專利名稱：鑒別分泌型蛋白標志物的系統及方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，更具體地，本發明涉及一種鑒別分泌型蛋白標志物的系統及方法。
背景技術：
根據已有的研究發現，許多疾病(如腫瘤)的發生與發展都與由相關的細胞或組織中表達分泌特異性蛋白標志物相關。因此，發展生物學的標記分子對于盡早檢測以及早期治療多種相關疾病具有十分重要的意義。
如果能在病人血清中發現疾病的生物學標記分子，將會對于這些病人的治療帶來很重要的影響。這些生物學標記分子可以被醫生用來作為確診的測試，醫生可以通過它們來監控單個疾病病例對于治療的反應，來預測什么時候會有這個疾病的復發。醫生可以通過一系列的疾病標記分子水平的測定來決定是否要開始，繼續或者維持治療。
目前，已經找到了多種疾病相關的標記分子，特別是腫瘤相關的標記分子。腫瘤中的血清標記分子可以被分為腫瘤相關的癌胚抗原，異常表達的激素，酶，以及癌癥宿主代謝產物。癌胚蛋白，例如癌胚胎蛋白(AFP)，在胚胎的生命周期中以高水平循環，但在正常的成體的血清或體液中，只有很少量能被檢測到。然而，在一些特定的癌細胞中，這些蛋白的合成會再次啟動。在75％的包含卵黃囊成分的睪丸癌(比如畸胎瘤和胚胎細胞瘤)和80％的原發性肝細胞瘤中，AFP的水平都有上升。在高級胃癌和胰腺癌中，它的水平也有上升。另一個癌胚抗原是CA125，它能在上皮性的腫瘤特別是上皮性的卵巢癌中有上調。然而CA125的敏感性不是很大，因為它只能在50％的一級卵巢癌中和60％的二級卵巢癌中被檢測到。其他的血清標志物分子還包括異常表達的激素，然而，只有很少的一部份癌癥能穩定性的產生一種異常的激素，可以被用來作為病人的血清標志物分子，包括人類慢性促性腺激素(hCG)和人類促黃體激素(hLH)。hCG被經常用來檢測和監控胎盤和睪丸癌癥，但也在肝癌，肺癌，胃癌以及卵巢癌患者的血清中被發現。血清中的酶也可以被用來作為腫瘤的標志物分子，例如胎盤堿性磷酸酯酶和骨堿性磷酸酯酶。前列腺特異性抗原(PSA，一種絲氨酸蛋白酶)也許是最廣泛使用的一種血清標志物分子。在血清中的高PSA水平顯示其需要進一步的醫學評價來確定是否有前列腺癌的存在。有數據表明，從1989年開始的PSA測試的使用與前列腺癌早期診斷的增加和晚期診斷的明顯減少相關。然而假陽性和假陰性的PSA值也是有害的問題。例如，PSA在血清中的水平在一些良性的前列腺腫大，前列腺炎和尿道感染也有上升。少于10％的肺癌病人有產生異常激素的臨床表現。目前，幾乎沒有肺癌的血清標志分子存在。在5％的遷移性的鱗癌或者大細胞肺癌中，高水平的甲狀旁腺激素相關蛋白能被檢測到。而小細胞肺癌則通常更和異常內分泌激素(例如促腎上腺皮質激素，診斷中的2％)的產生，抗利尿激素和黑素細胞刺激激素的上調相關，但可測量的內分泌性血清異常的發生率也少于所有病人的13％，病人血清中不定期的將會有CA125水平的升高。
迄今為止，對于包括肺癌在內的某一特定癌癥的標志分子的特異性都不好，一方面是因為腫瘤細胞的代謝和免疫方面的特性和正常細胞非常相像。有相當一部份人雖然血清中有非正常水平的血清腫瘤標志物，但卻是處在非惡性的情況下(假陽性)。同時，有許多惡性腫瘤血清測試方法的敏感性不強，導致了一些假陰性的情況發生。因此，頻繁發生的假陽性和假陰性測試導致了腫瘤標志分子作為檢測惡性腫瘤手段的局限性。由于這些假陽性和假陰性結果的發生頻率是和在某一特定個體中單一腫瘤標志物分子的上升相關，因此，多種腫瘤標志物分子的使用將能夠增強這種檢測的特異性和敏感性。例如，一種前列腺癌的新腫瘤標志物分子—血清前列腺特異性膜抗原(PSMA)-已在最近進行一些測試，它的臨床應用還有待探索(12-14)。血清中PSA和PSMA的同時測定，將能夠減少假陽性和假陰性結果。
基于上述現有技術中存在的問題，本領域還需要尋找一些跟疾病的發生和發展相關的蛋白標志物，以能夠及時地判斷出疾病高危人群、進行疾病早期診斷、或對疾病的發生和發展作出準確的分析。
發明內容
本發明的目的在于提供一種鑒別分泌型蛋白標志物的系統及鑒別分泌型蛋白標志物方法。
在本發明的第一方面，提供一種鑒別分泌型蛋白或跨膜蛋白的系統，所述的系統包括(a)一種酵母細胞，所述的酵母細胞不表達有功能的分泌型蔗糖轉化酶(SUC2)；和(b)一種表達載體，所述的表達載體含有蔗糖轉化酶基因表達盒，所述的蔗糖轉化酶基因表達盒含有缺失信號序列的蔗糖轉化酶基因。
