳桿菌LP-Onlly，其16S rRNA基因GeneBank(NCBI)序列登錄號為AY590777。
所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發酵培養基中加入20～80mmol/L乙酸。
所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發酵培養基中加入50mmol/L乙酸。
所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發酵培養基中加入10～20mmol/L丙酸。
所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發酵培養基中加入10mmol/L丙酸。
所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發酵培養基中加入10～20mmol/L正丁酸。
所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發酵培養基中加入20mmol/L正丁酸。
所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發酵培養基中加入20～80mmol/L乙酸鉀。
所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發酵培養基中加入50mmol/L乙酸鉀。
所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發酵培養基中加入2mmol/L檸檬酸鉀或3mmol/L三聚磷酸鉀。
圖1是本發明方法中乙酸對植物乳桿菌耐酸性的影響情況示意圖。
圖2是本發明方法中丙酸對植物乳桿菌耐酸性的影響情況示意圖。
圖3是本發明方法中正丁酸對植物乳桿菌耐酸性的影響情況示意圖。
圖4是本發明方法中乙酸鉀對植物乳桿菌耐酸性的影響情況示意圖。
圖5是本發明方法中檸檬酸鉀對植物乳桿菌耐酸性的影響情況示意圖。
圖6是本發明方法中三聚磷酸鉀對植物乳桿菌耐酸性的影響情況示意圖。
具體實施例方式本發明提供了一種提高植物乳桿菌耐酸性的方法，主要技術方案就是在發酵培養基中添加弱酸或弱酸鹽以提高植物乳桿菌細胞耐酸性。具體情況詳敘如下1.菌種植物乳桿菌LP-Onlly(Lactobacillus plantarum LP-Onlly)，為上海交大昂立股份有限公司研究院從健康嬰兒糞便中分離、鑒定并保存。
2.培養基包括斜面培養基、種子培養基及發酵培養基均為MRS培養基。
3.培養方法一級種子培養從斜面培養基上挑二環菌至種子培養液中，50ml三角瓶裝液30ml，37℃培養16h。二級種子培養將一級種子液以萬分之一的接種量接入種子培養液中，50ml三角瓶裝液30ml，37℃培養16h。發酵培養將二級種子液以萬分之一的接種量接入發酵培養液中，50ml三角瓶裝液30ml，37℃培養16h。
4.分析方法
(1)耐酸性能評價方法將發酵細胞以生理鹽水洗滌兩次后于pH2、37℃下90min，測細胞殘存率。
(2)活菌計數方法參見GB/T 4789.35-2003(乳酸菌飲料中的乳酸菌檢驗)。
實施例1在發酵培養基中加入乙酸。
如圖1所示乙酸濃度(10mmol/L)對細胞耐酸性能較對照沒有提高；而乙酸濃度從10mmol/L增加到50mmol/L時，細胞耐酸性較對照就有了非常大的提高，在pH2、37℃下90min細胞殘存率約提高200倍；進一步增加乙酸濃度(從50mmol/L增加到80mmol/L)細胞耐酸性明顯降低，但較對照也有較大提高。
實施例2在發酵培養基中加入丙酸。
如圖2所示10mmol/L的丙酸濃度可使細胞耐酸性能得到較大提高，在pH2、37℃下90min細胞殘存率較對照約提高90倍；丙酸濃度從10mmol/L增加到20mmol/L時，細胞耐酸性基本一致；進一步增加丙酸濃度(從20mmol/L增加到50mmol/L)細胞耐酸性急劇降低，此時，與對照相當。
實施例3在發酵培養基中加入正丁酸。
如圖3所示10mmol/L的正丁酸濃度使細胞耐酸性能得到較大提高，在pH2、37℃下90min，細胞殘存率較對照約提高120倍；進一步增加正丁酸濃度(從10mmol/L增加到20mmol/L)，細胞耐酸性進一步提高，在pH2、37℃下90min，細胞殘存率較對照約提高200倍；再增加正丁酸濃度(從20mmol/L增加到50mmol/L)，細胞耐酸性急劇降低，此時，與對照相當。
實施例4在發酵培養基中加入乙酸鉀。
如圖4所示乙酸鉀濃度(10mmol/L)對細胞耐酸性能較對照沒有提高；而乙酸濃度從10mmol/L增加到50mmol/L時，細胞耐酸性較對照有非常大的提高，在pH2、37℃下90min細胞殘存率約提高200倍；進一步增加乙酸濃度(從50mmol/L增加到80mmol/L)細胞耐酸性明顯降低，但較對照也有較大提高。
實施例5在發酵培養基中加入檸檬酸鉀。
