專利名稱：：Sirt1在預防、控制或治療肥胖中的用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物技術和醫藥領域，具體涉及一種新的可作為預防、控制或治療肥胖的耙點的蛋白。
背景技術：
：目前肥胖的發病率正在逐年增加，據統計全球目前有3億人患肥胖癥，13億人超重。肥胖是體內脂肪堆積過多和/或分布異常的一種狀態。1997年，世界衛生組織(WHO)將肥胖明確宣布為一種疾病。肥胖癥作為一種全身內分泌代謝疾病，不但影響體態和活動，而且與高脂血癥、動脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病、癌癥、痛風、脂肪肝、內分泌失調、肺泡低換氣綜合征、膽囊炎等密切相關，以及抵抗力低下而易感染，故有損健康和有礙延壽。一般來說，能量的獲得大于消耗時促進發胖。體內有許多調節機制促進進食與產熱，進而調節體脂量，使人們保持正常體重。當這些調節機制異常時，能量平衡狀態被打破，導致肥胖發生。經過研究目前有近200個肥胖相關基因被發現。所述的機制主要包括以下幾個方面①主要作用于下丘腦的生物因子:神經內分泌遞質神經肽Y(NPY)、阿片促黑激素皮質素原(POMC)、黑色素細胞刺激素(a-MSH)、AgRP、增食因子(orexin)、5-羥色胺、腸道分泌的腦腸肽，脂肪細胞分泌的痩素等；交感神經、下丘腦-垂體-腎上腺軸等反饋機制均能調節機體能量平衡。②主要作用于外周脂肪細胞的調節因子有腫瘤壞死因子a、解偶聯蛋白(UCP)、還可通過激活或抑制脂肪細胞上的e3-腎上腺素受體和過氧化物酶增殖物激活受體Y(PPAR-Y)及其轉錄共激活因子(PGC-1)調節體脂目前開發的減肥藥物分為三大類抑制食欲的藥物、增加能量消耗的藥物和抑制腸道消化吸收的藥物。減肥西藥的研究集中在腎上腺素能藥物，該藥物直接作用于中樞神經系統(CNS)，起到抑制食欲減少攝食的作用；5-羥色胺受體激動劑，這類藥物作用于CNS的5-羥色胺受體，增加飽腹感而起到抑制食欲的作用；單胺再攝取抑制劑，西部曲明是該類藥物的代表，它能減少攝食，增加產熱；脂酶抑制劑，奧利司他是該類藥物的代表，它能抑制胰腺和胃腸中的羧基脂酶及磷脂酶A2活性，從而抑制腸道對脂肪的吸收，降低體內脂肪儲存而減輕體重。然而，目前市場上很多減肥藥物在藥物療效和安全性方面還無法保證。目前對減肥藥的開發主要集中在干擾中樞神經系統的正常通路，因而極易引起副作用。因此，需要尋找新的減肥作用靶點，最好是通過直接作用于脂肪細胞因子來實現減肥。目前鑒于PfAR激動劑的研究開發也是減肥藥篩選的新思路，開發了AD9677、CP-331、679等二十余種藥物，它們對P3-AR具有高度選擇性，在動物模型中效果肯定。另外，多酚類物質減肥作用的研究也小有成果，現已經開發出減肥保健品茶多酚(EGCG)。研究發現，長期服用茶多酚(4g/d)不僅可以減少體內脂肪的積累，而且對促進肝臟中脂質的代謝都有促進作用。但其缺點是作用時間長。綜上所述，現在仍然缺少一種理想的減肥作用靶點以及針對該靶點的有效的、作用時間短、安全性好的減肥藥物。
發明內容本發明的目的在于提供白藜蘆醇的用途，用于提高脂肪組織或脂肪細胞中Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-l蛋白的表達量。本發明的另一目的在于提供一種組合物，所述的組合物含有有效量的白藜蘆醇，以及食品學或藥學上可接受的載體。本發明的另一目的在于提供Sii"tl基因或蛋白的用途，用于制備減肥的食物或藥物；或篩選減肥的食物或藥物。在本發明的第一方面，提供白藜蘆醇的用途，用于制備提高Sirtl蛋白、PGOl蛋白、或UCP-1蛋白的表達量的組合物。在本發明的一個優選例中，所述的組合物同時提高Sirtl蛋白、PGC-l蛋白、和UCP-1蛋白的表達量。在本發明的另一優選例中，所述的表達量的提高為比正常表達量提高10%;更優選的，比正常表達量提高20%;進一步優選的，比正常表達量提高30%;最優選的，比正常表達量提高50%或更高。在本發明的另一優選例中，所述的組合物含有0.01—49.9mg白藜蘆醇/劑。在本發明的第二方面，提供一種組合物，所述的組合物含有有效量的白藜蘆醇，以及食品學或藥學上可接受的載體。在本發明的另一優選例中，所述的組合物為單元劑型，含有白藜蘆醇0.01—49.9mg/劑。在本發明的另一優選例中，所述的組合物的劑型為口服制劑，更佳地為顆粒劑、膠囊、片劑、粉末劑、口服液、混懸液、或乳劑。在本發明的另一優選例中，所述的藥學上或食品上學可接受的載體或賦形劑選自填充劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、泡騰劑、矯味劑、包覆材料、膳食制品、或緩/控釋劑。在本發明的另一優選例中，含有白藜蘆醇0.01-4.9mg/劑；更優選的，含有白藜蘆醇0.05—4.0mg/劑；進一步優選的，含有白藜蘆醇0.1—3.0mg/劑；最優選的，含有白藜蘆醇0.2—2.0mg/劑；比如，可含有白藜蘆醇0.5mg/劑，0.8mg/劑，1.0mg/劑，1.5mg/劑，1.8mg/劑，或2.0mg/劑。在本發明的另一優選例中，含有白藜蘆醇6-49.9mg/劑；更優選的，含有白藜蘆醇8—45mg/劑；進一步優選的，含有白藜蘆醇12—35mg/劑；進一步更優選的，含有白藜蘆醇15—30mg/劑；最優選的，含有白藜蘆醇18—25mg/劑；比如，可含有白藜蘆醇20mg/劑，22mg/齊IJ，24mg/劑，或25mg/劑。