一種平行的多位點基因型實時定量檢測技術的制作方法

專利名稱：一種平行的多位點基因型實時定量檢測技術的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及核酸檢測、基因診斷、基因序列分析、基因 類型及多態性的分析以及基因表達的分析等領域。更具體地說，本發明涉及多位點基 因突變檢測多個位點堿基多態性分析，其中這些位點可以是在不同的基因片段上。
背景技術：
在基因檢測或是核酸序列分析中，通常要檢測少到一個基因位點的突變或是單個
堿基多態性變化。核酸連接酶反應包括連接酶檢測反應(Ligase Detection Reaction, LDR)和連接酶鏈反應(Ligase Chain Reaction, LCR)就是為此目的而設計的。它可以單 獨使用或結合聚合酶鏈式反應(PCR)快速準確地檢測少到一個堿基的變化。
核酸連接酶反應是Landegren等人于1988年為檢出序列中點突變而設計、發明 的。合成一對探針A、 B，它們完全覆蓋了靶序列。經退火與靶序列結合后，探針A、 B間留下一個切口，加入連接酶封閉切口，兩探針成靶序列完整的互補鏈。如果靶序 列中有點突變，探針不能與靶序列精確結合，切口附近核苷酸的空間結構發生變化， 連接反應不能進行，變性后探針仍是兩個。顯然，當耙序列中存在點突變時，檢測連 接產物結果是陰性的。
Barany于1991年報道了耐熱連接酶-Taq連接酶的發現及其在LCR中的應用， 為連接酶反應的實用化奠定了基礎。用Taq連接酶做連接酶反應只在兩個保溫點的循 環(94'C、 lmin和65°C、 3min)。產物檢測也非常方便、敏感。因此可以說連接酶反 應是目前檢測已知序列中有無點突變和單堿基多態性檢測的最佳方法。
連接酶檢測反應是通過設計兩條能與靶序列DNA精確并且緊密雜交的寡核苷酸 探針(本發明中也稱為連接酶反應探針、或是分別稱為區分探針和通用探針)完成的。 寡核酸雜交后，DNA連接酶可使其正常配對的相鄰堿基共價連接，而在連接點有錯 配的相鄰堿基則幾乎不發生共價連接，連接產物通常是通過凝膠電泳觀察其大小，或 通過核酸雜交技術檢測。這一過程如重復進行多個循環，則連接產物會呈線性增加(圖 1)。若此反應中有兩對互補的與能靶序列DNA結合的寡核苷酸探針(本發明中也稱 為連接酶反應探針、或是分別稱為區分探針和通用探針)進行循環的連接反應，每次 連接反應的產物又可在下一輪反應中當模板，則靶序列以指數形式擴增出來，或稱之 為連接酶鏈反應(圖2)。
核酸連接酶反應除單獨使用外，還可結合聚合酶鏈式反應，進一步提高其檢測的 靈敏度。可以在連接酶反應的一對寡核苷酸探針的兩端加上一對引物序列，連接酶檢
測反應的產物再通過PCR反應進一步擴增(圖3)。或是PCR擴增后，以PCR反應產 物為靶序列DNA，通過連接酶檢測反應檢測PCR產物上的單堿基差異(圖4)。
用于連接酶反應的寡核苷酸探針一般為20個左右堿基，使被檢變異核苷酸位于 即將連接的兩個寡核苷酸探針連接點端。例如在

圖1-圖4中第2步反應位于右側寡核 苷酸探針的5'端。同時，左側寡核苷酸探針是5'熒光標記。右側寡核苷酸5'端 需磷酸化才能與左側寡核苷酸的3' -OH相連接。當兩段寡核苷酸探針與靶序列DNA 緊密雜交上后，且在連接點無錯配堿基時，DNA連接酶將兩段寡核苷酸探針共價連 接。如果某一寡核苷酸探針與靶序列DNA雜交不上，或是雜交上后連接點存在錯配 堿基，則DNA連接酶不能將兩段寡核苷酸探針共價連接。
因此，連接酶反應對于單個堿基的差異極為敏感，它通常用于單個堿基位點的突 變檢測，或是單堿基多態性的分析。而且，連接酶鏈反應的擴增效率與PCR相當。 同時，連接酶檢測反應亦可以有多對寡核苷酸探針，而且多對寡核苷酸探針可以不局 限于在耙DNA鏈的一段區域中。多個連接產物可通過與DNA陣列雜交的方法同時 檢測。所以，連接酶檢測反應與DNA陣列技術相結合可同時檢測多個位點的堿基差 異。
但是，連接酶反應和檢測是一多步反應，反應后需要煩瑣的DNA電泳檢測或是 核酸雜交檢測，因此檢測步驟多、時間長，并且由此容易產生樣品相互之間的交叉污 染。使得連接酶反應對技術操作人員以及實驗室要求很高，而且檢測的錯誤率很高。 連接酶反應最終在臨床檢測的應用受到了挑戰。
因此，本領域中仍然需要有操作更為簡單的平行檢測多種核酸分子的點突變或基因 多態性的方法。

發明內容
本發明者經過技術創新和深入研究，建立了能同時對核酸中多位點的基因型進行
實時檢測定量分析的方法。
具體而言，本發明第一方面提供了一種平行測定樣品中多種核酸分子的存在或量
的方法，該方法包括以下步驟
a) 提供一樣品，所述樣品中包含待檢測的核酸分子；
b) 對所述核酸分子進行核酸連接酶反應，得到經熒光基團標記的連接產物；
c) 提供一固相載體，所述載體表面不同的位置固定了多種識別核酸探針分子；
d) 使所述識別核酸探針分子與所述樣品液相接觸，從而使所述經熒光基團標記 的連接產物與所述識別核酸探針分子結合；
e) 用激發光源在固相載體與液體界面處產生倏逝場，使得與所述探針分子結合 的所述連接產物上的熒光基團被激發產生熒光信號；
f) 檢測所述熒光信號的位置和強度，從而確定樣品中多種核酸分子的存在或量。 本發明另一方面提供了一種平行測定樣品中多種核酸分子的存在或量的方法，該
方法包括以下步驟
a) 提供一樣品，所述樣品中包含待檢測的核酸分子；
b) 對所述核酸分子進行核酸連接酶反應，得到經第一熒光基團標記的連接產物；
c) 提供一固相載體，所述載體表面不同的位置固定了多種識別核酸探針分子， 所述識別核酸探針分子上結合有第二熒光基團，其中所述第二熒光基團的發射譜與所 述第一熒光基團的激發譜重疊，或所述第一熒光基團的發射譜與所述第二熒光基團的 激發譜重疊；
d) 使所述識別核酸探針分子與所述樣品液相接觸，從而使所述經第一熒光基團 標記的連接產物與所述識別核酸探針分子相互結合；
e) 用光激發所述第一熒光基團和所述第二熒光基團中的一個；
f) 檢測所述第一熒光基團和所述第二熒光基團中的另一個的信號發射的熒光位 置和強度，從而確定樣品中多種核酸分子的存在或量。
本發明的方法是全新的，其通過一步反應可高通量的對核酸分子中成百上千個位 點的突變或基因型進行檢測和定量。它有著操作簡便，不需要連接酶反應后的開管檢 測步驟，檢測時間短的優點，從而方便操作人員使用，并且降低樣品間的交叉污染概 率。并且，它能夠對核酸中多個位點進行平行檢測，多個位點不局限于核酸中的同一 區段中，同時此技術能定量分析各位點上基因型相對比例。總的來說，它具有檢測通 量大、特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、操作簡便、全封閉反應 等優點，將成為分子生物學研究以及臨床檢測的重要工具。
圖1為核酸連接酶檢測反應示意圖。 圖2為核酸連接酶鏈反應示意圖。 圖3為核酸連接酶-PCR聯合反應示意圖。 圖4為核酸PCR-連接酶聯合反應示意圖。 圖5為全反射產生倏逝場的原理圖。
圖6顯示了倏逝場強度與深度的關系隨入射角度(A)和折射率(B)的變化。 圖7為平面波導產生倏逝場的原理圖。 圖8為熒光共振能量轉移原理圖。
圖9為多種核酸的實時定量反應的熒光變化曲線示意圖。
圖10A顯示了核酸探針分子通過化學鍵連接在玻璃表面。 圖10B顯示了核酸探針分子通過聚合物連接包埋在金屬氧化物表面。 圖11為通過全反射產生倏逝場對多種核酸分子進行平行實時定量分析方法的梗 概圖。
圖12顯示了通過倏逝場實時激發與固定在載體表面的識別探針分子雜交的 PCR-LDR聯合反應產物上的熒光基團。
圖13A顯示，隨著PCR-LDR聯合反應的溫度循環的進行，CCD檢測到的被倏 逝場激發檢測HLA基因堿基多態性的探針點雜交上的熒光信號。
圖13B為隨著PCR-LDR聯合反應的進行，通過倏逝場激發的各探針點，實時檢 測其熒光強度變化曲線，并由此獲得的Ct值。
圖14為通過平面波導產生倏逝場對多種核酸分子進行平行實時定量分析方法的 梗概圖。
圖15為顯示了通過倏逝場實時激發與固定在載體表面的識別探針分子雜交的 LDR-PCR聯合反應產物上的熒光基團。
圖16A顯示，隨著LDR-PCR聯合反應的溫度循環的進行，CCD檢測到的被倏 逝場激發檢測乙肝病毒耐藥性突變的探針點雜交上的熒光信號。
圖16B為隨著LDR-PCR聯合反應的進行，通過被倏逝場激發的各探針點，實時 檢測其熒光強度變化曲線，并由此獲得的Ct值。
圖17為通過熒光共振能量轉移對多種核酸分子進行平行實時定量分析方法的梗 概圖。
圖18為通過熒光共振能量轉移實時激發與固定在載體表面的識別探針分子雜交 的連接酶反應產物上的熒光基團。
圖19A為隨著連接酶鏈反應(LCR)的溫度循環的進行，CCD檢測到的通過熒光 共振能量轉移激發檢測P53基因突變的探針點雜交上的熒光信號。
圖19B為隨連接酶鏈反應進行，通過熒光共振能量轉移激發的各探針點，實時 檢測其熒光變化曲線，并由此獲得的Ct值。
較佳實施方案
本發明第一方面提供了一種平行測定樣品中多種核酸分子的存在或量的方法，該
方法包括以下步驟
a) 提供一樣品，所述樣品中包含待檢測的核酸分子；
b) 對所述核酸分子進行核酸連接酶反應，得到經熒光基團標記的連接產物； C)提供一固相載體，所述載體表面不同的位置固定了多種識別核酸探針分子；