如圖5所示2mmol/L的檸檬酸鉀濃度可使細胞耐酸性能得到較大提高，在pH2、37℃下90min細胞殘存率較對照約提高100倍；檸檬酸鉀濃度從2mmol/L增加到5mmol/L時，細胞耐酸性急劇降低；進一步增加檸檬酸鉀濃度(從5mmol/L增加到10mmol/L)，細胞耐酸性基本一致，但較對照略有提高。
實施例6在發酵培養基中加入三聚磷酸鉀。
如圖6所示1mmol/L的三聚磷酸鉀濃度對細胞耐酸性能較對照沒有提高；而三聚磷酸鉀濃度從1mmol/L增加到3mmol/L時，細胞耐酸性較對照有些提高，在pH2、37℃下90min細胞殘存率約提高5倍；三聚磷酸鉀濃度從3mmol/L增加到5mmol/L時，細胞耐酸性降低，此時，與對照相當。
本發明方法的作用原理是乳酸菌耐酸是因為其自身可維持細胞內外的pH梯度，使細胞內的pH不至于太低，但當內部的pH下降到超過一定的閾值，細胞功能將被抑制，從而導致細胞死亡。
眾所周知，當細胞進入穩定期時，60個以上與細胞穩定性密切相關的基因在RpoS基因編碼產生σs蛋白控制下誘導啟動，因此，穩定期細胞耐熱和耐酸等性能主要取決于σs濃度，而σs濃度可通過提高RpoS轉錄水平或rpos mRNA翻譯水平或防止σs蛋白水解等手段來提高。研究表明，cAMP-CRP、UDP-glucose、EIIA、多磷酸鹽(polyphosphate)、ppGpp、HSL、電離度為4.8～4.9的弱酸鹽(如醋酸鹽、丙酸鹽、苯甲酸鹽等)、谷氨酸鈉、海藻糖及胞內NADH向NAD的轉化率均可提高RpoS的轉錄水平；而細胞向高滲或酸性pH轉換、低溫、生長達到一定細胞密度、一些蛋白如Hfq、HU、DksA、RprA等均可促進rpos mRNA翻譯；突然的碳饑餓、滲透壓提高、酸性pH轉換、熱沖擊(如從30℃升至42℃ 20min)產生的熱激蛋白如DnaK、DnaJ、GrpE均可使σs穩定；RssB-CIpXP途徑中的CIpXP蛋白酶負責σs水解，而Crl蛋白可促進σs和RNA聚合酶的核心酶(E)結合，使σs避免與RssB結合被水解，從而提高σs活性。因此，可通過上述手段提高細胞內σs濃度，從而提高細胞耐酸性。
本發明方法通過在發酵培養基中添加弱酸(乙酸、丙酸及正丁酸)或弱酸鹽(乙酸鉀、檸檬酸鉀及三聚磷酸鉀)均可不同程度地提高植物乳桿菌細胞耐酸性；另外，乙酸和乙酸鹽對植物乳桿菌耐酸性提高作用基本一致，這表明弱酸鹽對細胞耐酸性的影響是通過其弱酸起作用的，而與其金屬離子沒有什么關系。本發明方法將為乳酸菌耐酸性提高提供一個具現實意義的方法，從而提高產品品質，延長產品貨架壽命。
權利要求
1.一種提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于該植物乳桿菌為植物乳桿菌LP-Onlly，在發酵培養基中添加弱酸或弱酸鹽以提高植物乳桿菌細胞的耐酸性能。
2.根據權利要求1所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發酵培養基中加入20～80mmol/L乙酸。
3.根據權利要求2所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發酵培養基中加入50mmol/L乙酸。
4.根據權利要求1所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發酵培養基中加入10～20mmol/L丙酸。
5.根據權利要求4所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發酵培養基中加入10mmol/L丙酸。
6.根據權利要求1所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發酵培養基中加入10～20mmol/L正丁酸。
7.根據權利要求6所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發酵培養基中加入20mmol/L正丁酸。
8.根據權利要求1所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發酵培養基中加入20～80mmol/L乙酸鉀。
9.根據權利要求8所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發酵培養基中加入50mmol/L乙酸鉀。
10.根據權利要求1所述的提高植物乳桿菌耐酸性的方法，其特征在于在發酵培養基中加入2mmol/L檸檬酸鉀或3mmol/L三聚磷酸鉀。
全文摘要
本發明涉及植物乳桿菌，特別是一種提高植物乳桿菌耐酸性的方法。該方法中的植物乳桿菌為植物乳桿菌LP－Onlly，在發酵培養基中添加弱酸或弱酸鹽以提高植物乳桿菌細胞耐酸性。本發明將為乳酸菌耐酸性能提高提供一個具現實意義的方法，從而提高產品品質，延長產品貨架壽命。
文檔編號C12N1/36GK1935981SQ200610028708
公開日2007年3月28日 申請日期2006年7月7日 優先權日2006年7月7日
發明者蘭先德, 范小兵, 張和春, 杭曉敏, 潘玉輝, 楊國, 倪新華, 王勁松 申請人:上海交大昂立股份有限公司