專利名稱：一種用于檢測細胞分化功能模型的建立方法
技術領域：
本發明涉及一種模型的建立方法，具體地說是關于一種用于檢測細胞分化功能模型的建立方法。
背景技術：
將體外培養的細胞回植入體內，這些細胞可以繼續形成代表其來源的組織。因此，將體外培養的細胞回植入體內以觀察細胞的功能、起源以及影響因素被作為一種研究模型得到廣泛應用。承載細胞移植的支架材料包括人工合成材料以及天然材料。口腔研究領域曾有研究者用牙根或根片來承載細胞。但研究者用體外共培養的方式來觀察體外細胞形成的組織，并未將承載根片的細胞植入體內。有研究者將附著了細胞的牙根植入腭部牙槽骨內，仍沒有脫離牙周韌帶細胞起源的微環境，因此，可能受到局部區域生長因子的影響。并且，植入的細胞是直接與周圍組織細胞相接觸的，可能受到細胞生長環境中其他細胞的信號影響。目前，有微囊包裹技術(Encapsulation)，用于胰島移植的研究。在胰島外面包裹一層膜狀結構物質，使胰島與宿主的免疫系統隔離開來，免受宿主的免疫細胞以及免疫大分子的攻擊，同時小分子的營養成分、氧氣、胰島分泌的胰島素等又可以自由進出包囊。1980年，Lim等發明了海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉(alginale-polylysine-alginale，APA)微囊包裹技術。但未見有用不可吸收性膜來包裹的研究。另外，關于應用不可吸收性膜的引導組織再生術，旨在隔離牙齦結締組織和上皮細胞，在口腔醫學領域也取得了較好的效果。但沒有將接種細胞的根片包裹以避免裸鼠細胞侵入影響的技術。
現有技術有下列缺點(1)與細胞共培養的根片植入體內，由于接種的細胞是直接與周圍組織細胞相接觸的，可能受到生長環境中其他細胞的信號影響。
(2)微囊包裹技術正在研究過程中，可能不適合于包裹本研究中體積較大的根片，所需成本較高。
釉基質蛋白(enamel matrix proteins，EMPs)已被廣泛地應用于牙周組織再生的基礎研究及臨床治療，但是關于其作用的具體機制還不是很清楚。大部分的研究集中于EMPs對體外培養細胞的增殖、分化及基質合成等方面。但應用不同的細胞得出了不同的結論。
現有已經公開的技術能夠在體外觀察EMPs對骨髓基質細胞在根片表面附著生長的影響，但還沒有實驗來研究其對細胞分化的生理功能方面的影響。
發明內容
本發明的目的在于提供一種用于檢測細胞分化功能模型的建立方法。本發明的目的是通過以下技術方法來實現的一種用于檢測細胞分化功能模型的建立方法，包括以下步驟(1)制備根片、釉基質蛋白、骨髓基質細胞；(2)將上述根片的根面用釉基質蛋白覆蓋；
(3)將骨髓基質細胞接種在步驟(2)獲得根片表面上；(4)將步驟(3)獲得根片置入聚四氟乙烯膜的口袋內；(5)將口袋包繞的根片放入裸鼠皮下。
其中步驟(1)所述的骨髓基質細胞選自豬骨髓基質細胞、狗骨髓基質細胞、兔骨髓基質細胞。步驟(1)所述的骨髓基質細胞優選自豬骨髓基質細胞。步驟(2)所述的根片表面用200μg/ml釉基質蛋白溶液覆蓋。步驟(3)所述的接種骨髓基質細胞后根片用DMEM培養液培養。步驟(3)所述的接種骨髓基質細胞后根片也可用DEX培養液培養。