在本發明的另一優選例中，每天服用1劑、2劑、或3劑本發明組合物。在本發明的第三方面，提供所述的組合物的用途，其特征在于，用于提高Sirtl蛋白、PGC-l蛋白、或UCP-l蛋白的表達量。在本發明的另一優選例中，所述的組合物用于同時提高Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、和UCP-1蛋白的表達量。在本發明的第四方面，提供一種減肥的方法，給予受試者有效量的白藜蘆醇。在本發明的另一優選例中，給予受試者0.01—49.9mg/劑的白藜蘆醇。在本發明的第五方面，提供一種Sirtl基因或蛋白的用途，用于(i)制備預防、控制或治療肥胖或肥胖相關疾病的食物或藥物；或(ii)篩選預防、控制或治療肥胖或肥胖相關疾病的食物或藥物。在本發明的另一優選例中，所述的肥胖相關疾病包括但不限于體內脂肪積累導致的疾病、糖尿病、脂肪肝、肝臟肥大、脂質代謝異常等。在本發明的第六方面，提供一種篩選增加Sirtl蛋白表達的物質(進而作為減肥候選物質)方法，包括步驟(a)在測試組中，向表達Sirtl蛋白的體系中添加待篩選的候選物，并檢測Sirtl蛋白的表達情況；(b)將步驟(a)測試組中Sirtl蛋白的表達情況與添加所述候選物的對照組中Sirtl蛋白的表達情況進行比較，如果測試組中Sirtl蛋白的表達在統計學上多于(優選明顯多于，比如多10%,更優選地多20%，最優選的多30%或更多)對照組，就表明該候選物是增加Sirtl蛋白表達的物質。在本發明的另一優選例中，所述的表達Sirtl蛋白的體系為細胞，動物模型、或溶液體系。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖1顯示了白藜蘆醇(RV)對小鼠體重的影響。其中，低脂表示低脂肪詞料對照組；高脂表示高脂肪飼料對照組；RV(L)表示白藜蘆醇給藥濃度為2.5mg/kg/d;RV(H)表示白藜蘆醇給藥濃度為25mg/kg/d。圖2顯示了高脂組小鼠與高脂+低劑量白藜蘆醇組小鼠的對比照片。圖3顯示了HPLC檢測反式或順式白藜蘆醇含量示意圖，并且隨著天數的不同而不同。圖4顯示了低劑量和高劑量的反式白藜蘆醇含量的量化統計比較。圖5顯示了低脂組、高脂組、高脂低劑量白藜蘆醇組和高脂高劑量白藜蘆醇組小鼠體內脂肪含量的變化。圖6顯示了低脂組、高脂組、高脂低劑量白藜蘆醇組和高脂高劑量白藜蘆醇組小鼠體內脂肪率的變化。圖7顯示了高脂組、高脂低劑量白藜蘆醇組小鼠的腹部解剖圖，可見高脂低劑量白藜蘆醇組小鼠的白色脂肪組織明顯比高脂對照組有明顯減少。圖8顯示了在高倍鏡(X200)下觀察褐色脂肪(BAT)切片，可見高脂白藜蘆醇干預組小鼠脂肪細胞比高脂組明顯變小。圖9顯示了在高倍鏡(X200)下觀察腹部脂肪(IWAT)切片，顯示高脂且白藜蘆醇干預組小鼠的脂肪細胞比高脂組明顯變小。圖IO顯示了在高倍鏡(X200)下觀察附睪脂肪(EWAT)切片，顯示高脂且白藜盧醇干預組小鼠的脂肪細胞比高脂組明顯變小。圖ll顯示了低脂組、高脂組、高脂低劑量白藜蘆醇組和高脂高劑量白藜蘆醇組小鼠能量攝入量的比較。圖12顯示了正常狀態下低脂組、高脂組、高脂低劑量白藜蘆醇組小鼠的體溫變化。圖13顯示了饑餓狀態下低脂組、高脂組、高脂低劑量白藜蘆醇組的小鼠體溫變化。圖14顯示了低脂組、高脂組、高脂低劑量白藜蘆醇組小鼠的褐色脂肪細胞線粒體電鏡圖(X8400倍)。圖15顯示了低脂組、高脂組、高脂低劑量白藜蘆醇組小鼠的白色脂肪細胞線粒體電鏡圖(X8400倍)。圖16顯示了低脂組、高脂組、高脂低劑量白藜蘆醇組小鼠的褐色脂肪線粒體面積統計。圖17顯示了低脂組、高脂組、高脂低劑量白藜盧醇組小鼠的白色脂肪線粒體面積統計。圖18顯示了小鼠脂肪組織中，SIRT1、PGC-1、PTP-1B和UCP1蛋白的表達情況。圖19顯示了低脂組、高脂組、高脂低劑量白藜蘆醇組、高脂高劑量白藜蘆醇組小鼠的脂肪組織中，SIRT1、PGC-1、PTP-1B和UCP1蛋白的灰度的統計。圖20顯示了3T3-L1細胞中，SIRT1、PGC-l蛋白的變化。圖21顯示了原代脂肪細胞中，SIRT1、PGC-1蛋白的變化。具體實施例方式本發明人經過廣泛的研究，發現白藜蘆醇能夠顯著地提高脂肪組織或脂肪細胞中Sirtl(sirtuin1)蛋白、過氧化物酶體增殖物激活受體Y共激活因子-1(PGC-1)蛋白、和解偶聯蛋白-1(UCP-l蛋白)的表達量。此外，本發明人還首次發現，低劑量的白藜蘆醇就可顯著提高Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-1蛋白的表達量，進而提供良好的減肥效果，并且低劑量的效果明顯好于高劑量。基于此完成了本發明。白黎盧醇(Resveratrol，Res)，化學名稱為芪三酚(3，4，，5，-三羥基芪)，分子式CmH,203，分子量228.25，反式白黎蘆醇(有活性)如式(I)所示，順式白黎蘆醇(無活性)如式(II)所示。目前己知有70多種植物中含有白藜蘆醇，其中在葡萄、花生、桑椹以及中藥虎帳中含量特別豐富。它是一種活性非黃酮類多酚化合物，呈白色針狀晶體，難溶于水，能溶于乙醇、乙酸乙酯，丙酮等極性強的溶劑中；以游離態(順式、反式)和糖苷結合態(順式、反式)兩種形式存在，反式白藜蘆醇在光照條件下容易變成順式白藜蘆醇。