專利名稱：一種紅酵母細胞以及生產光學純手性仲醇的方法
技術領域：
本發明屬于生物化工領域，涉及一種紅酵母細胞以及生產光學純手性仲醇的方法。
背景技術：
光學活性手性仲醇是手性藥物，如(R)-硝苯洛爾、(R)-托莫西汀，以及其它手性化學品合成的重要中間體。目前通常采用的手性仲醇制備方法包括消旋醇或酯的對映選擇性拆分以及潛手性酮的不對稱還原。如文獻生物加工過程，2005，3(3)1-8所介紹的方法。
酯酶或脂肪酶催化的外消旋仲醇的對映選擇性酯化或轉酯化拆分以及外消旋酯的對映選擇性水解拆分是制備光學活性手性仲醇最常用的方法，這種方法的主要優點在于目前商品脂肪酶的種類較多，針對特定的底物，能比較容易地選出具有高活力和高對映選擇性的酶。但該方法有一個最大的缺點，即目標對映體產物的最高收率不超過50％。另外，對于脂肪酶催化的外消旋酯水解拆分，必須事先合成外消旋的底物酯，對于工業化生產而言，不僅增加了操作步驟，而且增加了額外的成本。
潛手性酮的不對稱還原是制備光學活性手性醇的重要方法，該方法在理論上能將底物酮100％地轉化為單一對映體的手性醇，具有較高的工業應用價值。化學法對潛手性酮的不對稱還原通常使用手性氨基醇或過渡金屬配合物等作為催化劑，用化學還原劑實現酮的還原。化學法催化的酮不對稱還原雖然具有較高的產率，但其主要缺點是反應的立體選擇性往往不夠理想，產品的光學純度常常不能達到制藥行業的要求，而且手性催化劑的制備和回收比較困難，價格比較昂貴。
生物法催化的潛手性酮不對稱還原具有立體專一性高的優勢，還原產物仲醇的光學純度通常很高。生物法催化酮不對稱還原所使用的生物催化劑一般包括脫氫酶制劑和微生物活性整細胞。使用分離純化的脫氫酶制劑催化酮的不對稱還原，操作簡單，沒有副反應，產物提取方便，但其最大缺點是反應體系中需要額外添加還原型輔酶NADH或NADPH，而這些輔酶非常昂貴，難以用于大規模產品生產。目前雖然已報道了一些雙酶耦合的體外輔酶再生系統，但其大規模應用還有很多問題有待解決。而使用活性整細胞催化酮的還原相對要方便得多，細胞體內存在完整的輔酶再生系統，只需加入適量的輔底物(如葡萄糖或乙醇等)，即可進行輔酶的自發循環再生，無須額外添加價格昂貴的還原型輔酶，并且整細胞的使用可以免去酶的提取純化過程，更適合于工業規模生產。
面包酵母是一種常用的生物還原催化劑，但是面包酵母細胞內含有多種立體選擇性不同甚至完全相反的羰基還原酶組分，當應用于潛手性酮的不對稱還原反應時，其產物手性仲醇的光學純度往往比較低。
發明內容
本發明需要解決的技術問題是公開一種紅酵母細胞以及生產光學純手性仲醇的方法，以克服現有技術存在的上述缺陷。
本發明的紅酵母細胞(Rhodotorula sp.ECU316-1)是一種屬于紅酵母屬的菌種，該菌種是從上海植物園的土壤中分離，并經過多輪紫外誘變篩選后獲得的，于2006年6月14日在中國普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號為CGMCC1735。
本發明的菌種具有如下的微生物學特征1.形態特征(1)細胞的形態和大小卵形，2.3～5.0×4.0～10.0μ m；(2)擲胞子的形成無；2.在各種培養基上的生長狀態(1)牛肉浸膏瓊脂平板培養(30℃，36小時)菌落形狀圓形；菌落表面隆起平滑、有光澤、菌落粘稠大小2～4mm；色調粉紅色。
(2)牛肉浸膏明膠穿刺培養(20℃，6天)不液化明膠3.生理生化特征(1)硝酸鹽利用(28℃，5天)能利用；(2)胞外類淀粉化合物產生不產生；(3)尿素水解陽性(4)甲基紅試驗陰性；