本發明具體步驟如下牙齒去掉牙冠，制作根片。消毒，根面用EMPs覆蓋。放入細胞培養箱內。抽取髂骨骨髓，全骨髓培養法獲得骨髓基質細胞，制成細胞懸液，接種到根片表面。靜置培養7天后，經掃描電鏡確定細胞在根面上生長良好。傾去培養液，用PBS緩沖液清洗，置入聚四氟乙烯膜做成的口袋內。(聚四氟乙烯口袋的制備將聚四氟乙烯膜折疊成雙層，寬度約15mm，置于平板上。將細刃狀的帶柄鐵質工具在爐火上灼燒，直至鐵具末端變紅，表示已達到較高溫度。迅速沿著雙層薄膜整齊劃痕。高溫作用下，兩層薄膜粘合在一起。間隔約10mm，按上述方法再作一道劃痕，即做成只有一端開口的口袋。包裝多個聚四氟乙烯薄膜做成的口袋，進行高溫高壓消毒，以備放置根片所用。)在裸鼠背部作縱形切口，暴露皮下組織。將屏障膜包繞的根片放入皮下，嚴密縫合傷口。術后，觀察動物傷口愈合及活動情況。傷口愈合良好，動物無異常。分別于術后3周和8周處死動物，分離周圍組織，根片與屏障膜一起固定，石蠟包埋，制作5μm切片。HE染色，進行組織學觀察。
本發明所公開一種用于檢測細胞分化功能模型的建立方法，其優點表現在(1)本發明將細胞體外培養與體內生長相結合，并用屏障膜隔離裸鼠細胞的影響，可以觀察EMPs對骨髓基質細胞分化的影響，從而為研究EMPs的作用機制提供有效的研究模型。
(2)在本發明中，實驗的前3周，聚四氟乙烯膜能將裸鼠細胞阻擋在外側，有利于骨髓基質細胞在根片表面生長分化，不受裸鼠細胞影響。至8周時，不同的處理組形成了不同的組織解構，表明EMPs可促進豬骨髓基質細胞向成牙骨質細胞方向分化，亦表明了所用的研究模型是成功的。
(3)接種的骨髓基質細胞在根面已經定植、增殖并分化出類似牙骨質和纖維組織的成分，表明EMPs可促進豬骨髓基質細胞向成牙骨質細胞方向分化，開拓了釉基質蛋白新應用。
圖1豬BMSCs原代培養第5天，細胞呈紡錘形，形成成纖維細胞樣集落樣單位(CFUs)，(倒置顯微鏡，x50)。
圖2豬BMSCs原代培養第5天，細胞呈紡錘形，細胞核大，單核，位于中央，細胞有長的突起(倒置相差顯微鏡，x100)。
圖3植入屏障膜包繞的細胞-根片的裸鼠，傷口愈合良好。箭頭顯示標本植入部位。
圖43周標本，ePTFE膜與根片外側面之間有纖維組織形成，細胞成分較多；內側面與屏障膜之間無組織結構(箭頭所指)，裸鼠組織被阻擋在ePTFE膜外側(HE染色，x40).MePTFE膜；NFT新生的纖維組織；RS根片；MT裸鼠組織。
圖5實驗組1標本，術后8周。纖維組織沿根片表面生長(箭頭所指)，未見新生的礦化組織形成。HE染色，Ax40；Bx100。
圖6實驗組2標本，術后8周。可見新生的牙骨質樣物形成，表面有復層排列的呈立方狀的細胞，類似成牙骨質細胞(箭頭所示)。Dentin牙本質；NCL新形成的牙骨質樣組織；MePTFE膜。A、B、CHE染色，分別為x40、x100、x200。
圖7實驗組3標本，術后8周。形成骨樣組織，外側無纖維組織。鈣化物內細胞成分較多，骨陷窩密集Dentin牙本質；NBL新形成的骨樣組織；OC原有牙骨質；MePTFE膜。A、CHE染色，分別為x40、x100。
圖8實驗組3標本，術后8周。形成的骨樣組織具有骨髓腔樣結構(箭頭所示)。Dentin牙本質；NBL新形成的骨樣組織；OC原有牙骨質；MePTFE膜。AHE染色，x100；B硬組織切片，苦味酸-品紅染色，x100。
圖9實驗組4標本，術后8周。硬組織切片，苦味酸-品紅染色，x100。Dentin牙本質；NCL新形成的牙骨質樣組織；NFT新形成的纖維組織；MePTFE膜。