因此，可將白藜蘆醇或含有白藜蘆醇的制劑裝在具有避光作用的容器中，比如棕色瓶中。迄今為止的研究表明，白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗氧化、抗心血管疾病、抗細菌、抗炎、抑制血小板凝集、調節免疫、化學預防等作用。白藜蘆醇可以降低血清中膽固醇及甘油三酯的含量。但是，白藜蘆醇的以往的研究集中于降低心血管疾病發病率、抗腫瘤、抗氧化等方面的研究，目前還沒有其關于減肥方面的研究報道。且由于它是一種天然植物中含有的物質，因此安全性高。本發明證實了白藜蘆醇具有良好的減肥效果，因此其可以作為一種安全可靠的減肥制品。在本發明中，對于制備白藜蘆醇的方法沒有特別的限制，比如其可以提取自植物，或者可以采用化學合成的方法來制備。一種優選的方法是從植物中提取白藜蘆醇，所述的植物包括但不限于葡萄、花生、桑椹、或中藥虎杖。為了研究白藜戸醇的減肥效果，本發明人首先利用高脂食物誘導肥胖小鼠，建立肥胖模型。通過給水口服方式用白藜蘆醇對肥胖鼠進行干預。經過喂養后，對給藥組與高脂肪對照組進行外形、體重、生理生化等指標的比較，驗證白藜盧醇的減肥效果。進一步地，本發明人還研究了白藜蘆醇減肥的機制。首先驗證白藜蘆醇干預后的小鼠體重減輕的部位為脂肪組織，之后在能量攝入和能量消耗兩方面進行了減肥效果的研究。排除了減肥作用是由于抑制食欲而引發后，進一步通過檢測體溫的變化，發現給藥后的小鼠產熱增加。繼而通過檢測脂肪組織中產能細胞器線粒體的增加、生熱相關蛋白的變化進一步驗證了小鼠產熱確實有所增加。根據上述試驗結果證實白藜蘆醇通過促進脂肪組織中Sirtl、PGC-1、UCP1蛋白表達，提高小鼠產熱，加快能量消耗，提高脂肪代謝率，從而達到減肥的效果。因此，本發明提供了白藜蘆醇的用途，用于提高脂肪組織或脂肪細胞中Sirtl蛋白、PGC-l蛋白、或UCP-l蛋白的表達量。本發明人首次發現，白藜蘆醇可以提高脂肪組織或脂肪細胞中Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-1蛋白的表達量。而Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-1蛋白是脂肪代謝相關的蛋白，因此，白藜蘆醇可通過提高這些蛋白的表達來促進脂肪的代謝，從而達到減肥的目的。在本發明的一種優選方式中，白藜蘆醇能夠同時提高Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、和UCP-l蛋白的表達量。在本發明的一種優選方式中，白藜蘆醇通過提高Sirtl蛋白的表達，從而增加了PGOl蛋白的表達，從而引起動物產熱增加，達到減肥的效果。本發明還提供了一種組合物，所述的組合物含有有效量的白藜蘆醇，以及食品學或藥學上可接受的載體。如本文所用，術語"含有"或"包括"包括了"包含"、"基本上由......構成"、和"由......構成"。如本文所用，術語"藥學上可接受的"或"食品學上可接受的"的成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應)的，即有合理的效益/風險比的物質。如本文所用，術語"有效量"是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。如本文所用，術語"藥學上可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟矢口的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到關于藥學上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、泡騰劑、潤濕劑或乳化劑、矯味劑、pH緩沖物質等。本發明的組合物中，白藜蘆醇也可以以"生理學可接受的鹽"或"生理學可接受的酸或堿衍生的鹽"形式使用。此外，還可以使用含有白藜蘆醇的提取物或混合物。如本文所用，術語"本發明的組合物"包括藥物組合物、食物組合物和/或膳食添加劑。如本文所用，術語"單元劑型"是指為了服用方便，將本發明的組合物制備成單次服用所需的劑型，包括但不限于各種固體劑(如片劑)、液體劑、膠囊劑、緩釋劑。所述的單元劑型中含有對于提高Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-l蛋白的表達量有效的本發明的組合物；或者含有對于減肥有效的本發明的組合物。本發明中，當將所述的組合物制備成單元劑型時，含有白藜蘆醇0.01—49.9mg/劑；在本發明的一種優選方式中，含有白藜蘆醇0.01-4.9mg/劑；更優選的，含有白藜蘆醇0.05—4.0mg/劑；進一步優選的，含有白藜戸醇0.1—3.0mg/劑；最優選的，含有白藜蘆醇0.2—2.0mg/劑；比如，可含有白藜蘆醇0.5mg/劑，0.8mg/劑，1.0mg/齊U，1.5mg/劑，1.8mg/劑，或2.0mg/劑。在本發明的另一種優選方式中，所述的單元劑型含有白藜蘆醇6-49.9mg/劑；更優選的，含有白藜蘆醇8—45mg/劑；進一步優選的，含有白藜戸醇12—35mg/劑；進一步更優選的，含有白藜蘆醇15—30mg/劑；最優選的，含有白藜蘆醇18—25mg/劑；比如，可含有白藜蘆醇20mg/劑，22mg/劑，24mg/劑，或25mg/劑。