(5)對氧的需求好氣；(6)高滲培養基耐受性能耐受含20％NaCl的高滲培養基(7)碳源同化陽性葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、淀粉和肌醇陰性乳糖(8)碳源發酵不發酵碳源(9)生長pH范圍5.0～8.0；(10)生長最適宜溫度25～35℃；根據文獻“酵母菌的特征與鑒定手冊”提供的鑒定方法和上述的試驗結果表明，該細胞屬于紅酵母菌類群，但又與以前報道的紅酵母細胞有明顯的不同，其主要不同之處在于一般的紅酵母細胞不能耐受高滲培養基，而本發明的紅酵母細胞能耐受高滲培養基，并且對許多底物的對映選擇性有顯著提高，如催化還原產物對硝基苯乙醇的ee值由原先的96％提高到高于99％。
本發明的紅酵母Rhodotorula sp.ECU316-1可以用于生產光學純手性仲醇，包括如下步驟(1)對紅酵母Rhodotorula sp.ECU316-1進行搖瓶培養培養基配方為葡萄糖10～30g/L，酵母膏0～20g/L，蛋白胨0～20g/L，KH2PO41～5g/L，NaCl1～10g/L，MgSO40.5～5g/L，pH6～8，搖瓶裝液量為10～30％，基于培養基的體積，接種量為2～10％，培養溫度為25～40℃，搖床轉速為100～200rpm，培養時間為15～30hr。
(2)發酵罐培養培養基配方與搖瓶培養基配方相同，發酵罐裝液量以體積計為60～80％，基于培養基的體積的2～10％的比例接入種子液。培養溫度為25～40℃，通氣量為0.5～1.5vvm，攪拌轉速為300～600rpm，發酵時間為20～35hr。離心收獲細胞。
(3)直接用紅酵母整細胞或將其固定化后作為生物催化劑，置于水或水與有機溶劑的兩相體系中，催化底物酮的不對稱還原，然后從反應產物中收集還原產物——光學純的手性仲醇，具體包括如下步驟將紅酵母整細胞或固定化后的紅酵母細胞置于水、緩沖液或水與有機溶劑的兩相體系中，使細胞濃度為50～500g(濕重)/L，加入羰基底物，羰基底物濃度為10～200mM，反應溫度為25～40℃，反應時3～48小時，并通過薄板層析監測反應進行的程度，待反應完成后，從反應產物中收集還原產物——光學純的手性仲醇，轉化率可達到95％以上。
所說的羰基底物的結構通式為R1COR2；其中R1和R2分別代表-CH3，-CH2CH3，-CH2X，-CH2CH2X，-C6H5，-C6H4X，且R1和R2不相同；X代表F，Cl，Br，I，OH，NH2，NO2，N3；優選的羰基底物選自苯環、甲基取代的苯乙酮衍生物、乙酰吡啶衍生物、α-酮酯或β-酮酯；所說的緩沖液可選用pH為6-8的磷酸鉀緩沖液或Tris-HCl緩沖液；所說的有機溶劑選自環己烷、正己烷、正庚烷、異辛烷、異丙醚、甲基叔丁基醚或甲苯等溶劑其中的一種，有機相與水相的體積比為1∶5至5∶1；所說的固定化后的紅酵母細胞是海藻酸鈣包埋的紅酵母細胞，制備方法如下將紅酵母濕細胞與海藻酸鈉水溶液混合，濕細胞終濃度為10～30％，海藻酸鈉終濃度為2～4％。將混合物逐滴滴入濃度為0.05～0.2M的CaCl2溶液中，凝固成球。生成的固定化細胞凝膠顆粒在8～12mM CaCl2溶液中固化10～12小時，儲存備用。
按照本發明優選的方法，反應體系中可以添加幫助底物分散的表面活性劑，優選的表面活性劑為吐溫-80，加入量為反應體系質量的0.2％～5％。
采用本發明的紅酵母細胞生產光學純手性仲醇，具有顯著的優點，底物的轉化率可達到95％以上，能夠合成高光學純度(＞99％)的手性仲醇，而且催化劑易于制備、反應條件溫和、底物適應性廣，具有很好的工業應用開發前景。
具體實施例方式
實施例1培養基配方為葡萄糖15g/L，酵母膏7.5g/L，蛋白胨7.5g/L，KH2PO41.0g/L，NaCl1.0g/L，MgSO40.5g/L，pH7.0。121℃高溫滅菌20min。