在本發明的另一優選例中，所述的表達載體可自我復制并且可轉入所述的酵母細胞。
在本發明的另一優選例中，所述的蔗糖轉化酶基因表達盒從5’至3’依次含有多克隆位點、缺失信號序列的蔗糖轉化酶基因、和終止密碼子。
在本發明的另一優選例中，所述多克隆位點包括HindIII位點和NotI位點。
在本發明的另一優選例中，所述的酵母細胞選自YT455/SUC2Δ9P。
在本發明的另一優選例中，所述的表達載體選自pRB576L/SUC2ΔSP，或pRB576/SUC2ΔSP在本發明的第二方面，提供一種鑒別編碼分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA的方法，所述的方法包括(1)將外源的cDNA片段插入到含有缺失信號序列的蔗糖轉化酶基因的表達載體中；(2)將步驟(1)獲得的表達載體導入不表達有功能的分泌型蔗糖轉化酶的酵母細胞中，并在蔗糖作為唯一碳源的培養基上培養，從而獲得能夠生長的酵母細胞；(3)鑒定從步驟(2)獲得的酵母細胞中的外源cDNA片段的信息，基于此獲得編碼分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA。
在本發明的另一優選例中，在步驟(3)中，包括分離出插入了外源cDNA片段的表達載體，并分離所述cDNA片段，基于該片段獲得全長cDNA，所述的全長cDNA即為編碼分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA。
在本發明的另一優選例中，所述的酵母轉化酶基因表達盒從5’至3’依次含有多克隆位點、缺失信號序列的酵母轉化酶基因、終止密碼子；并且，將外源的cDNA片段插入所述的表達載體的多克隆位點中。
在本發明的另一優選例中，提供一種鑒別編碼分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA的方法，所述的方法包括(1)提供一種表達載體，所述的表達載體可自我復制并且可轉入所述的酵母細胞，并且所述的表達載體含有SUC2基因表達盒，所述的SUC2基因表達盒從5’至3’依次含有多克隆位點、缺失信號序列的SUC2基因(SUC2Δsp)、終止密碼子；(2)將cDNA文庫的cDNA片段插入所述表達載體的多克隆位點，從而獲得插入外源cDNA片段的表達載體；(3)用步驟(2)獲得的表達載體，轉化酵母細胞，所述的酵母細胞不表達SUC2基因，并在蔗糖作為唯一碳源的培養基上培養，從而獲得能夠生長的酵母細胞；(4)從所述酵母細胞中，分離出插入了外源cDNA片段的表達載體，并分離所述cDNA片段；(5)以步驟(4)獲得的cDNA片段為探針，從cDNA文庫中獲得相應的全長cDNA；或者測定所述該cDNA片段的序列，并基于該序列獲得相應的全長cDNA，所述的全長cDNA即為編碼分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA。
在本發明的另一優選例中，所述的cDNA片段來源于cDNA文庫，并且所述的cDNA片段是富集了5’端cDNA的cDNA片段。
在本發明的另一優選例中，所述的cDNA文庫為疾病相關的細胞或組織的cDNA文庫。
在本發明的另一優選例中，所述的cDNA文庫中富集疾病特異性或組織特異性cDNA。
另一方面，本發明還提供一種通過所述的方法獲得的分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA，以及由該cDNA編碼的蛋白。
在本發明的第三方面，提供一種酵母細胞，所述的酵母細胞不表達有功能的分泌型酵母轉化酶。
本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
圖1為一組示意圖。
其中，圖1(a)顯示了分泌形式的蔗糖轉化酶將酵母細胞外的蔗糖水解為葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖被轉運到酵母體內作為碳源，使細胞能夠在YEP-SA培養基上生長的流程示意圖。圖1(b)顯示了刪除掉信號序列的SUC2基因(SUC2ΔSP)編碼的蔗糖轉化酶不能分泌到酵母細胞外，不能將蔗糖水解為葡萄糖和果糖，酵母細胞無法在YEP-SA培養基上生長。圖1(c)顯示了用含有信號序列的cDNA和刪除掉信號序列的SUC2基因(SUC2ΔSP)的載體轉化的酵母細胞能夠在YEP-SA培養基上生長。