d)使所述識別核酸探針分子與所述樣品液相接觸，從而使所述經熒光基團標記 的連接產物與所述識別核酸探針分子結合；
e) 用激發光源在固相載體與液體界面處產生倏逝場，使得與所述探針分子結合 的所述連接產物上的熒光基團被激發產生熒光信號；
f) 檢測所述熒光信號的位置和強度，從而確定樣品中多種核酸分子的存在或量。 適用于本發明方法的樣品可以是各種形式，只要其中具有待檢測的目標核酸分子
即可。例如可以用本領域熟知或公開的方法(如限制性內切酶消化或機械方法)得到核 酸樣品，如總DNA、基因組DNA、 cDNA、總RNA、 mRNA等或其混合物。
本文所用的術語"核酸"、"核酸分子"可以互換使用，其指脫氧核糖核酸或核糖 核酸及其單鏈或雙鏈形式的聚合物。除非另有特別限定，該術語包括含有天然核苷酸 的已知類似物的核酸。該術語"核酸"可與基因、cDNA和基因編碼的mRNA互換 使用。另外，本發明的核酸分子還涵蓋了核酸片段、核酸亞序列、核酸衍生物和核酸 修飾物。所述的核酸長度可以各異，其可以是較大核酸分子的片段或較小的部分。較 佳的是，待檢測的核酸長度至少為30個堿基對，更佳的是長度為至少50個堿基對。 待檢測的核酸可以是已知的或未知的序列，可以是單鏈或雙鏈形式。其可從任何來源 衍生待擴增的核酸。
在本發明的較佳實施方案中，本發明的方法可用于平行檢測基因組中的堿基多態 性及其量。在另一較佳實施方案中，本發明的方法可用來檢測樣品中多個基因位點的 突變及其量。
在本發明方法中采用了一種固相載體,所述載體表面不同的位置固定了多種識別 核酸探針分子，所述識別核酸探針分子對連接酶反應產物的核酸分子中的一段序列有 特異性。更具體地說，該識別核酸探針分子對連接酶反應中所用探針(引物)對中不提 供熒光標記的探針的全部序列或部分有特異性(互補性)。
本文所用的術語"固相載體"或"固體載體"是指核酸可固定于其上的對熒光基 團的激發波長有低吸收的固體表面。例如，玻璃、尼龍膜、石英、陶瓷、金屬、塑料、 有機聚合物等材料都能做為本發明的固體載體，只要該載體在對要檢測的熒光基團激 發波長段的光低吸收，都能檢測到明顯的熒光信號。應當注意的是，對于載體并不必 需是透明的，只要其對一定波長段的光低吸收，即對這一波段的光是透明的即可，其 也可能在可見光的其他波段是不透明的。另外，固體載體的折射率需要大于所選液相 的折射率，通常較佳的折射率需要大于1.33。在本發明中，優選的固相載體是玻璃。 在較佳的實施方案中，這些載體宜經過化學方法修飾，從而帶有活性基團，能與核酸 上的氨基、醛基、磷酸基、或是修飾的巰基等形成穩定的連接，增強對核酸探針分子 的固定能力。
本文所用的術語"固定"是指將核酸固定在固相支持物上，通過化學共價結合方 式附著，或通過不可逆的被動吸附，或通過分子間的親和力(例如利用生物素酰化的分子接頭來固定于涂有親和素的表面)。這種固定的強度必須足以在DNA變性條件 下，不會因用水或緩沖水溶液洗滌而被除去。 一種較佳的固定方法是采用雙官能交聯 劑處理玻片，以得到帶有反應性交聯基團(如氨基、硫代或丙烯酸基團)的表面。所述 交聯劑可以是，例如，l一乙基一3 — (3 — 二甲基氨基丙基)—碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、 琥珀酰酐、苯基二異硫氰酸鹽或馬來酸酐、或異雙官能團交聯劑，如間一馬來酰亞胺 苯甲酸一N —羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)、 N —琥珀酰亞胺[4一碘乙酰基]氨基苯甲酸 (SIAB)、琥珀酰亞胺4一[N—馬來酰亞胺甲基]環己垸一1一羧化物(SMCC)、 N—y— 馬來酰亞胺丁酰氧一琥珀酰亞胺酯(GMBS)、琥珀酰亞胺一4一[對一馬來酰亞胺苯基] 丁酸鹽(SMPB)等。另外可參見文獻Nucleic Acids Research, 29: e69, 2001. Analytical Biochemistry, 247: 96—101， 1997. Analytical Biochemistry, 266: 23—30， 1999. Nucleic Acids Research, 30: 4793-4802， 2002。
固定于載體表面上的識別核酸探針分子可根據各種要檢測的連接酶反應產物的 序列信息進行設計，從而使其能夠以特異性的方式結合各自要檢測的連接酶反應產 物。該探針的長度可以由本領域技術人員根據需求進行合適的選擇，通常在6-2000 個核苷酸(較佳8-50個核苷酸、更佳15-40個核苷酸)之間。另外，根據具體的用途， 可能還需要采用修飾過的核酸探針。該核酸探針可用本領域技術人員熟知的方法來制 備。識別核酸探針在固相載體上宜為空間上分開的陣列，其通常是這樣構成的，將固 相載體(如玻片)分成不同的區域，使每個區域中只含有一種核酸探針分子。通過DNA 陣列技術，可使多種DNA探針分子排列在固體載體上。
用于核酸檢測的識別核酸探針分子通常包括寡聚核苷酸、寡聚硫代核苷酸、肽核 酸(peptide nucleic acid)、長鏈DNA分子、RNA分子、或者它們的修飾物。這些核酸
探針分子可以通過化學鍵連接、物理吸附、或是聚合物包埋、蝕刻或粘聯等方式固定 在固體載體上。核酸探針還可通過接頭或間隔臂連接在固相載體上。排列在固體載體
上的識別探針分子通過堿基間的相互配對，與目標分子(反應產物)相結合。通常目標 分子是被熒光基團標記上的，它可通過擴增反應使得熒光基團等標記的脫氧核苷三磷 酸(dNTP)摻入到目標核酸分子的擴增產物中，或是通過熒光基團等標記的寡核苷酸引 物或探針(連接酶反應探針)使反應產物帶上熒光基團的方法。通過核酸雜交后，雜交 結合上去的目標分子所帶的熒光信號被檢測到。
核酸連接酶反應是通過DNA連接酶，將與靶DNA分子退火結合上的只留有一 個缺口(nick)的兩段核酸探針分子共價連接成與靶序列完整的互補的一條鏈。并且如
果耙序列中有點突變，探針不能與靶序列精確結合，缺口附近核苷酸的空間結構發生 變化，連接反應不能進行，變性后探針仍是兩個。
在連接酶反應中，使用的是各種DNA連接酶，包括T4 DNA連接酶、E. coli DNA 連接酶、TaqDNA連接酶、PfoDNA連接酶、TthDNA連接酶、Ampligase DNA連
接酶、以及它們遺傳修飾的衍生物等。優選方案中使用的是熱穩定的DNA連接酶， 如Taq、 Pfo、 Tth、 Ampligase DNA連接酶等，通過核酸變性、連接過程的多個循環 后連接反應產物能呈線性或是指數的擴增。可用于本發明的連接酶反應包括連接酵檢 測反應(LDR)和連接酶鏈反應(LCR)。
在連接酶反應中使用的探針分子通常對每個要檢測位點設計成兩段，每段有10 個以上的堿基與靶序列相互匹配，較佳方案為15-40個堿基與靶序列相匹配。將要檢 測的突變點設計在連接缺口的兩端(如圖1-圖4)，可以是左邊探針的3'端或是右邊 探針的5'端。另外，左邊探針的3'端要帶羥基，右邊探針的5'端帶磷酸基團。 連接酶反應探針分子的中間(非連接位點)可以有一個或少數幾個與靶核酸序列不匹配 的堿基。探針分子中間少數不匹配堿基的存在，只要兩條探針分子能與靶序列結合， 將不會影響連接反應，并且還能提高連接酶反應的特異性。
在另一個實施方案中，兩端探針中間可以留有幾個堿基(例如2-10個、較佳為2-5 個)的缺口。這時如果反應液中存在DNA聚合酶，則缺口將先被DNA聚合酶補齊后， 再被DNA連接酶將切口連上，這種方案中，要檢測的突變點將要求設計在右邊探針 的5'端。同樣原理，在連接酶鏈反應中，則針對每個要檢測位點需設計成兩對相互 互補的探針，進行鏈式的擴增反應，探針設計的要求同上。
在反應液中，除了含有要檢測的靶核酸、DNA連接酶、DNA聚合酶(在探針間 留有多個堿基缺口的情況下)、及相應的連接酶探針外，還要求在含有Tris-HCl， KC1， MgCl的緩沖液中，另外還有反應底物NAD+或是rATP，以及保護試劑二硫蘇糖醇 (DTT)和牛血清白蛋白(BSA)。較優的反應緩沖液為20mM Tris-HCl(pH 8.0)， 5mM MgC12， 50mMKCl， 10mMDTT， lmM NAD+(或rATP);連接酶探針的濃度可在lpM 到luM間。連接酶反應通常在變性、連接兩個保溫點的循環進行，80度以上的變性 溫度和65度左右的連接溫度。較佳的反應程序為94°C、 lmin和60-65°C、 3min， 連接的溫度隨連接酶反應探針的退火溫度而定。
如在反應液中加入熱穩定的DNA聚合酶，以及相應的引物和脫氧核苷三磷酸 (dNTP)，則在連接酶反應的同時能進行PCR擴增，進一步提高反應的靈敏度。
PCR反應是通過DNA聚合酶在體外進行復制，反轉錄復制的過程，從而同樣地 線性或是指數性的擴增其拷貝數。如本領域技術人員所知道的，擴增過程通常包括變 性，退火，合成三個步驟，即雙鏈核酸分子的解鏈(變性)，被解鏈的核酸分子與引物 分子結合(退火)，聚合酶以解鏈的核酸分子為模板合成與之互補的DNA分子。
"聚合酶鏈式反應"或"PCR"指一種適用于核酸、RNA和/或DNA的小量特定 片段的技術，其在例如美國專利No. 4,683,195(1987年7月28日授權)中有詳細的描 述。通常，需要獲得感興趣區域兩端或其外延的序列信息，從而可以設計寡核苷酸引 物；這些引物應與待擴增模板相反鏈的序列基本上相同或相似。兩個引物的核苷酸可