取4℃保存的紅酵母斜面菌種，挑取一環接種至裝有50ml培養基的250ml搖瓶中，在30℃下，160rpm振搖培養20hr，按5％的接種量轉接至盛有100ml培養基的500ml搖瓶中，于160rpm、30℃繼續培養20hr，離心收獲細胞。發酵液酶活力約為20U/L，細胞濃度約40g(濕重)/L，單位細胞的酶活為0.5U/g濕細胞。
細胞活力單位定義為30℃，pH7.0的條件下，每分鐘催化苯乙酮還原生成1.0μmol苯乙醇所需的細胞量。
實施例2發酵培養基配方葡萄糖30g/L，酵母膏15g/L，蛋白胨15g/L，KH2PO42.0g/L，NaCl1.0g/L，MgSO40.5g/L，調節pH為7.0。121℃高溫滅菌20min。
種子液培養基同實施例1。挑取斜面菌種，分別接種至裝100ml培養基的500ml搖瓶中，在30℃，160rpm振搖培養20hr，按5％的接種量轉接至盛有3L發酵培養基的5L攪拌發酵罐中，通氣量為3.0L/min，培養溫度恒定為30℃，攪拌轉速為400rpm。發酵培養30h，離心收獲細胞。發酵液酶活力為79.5U/L。
實施例3在50g濕細胞中加入100ml生理鹽水(0.9％NaCl溶液)，懸浮調勻，隨后與預先加熱溶解的海藻酸鈉溶液混合，加水定容至250ml，攪拌均勻，海藻酸鈉終濃度為2.5％(w/v)。將此混合物逐滴滴入0.1M的CaCl2溶液中，凝固成球。生成的固定化細胞凝膠顆粒在10mM CaCl2溶液中固化12h，然后儲存于4℃，待用。
實施例4～13紅酵母整細胞催化苯乙酮衍生物的不對稱還原取12g紅酵母濕細胞懸浮于100mL磷酸鉀緩沖液(50mM，pH7.0)中，分別加入1.0mmol不同結構的底物羰基化合物，反應混合物在30℃，160rpm條件下在恒溫搖床上振搖反應，間歇取樣測定反應轉化率，轉化完全時結束反應。8,000×g離心8min，上清液用乙酸乙酯萃取，萃取液加無水硫酸鈉干燥后旋轉蒸發除去溶劑，用硅膠柱層析法純化粗產品，用手性氣相、液相色譜或通過比旋光度的測定分析產物的光學純度。反應結果以及產物的構型和光學純度如下表所示。
實施例14～16紅酵母整細胞催化乙酰吡啶的不對稱還原取12g紅酵母濕細胞懸浮于100mL磷酸鉀緩沖液(50mM，pH7.0)中，分別加入10.0mmol的羰基底物乙酰吡啶，反應混合物在30℃，160rpm條件下在恒溫搖床上振搖反應，間歇取樣測定反應轉化率，轉化完全時結束反應。8,000×g離心8min，上清液用乙酸乙酯萃取，萃取液加無水硫酸鈉干燥后旋轉蒸發除去溶劑，用硅膠柱層析法純化粗產品，用手性氣相色譜分析產物的光學純度。反應結果以及產物的構型和光學純度如下表所示。
實施例17～23紅酵母整細胞催化α-酮酯以及β-酮酯的不對稱還原取12g紅酵母濕細胞懸浮于100mL磷酸鉀緩沖液(50mM，pH7.0)中，分別加入不同濃度的α-酮酯或β-酮酯，反應混合物在30℃，160rpm條件下在恒溫搖床上振搖反應，間歇取樣測定反應轉化率，轉化率達到100％時結束反應。8,000×g離心8min，上清液用乙酸乙酯萃取，萃取液加無水硫酸鈉干燥后旋轉蒸發除去溶劑，用硅膠柱層析法純化粗產品，用手性氣相、液相色譜或通過比旋光度的測定分析產物的光學純度。反應結果以及產物的構型和光學純度如下表所示。
實施例24取15g紅酵母濕細胞，放在500ml搖瓶中，加入含有1g葡萄糖的100ml磷酸鉀緩沖液(50mM，pH7.0)重新懸浮細胞，加入100ml異辛烷和0.6ml苯乙酮，在恒溫搖床上，恒溫30℃，160rpm條件下振搖反應30h，獲得(S)-1-苯乙醇，轉化率為96％。
實施例25取100g海藻酸鈣包埋固定化細胞，放在500ml搖瓶中，加入200ml Tris-HCl緩沖液(50mM，pH 7.0)，2g葡萄糖，1.2ml苯乙酮和0.4g吐溫-80，在恒溫搖床上，恒溫30℃，160rpm反應24h，獲得(S)-1-苯乙醇，轉化率為95％。