所述的組合物每天服用的劑量在1-5劑為宜；優選的為1劑、2劑、或3劑；最優選的，每天服用的劑量為l劑。上述劑量可根據體重進行適當增減。本發明的組合物可直接用于預防、緩解或治療肥胖，或可與其它藥物或膳食添加劑共同使用。本發明還提供了一種Sirtl基因或蛋白的用途，用于制備減肥的食物或藥物；或篩選減肥的食物或藥物。在本發明的一種方式中，可釆用通過基因工程手段制備的重組的Sirtl基因或蛋白。本發明也可采用經修飾或改良的Sirtl基因或蛋白，比如，可采用為了促進其半衰期、有效性、代謝、和/或蛋白的效力而加以修飾或改良的Sirtl蛋白。所述經過修飾或改良的Sirtl蛋白可以是一種共軛物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述經過修飾或改良的Sirtl蛋白可以是與天然存在的Sirtl蛋白具有較小的共同點，但也能預防、控制或治療哺乳動物的肥胖，且不會帶來其它不良影響或毒性。也就是說，任何不影響Sirtl基因或蛋白的生物活性的變化形式都可用于本發明中。在本發明一種方式中，可將所述的Sirtl蛋白直接給藥于哺乳動物(比如人)，或者，可將編碼Sirtl蛋白的基因通過常規的方法克隆到適當的載體中，將所述的載體導入到可表達所述Sirtl蛋白的細胞中，使所述的細胞表達Sirtl蛋白。優選的，可將編碼Sirtl蛋白的基因或攜帶所述基因的載體通過常規的方法引入到靶細胞中實現Sirtl蛋白的表達。所述的靶細胞包括但不限于脂肪細胞、前脂細胞等。由于本發明人第一次將Sirtl蛋白表達的升高與肥胖相關聯，因此，本發明還提供了一種篩選增加Sirtl蛋白表達的物質方法，即建立Sirtl蛋白表達系統，在該系統中加入候選物質，判斷候選物質對于Sirtl蛋白表達量的影響。如果Sirtl蛋白的表達在統計學上多于對照組，就表明該候選物是增加Sirtl蛋白表達的物質。所述物質可作為一種有潛力的減肥藥物。因此，本發明還包括通過所述篩選方法獲得的增加Sirtl蛋白表達的物質。本發明還提供了一種減肥的方法，給予受試者有效量的白藜蘆醇。在本發明的一種優選方式中，給予受試者白藜蘆醇的量為0.01—4.9mg/60kg體重/天；更優選的，給予受試者白藜蘆醇的量為0.05—4.0mg/60kg體重/天；進一步更優選的，給予受試者白藜蘆醇的量為0.1—3.0mg/60kg體重沃；最優選的，給予受試者白藜蘆醇的量為0.2—2.0mg/60kg體重/天；比如，每劑可給予受試者白藜蘆醇的量為0.5mg/60kg體重/天、0.8mg/60kg體重/天、l.Omg/60kg體重/天、或1.5mg/60kg體重/天。在一天中，可以將所述的量單次給予或多次給予。在本發明的另一種優選方式中，給予受試者白藜蘆醇的量為6—49.9mg/60kg體重/天；更優選的，給予受試者白藜蘆醇的量為8—45mg/60kg體重/天；進一步更優選的，給予受試者白藜蘆醇的量為12—35mg/60kg體重/天；最優選的，給予受試者白藜蘆醇的量為15—30mg/60kg體重/天；比如，每劑可給予受試者白藜蘆醇的量為20mg/60kg體重/天、22mg/60kg體重/天、或24mg/60kg體重/天。在一天中，可以將所述的量單次給予或多次給予。本發明的主要優點在于-(1)首次提出并證實白藜蘆醇可用于減肥，發現低劑量的白藜蘆醇就具有良好的減肥效果，并且低劑量的效果明顯好于高劑量。(2)首次提出SIRT1可以作為預防、控制或治療肥胖的靶蛋白，白藜蘆醇可以上調SIRT1蛋白的表達水平。(3)由于白藜蘆醇是一種非常昂貴的物質，因此，本發明的低劑量的白藜蘆醇大大降低了減肥藥物或減肥食品的成本。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例l白藜蘆醇的配制采用的白藜蘆醇原料購自Sigma公司，商品號R5010。1.配制用于后續試驗的25mg/L白藜蘆醇溶液將25mg白藜戸醇配制于1L的潔凈水中。2.配制用于后續試驗的250mg/L白藜蘆醇溶液將250mg白藜戶醇配制于1L的潔凈水中。3.配制用于人類的白藜盧醇的食物組合物、保健品或藥物組合物。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>采用常規的配制組合物的方法配制上述的白藜蘆醇的食物組合物或藥物組合物。實施例2白藜蘆醇的減肥作用本實施例的目的是要驗證白藜蘆醇的減肥效果，因此本發明人建立了肥胖鼠模型，一般用于實驗研究的肥胖動物模型按照病因主要分為5類遺傳性肥胖、營養性肥胖、缺少活動性肥胖、內分泌性肥胖和下丘腦性肥胖模型。在人類，肥胖患者多為單純性肥胖(約占肥胖人群總數的95%)，而目前所建立的遺傳性肥胖模型如ob/ob，db/db，fa/fa等基因突變的動物模型在人類僅有個例報道，本實施例通過建立營養性肥胖小鼠模型以模擬人類肥胖的主要模式，從而對單純性肥胖的藥物治療進行研究。首先利用高脂食物誘導肥胖小鼠，建立肥胖模型。通過給水口服方式用白藜蘆醇對肥胖鼠進行干預。經過18周喂養后，對給藥組與高脂肪對照組進行外形、體重、生理生化等指標的比較，驗證白藜蘆醇的減肥效果。