以與擴增材料的兩端恰好重合。聚合酶鏈式反應可用來擴增全部基因組DNA中的、 從全細胞RNA、噬菌體或質粒序列等轉錄獲得的cDNA中的特定RNA序列、特定 DNA序列。本文所用的PCR被認為是擴增樣品中核酸分子的一個但并非唯一的例子， 該方法中采用已知的核酸作為引物和核酸聚合酶來擴增或產生特定片段的核酸。
在聚合酶鏈式反應中，雙鏈的DNA分子在90'C以上變性成單鏈分子，然后在 50-6(TC與引物分子相結合，同時結合上DNA聚合酶，DNA聚合酶以此單鏈DNA分 子為模版，脫氧核苷三磷酸(dNTP)為底物，復制出另一條與之互補的DNA，通常聚 合酶鏈式反應中的DNA聚合酶最適的合成溫度為70-78'C。通過復制，目標DNA分 子擴增了一倍。這樣多次的重復反應n個循環后，目標DNA分子擴增了近2M音。具 體可用于本發明的核酸聚合酶的例子是DNA聚合酶(T4 DNA聚合酶)、各種耐熱細菌 的熱穩定DNA聚合酶(如Taq、 VENT、 Pfii、 Tli、 Tfl DNA聚合酶)以及它們遺傳修飾 的衍生物(TaqGold， VENTexo, Pftiexo)。優選的DNA聚合酶是沒有3'到5'核酸外 切酶活性的TaqDNA聚合酶。用于本發明的核苷三磷酸分子是脫氧核糖核苷三磷酸， 如dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP。核苷三磷酸可以是天然或非天然形成的。
當使用DNA連接酶和DNA聚合酶進行連接酶反應和PCR擴增聯合反應時，由 于兩個反應條件近似，為簡化反應步驟，減少檢測時間，在優選的反應方案中，聯合 反應是在同一個反應空間同步進行的。
對于樣品中要檢測的目標分子為RNA分子時，可采用在反應液中加入T4 DNA 連接酶，先在低溫(37-45。C)連接生成DNA連接產物再通過連接酶反應或與PCR聯合 的連接反應擴增這一DNA連接產物，實現對RNA分子的檢測。另一方案為采用能 以RNA為模板的DNA聚合酶，如TthDNA聚合酶，通過一步或兩步反轉錄PCR反 應擴增后，再通過連接酶反應，產生連接產物與識別探針分子雜交檢測。
在連接酶反應中，對其中一段的連接酶探針分子通過合成的方法進行熒光標記， 可使反應產物帶上熒光基團。如聯合PCR擴增反應，則在核酸連接產物進行擴增反 應的過程中，通過在擴增引物上標記熒光基團或是在底物脫氧核苷三磷酸(dNTP)或是 核苷三磷酸(NTP)上標記熒光基團，就可使反應產物標記上所需的熒光基團。因此， 反應產物標記上熒光可通過使用有熒光基團標記的脫氧核苷三磷酸或熒光基團標記 的核苷三磷酸類似衍生物、有熒光基團標記的寡核苷酸或有熒光基團標記的寡核苷酸 修飾衍生物、或其組合等方法使反應產物被熒光基團標記。
標記熒光基團的技術是現有技術中所熟知的。常見的熒光基團包括，但不局限于， 有機熒光分子類，如熒光素，TAMRA， Cy3, Cy5, Cy5.5，羅丹明，Alexa Fluor系列等； 熒光蛋白類，如GFP， CFP， BFP， YFP等；含稀土金屬離子的時間分辨熒光以及量 子點(Quantum dot)四種。
在反應的連接或是退火過程中，連接產物或是PCR擴增產物會與固定在載體上
的識別核酸探針分子相結合，設計固定在載體上的核酸探針分子要注意特異地不與合 成的熒光標記的連接酶反應探針或是熒光標記的PCR擴增引物雜交。它們的較佳方 案是特異與連接產物相結合。與固定在載體上的核酸探針分子相雜交的針對目標核酸 分子的連接或擴增產物上的熒光基團得以被本發明的特異的方式激發。具體而言，這 些熒光基團可以被載體內由光的全反射、或是平面波導所產生的倏逝場激發。 (i)光的全反射產生的倏逝場
眾所周知，當光從高折射率(np如玻璃)的介質(光密介質)照射到低折射率(112， 液相如水)的介質(光疏介質)，并且入射角大于臨界角(ec， ec = sin" (n2/n0當n2<ni) 時，光將在光密介質中發生全反射，從而不能折射到光疏介質中。然而，當光發生全 反射時，光波會以電磁場的形式在入射點的地方滲透至光疏介質中，滲透的電磁場的 強度隨著滲透深度的加深而成指數衰減(圖5)，其滲透的深度為
dp^(人/2unO[l/(sin2e-n22/n,2)]'。(X，光在真空中的波長；9，入射角度) 其深度通常在100到300納米之間。根據公式，它與入射角，入射光波長，折射 率有關(圖6)。這種通過全反射滲透到光疏介質的電磁場就被稱為倏逝場。倏逝場和 其他光源一樣，也能激發熒光基團。如果光密介質表面鍍有納米量級(約100-200納米) 的金、銀、銅等貴重金屬膜或顆粒，將可以一定程度的增強倏逝場激發熒光的強度， 增強程度為幾倍到幾十倍不等，增強程度與金屬種類和厚度等因素有關(參見文獻 Analytical Biochemstry, 334: 303-311, 2004. Journal of Fluorescence, 14: 425-441, 2004. Current Opinion in Biotechnology, 16: 55-61,2005)。因此，在本發明的一個較佳的實施 方案中，光密介質(即固相載體)表面可以鍍有小于1000納米厚(通常約50-500納米， 更佳約100-200納米)的金屬膜，或者直徑小于1000納米(通常約50-500納米，更佳 約100-200納米)的金屬顆粒，其中所述金屬選自金、銀、銅或其它貴金屬。
由于倏逝場滲透的深度非常小，只有幾百納米，因此倏逝場只能激發貼近于介電 層100-200納米內的熒光基團，而絕大部分在光疏介質中的熒光基團不會受到激發。 倏逝場激發的熒光信號強度相當于結合到載體表面的目標DNA分子的量。溶液中熒 光標記的目標DNA分子的濃度越高，與DNA探針結合上的分子也越多，激發的熒 光信號也越強。
(ii)平面波導產生的倏逝場
平面波導一般為100-300納米的高折射率膜，例如五氧化二鉭(1&205)， 二氧化鈦 (Ti02)，氧化鋅(ZnO)，氧化鋯(ZrO》，氧化鈮(1%205)，氧化鉿(Hf02)等金屬氧化物膜。 其沉積在透明的低折射率的固體基材(如玻璃，透明聚合物等)上。激光通過棱鏡或是 光柵等方法耦合進該高折射率膜后，光在這一平面薄膜內傳輸。同時，它將在高折射 率膜和低折射率層之間產生很強的隨著滲透的深度的加深而成指數的衰減的倏逝場。 倏逝場滲透的深度為
dp-(X/2rai!)[l/(sin2e-n22/11,2)]1。 (X，光在真空中的波長；9，入射角度) 該深度同樣在大約100-200納米(圖7)。在這平面波導層上固定上核酸探針分子 后，倏逝場將激發雜交上的熒光探針分子，如果在平面波導層上鍍有納米量級(約 100-200納米)的僉、銀、銅等貴重僉屬膜或顆粒，將可以一走程度的增強倏逝場激發 熒光的強度，增強程度為幾倍到幾十倍不等，增強程度與金屬種類和厚度等因素有關。 同樣的，由于平面波導產生的倏逝場穿透深度在納米級，絕大部分在反應液這一光疏 介質中的熒光基團不會受到激發，從而就能檢測平面波導層上的特定位置的熒光強 度。根據該熒光強度變化與核酸分子濃度的對應關系或制作標準曲線，就能檢測溶液 中各個目標核酸分子的濃度。
本發明另一方面提供了一種平行測定樣品中多種核酸分子的存在或量的方法，該 方法包括以下步驟
a) 提供一樣品，所述樣品中包含待檢測的核酸分子；
b) 對所述核酸分子進行核酸連接酶反應，得到經第一熒光基團標記的連接產物； C)提供一固相載體，所述載體表面不同的位置固定了多種識別核酸探針分子，
所述識別核酸探針分子上結合有第二熒光基團，其中所述第二熒光基團的發射譜與所 述第一熒光基團的激發譜重疊，或所述第一熒光基團的發射譜與所述第二熒光基團的 激發譜重疊；
d) 使所述識別核酸探針分子與所述樣品液相接觸，從而使所述經第一熒光基團 標記的連接產物與所述識別核酸探針分子相互結合；
e) 用光激發所述第一熒光基團和所述第二熒光基團中的一個；
f) 檢測所述第一熒光基團和所述第二熒光基團中的另一個的信號發射的熒光位 置和強度，從而確定樣品中多種核酸分子的存在或量。
與探針分子結合的目標核酸分子擴增產物上的熒光基團也可以通過熒光共振能 量轉移(Flourescent resonance energy transfer, FRET)來激發。如圖8所示，熒光共振能 量轉移是指當兩種不同的熒光生色團在空間上距離較近，且其中一種生色團(供體)801 的發射譜與另一種生色團(受體)807的激發譜有重疊時，當供體被激發時(如802所 示)，受體809會因供體激發能的轉移808而被激發。理論上講，只要兩個光譜有重 疊，就會發生FRET，只是能量轉移的效率與光譜重疊的積分、熒光量子效率和供體 受體的距離等因素有關。(可參照文獻Proc Natl Acad Sci U S A 58: 719-726， 1967)能 量轉移50。/。時的距離Rtr[8.8xl(FxK2xn4xQYdXJa)]"6A， K為極化方向因子，供 體受體方向隨機是通常為2/3， n為折射率，水溶液通常為1.33-1.34， QYd為供體的熒 光量子效率，J(人)為供體的發射光譜與受體激發光譜重疊的積分強度。其直觀表現就 是供體產生的熒光強度較其單獨存在時要低的多810，而受體發射的熒光卻大大增強 809，能量轉移效率與兩個生色團激發譜和發射譜的重疊程度、供體與受體躍遷偶極
的相對取向、供受體間的距離有密切關系。發生熒光共振能量轉移時，分子間距離小