圖10實驗組4標本，術后8周。可見在原有牙骨質表面有新生的牙骨質樣物形成，表面有單層排列的呈立方狀的細胞，類似成牙骨質細胞(箭頭所示)。Dentin牙本質；NCL新形成的牙骨質樣組織；OC原有牙骨質；NFT新形成的纖維組織；MePTFE膜。A、CHE染色，分別為x100、x200；右側為正常牙周組織標本，HE染色，x100。牙骨質與牙本質染色接近，為細胞性牙骨質。牙骨質與牙本質交界處有清晰的淡染的纖維交錯帶。牙槽骨內有骨髓腔，牙周韌帶纖維插入牙槽骨和牙骨質中。AB牙槽骨，PDL牙周韌帶，C牙骨質，D牙本質。
圖11對照組組織學觀察，纖維組織形成(箭頭所示)。HE，x40。Dentin牙本質。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步描述。
實施例1豬骨髓基質細胞的分離培養材料與方法一、主要實驗材料1.實驗動物3月齡健康雜交豬，體重20kg左右，上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院動物房提供，符合國家實驗動物檢疫標準。
2.骨髓穿刺用品無菌骨髓穿刺包(內有16號骨髓穿刺針、紗布、洞巾)、一次性10m l空針、無菌50m l離心管、肝素3.細胞培養用液體和試劑(1)DMEM培養液及配制NaHCO33.7g(分析純AR，中國上海虹光化工廠)
L-谷氨酰胺 300mg(Sigma，USA)維生素C50mg(Sigma，USA)青霉素 200 000u(上海新華制藥廠)硫酸鏈霉素 200 000u(上海新華制藥廠)DMEM 10g(高糖型，Gibco，Invitrogen Corporation，USA)FBS100ml(Hyclone，南美洲，Cat NOCH30160.03)上述成分配制后，加入適量雙蒸水，磁力加熱攪拌器上充分溶解，調節pH至7.4左右，補雙蒸水至1000ml。經0.22μm無菌濾器過濾滅菌后，500毫升滅菌器分裝，4℃冰箱保存。
(2)礦化誘導液(本文中簡稱DEX培養液)在上述DMEM培養液中加入地塞米松2μl(2mg/ml，Sigma，USA)β-甘油磷酸鈉 2.16g(Sigma，USA)按同上方法消毒儲存備用。
(3)PBS緩沖液NaCl8.0g/LKCl 0.2g/LNa2HPO4·12H2O 3.44g/LKH2PO40.2g/LpH值約為7.4，高溫高壓滅菌后，加入青霉素、硫酸鏈霉素各200 000u/L，分裝備用。
(4)0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液配制EDTA Na2·2H2O 0.2g(Amresco-0105，Sigma)胰蛋白酶(1∶250) 2.5g(Amresco-0458，Sigma)加入PBS緩沖液至1000ml，0.22μm無菌濾菌器滅菌，分裝，4℃冰箱貯存。
2.實驗儀器(1)CO2培養箱Hereaus HERA Cell 3180F INC，德國(2)倒置相差顯微鏡LEICA DMRIRB，Leica，德國(3)TDL-40型低速臺式大容量離心機上海安亭科學儀器廠，中國(4)血球計數板國營上海醫用光學儀器廠，中國(5)Sartorius BS124 S電子天平北京賽多利斯儀器系統有限公司，中國(6)79-1型磁力加熱攪拌器常州國華電器有限公司，中國(7)DHG-9076A電熱恒溫鼓風干燥箱上海精宏實驗設備有限公司，中國(8)DK-8D電熱恒溫水槽上海精宏實驗設備有限公司，中國(9)TOMY AUTOCLAVE SS-325高壓滅菌器TOMY KOGYO，日本(10)Z 2型細胞粒度計數儀Beckman Coulter，美國3.