實驗動物雄性C57BL/6J小鼠，購自中國科學院上海實驗動物中心(斯萊克實驗動物有限公司)。飼料配方低脂肪含量飼料脂肪4.3gm%(10kcal%);高脂肪含量飼料脂肪24gm%(45kcal%)。1.髙脂飲食誘導肥胖小鼠模型的建立32只小鼠按照體重隨機分為四組①低脂對照組8只，平均體重18.65g;②高脂對照組8只，平均體重18.31g;③高脂低濃度給藥組8只，平均體重18.99g;④高脂高濃度給藥組8只，平均體重18.46g。四組小鼠平行飼養。小鼠三周斷奶后進入實驗室，均給予普通飼料。適應環境一周后按照下述給水和喂食方法飼養。低脂對照組給予低脂飼料、潔凈水，能夠自由取食、飲水。高脂對照組及高脂給藥組均給予高脂飼料，高脂對照組的飲水給予潔凈水，高脂低濃度給藥組的飲水給予含白藜蘆醇25mg/L的潔凈水、高脂高濃度給藥組的飲水給予含白藜蘆醇250mg/L的潔凈水。每組動物均可以自由取食、飲水。實驗室溫度2125T:，相對濕度4070%，晝夜比12:12。每周三次投食，記錄投食量和撤食量，每周稱體重一次，并記錄。喂養18周。2.干預用藥白藜蘆醇分子式(:14仏203，購自sigma公司，批號R5010。干預劑量及方法低濃度2.5mg/kg/d，高濃度25mg/kg/d各干預組小鼠將藥物溶于適量純凈水(每只小鼠日攝水量約為3mL)。采用自然飲水口服給藥方法，經過HPLC檢測驗證，兩天換藥一次，可以保持藥效不失活。對照組小鼠僅給予潔凈水。3.動物取血及組織樣品采集實驗前動物禁食12小時，實驗時首先稱量動物體重，測量肛門體溫；依照體重值注射適量戊巴比妥鈉(40mg/kg)，待麻醉后取血lmL/只，血樣離心(14000rpm，10min，4。C)取血清，每份血清各分兩管，一部分用于測量血脂等生化指標，一部分-8(TC保存用于測胰島素含量；之后解剖腹腔，灌注生理鹽水剝離四組小鼠的腹部白色脂肪組織(IWAT)、附睪脂肪組織(EWAT)、褐色脂肪組織(BAT)，生理鹽水沖洗后將各組織塊分為兩份，一份用于冰凍切片的組織固定準備切片，另一份直接液氮速凍后-8(TC保存。4.冰凍切片將所取小塊脂肪組織分別用4y。多聚甲醛(PFA)固定，PBS沖洗后依次用10%、20%、30%濃度的蔗糖溶液脫水，最后經OCT包埋后凍存準備進行切片。切片厚度為5uM，切片后晾干、蘇木精伊紅(HE)染色，每個標本取2-4張切片，在200倍顯微鏡下觀察視野中脂肪細胞的大小。結果1.白藜蘆醇可抑制高脂飲食誘導的小鼠體重增加本實施例參考國內外報道的高脂、高能詞料喂養小鼠(參見Hildebrandt，A.L.等，AntiobesityeffectsofchroniccannabinoidCBlreceptorantagonisttreatmentindiet-inducedobesemice.EuropeanJournalofPharmacology2003.462:125-132;或Chen,L等，Nyomba.GlucoseIntoleranceandResistinExpressioninRatOffspringExposedtoEthanolinUtero:ModulationbyPostnatalHigh-FatDiet.Endocrinology.2003,144:500-508;或Bagnasco,M.等，LeptinExpressionInHypothalamicPvnReversesDietaryObesityAndHyperinsulinemiaButStimulatesGhrelin.ObesRes.2003.11:1463-1470)。按照實驗方法所述飼養18周，得到體重變化曲線如圖l所示。從高脂對照組和高脂低濃度給藥組中各取得體重接近組內平均體重的小鼠拍照，結果如圖2，可以看到外形上的變化。由圖l可以看出，低脂對照和高脂對照組相比，喂養四周后體重有明顯差異，說明模型建立是成功的。而高脂對照組與給藥組相比，喂養10周時低濃度組開始出現顯著性差異(P〈0.05):高脂肪對照組平均體重增加14.83克，低濃度給藥組增加10.63克；此時，高濃度給藥組體重增加12.39克，和高脂肪對照組無明顯差異。低脂對照組中平均體重增加7.71克。高濃度給藥組在喂養14周時開始有顯著性差異高脂肪對照組平均體重增加17.69克，高濃度給藥組體重增加13.79克；此時，低濃度給藥組增加13.50。低脂對照組中平均體重增加7.71克。由此說明，白藜盧醇具有良好的減肥效果，并且低劑量的減肥效果好于高劑量。2.白藜盧醇的給藥方式可以有效減緩其變性白藜蘆醇是一種見光易變性的多酚類化合物，其有效形式為反式結構(trans-resveratrol)，當反式結構的白藜蘆醇受光照10小時后，80%都變性為順式結構(cis-resveratrol)，而順式結構沒有藥力效果。因此，本發明人在實驗中對白藜盧醇的處理方式進行檢測。采用鋁箔包裹裝有含白藜蘆醇的飲用水，然后通過飲用水給藥。本發明人通過HPLC的方法檢測經過避光處理的白藜蘆醇在第2天和第3天的有效成分。結果如圖3，圖4。圖3所示HPLC測定結果表明，在實驗條件下，經過避光處理后的白藜蘆醇可以減緩反式結構變為順式結構的速度。圖4的量化統計發現，白藜蘆醇分別放置2天和3天后，低濃度白藜蘆醇中反式結構的殘余量仍高達97.68%和95.41%，與原液濃度相比沒有顯著性差異；高濃度白藜蘆醇中的殘余量也達到92.06%和74.73%，與原液濃度的比值分別出現顯著性差異，*P<0.05，**P<0.01。