于10nm。常用的FRET熒光基團對對于本領域技術人員而言是熟知的，其包括，但 不局限于，CFP-YFP， CFP-dsRED， BFP-GFP， GFP-dsRED， YFP-dsRED， Cy3-Cy5, Alexa488-Cy3 ， FITC-羅丹明(TRITC) ， YFP-TRITC ， YFP- Cy3 ， Fluorescein-Tetramethylrhodamine, IAEDANS-Fluorescein, EDANS-Dabcyl ， Fluorescein-QSY 7 和QSY 9， Alexa Fluor 350-Alexa Fluor 488， Alexa Fluor 488-Alexa Fluor 546， Alexa Fluor 488-Alexa Fluor 555， Alexa Fluor 488-Alexa Fluor 568， Alexa Fluor 546-Alexa Fluor 568， Alexa Fluor 488-Alexa Fluor 594， Alexa Fluor 546-Alexa Fluor 594， Alexa Fluor 555-Alexa Fluor 594， Alexa Fluor 488-Alexa Fluor 647， Alexa Fluor 546-Alexa Fluor 647， Alexa Fluor 555-Alexa Fluor 647， Alexa Fluor 568-Alexa Fluor 647， Alexa Fluor 594-Alexa Fluor 647， Alexa Fluor 350-QSY 35， Alexa Fluor 488-QSY 35， Alexa Fluor 546-QSY 35， Alexa Fluor 350-dabcyl, Alexa Fluor 488-dabcyl， Alexa Fluor 546-dabcyl， Alexa Fluor 488-QSY 7和QSY 9， Alexa Fluor 546-QSY 7和QSY 9， Alexa Fluor 555-QSY 7和QSY9， Alexa Fluor 568-QSY 7和QSY 9， Alexa Fluor 568-QSY 21 ， Alexa Fluor 594-QSY 21, Alexa Fluor 647-QSY 21等。然而，本領域技術人員能夠明了還能 夠將其它FRET熒光基團對用于本發明的方法中。
因此，利用熒光共振能量轉移的方法檢測時，只需要固定在固體載體上的識別探 針分子804連接上熒光基團，而被檢測的目標核酸805分子標記上另一種熒光基團。 并且這兩種熒光基團，其中一種生色團(供體)801的發射譜與另一種生色團(受體)807， 809的激發譜有相當程度的重疊時，光激發供體802，而檢測受體熒光811，那么只 有雜交上的核酸分子806的熒光才能被檢測到，大量的在溶液中的以及未被雜交上的 探針上的背景熒光不被激發807，或是激發的光由于不發生熒光共振能量轉移，發射 的波長不同803，可以被濾鏡過濾而不被檢測到。這樣，熒光信號強度相當于結合到 載體表面的目標DNA分子的量。溶液中熒光標記的目標DNA分子的濃度越高，與 DNA探針結合上的分子也越多，激發的熒光信號也越強。
上述兩個方法中的熒光信號和強度可用常規的儀器來進行檢測，例如可以采用電 荷耦合器(Charge-CoupledDevice, CCD),光電倍增管(PMT)，光電探測器，或者光功 率計等檢測設備。熒光標記優選的檢測系統是電荷耦合儀(CCD)照相機，它可任選地 與放大裝置(如顯微鏡)連接。
通常，本發明以上兩種方法可以基于想類同的光學平臺配置，它們包含如下配置:
激發光源包括穩定的汞燈、氙燈、汞氙復合電弧燈光源；從紫外到紅外波段不 同波長的激光光源，包括氣體激光，半導體激光。
中性密度濾光片用以控制激發光的強度。
透鏡組用來整合光的條帶，控制光的入射。
濾鏡組為選定的熒光基團組合配置合適的濾鏡組，包括激發，發射，二色分光 等。它可以削減光譜串色，提高要檢測熒光的信號噪聲比。
檢測設備其特征是能感應某一位置光強度，核心成分可從高靈敏度PMT或冷 CCD，光電探測器，或者光功率計中逸擇。
本發明實際上還可以是一種實時定量連接酶反應技術，該技術在反應體系中加入 熒光基團，利用熒光信號的累積，實時監測整個反應進程，最后通過制作標準曲線對 目標核酸分子進行定量分析的方法。在反應過程中產生的連接反應產物是呈指數方式 增加的，隨著反應循環數的增加，最終反應不再以指數方式生成連接反應產物，從而 進入平臺期。在傳統的連接酶反應中，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來檢測連接酶 反應的最終產物，或是反應后通過DNA雜交方法檢測，用此終點法對連接酶反應產
物定量存在不可靠之處。與實時定量聚合酶鏈式反應類似，對整個反應擴增過程進行 了實時的監測和連續地分析擴增相關的熒光信號，隨著反應時間的進行，監測到的熒
光信號的變化可以繪制成一條曲線(圖9)。在反應早期，產生熒光信號的水平不能與
背景明顯地區別，而后熒光信號的產生進入指數期、線性期和最終的平臺期，因此可 以在反應處于指數期的某一點上來檢測反應產物的量，并且由此來推斷模板最初的含 量。為了便于對所檢測樣本進行比較，在實時定量反應的指數增長期，首先需設定一 定熒光信號的域值，如果檢測到熒光信號超過域值被認為是真正的信號，它可用于定
義樣本的域值循環數(Ct)。 Ct值的含義是每個反應管內的熒光信號達到設定的域值
時所經歷的循環數。盡管本發明實施例中設定Ct值為擴增反應開始時信號值的3倍， 然而，應當理解，本領域技術人員能夠根據具體需求選擇和確定合適的Ct值。
本發明研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系， 起始拷貝數越多，Ct值越小。因此，在利用已知起始拷貝數的標準品作出標準曲線后， 只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
在本發明中，隨著溶液中目標DNA分子的擴增，熒光標記的目標DNA分子的 濃度可呈指數方式增加，與固定在載體表面的DNA探針分子結合上的也增多，相應 探針位置上激發的熒光信號也增強。因此，能夠在整個反應過程進行了多種探針的實 時監測和連續地分析擴增相關的熒光信號。隨之可以繪制成多條S型曲線，得出多個 探針分子的Ct值，從而判斷和檢測目標核酸的種類、基因型和拷貝數。
為了更詳細的敘述本發明，根據附圖進行如下具體說明。然而，應理解，這些實 施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。除非另有描述，本發明的實施將 采用本領域技術人員所知的常規技術，這些技術在下列文獻中有完整的描述例如， Sambrook《分子克隆實驗指南》第2版(1989);《DNA克隆》第I和II巻(D.N. Glover 編輯1985);《寡核苷酸合成》(M丄Gait編輯，1984);《核酸雜交》(B.D. Hames和S丄 Higgins編輯.1984)。或者，可按照試劑生產商所提供的說明書進行。
實施例l
作為實施例l，對適用本發明的核酸檢測方法，以對人白細胞抗原A(HLA-A)基 因第二外顯子(以下稱為目標基因)的堿基多態性的平行定量分析為例進行說明。
HLA基因的堿基多態性對控制T細胞識別和在組織器官移植中決定組織相容性 上起著關鍵作用。本發明者用PCR-LDR聯合反應檢測HLA-A基因中外顯子2上的 一些堿基位點的多態性。取人的基因組DNA，在HLA-A基因內含子1和內含子2上 設計一對引物，這對引物可擴增HLA-A外顯子2序列，在此實施例中使用的PCR擴 增引物為
5， GGCAGGTCTCAGCCACTGCTCG (SEQ ID NO: 1) 5， CGCAGGTCAGGACCCCTCATCCC (SEQ ID NO: 2)
同時，針對HLA-A基因外顯子2中的三個堿基多態性位點設計連接酶反應的連 接探針分別為
HLA-A249區分連接酶反應探針
5'atacgactcactataCTGGATAGAGCAGGAGGGG (SEQ ID NO: 3) 5'taaccctcactaaaCTGGATAGAGCAGGAGGGT (SEQ ID NO: 4) HLA-A249通用連接酶反應探針
5，P04-CCGGAGTATTGGGACCAGG-Cy3 (SEQ ID NO: 5) HLA-A280區分連接酶反應探針
5'atacgactcactataTGGCAGGAGACACGGAATA (SEQ ID NO: 6) 5'ttaaccctcactaaaTGGCAGGAGACACGGAATG (SEQ ID NO: 7) HLA-A280通用連接酶反應探針
5， P04-TGAAGGCCCACTCACAGAC-Cy3 (SEQ ID NO: 8) HLA-A301區分連接酶反應探針
5'acgactcactatagGAAGGCCCACTCACAGACTG (SEQ ID NO: 9) 5'aaccctcactaaagGAAGGCCCACTCACAGACTC (SEQ ID NO: 10) HLA-A301通用連接酶反應探針 5， P04-ACCGAGCGAACCTGGG-Cy3 (SEQ ID NO: 11)