細胞培養用器材培養皿、培養板(Corning，NY14831，USA)二、方法1.豬骨髓基質細胞的分離培養(1)取材實驗動物經氯胺酮10mg/kg肌注誘導后，肌注速眠新0.1ml/kg麻醉。動物側臥，常規備皮、消毒、鋪巾。用肝素化的16號無菌骨髓穿刺針，垂直進入髂前上棘后上方約1cm處，進入骨髓腔，抽取骨髓血約4ml，置于500u/ml肝素化的無菌離心管中。
(2)洗滌與離心于離心管中加入無血清DMEM培養液約20ml，混勻制成細胞懸液，2000r/min(800g)離心20min，棄去大部分的上清液及漂浮的脂肪，保留界面層及下方的沉淀層。
(3)原代培養于保留離心管中加入含10％FBS的DMEM培養液，混勻，制成細胞懸液，按10ml/皿接種。大約1.5-2ml骨髓血接種于一皿直徑為10cm的培養皿。置于37℃、5％CO2飽和濕度培養箱，進行原代培養。靜置培養5天后，首次更換培養液。搖動培養皿，使未貼壁的細胞浮起，吸去含大量紅細胞的培養液。PBS洗滌1-2次，于倒置顯微鏡鏡下觀察，可見多個細胞克隆形成。加入新鮮培養液繼續在相同條件下培養。
(4)傳代培養細胞生長達到接近融合狀態后，進行傳代。吸去培養液，PBS洗滌1次，加入3ml胰蛋白酶-EDTA消化液，鏡下見大部分細胞胞質回縮、形態變圓后，加入約3ml含血清DMEM培養液終止胰酶的消化作用。收集細胞，吹打，制成細胞懸液，血球計數板計數細胞。細胞懸液1000r/min，離心5min，棄上清液，用新鮮培養液懸浮細胞，以2×104/cm2的細胞密度接種于新的培養皿內，置于37℃、5％CO2飽和濕度培養箱內培養。第二天，更換培養液，棄去未貼壁的細胞。以后3天換液一次，待細胞達到80％融合后，同上傳代培養。
實施例2釉基質蛋白的提取材料和方法一、實驗儀器和試劑1.釉基質蛋白提取用主要儀器和試劑(1)牙胚取自六月齡健康豬上下頜骨內正在發育的磨牙的牙胚。健康雜交豬由上海市東風肉聯廠提供(2)乙酸中國江蘇省無錫中西藥品器械集團有限公司，使用時用去離子水稀釋，終濃度為0.5M/L(3)三氯乙酸分析純AR，江蘇永華精細化學品有限公司，去離子水配成20％溶液(w/v，20g/100ml)(4)丙酮分析純，AR，江蘇省蘇州市第二化工研究所有限責任公司(5)低溫高速離心機Heraus 28 RS，Germany(6)超低溫冰箱(-80℃)REVCO，REVCO Scientific，Inc，USA(7)真空冷凍干燥器VIRTIS BENCHTOP，USA二、實驗方法取出-80℃凍存的牙胚，室溫下融化。將牙胚置于冰塊上，小心刮取牙胚表面的奶酪樣物質，分裝入Eppendorf管。每管內加1ml 0.5mol/L乙酸，搖勻，4℃冰箱內過夜。小心吸取上清液和中間白色凝乳狀層，加入適量20％三氯乙酸，混勻。4℃離心15min，12 000轉/min。棄上清液，于沉淀物中加入丙酮少許，搖勻，同上轉速離心5min。棄上清，待丙酮充分揮發。每管內加入去離子水以使沉淀物溶解或漂浮其中，-80℃冷凍后，-56℃真空干燥。提取物-80℃密封保存。
實施例3BMSCs復合根片裸鼠體內移植實驗一、實驗材料1.齦下刮治器Gracey匙刮，上海康橋齒科醫械廠2.EDTA凝膠240g/L，Biora AB，Sweden3.柏萊克-理克羅氏脫鈣液配制氯化鋁結晶 70克蒸餾水 1000ml甲酸50ml濃鹽酸(37％)85ml上述成分按比例混勻溶解后，備用。