由此說明，試驗中對白藜蘆醇的處理是有效的，可以保證實驗的可靠性。3.白藜蘆醇通過抑制脂肪的積累達到防治肥胖的效果本發明人還進一步檢測了小鼠體重減輕是由哪個或哪些組織的重量減輕引起的，以及減少的成份是脂肪、其它器官還是體液。本發明人利用核磁共振儀檢測了活體小鼠體內脂肪含量的變化。結果如圖5，圖6所示。由圖5和圖6可見，與高脂對照組與低脂對照組相比，脂肪含量有顯著性的增加，再次證明實驗中建立的肥胖小鼠模型是可靠的。低濃度給藥組與高脂對照組相比，脂肪含量減少約5g，且有顯著性差異(P〈0.01)。結合圖l顯示體重的變化可以看出，低濃度給藥組的體重變化量較高脂對照組大約也是5g左右。提示白藜蘆醇的體重減輕部位是在脂肪組織，證實了它的減肥效果。圖6所示的脂肪率的變化趨勢與圖5所示的脂肪含量變化趨勢相同。此外，喂養18周后，進行腹部解剖發現，腹部脂肪以及內臟大網膜脂肪都有明顯減少，其他組織器官未見明顯變化，如圖7所示。由圖7可見，低濃度給藥組的白色脂肪組織明顯較高脂對照組有明顯減少，為了進一步確認脂肪細胞是否發生變化，進一步作了白色脂肪組織和褐色脂肪組織的冰凍切片HE染色，高倍鏡(X200倍)下觀察腹部脂肪(IWAT)、附睪脂肪(EWAT)、褐色脂肪(BAT)細胞數目和體積的變化，結果如圖8、圖9、圖10所示。圖8、圖9、圖10中不同組間脂肪細胞的大小和數目存在明顯差異(HEX200)，高脂對照組的大型脂肪細胞數明顯多于低脂對照組，小型及中型細胞少；白藜蘆醇的高、低兩濃度給藥組中觀察到的肥胖小鼠大型脂肪細胞數明顯減少，小型和中型細胞數增加；低濃度變化趨勢與高濃度相同，且比高濃度的變化更顯著。與前面關于脂肪含量測定結果相符。此外，本發明人還采用了比2.5mg/kg/d更低劑量(如1.0mg/kg/d、L5rag/kg/d)的白藜蘆醇試驗肥胖小鼠，結果發現，低劑量的白藜蘆醇具有良好的降脂、減肥的作用。本實施例中，選用斷奶后的C57BL/6J小鼠分別用高脂飼料喂養三組和低脂飼料喂養一組，其中白藜蘆醇(高、低兩種濃度分別采用給水口服的方式)干預其中兩組高脂喂養組。通過十八周的喂養，發現白藜蘆醇干預后可降低肥胖小鼠體重，而通過對脂肪含量的檢測發現，減重的部位就是脂肪組織，且從脂肪細胞的冰凍切片圖可以看出，脂肪細胞大小也有顯著變化。同時，白藜蘆醇干預后對血清總膽固醇、血清低密度脂蛋白等指標均有明顯的影響，以上結果均顯示出白藜盧醇有較好的減肥作用。從實驗結果來看，白藜蘆醇的干預濃度為2.5mg/kg/d或該濃度以下時對于鼠的減肥效果較好。根據一般的換算規律，換算為人用量，則服用藥量為約在0.1-15mg/60kg/d。與以往報道的減肥藥物茶多酚、脂酶抑制劑CT-II等比較而言，白藜戸醇可以通過較少的使用量達到減肥效果(其中，茶多酚(EGCG)減月巴齊lj量為4g/d(JonesJR等，DeletionofPPARgammainadiposetissuesofmiceprotectsagainsthighfatdiet-inducedobesityandinsulinresistance.PNAS.2005，102(17):6207-12);脂酶抑制劑CT-II減肥劑量為50g/d(MYamamoto.Anti-obesityeffectsoflipaseinhibitorCT-II，anextractfromedibleherbs,NomameHerba，onratsfedahigh-fatdiet.Internationaljournalofobesity.2000,24:758-764);大麻的CBl受體抑制劑Rimonabant的減肥劑量為0.5g/d(B.Poirier等，Theanti-obesityeffectofrimonabantisassociatedwithanimprovedserumlipidprofile.Diabetes,obesityandmetabolism.2005,7:65-72))。動物實驗中發現小鼠服用白藜蘆醇后除以上檢測指標變化外，其它表型均未發現不正常，由此證實白藜蘆醇濃度安全性的假設即白藜蘆醇來源于植物中，是一種天然化合物，產生副作用的可能性很低。目前常用的減肥藥副作用較大、治療周期長、減肥效果一般(一般減重不超過體重的5%)而且價格昂貴，所以白藜蘆醇作為一種新型的副作用小、服用劑量低(因而可有效降低成本)的減肥藥，有很廣闊的市場開發前景。試驗中白藜蘆醇干預濃度選用兩種，其中低濃度為在自然狀態下水溶液中的溶解值，高濃度為10倍于低濃度的濃度。從試驗結果上看，低濃度的減肥效果反而優于高濃度，如體重變化、脂肪含量、脂肪細胞大小等。從而證實藥物效果并非濃度越大越好。隨著年齡增加，人類體內的總體脂量及相對脂量增加，肥胖的發病率增高。在本實施例中，從造模開始到小鼠處死共18周，隨著鼠齡的增加，高脂對照組小鼠發生肥胖的趨勢也逐漸增加，因此在肥胖的發病過程中，年齡也是一個不可忽視的因素。白藜蘆醇的干預可以抑制高脂肪飲食誘導產生的肥胖，但隨著鼠齡的增長，體重仍會繼續增加，但增加幅度較高脂肪對照組有明顯減緩。實施例3白藜戸醇減肥機理通過體內和體外試驗對白藜戸醇的減肥機理進行初步研究。肥胖是由于能量攝入與消耗不平衡所導致的，因此本實施例主要集中在白藜蘆醇干預后的小鼠在能量攝入和消耗的變化。