以上使用的連接酶反應探針中，區分探針3'端為羥基，通用探針5'端為磷酸基 團，3'端為Cy3熒光基團標記。區分探針中大寫字母的堿基為與模板序列匹配的堿基， 小寫字母的堿基為標簽序列，用于區分兩種連接產物。在這些連接酶反應探針中，序 列中間有部分幾個堿基由于堿基的多態性而可能不完全匹配，但它們并不會影響連接 反應的進行，要檢測的多態性堿基在區分探針的3，端，通過黑體標記上了。 針對連接酶反應的產物設計以下用于陣列化檢測的探針用于檢測識別連接酶反 應產物
HLA-A249陣列識別探針
5， CTGCTCTATCCAGTATAGTGAGTCGTAT-NH2(SEQ ID NO: 12) 5， CTGCTCTATCCAGTTTAGTGAGGGTTA-NH2(SEQ ID NO: 13) HLA-A280陣列識別探針
5， GTCTCCTGCCATATAGTGAGTCGTAT-NH2(SEQIDNO: 14) 5， GTCTCCTGCCATTTAGTGAGGGTTAA-NH2(SEQIDNO: 15) HLA-A301陣列識別探針
5， GTGGGCCTTCCTATAGTGAGTCGT-NH2(SEQ ID NO: 16) 5， GTGGGCCTTCCTTTAGTGAGGGTT-NH2(SEQ ID NO: 17)
各種陣列識別探針分子通過化學連接方法固定在玻璃表面(圖10A)，具體的固 定方法可參照文獻Analytical Biochemistry, 266: 23-30, 1999.中的方法。當然，它們也 能通過化學鍵連接，物理吸附，或是聚合物包埋等方式固定在其他透明的折射率比反 應溶液高的其他固體載體上，如石英，聚碳酸酯，聚苯乙烯，聚乙烯，PMMA等。
將人的基因組DNA與PCR擴增引物、連接酶反應探針、酶、反應緩沖液按以 下濃度混合后加到反應艙中
20mMTris-HCl(pH8.0)， 5mMMgC12， 50mMKCl， 10mMDTT， O.lmMdNTP， lmMNAD+;各種連接反應酶探針分別為1nM; PCR擴增引物各100nM; 5uTaqDNA 聚合酶；和20uTthDNA連接酶。
反應在以下的溫度循環中進行96。C2min(變性)；10個如下循環94°C， 30s(變 性)，68。C30s(引物退火)，74。C30s(延伸)；25個如下循環94。C30s(變性)，58°C 2min(退火、延伸、和連接)。
下面結合圖11和圖12對本發明實施例方法及過程進行詳細說明。如圖所示，各 種核酸探針(陣列識別探針)1103， 1104， 1207通過DNA陣列的方法固定在K9玻璃 1109， 1209表面。固定探針的玻璃與一樣品槽1101密合形成反應艙。將反應液加入 到反應艙后，整個反應溫度受到一個加熱溫度控制平臺1105的控制，按照以上的溫 度循環，進行多個循環擴增和連接。首先的10個循環，由于設計的引物退火溫度高 于連接酶探針的退火溫度，在65。C時，引物與人基因組DNA模板結合，在TaqDNA 聚合酶作用下，主要進行PCR的擴增反應，基因組DNA的HLA-A外顯子2的序列 被擴增，得到擴增產物1211。 10個循環后，降低退火溫度為55。C，此時擴增引物與 連接酶反應探針1203， 1210都與模板DNA，即PCR擴增產物1211 ，相結合，同時 進行PCR擴增和連接酶檢測反應。Cy3(1201)標記的連接酶反應探針1203與通用探
針1210與PCR反應的擴增產物1211退火相結合1212，在DNA連接酶1204作用下 共價連接，連接酶反應產生的連接產物1202從而帶上了 Cy3熒光基團1201。
隨著反應的進行，PCR擴增產物成指數增長，同時連接反應的產物也隨之增長。 在每個循環的55 。C反應過程中，連接酶反應產物1208也將與固定的識別探針1207 通過堿基的相互配對而結合。這種結合信號被全反射產生的倏逝場1206激發而被檢 測到。即，在55。C退火過程進行約2分鐘后，氬離子激光器1106被打開，產生514 納米的激光。激光通過一透鏡組1107，整合成線狀后，通過棱鏡1108，以大約75度 的角度偶合進玻片1109中，由于入射角大于折射臨界角(ec = sin"(1.34/1.52))，激光 在玻片中產生多次的全反射，從而產生倏逝場。
由于每一位點上的兩種堿基多態性所帶的標簽序列不一樣，陣列化的識別探針一 半與標簽序列匹配一半與通用序列相匹配，每種多態性對應的連接酶反應產物將特異 的只與一種一種識別探針相結合。因此在與對應的連接酶反應產物1208雜交的識別 探針分子1207位點上，倏逝場激發雜交上的目標基因片段上的Cy3熒光基團1205， 使它產生552納米左右的發射波長，此發射波長通過一中心波長550納米的濾鏡1111 后，被CCD(1112)接收，通過CCD可檢測到各探針點位置上的熒光信號強度1213。 陣列上各點的信號的有無對應相應的堿基形態(圖13A)。隨著擴增反應多個循環進行， 陣列上各點的信號值隨之增大(圖13A)，當某一點的信號值達到一域值，即擴增反應 開始時信號值的3倍，記錄這時的循環數Cti(i為探針編號)(圖13B)。根據各個探針的 Cti可以定量各種堿基形態的相對拷貝數。由于每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝 數的對數存在線性關系，而且起始拷貝數越多，Ct值越小，因此，根據Ct值可以推 算出目標基因各種堿基形態起始的相對拷貝數。當然對于基因組來說，通常只要檢測 堿基的形態。
實施例2
作為實施例2，對適用本發明的核酸檢測方法，以對檢測乙肝病毒拉米夫定耐藥 性突變的定量分析為例進行說明。
乙肝病毒的耐藥性通常是由于病毒基因的突變使得病毒DNA聚合酶上204號位 點上的M氨基酸轉變為I氨基酸或是V氨基酸，或是180號位點上的L氨基酸轉變 為M氨基酸。由于突變使得DNA聚合酶的空間結構發生變化，從而病毒DNA聚合 酶逃過藥物的作用。本發明者用LDR-PCR聯合反應檢測乙肝病毒上這兩點的突變。
取乙肝病毒的基因組DNA。針對乙肝病毒DNA聚合酶基因的兩個位點的堿基 多態性設計連接酶反應的連接探針分別為
pol-M204I區分探針 5' GrC4爿C04 GGrGCCL4 atacgactcactataCCCCC AATACC AC ATC AACC (SEQ ID NO: 18)
5' GrCWCZ4 04 CG^ GGrGCCtaaccctcactaaaCCCCCAATACC AC ATC AAC A (SEQ ID NO: 19)
5 ， GrC" rCZ4 GGrGCCattgcgtacctcatCCCCC AATACC AC ATC AACG
(SEQ ID NO: 20)
pol-M204I通用探針
5， P04-ATATAACTGAAAGCCAAACAGTGGrGCO4C4C7^CGa4Ga4 (SEQ ID NO: 21)
pol-M204V區分探針
5，GrcX4rCK404C04GGrGCC4atacgactcactataCCCAATACCACATCATGCAT (SEQ ID NO: 22)
5，GrC44rC7^04CG^GG7UCC4taaccctcactaaaCCCAATACCACATCATGCAC (SEQ ID NO: 23)
pol-M204V通用探針
5' P04-ATAACTGAAAGCCAAACAGTGGGrGCO4C4CnGO4GG4m (SEQ ID NO: 24)
pol-L180M區分探針
5' GrCA4rCK4 G^ C04 GGTGCC4atacgactcactataAATGGC ACTAGTAAACTG AG GCAG (SEQ ID NO: 25) 5，<
CAT (SEQ ID NO: 26)
pol-L180M通用探針
5， P04-27)
以上使用的連接酶反應探針中，區分探針3，端為羥基，通用探針5'端為磷酸基 團。區分探針中正體大寫字母的堿基為與模板序列匹配的堿基，小寫字母的堿基為標 簽序列，用于區分兩種連接產物，斜體大寫字母的堿基為擴增引物結合序列。在這些 連接酶反應探針中，序列中間有部分幾個堿基由于堿基的多態性或突變而可能不完全 匹配，但它們并不會影響連接反應的進行，另外，探針中有意加入一個不匹配位點(下 劃線標出)，以提高連接反應的特異性。要檢測的多態性堿基在區分探針的3，端，通 過黑體標記上了。
連接酶反應產物通過以下引物擴增
5，GTCAATCTAGACGAGGTGCC (SEQ ID NO: 28)
5，Cy5-TAATCCTCCGTAGTGTCGCA (SEQ ID NO: 29)
針對連接酶反應的產物設計以下用于陣列化檢測的探針用于檢測識別連接酶反
應產物
pol-M204I陣列識別探針
5， atacgactcactataCCCCAATACCACATC-NH2(SEQ ID NO: 30) 5， taaccctcactaaaCCCCAATACCACATC-NH2 (SEQ ID NO: 31) 5， attgcgtacctcatCCCCCAATACCACATC-NH2(SEQ ID NO: 32) pol-M204V陣列識別探針