4.聚四氟乙烯微孔薄膜(上海塑料研究所提供，牌號為H-PSFWM-0.10-90，厚度為0.10mm，寬度為90mm)5.石蠟包埋機Thermo Shandon Histocentre 2，England二、實驗方法
1.根片獲得及處理豬經過量戊巴比妥鈉麻醉處死后，拔除牙齒，包括上下前牙、前磨牙和第一、二磨牙。用金剛砂車針片切，去掉牙冠，用齦下刮治器徹底刮除根面的牙周膜和牙骨質，并進行根面平整，直至根面光滑。用金剛砂車針沿與牙齒長軸平行方向將牙齒片切為兩部分。用刮匙去凈牙髓組織，但不觸及內側的前期牙本質層。制成的根片，一側為面向牙周韌帶面(簡稱為外側面)，另一側為前期牙本質面(簡稱為內側面)。240g/L EDTA凝膠處理外側面2min，生理鹽水沖洗。將根片放入200 000U/ml的青霉素和鏈霉素液中浸泡24h。然后用紫外燈照射4小時，隨即放入4℃條件下的PBS緩沖液中(PH值7.4，青霉素、鏈霉素濃度為200U/ml)。24小時后取出根片，PBS液沖洗，置入48孔板中，外側面向上。
取40個根片，共分為4個實驗組實驗組1，根片表面未用200μg/mlEMPs溶液處理，接種BMSCs后用DMEM培養液培養；實驗組2根片表面用200μg/mlEMPs溶液處理，接種BMSCs后用DMEM培養液培養；實驗組3根片表面未用200μg/mlEMPs溶液處理，接種BMSCs后用DEX誘導液培養；實驗組4根片表面用200μg/mlEMPs溶液處理，接種BMSCs后用DEX誘導液培養。分別以相同處理但未接種BMSCs的根片作為相應的對照組。根片分組處理及各組根片數量情況如表1所示。
表1根片分組及各組根片數量情況
注#列“+”表示根片用EMPs處理；“-”表示根片無EMPs處理。
§列“+”表示根片接種BMSCs；“-”表示根片未接種BMSCs。
2.根片表面接種骨髓基質細胞細胞傳代培養至第二代，取生長旺盛的骨髓基質細胞，0.25％胰蛋白酶、0.02％EDTA消化，收集細胞，分別用DMEM培養液和DEX培養液懸浮細胞，制成單細胞懸液，濃度為320 000個/ml，按照表1所示分組，每孔接種0.5ml。按表1所示的對照組處理，表面用EMPs處理或不處理各兩個根片，接種不含骨髓基質細胞的DEX培養液或DMEM培養液0.5ml。將48孔板放入細胞培養箱內靜置培養。
3.根片裸鼠體內植入BMSCs接種培養后7天，觀察培養皿內細胞生長旺盛。根片用PBS緩沖液漂洗，洗去培養液中血清成分。所有根片均用已消毒的聚四氟乙烯微孔薄膜呈袋狀包被備用。5周齡Bal/c裸鼠經乙醚吸入麻醉后，消毒皮膚，在背部兩側皮膚分別作2個縱切口，分離，暴露皮下組織。將已包被的根片植入裸鼠皮下，嚴密縫合傷口。本實驗中，將11只裸鼠隨機分為3組DMEM培養液組5只裸鼠，每只裸鼠體內植入實驗組1和組2各兩個根片；DEX培養液組5只裸鼠，每只裸鼠體內植入實驗組3和組4各兩個根片；對照組1只裸鼠，植入對照組1、2、3和4各一個根片。術后記錄每個部位植入根片的組別。
4.裸鼠標本處理4.1脫鈣標本處理根片植入裸鼠體內后，經過3、8周，裸鼠斷頸處死，銳分離取材，將聚四氟乙烯膜包繞的根片取出，4℃條件下，10％福爾馬林固定24小時，標本用柏萊克-理克羅氏脫鈣液脫鈣3天。檢查見組織變軟即終止脫鈣。標本用流水沖洗24小時以洗去脫鈣液。自動脫水機梯度酒精脫水，石蠟包埋。與牙齒長軸方向平行，以牙齒近遠中方向作5μm厚連續切片，取中間部分切片用于蘇木精-伊紅染色。