通過體內試驗觀察能量攝入、產熱、線粒體變化以及體內體外試驗檢測產能相關蛋白PGC-1和UCP1的變化，結果表明，白藜蘆醇的減肥作用不是通過影響能量攝入，而是通過增加SIRT1、PGC-1或UCP1的表達，進而提高能量消耗而實現的。實驗動物雄性C57BL/6J小鼠32只，3周齡，體重1619克，購自中國科學院上海實驗動物中心(斯萊克實驗動物有限公司)。主要儀器AL104型電子天平，Mettler公司DT-1TB型電子體溫計，上海華辰醫用儀表有限公司LKB-I型超薄切片機，LEICA公司CM-120透射電鏡，PHILIPS公司主要試劑白藜蘆醇購自Sigma公司，商品號R5010一抗Anti-PGC-l(H-300)，購自SANTACRUZ公司，貨號sc-13067Anti-UCP1，購自CHEMICON公司，貨號AB3038Anti-PTP-1B，購自UPSTATE公司，貨號07-088Anti-Sirtl，購自UPSTATE公司，貨號05-707二抗Anti-Mouse、Anti-Rabbit,購自Jackson公司主要方法1.攝能統計每周三次投食，記錄投食量與撤食量以計算攝食量，根據食物熱量含量可換算出攝能量。2.體溫的測定體溫計測量肛溫，測定方法如MasakiT等，Peripheral,butnotcentral,administrationofadiponectinreducesvisceraladiposityandupregulatestheexpressionofuncouplingproteininagoutiyellow(Ay/a)obesemice.Diabetes.2003,52(9):2266-73中的相關方法。3.電鏡觀察線粒體實驗方法參考《細胞試驗指南》，科學出版社，黃培堂等譯(2003)中第1161-1194頁所述的方法。4.Western檢測蛋白含量實驗方法參考《抗體技術實驗指南》，科學出版社，沈關心、龔非力等譯(2002)中第161-184頁所述的方法。結果1.小鼠能量攝入與消耗的檢測(1)白藜戸醇不影響小鼠能量的攝入營養物質能量的吸收、儲存和消耗構成了一個十分復雜的體內平衡系統，從而保持相對恒定的能量儲備和體重。當能量攝入大于能量消耗即產生脂肪堆積，引起肥胖。因此，首先本發明人通過記錄小鼠攝食量，比較四組實驗小鼠的能量攝入情況，見圖11。如圖11所示，實驗觀察小鼠試驗后14周能量攝入情況。通過將14周的攝能累計進行比較，可以看到低脂對照組的攝能量少于高脂飼料喂養的三組。高脂對照組與給藥組相比攝能量幾乎相同。說明給藥干預并未影響小鼠飲食及攝能情況。(2)白藜蘆醇增加小鼠的產熱由于減肥的同時不影響能量攝入，那么必定與增加能量消耗有關。因此實驗繼續對小鼠產熱能力進行了檢測，采用測量體溫的方法測試產熱變化。結果如圖12、圖13所示。圖12中檢測了小鼠在正常狀態下的體溫，柱狀圖可以看出低脂對照組和高脂對照組的體溫相差不大；給藥組體溫較高脂對照組升高約0.8°C，有顯著性變化(P<0.02)。進一步檢測白藜蘆醇干預后對適應性產熱的影響，試驗中將小鼠禁食12小時如圖13所示，檢測體溫發現，四組小鼠的體溫比照正常狀態時均有所下降。其中高脂對照組比低濃度給藥組的體溫大約低rC(P〈0.02)。結果顯示白藜蘆醇干預后小鼠的產熱較對照組有顯著性增加，此外還增加了適應性產熱。提示其減肥作用是通過增加能量消耗產生減肥效果。結合前面發現減肥作用位置在脂肪組織，因此下面試驗觀察小鼠脂肪細胞中提供能量的細胞器一一線粒體的變化。(3)白藜蘆醇干預后小鼠線粒體增多電鏡觀察小鼠白色脂肪和褐色脂肪細胞中線粒體的變化，如圖14、圖15。統計視野中線粒體所占面積比例，作柱狀圖量化線粒體體積的變化，如圖16、圖17所示。從電鏡照片觀察可見，褐色脂肪和白色脂肪在各組間的變化趨勢相同。低脂肪對照組線粒體數目多、總面積大，而高脂對照組的線粒體數目少，總面積小，同時脂滴面積及數目較低脂對照組有明顯增加，與冰凍切片結果相符。低濃度給藥組的線粒體數目比低脂對照組少，但比高脂對照組明顯增多。統計線粒體面積可見，白藜蘆醇低濃度干預后的給藥組，褐色脂肪線粒體的面積較高脂對照組增加一倍(P〈0.05),白色脂肪線粒體面積增加約一倍(P〈0.05)。結果提示，給藥后的小鼠脂肪細胞中的產能細胞器一一線粒體有顯著增加，進一步證明了白藜蘆醇可能增加高脂肪飼養小鼠的產能功能。2.檢測與產能相關蛋白的變化(1)白藜蘆醇促進脂肪組織產能蛋白的表達肥胖從根本上講是能量相對攝入量與能量消耗間平衡失調的結果。造成機體能量失調的原因非常復雜，隨著分子生物學技術的發展，目前已經發現多個與肥胖相關的基因，目前研究熱點集中在PGC-1、UCP1等蛋白。本試驗為進一步探討產能可能的分子機制，檢測了脂肪組織中很多相關蛋白表達。如圖18所示。圖18中用Western檢測四組小鼠脂肪組織中Sirtl、PGC-1、UCP1、PTP-IB蛋白的表達，結果發現，白藜蘆醇干預后Sirtl、PGC-1、UCP1的表達較高脂對照組有升高，統計條帶灰度可以量化比較條帶灰度的變化，如圖19所示Sirtl、PGC-1、UCP1在給藥組的表達較高脂對照組變化P〈0.05。結果提示白藜蘆醇干預后的小鼠可以增加與生熱相關蛋白的表達，這是它的減肥效果通路。即白藜蘆醇通過激活Sirtl，從而增加了PGC-1的表達。