5， atacgactcactataCCCAATACCACATCA-NH2(SEQ ID NO: 33) 5， taaccctcactaaaCCCAATACCACATCA-NH2(SEQ ID NO: 34) pol-L180M陣列識別探針
5，atacgactcactataAATGGCACTAGTAAACTG-NH2(SEQ ID NO: 35) 5，taaccctcactaaaAATGGCACTAGTAAACTG-NH2(SEQ ID NO: 36)
各種陣列識別探針分子通過化學連接方法固定在五氧化二鉭的表面。如圖14所 示，在一塊約lmm厚的玻璃片或是透明塑料片1410表面的兩頭分別都刻蝕出一條約 0.5mm寬的光柵1408，光柵周期約700納米，深度約10-20納米。再在整個玻璃表面， 包括光柵部分都鍍上一層約100-200納米厚的五氧化二鉭013205)層1409，形成平面光 波導層。在五氧化二鉭的表面通過靜電相互作用結合上一層多聚(L-賴氨酸)-接枝-聚 乙二醇(PLL-g-PEG)的共聚合物，從而活化其表面(圖10B)。
將乙肝病毒的基因組DNA與連接酶反應探針、PCR擴增引物、酶、反應緩沖液 按以下濃度混合后加到反應艙中
20mMTris-HCl(pH8.0)， 5mMMgC12， 50mMKCl， 10mMDTT， O.lmMdNTP， lmM NAD+;各種連接反應酶探針分別為O.lnM;PCR擴增引物各100nM; 5u Taq DNA 聚合酶；和20uTaqDNA連接酶。
反應在以下的溫度循環中進行96。C2min(變性)；10個如下循環94。C30s(變 性)，65。C2min(連接)；30個如下循環94。C30s(變性)，55°C lmin(引物退火、連接)， 74。C30s(延伸)。
為更詳細的說明此發明，通過圖14和圖15對本發明實施例方法及過程進行說明。 將以上使用的探針(陣列識別探針)1403， 1404， 1507通過DNA陣列的方法，可以固 定在結合有PLL-g-PEG共聚合物的五氧化二鉭(Ta20s)平面光波導層1409， 1509表面 (圖IOB)，并在兩條光柵位置中間。固定探針的鍍有五氧化二鉭平面光波導層的玻璃 片與一樣品槽1401密合形成反應艙。將上面描述的反應液加入并充滿反應艙，整個 反應溫度受到一個加熱溫度控制平臺1405的控制，從而進行以上描述的溫度循環過 程。首先的10個循環的65。C時，由于設計的連接酶探針退火溫度高于引物的退火溫
度，連接酶探針(區分探針和通用探針)與病毒基因組DNA模板結合，在TaqDNA連 接酶作用下主要進行連接酶反應，匹配的連接酶反應探針相連接，生成連接酶反應產 物1510。而后，特別是在后30個循環中，連接酶反應產物1510與引物1503相結合， 在Taq DNA聚合酶1504作用下被指數擴增(雖然連接酶反應探針在DNA聚合酶作用 下也能被延生復制，但它們不會被大量指數擴增，對結果無影響)。同時擴增的連接 產物1502由于引物1503上Cy5的熒光基團標記1501而帶上了 Cy5熒光基團。
隨著反應的進行，連接酶反應產物1510， 1502成指數增長，同時被Cy5熒光基 團標記。在55。C退火反應過程中，擴增的連接酶反應產物1502將與固定的識別探針 1507通過堿基的相互配對而結合。這種結合信號被平面光波導產生的倏逝場1506激 發而被檢測到。即在55。C退火反應進行約一分鐘后，氦氖激光器1406被打開，產生 633納米的激光。激光通過一透鏡組1407，整合成線狀后，以約15度角照射到光柵 1408，通過光柵后偶合進五氧化二鉭1409層，形成平面波導，并在五氧化二鉅表面 產生的倏逝場。
有些識別探針分子因為對應的連接酶反應產物被擴增而與之雜交上1507，倏逝 場激發雜交上的連接酶反應產物上的Cy5熒光基團1505，使它產生約665納米的發 射波長1504，此發射波長通過一 670納米的濾鏡1411后，被CCD(1412)接收，從而 可檢測到各探針點位置上的熒光信號強度1511。陣列上各點的信號大小不一(圖16A)， 對應于各突變體的量的不一樣。隨著擴增反應多個循環進行，陣列上各點的信號值隨 之增大，當某一點的信號值達到一域值，即擴增反應開始時信號值的3倍(圖16B)， 記錄這時的循環數為探針編號)。根據各個探針的Cti而定量個突變體的量。
實施例3
作為實施例3，對適用本發明的核酸檢測方法，以連接酶鏈反應定量分析p53基 因突變為例進行說明。
在此實例中，針對人的p53基因第4外顯子上第72個編碼子位點的突變檢測， 設計以下連接酶鏈反應的探針
正向區分探針
5， P04-GCGTGGCCCCTGCACCAGatacgactctg (SEQ ID NO: 37) 5， P04-CCGTGGCCCCTGCACCAGtaactcgtcac (SEQ ID NO: 38)
正向通用探針
5'TAMRA-CCCAGAATGCCAGAGGCTGCTC (SEQ ID NO: 39)
反向區分探針
5， P04-CGGGGAGCAGCCTCTGGCA (SEQ ID NO: 40) 5， P04-GGGGGAGCAGCCTCTGGCA (SEQ ID NO: 41)
反向通用探針
5'AGCTGCTGGTGCAGGGGCC (SEQ ID NO: 42)
以上使用的連接酶反應探針中，通用探針3'端為羥基，區分探針5'端為磷酸基 團，正向通用探針5'端用TAMRA熒光基團標記。區分探針中正體大寫字母的堿基為 與模板序列匹配的堿基，小寫字母的堿基為標簽序列，用于區分兩種連接產物。另外， 探針與模板結合后連接位點處有3-4個堿基的缺口 ，它們可以通過DNA聚合酶補平 后連接，能提高連接反應的特異性。要檢測的多態性堿基在區分探針的5'端(黑體標 記)。
另外，設計FAM熒光標記的固定識別探針如下
5，NH2-CAGAGTCGTAT1CGCTGGTGCGAGGGCCACGCAGGGAG-FAM (SEQ ID NO: 43)
5 ，NH2-GTGACGAGTTA1CGCTGGTGCGAGGGCCACGGAGGGAG-FAM (SEQ ID NO: 44)
在以上的識別探針中有意加入幾個突變的堿基，目的只是為了使識別探針能更特 異的識別兩種連接產物，而幾乎不與未連接反應探針結合，減少未連接探針的競爭結 合。有意加入的突變堿基用下劃線標出，p53基因突變點用黑體標出。
為更詳細的說明此發明，通過圖17和圖18對本發明實施例方法及過程進行說明。 如圖，將上述各種識別探針1701， 1702， 1804用FAM熒光基團1803， 1806標記上 后，通過化學連接(如實施例1所述)固定在玻璃載體1703， 1807表面，載體可以是金 屬，陶瓷，聚合物材料等任何固體材料上。固定探針的玻璃與一樣品槽1705密合形 成反應艙。取待測樣品的cDNA，與連接酶鏈式反應液1704加入并充滿整個反應艙， 反應液包括20mM Tris-HCl(pH 8.0)， 5mMMgC12, 50mMKCl， 10mMDTT， O.OlmM dNTP， lmMNAD+;各種連接反應酶探針分別為100nM; luTflDNA聚合酶；和50u TaqDNA連接酶。整個反應溫度受到一個加熱溫度控制平臺1711的控制，從而進行 多個循環擴增，包括目標基因片段的反復變性(>90°<:)，退火和連銜65。C)的過程。反 應溫度控制程序為96。C2min(變性)；IO個如下循環，94。C30s(變性)，65。C2min(退 火、補平、連接)；30個如下循環:90。C15s(變性)，65。C2min(退火、補平、連接)
連接酶鏈反應在連接酶1801的作用下，產生的連接產物片段1810因為TAMRA 標記的連接反應探針1809而帶上了TAMRA熒光基團1811，并呈指數擴增。在退火 和連接過程中，連接酶反應產物1805與固定的探針1804通過堿基之間的相互配對而 結合。在退火連接過程進行約2分鐘后，氬離子激光器1708被打開，產生488納米 的激光。激光通過一透鏡組1707，照射在固體載體表面固定的探針區域。樣品中含 有的靶DNA序列的連接反應產物1805被連接擴增標記上TAMRA熒光基團后，與 對應的探針分子1804相雜交結合。488納米的激光激發探針分子上的FAM基團1803
而產生520納米的發射波長，它被結合上的擴增DNA上的TAMRA基團1802所吸 收1808， TAMRA基團產生590納米的發射波長而呈紅色1802。
如果在樣品中沒有的對應的基因變異，相應的連接產物將不會被擴增，其對應的 識別探針分子1806不結合上有TAMRA基團的分子，被激發后，產生528納米的藍 光1806。另外，溶液中的含有TAMRA基團1811的連接探針1809和被連接擴增而 未雜交上的的DNA分子1810將不被激發。CCD(1710)通過一中心波長為600納米的 濾鏡1709后被檢測成相1812，由于雜交上的探針分子1804發出的590納米的紅光 能夠透過600納米的濾鏡，而沒被雜交上的探針分子1806發出的518納米的藍光， 被散射的488納米的激光都不能透過。因此，CCD成像的各探針點位置上的信號強 度，即為雜交上的DNA的量，其對應于相應的p53基因擴增產物的量(圖19A)。
隨著擴增反應多個循環進行，陣列上各點的信號值隨之增大(圖19A)，當某一點 的信號值達到一域值，即擴增反應開始時信號值的3倍，記錄這時的循環數CUi為探 針編號)(圖19B)。根據各個探針的C、而能定量p53基因正常和突變cDNA的相對拷 貝數。由于每種模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，而且起始 拷貝數越多，Ct值越小，因此，根據Ct值可以推算出目標基因片段正常和突變體的 相對拷貝數。