4.2不脫鈣標本處理同上取材后，標本用10％福爾馬林固定24小時，流水沖洗1小時后，置入70％酒精固定，甲基丙烯酸甲酯自塑化液包埋標本，與牙齒長軸平行，近遠中向用硬組織切片機(Leica SP 1600，Germany)做80μm厚硬組織切片。將切片黏附在塑料玻片上，經過打磨(靜電植砂氧化鋁耐水砂紙，1200目，中國上海)拋光(金剛玉磨光粉，山東淄博)，超聲震蕩洗滌2min，擦干，進行苦味酸-品紅染色(1)0.1％甲酸浸泡3min(上海振興化工一廠)(2)20％甲醇固定2h(3)60℃ Stevenel染液染色2min(進口分裝，水浴箱JuLaboTW12 Germany)(4)苦味酸(進口分裝)染色1min(5)100％乙醇脫水，鏡下觀察結果一、豬BMSCs培養原代細胞接種后第三天，在倒置顯微鏡下見培養皿內充滿血細胞。密集的血細胞之間有散在的折光性強的透光點。第5天，鏡下觀察見透光點明顯增大增多。更換培養液后，培養皿內仍有較多量的紅細胞和較大的有核血細胞等。BMSCs貼壁生長，呈紡錘形，有不規則細胞突起，細胞單核，較大，位于中央。BMSCs以成纖維細胞集落樣方式生長，集落中央細胞密集，向周圍呈放射狀排列，較稀疏，集落單位呈團狀、島狀分布，見圖1、圖2。細胞生長增殖迅速，鏡下可見較多的細胞分裂相。大約每隔3天傳代一次。
二、根片裸鼠體內移植1.動物及傷口愈合情況大體觀察根片植入裸鼠體內后，動物活動良好，未出現飲食異常及消瘦現象。術后兩周拆除縫線，觀察傷口愈合情況。傷口愈合不完全一致，大部分傷口愈合良好，屏障膜包繞根片位于裸鼠皮下，無暴露，見圖3。有4個植入區出現少量ePTFE膜暴露在皮膚外，但傷口無感染跡象，直到8周取材時亦無傷口感染。另有一個標本在8周取材時發現聚四氟乙烯膜內有波動感，外觀為淡黃色，示形成膜袋內膿腫。標本大體情況見表2。
表2各組標本愈合及數量分布情況
2.組織學觀察2.13周取材標本HE染色，顯微鏡下可見根片表面的牙骨質有的完全刮除，有的只部分刮除。在4個實驗組的標本上，可見在屏障膜和根片外側面(即接種了BMSCs的根面側)之間為纖維結締組織形成，細胞成分較多，與根片長軸平行排列。然而對側的屏障膜和根面之間未見組織結構，屏障膜內可見細胞成分，表明裸鼠的細胞成分被阻擋在膜的外面，見圖4所示。
2.28周取材標本2.2.1.實驗組1標本觀察，即DMEM培養液培養、根片未用EMPs處理，接種BMSCs組。HE染色顯微鏡下觀察，有4個標本顯示根面牙骨質未完全去除，但不論有無牙骨質存在，均顯示纖維結締組織沿根片表面生長，未見鈣化樣物質在根面形成；在對側，屏障膜與前期牙本質面之間有亦有纖維結締組織形成，但纖維成分較細小，與外側的裸鼠纖維組織成分結構相似，屏障膜內見有細胞存在，見圖5。硬組織切片兩個標本，形成組織結構同上，未見根面有鈣化物形成。
2.2.2.在實驗組2，即DMEM培養液培養、根片用EMPs處理，接種BMSCs組。僅一個標本顯示為細胞性牙骨質樣物形成于根片表面，有結締組織相鄰，圖6。另3個標本表現為纖維結締組織生長。硬組織切片兩個標本，一個為纖維結締組織生長，另一個為少量鈣化物形成。