PGC-1表達的增加在脂肪組織中可以促進解偶聯蛋白UCP1的表達，從而引起動物產熱增加達到減肥的效果。(2)脂肪細胞中與生熱相關的蛋白變化為在細胞水平上進一步驗證試驗的設想，試驗選用了3T3-L1前體脂肪細胞和原代培養的脂肪細胞，檢測白藜蘆醇刺激后Sirtl、PGC-1的變化，如圖20和圖21所示。如圖所示，3T3-LI前體脂肪細胞和原代培養的脂肪細胞在不同濃度白藜蘆醇刺激后，Sirtl和PGC-1蛋白表達量有相同的變化趨勢隨白藜蘆醇的加入蛋白表達增多，在O.luM濃度時蛋白表達達到峰值；繼續加大濃度到luM時，蛋白表達量急劇減少，甚至低于對照細胞中的表達量。根據常規的方法，將0.luM的濃度換算成人體(約60kg)的用量，則白藜蘆醇的用量約在1.0mg-2mg之間效果較佳，可見低劑量的白藜蘆醇通過促進Sirtl的表達，可達到良好的減肥效果。由此說明，白藜蘆醇干預脂肪細胞在一定濃度范圍內可以使Sirtl和PGC-1的表達量同步增加；同時并非濃度越大蛋白表達越多，低劑量效果反而更佳。本實施例以高脂飲食誘導的肥胖小鼠為基礎，驗證白藜蘆醇的減肥效果。通過實施例2證實白藜蘆醇在減輕體重、抑制脂肪積累、以及改善胰島素敏感型等方面有作用。與以往報道有關白藜蘆醇可以防止心血管疾病等報道相吻合。本實施例集中討論白藜蘆醇減肥作用的原因，一般來講肥胖主要是由于能量攝入與能量消耗的不平衡引起的，因此本實施例主要檢査了白藜蘆醇干預后對能量攝入和消耗的影響。結果如圖ll所示，白藜蘆醇并不影響能量的攝入，若不影響能量攝入的同時還能產生體重減輕的現象則必然涉及到能量消耗的增多。為了驗證上述論點，繼續檢測正常狀態和饑餓條件下小鼠體溫的變化，發現白藜蘆醇干預后的小鼠產熱增加，同時，觀察電鏡下脂肪細胞中線粒體的變化，發現其數目及體積也有顯著的增加，因此提示白藜蘆醇的減肥作用是通過誘導線粒體的生物合成增加而達到增加產熱效果的。進一步研究白藜蘆醇可能作用的靶蛋白時，選擇了與產熱相關的PGC-1、UCP1蛋白進行研究，WesternBlot實驗證明脂肪組織中Sirtl、PGC-1、UCPl蛋白表達在受到白藜蘆醇刺激后有明顯增加。根據以往報道PGC-1在脂肪組織中的作用是促進線粒體的生物合成，且有增加產熱和UCPl表達量的作用，此外，Sirtl和PGC-1在肝臟組織中曾經被證明有相互作用。因此提示白藜蘆醇通過促進脂肪組織中Sirtl、PGC-1、UCPl蛋白表達，以提高產熱，增加能量消耗，提高代謝率，從而起到減肥效果。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。權利要求1.白藜蘆醇的用途，其特征在于，用于制備提高Sirt1蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-1蛋白的表達量的組合物。2.如權利要求l所述的用途，其特征在于，所述組合物同時提高Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、和UCP-l蛋白的表達量。3.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的組合物含有0.01—49.9mg/劑白藜戸醇。4.一種組合物，其特征在于，所述的組合物含有0.01—49.9mg/劑的白藜蘆醇，以及食品學或藥學上可接受的載體。5.如權利要求4所述的組合物，其特征在于，含有白藜蘆醇0.01—4.9mg/劑。6.如權利要求4所述的組合物，其特征在于，含有白藜蘆醇6—49.9mg/劑。7.權利要求4-6任一所述的組合物的用途，其特征在于，用于提高Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-l蛋白的表達量；或用于制備預防、控制或治療肥胖或肥胖相關疾病的食物或藥物。8.如權利要求6所述的用途，其特征在于，所述組合物同時提高Sirtl蛋白、PGC-l蛋白、和UCP-l蛋白的表達量。9.一種Sirtl基因或蛋白的用途，其特征在于，用于(i)制備預防、控制或治療肥胖或肥胖相關疾病的食物或藥物；或(ii)篩選預防、控制或治療肥胖或肥胖相關疾病的食物或藥物。10.—種篩選增加Sirtl蛋白表達的物質方法，其特征在于，包括步驟(a)在測試組中，向表達Sirtl蛋白的體系中添加待篩選的候選物，并檢測Sirtl蛋白的表達情況；(b)將步驟(a)測試組中Sir11蛋白的表達情況與添加所述候選物的對照組中Sirtl蛋白的表達情況進行比較，如果測試組中Sirtl蛋白的表達在統計學上多于對照組，就表明該猴選物是增加Sirtl蛋白表達的物質。全文摘要本發明公開了白藜蘆醇的用途，用于提高脂肪組織或脂肪細胞中Sirt1蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-1蛋白的表達量。本發明還公開了一種含有白藜蘆醇的組合物。本發明首次提出并證實白藜蘆醇可用于減肥。并且首次提出SIRT1可以作為預防、控制或治療肥胖的靶蛋白，白藜蘆醇可以上調SIRT1蛋白的表達水平。文檔編號A23L1/30GK101095665SQ200610028219公開日2008年1月2日申請日期2006年6月27日優先權日2006年6月27日發明者史香林,芳張,翟琦巍申請人:中國科學院上海生命科學研究院