實施例26在2L攪拌反應器中，加入200g紅酵母濕細胞，1.0L自來水，10g葡萄糖，6ml苯乙酮，2g吐溫-80，反應溫度恒定為30℃，攪拌轉速為300rpm，反應17h，獲得(S)-1-苯乙醇，轉化率98％。
用500ml乙酸乙酯萃取反應液，重復兩次，合并萃取液，加入無水硫酸鈉干燥，旋轉蒸發濃縮，濃縮液過硅膠柱分離，洗脫液比例為石油醚/乙酸乙酯＝5∶1，合并含有產物苯乙醇的洗脫液，旋轉蒸發除去溶劑，得產品5.1g。以手性氣相色譜分析，產物的光學純度為99.1％ee。
權利要求
1.一種紅酵母細胞Rhodotorula sp.ECU316-1，保藏號為CGMCC1735。
2.一種以紅酵母細胞催化劑制備光學純手性仲醇的方法，其特征在于該方法包括先培養保藏號為CGMCC1735的紅酵母細胞(Rhodotorula sp.ECU316-1)，然后再將該培養物或將其固定化之后置于水、緩沖液或水與有機溶劑的兩相體系中，加入羰基底物，催化羰基底物的不對稱還原，然后從反應產物中收集還原產物——光學純的手性仲醇。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，水、緩沖液或水與有機溶劑的兩相體系中，細胞濃度為50～500g(濕重)/L。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，羰基底物濃度為10～200mM。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，反應溫度為25～40℃，反應時間為3-48小時，所說的緩沖液pH為6-8。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所說的有機溶劑選自環己烷、正己烷、正庚烷、異辛烷、異丙醚、甲基叔丁基醚或甲苯等溶劑其中的一種，有機相與水相的體積比為1∶5至5∶1。
7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所說的固定化后的紅酵母細胞是海藻酸鈣包埋的紅酵母細胞。
8.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，反應體系中可以添加幫助底物分散的表面活性劑，優選的表面活性劑為吐溫-80，加入量為反應體系質量的0.2％～5％。
9.根據權利要求2～8任一項所述的方法，其特征在于，所說的羰基底物的結構通式為R1COR2；其中R1和R2分別代表-CH3，-CH2CH3，-CH2X，-CH2CH2X，-C6H5，-C6H4X，且R1和R2不相同；X代表F，Cl，Br，I，OH，NH2，NO2，N3。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，羰基底物選自苯環或甲基被取代的苯乙酮衍生物、乙酰吡啶衍生物、α-酮酯或β-酮酯。
全文摘要
本發明公開了一種紅酵母細胞(Rhodotorulasp.ECU316－1)，保藏號為CGMCC1735，以及生產光學純手性仲醇的方法。采用本發明的紅酵母細胞生產光學純手性仲醇，具有顯著的優點，底物的轉化率可達到95％以上，能夠合成高光學純度(＞99％)的手性仲醇，且催化劑易于制備、反應條件溫和、底物適應性廣，具有很好的工業應用開發前景。
文檔編號C12P7/02GK1869197SQ20061002835
公開日2006年11月29日 申請日期2006年6月29日 優先權日2006年6月29日
發明者許建和, 潘江, 楊巍, 陸幫榮, 朱月珍 申請人:華東理工大學, 金壇市華英化工廠