2.2.3.實驗組3，即DEX培養液培養、根片未用EMPs處理，接種BMSCs組。HE染色顯示5個標本中的3個顯示為更像骨樣物沿著牙根表面，骨陷窩密集，外側無纖維結締組織，見圖7。有一個標本顯示為有骨髓腔形成，圖8所示。另外兩個標本顯示為纖維結締組織形成。硬組織切片標本兩個，其中一個標本顯示新形成的組織有明顯的骨髓腔樣結構，見圖9。
2.2.4.組4，即DEX培養液培養、根片用EMPs處理，接種BMSCs組。HE染色顯示4個標本中的3個根片表面有牙骨質樣物形成，表面有一層立方狀的細胞，并有纖維結締組織與之相鄰，硬組織切片兩個標本，有一個形成牙骨質樣物，見圖10。
2.2.5.在未接種BMSCs的對照組，8周時，無論應用EMPs與否，在兩側均有少量纖維結締組織形成，但無鈣化物形成，見圖11。
綜合分析術后3周和術后8周各組標本總數，牙骨質樣鈣化物、骨樣鈣化物及纖維結締組織形成占各組總標本的比例分布情況如3所示表3根片植入裸鼠體內后不同處理組形成的組織結構特征與各組總標本數的比例分布
通過本實驗，我們發現在實驗的前3周，聚四氟乙烯膜能將裸鼠細胞阻擋在外側，有利于骨髓基質細胞在根片表面生長分化，不受裸鼠細胞影響。至8周時，不同的處理組形成了不同的組織解構，表明EMPs可促進豬骨髓基質細胞向成牙骨質細胞方向分化，亦表明了所用的研究模型是成功的。
權利要求
1.一種用于檢測細胞分化功能模型的建立方法，包括以下步驟(1)制備根片、釉基質蛋白、骨髓基質細胞；(2)將上述根片的根面用釉基質蛋白覆蓋；(3)將骨髓基質細胞接種在步驟(2)獲得的根片表面上；(4)將步驟(3)獲得根片置入聚四氟乙烯膜的口袋內；(5)將口袋包繞的根片放入裸鼠皮下。
2.根據權利要求1所述的模型建立方法，其特征在于步驟(1)所述的骨髓基質細胞選自豬骨髓基質細胞、狗骨髓基質細胞、兔骨髓基質細胞。
3.根據權利要求2所述的模型建立方法，其特征在于步驟(1)所述的骨髓基質細胞優選自豬骨髓基質細胞。
4.根據權利要求1所述的模型建立方法，其特征在于步驟(2)所述的根片表面用200μg/ml釉基質蛋白溶液覆蓋。
5.根據權利要求1所述的模型建立方法，其特征在于步驟(3)所述的接種骨髓基質細胞后根片用DMEM培養液培養。
6.根據權利要求1所述的模型建立方法，其特征在于步驟(3)所述的接種骨髓基質細胞后根片用DEX培養液培養。
全文摘要
本發明涉及一種用于檢測細胞分化功能模型的建立方法，該方法包括以下步驟(1)制備根片、釉基質蛋白(EMPs)、骨髓基質細胞；(2)將上述根片的根面用釉基質蛋白覆蓋；(3)將骨髓基質細胞接種在步驟(2)獲得根片表面上；(4)將步驟(3)獲得根片置入聚四氟乙烯膜的口袋內；(5)將口袋包繞的根片放入裸鼠皮下。本發明優點表現在將細胞體外培養與體內生長相結合，并用屏障膜隔離裸鼠細胞的影響，可以觀察EMPs對骨髓基質細胞分化的影響，從而為研究EMPs的作用機制提供有效的研究模型。在實驗至8周時，不同的處理組形成了不同的組織結構，EMPs處理的根面有細胞性牙骨質樣物形成，表明EMPs可促進豬骨髓基質細胞向成牙骨質細胞方向分化，亦表明了所用的研究模型是成功的。
文檔編號C12Q1/04GK1884491SQ200610028508
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月30日 優先權日2006年6月30日
發明者束蓉, 宋愛梅, 謝玉峰, 宋忠臣, 王曉春 申請人:上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院