盡管本發明描述了具體的例子，但不可能羅列所有形式。本發明中的實例雖然都 只使用一種熒光分子標記，但很顯然多種熒光分子標記同樣適用于本發明。特別是在 實例中連接酶反應的探針分子都是采用一些標簽序列來區分不同的連接產物，本發明 者也能使用不同的熒光分子來區分不同的連接產物，例如不同突變或多態性靶序列生 成的連接產物帶上不同的熒光分子，通常這些熒光分子的發射波長不同，通過濾鏡可 以將它們區分開，這樣在檢測探針上不同波長的熒光信號將代表不同突變或多態性靶 序列的存在和量。
另外，在實例中雖然列舉的都是檢測基因的突變和多態性分析，但很明顯，這一 發明還能推廣應用于各種不同核酸序列存在的檢測，而不單單是針對于一個或幾個堿 基變化的檢測。由于連接酶反應不單是針對連接位點上堿基變化敏感，如果設計連接 酶反應探針與模板序列匹配或不匹配，將決定連接酶反應探針與目標模板能否結合， 它也就能敏感的反映出能否擴增出連接產物。基于此原理，此發明也能平行的檢測多 個基因的存在和量，且這多個基因可以是在不同的基因片段上。
總之，本發明中，使用的引物和探針設計靈活性很強，標記的方案也靈活多樣， 但是有一點對于本領域技術人員來說是明顯的，即在不脫離本發明的精神和范圍的前 提下可對本發明作各種變化和改動。因此，所附權利要求覆蓋了所有這些在本發明范
圍內的變動。本文引用的所有出版物、專利和專利申請均納入本文作參考。
序列表 <110>張露
〈120〉 一種平行的多位點基因型實時定量檢測技術
<130〉 063320
<160> 44
<170〉 Patentln version 3. 3
<210〉 1
<2il> 22
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<220〉
<221〉 misc一feature
<223〉 引物
〈400〉 1
ggcaggtctc agccactgct cg 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221〉 raisc—feature
<223> 引物—
<400〉 2
cgcaggtcag gacccctcat ccc 23
<210> 3
<211〉 34
<212> 腿
<213> 人工序列
<220>
<221> misc一feature
<223> 探針
〈400〉 3
atacgactca ctatactgga tagagcagga gggg
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
〈220〉
〈221> misc—feature
<223> 探針
<400〉 4
taaccctcac taaactggat柳gcaggag ggt
<210> 5
<211> 19
<212> DNA <213>人工序列
34
33
<220>
<221> raise—feature
<223> 探針
<400> 5
ccggagtatt gggaccagg 19
〈210〉 6
<211〉 34
<212〉 腿
<213〉 人工序列
<220>
<221> misc一feature
<223> 探針
<400> 6
atacgactca ctatatggca ggagacacgg aata
34
<210>7
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220〉
<221>misc feature
<223>探針_
<400>7
ttaaccctca ct站atggca<210〉8
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc feature
<223>探針—
<400>8
tgaaggccca ctcacagac<210>9
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc feature
<223>探針—
<400>9
acgact,cact ataggaaggc<210>10
<211>34
<212>腿
<213>人工序列
<220>
<221>misc feature
<223>探針—
<400>10
aaccctcact aaaggaaggc<210>11
<211〉16
<212>DNA
<213>人工序列
<220〉
<221>misc feature
<223〉探針—
<400>11
accgagcgaa cctggg<210>12
<211>28
<212>腿
<213〉人工序列
<220>
<221>raise feature
<223>探針—
34
19
34
34
16
<400> 12
ctgctctatc cagtatagtg agtcgtat
28
<210> 13 <211> 27
<212> 腿 <213>人工序列
<220>
<221> misc—feature
<223> 探針
<400〉 13
ctgctctatc cagtttagtg agggtta 27
<210>14
<211>26
<212>瞧
<213>人工序列
<220>
<221>raise featur'
<223>探針_
<400〉14
gtctcctgcc eLtatagtgag tcgtat 26
<210>15
<211>26
〈212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221〉misc feature
<223>探針一
<400〉15
gtctcctgcc atttagtgag i<210>16
〈211〉24
<212>DNA
〈213>人工序列
<220>
<221>misc feature
<223>探針一
<400>16
gtgggccttc ctatagtgag<210〉17
〈211〉24
<212〉腿
<213〉人工序列
<220>
<221>misc feature
<223>探針—
〈400>17
gtgggccttc ctttagtgag<210>18
<211>56
<212>腿
<213>人工序列
〈220〉
<221〉misc feature
<223〉探針—
<400>18
gtcaatctag acgaggtgcc<210>19
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
26
24
24
56
<220>
<221〉 misc—feature <223> 探針
<400> 19
gtcaatctag acgaggtgcc taaccctcac taaaccccca ataccacatc aaca 54
<210> 20
<211〉 54
<212> DNA
〈213> 人工序列
<220>
〈221〉 misc—feature <223> 探針
< 20
gtcaatctag acgaggtgcc attgcgtacc tcatccccca ataccacatc aacg 54
<210>21
<211〉44
<212>DNA
<213>人工序列
<220〉
<221>misc feature
<223>探針_
<400>21
atataactga aagccaaaca gtggtgcgac actacggagg atta 44
<210〉 22
<211〉 56
<212> 瞧
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature <223〉 探針
<400> 22
gtcaatctag acgaggtgcc aatacgactc actataccca ataccacatc atgcat 56
<210>23
<211〉55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221〉raise feature
<223>探針_
<400〉23
gtcaatctag acgaggtgcc ataaccctca ctaaacccaa taccacatca tgcac 55
〈210〉24
<211>43
<212〉DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc feature
<223>探針_
<400〉24
ataactgaaa gecaaacagt gggtgcgaca etaeggagga tta 43
<210>25
<211>60
<212>DNA
<213〉人工序列
〈220〉
<221>misc feature
<223>探針_
<400>25
gtcaatctag acgaggtgcc aatacgactc actataaatg gcactagtaa actgaggcag 60
<210> 26
<211> 59
<212> DNA <213>人工序列<220〉
<221>raise feature
<223>探針—
<400>26
gtcaatctag acgaggtgcc<210>27
<211>39
<212>瞧
〈213〉人工序列
<220>
〈221>misc feature
<223>探針—
<400〉27
g柳aacggg ctgaggccct<210〉28
<211>20
<212>腿
<213〉人工序列
〈220〉
<221〉misc feature
<223>探針—
<400>28
gtcaatctag acgaggtgcc<210〉29
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220〉
<221>misc feature
<223〉探針—
<400>29
taatcctccg tagtgtcgca<210>30
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc feature
<223>探針—
<400>30
atacgactca ctatacccca〈210>31
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc feature
<223>探針_
<400>31
taaccctcac taaaccccaa<210>32
<211>30
<212>DNA
<213〉人工序列
<220>
<221>misc feature
<223>探針—
59
39
20
20
30
29
<400> 32
attgegtace tcatccccca ataccacatc 30 〈210> 33
<211> 30
<212> DNA <213>人工序列
<220〉
<221> misc—feature <223>探針—
<400> 33
atacgactca ctatacccaa taccacatca
<210> 34
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc—feature
<223> 探針
30
<400> 34
taaccctcac taaacccaat accacatca
29
〈210〉 35
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc一feature
<223> 探針—
<400> 35
atacgactca ctataaatgg cactagtaaa ctg
<210> 36
<211〉 32
<212〉 DNA
<213> 人工序列
33
〈220〉
<221〉 misc—feature
<223> 探針
<400〉 36
taaccctcac taaaaatggc actagtaaac tg
<210> 37
<211> 29
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc—feature
<223> 探針—
<衡 37
gcgtggcccc tgcaccagat acgactctg
<210> 38
<211> 29
<212> DNA
<213〉 人工序列
32
29
<220〉
<221> misc—feature
<223> 探針
<400〉 38
ccgtggcccc tgcaccagta actcgtcac
<210> 39
<211〉 22
<212> DNA <213>人工序列
〈220〉
29
<221>misc feature
<223>探針—
< 39
cccagaatgc cagaggctgc<210>40
<211>19
<212>腿
<213〉人工序列
<220〉
<221>misc feature
<223>探針—
<400>40
cggggagcag cctctggca<210>41
<211〉19
<212〉DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc feature
<223〉探針—
<400>41
gggggagcag cctctggca<210>42
<211>19
<212>DNA
<213〉人工序列
<220>
<221〉misc feature
<223〉探針—
<400〉42
agctgctggt gcaggggcc<210>43
<211>38
<212〉DNA
<213>人工序列
〈220〉
<221>misc feature
<223>探針—
〈400〉43
cagagtcgta ttcgctggtg<210>44
<211〉38
<212>腿
<213〉人工序列
<220>
<221>misc feature
<223>探針一
<400〉44
22
19
19
19
38
gtgacgagtt atcgctggtg cgagggccac ggagggag 38
權利要求
1.一種平行測定樣品中多種核酸分子的存在或量的方法，該方法包括以下步驟a)提供一樣品，所述樣品中包含待檢測的核酸分子；b)對所述核酸分子進行核酸連接酶反應，得到經熒光基團標記的連接產物；c)提供一固相載體，所述載體表面不同的位置固定了多種識別核酸探針分子；d)使所述識別核酸探針分子與所述樣品液相接觸，從而使所述經熒光基團標記的連接產物與所述識別核酸探針分子結合；e)用激發光源在固相載體與液體界面處產生倏逝場，使得與所述探針分子結合的所述連接產物上的熒光基團被激發產生熒光信號；f)檢測所述熒光信號的位置和強度，從而確定樣品中多種核酸分子的存在或量。
2. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，在所述步驟b)中，所述核酸連接酶 反應包括使用探針對和DNA連接酶，所述探針對覆蓋所述待檢測的核酸分子，所述探針對中的一個探針被熒光基團標記，另一個探針與所述識別核酸探針分子特異性結 合，反應至少包括核酸變性、核酸連接的步驟。
3. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，在所述步驟b)中，通過使用有熒光 基團標記的脫氧核苷三磷酸、有熒光基團標記的寡核苷酸、或其組合使連接產物被熒 光基團標記。
4. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述固相載體選自玻璃、尼龍膜、 石英、陶瓷、金屬、塑料或有機聚合物；所述識別核酸探針分子通過化學鍵連接、物 理吸附、聚合物包埋、蝕刻或粘聯的方式固定在載體表面；
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相載體上鍍有小于1000納米厚的金屬膜，或者直徑小于1000納米的金屬顆粒，其中所述金屬選自金、銀、銅。
6. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，步驟b)中還包括聯合應用聚合酶鏈 反應進行擴增。
7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述倏逝場是通過在所述固相載體 內發生的光的全反射，或者通過平面波導產生的。
8. —種平行測定樣品中多種核酸分子的存在或量的方法，該方法包括以下步驟-a) 提供一樣品，所述樣品中包含待檢測的核酸分子；b) 對所述核酸分子進行核酸連接酶反應，得到經第一熒光基團標記的連接產物;c) 提供一固相載體，所述載體表面不同的位置固定了多種識別核酸探針分子，所述識別核酸探針分子上結合有第二熒光基團，其中所述第二熒光基團的發射譜與所述第一熒光基團的激發譜重疊，或所述第一熒光基團的發射譜與所述第二熒光基團的 激發譜重疊；d) 使所述識別核酸探針分子與所述樣品液相接觸，從而使所述經第一熒光基團 標記的連接產物與所述識別核酸探針分子相互結合；e) 用光激發所述第一熒光基團和所述第二熒光基團中的一個；f) 檢測所述第一熒光基團和所述第二熒光基團中的另一個的信號發射的熒光位 置和強度，從而確定樣品中多種核酸分子的存在或量。
9. 如權利要求8所述的方法，其特征在于，在所述步驟b)中，所述核酸連接酶 反應包括使用探針對和DNA連接酶，所述探針對覆蓋所述待檢測的核酸分子，所述 探針對中的一個探針被熒光基團標記，另一個探針與所述識別核酸探針分子特異性結 合，反應至少包括核酸變性、核酸連接的步驟。
10. 如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一熒光基團和第二熒光基團 在相距1-10納米時， 一個熒光基團能吸收另一熒光基團發射光的能量而被激發。
全文摘要
本發明提供了通過一步反應平行對多個位點的基因型進行擴增檢測并實時定量分析的方法。該方法通過連接酶反應生成多種不同核酸連接產物，并標記上熒光基團。反應與熒光標記的同時，熒光標記產物與固相陣列化的探針相結合，通過光的全反射或是平面波導所引起的倏逝場激發，或是通過熒光共振能量轉換來激發熒光基團，實時檢測多種連接酶反應產物。本發明的方法操作簡便快速，能對多個核酸片段上少至單個堿基的變化進行定量檢測，同時檢測的目標分子通量高。
文檔編號C12Q1/68GK101097204SQ200610028239
公開日2008年1月2日 申請日期2006年6月28日 優先權日2006年6月28日
發明者露 張 申請人:露 張