圖2顯示了載體pRB420、pRB576和pRB576L的結構示意圖。其中，質粒pRB420中插入了野生型的SUC2基因，質粒pRB576中插入缺失信號序列(第3第20個密碼子)的SUC2基因，將pRB576中的起始密碼子刪除，插入一個Not I酶切位點(pRB576L)。
圖3顯示了用肺癌細胞株H125建肺特異性cDNA富集的cDNA文庫，用差減雜交的方法扣除M663細胞株的mRNA。
圖4顯示了富集5’端cDNA的PCR的方法cDNA的5’端和3’端分別接上Hind III和Not I的酶切位點。
圖5顯示了克隆cDNA的5’-端片段進入pRB576L上Hind III和Not I的酶切位點的過程。
圖6顯示了利用酵母篩選包含信號序列的cDNA。
圖7顯示了進一步篩選陽性克隆的方法。
圖8顯示了利用酵母系統捕獲信號序列的實驗。用野生型SUC2基因(SUC2Δsp)(A、B)，刪除信號序列的SUC2基因(C、D)或者TGF-β信號序列(E、F)轉化酵母菌株YT455(SUC2Δ9，ade2-101，ura3-52)，然后將酵母涂在SDA平板上估計轉化效率(A、C、E)；將酵母涂在YEP-EA平板上觀察蔗糖酶的能力(B、D、F)，平板在30℃條件下培養三天，拍照。在SUC2Δsp中引入TGF-β的信號序列就能使酵母在蔗糖培養基上生長(F)。
具體實施例方式
本發明人經過長期的研究，開發了一種利用改造的酵母細胞(即缺失SUC2基因或SUC2基因不表達的酵母細胞)作為宿主，篩選分泌蛋白或跨膜蛋白的方法。本發明人設計的方法比其它方法更簡單，快速，并且具有高的檢測靈敏度和特異性。因此，可以采用本發明的方法來鑒別出分泌蛋白或跨膜蛋白；尤其是可針對一些疾病，找出疾病特異性分泌型蛋白標志物。基于此完成了本發明。
如本文所用，術語“分泌型蛋白”是指一類蛋白，其能夠在細胞中被表達，并且能夠通過細胞膜，被分泌到細胞外。通常，分泌型蛋白的氨基(N)端帶有一段長度不等(一般約幾十到幾百bp的核苷酸)的信號肽。
本發明的原理和應用本發明的系統包括(a)一種酵母細胞，所述的酵母細胞不表達有活性SUC2基因；和(b)一種表達載體，所述的表達載體可自我復制并且可轉入所述的酵母細胞，并且所述的表達載體含有SUC2基因表達盒，所述的SUC2基因表達盒從5’至3’依次含有多克隆位點、缺失信號序列的SUC2基因(SUC2Δsp)、終止密碼子。
可用于本發明的不表達SUC2基因的酵母細胞，可用常規方法制備。例如可通過基因破壞法對SUC2基因進行定位突變。在本發明中，表達無活性SUC2的酵母細胞仍視為不表達SUC2的酵母序列。
可用于本發明的含有SUC2基因表達盒的表達載體沒有特別限制，可以是任何能夠構建入所述含有SUC2基因表達盒，只要其能夠自我復制，并且能夠轉入到酵母細胞中進行目的基因的表達。
在本發明中，鑒別分泌型蛋白或跨膜蛋白是基于利用酵母細胞內產生的蔗糖轉化酶的分泌特性來實現的。
具體地，一些酵母細胞(如Saccharomyces cerevisiae)產生的蔗糖轉化酶具有兩種形式一種是包含信號肽的分泌形式，另一種是缺乏信號肽的胞內蛋白形式。所述的這兩種形式的蛋白由酵母中的同一個基因SUC2編碼。其中，分泌形式的蔗糖轉化酶能將細胞外的蔗糖水解為葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖會被轉運到酵母體內作為碳源，從而可作為酵母生長的能量來源(碳源)，如圖1(a)所示。反之，如果酵母細胞產生的是胞內蛋白形式的蔗糖轉化酶，沒有產生分泌到細胞外的蔗糖轉化酶，則酵母細胞外的蔗糖不能水解為葡萄糖和果糖，而酵母不能利用蔗糖作為碳源的，如圖1(b)所示。
可用cDNA文庫來替代SUC2中的信號序列，將cDNA文庫中的各種cDNA片段連接到含有SUC2ΔSP表達載體的SUC2ΔSP基因的5’端位置(即對應于SUC2野生型序列的信號序列位置)，將所述表達載體轉化入酵母細胞中，使酵母在以蔗糖為唯一碳源的培養基(如YEP-SA培養基)上生長。由此，只有包含有信號序列的cDNA片段轉化的酵母才能在以蔗糖為唯一碳源的培養基上長出克隆，如圖1(c)所示。通過上述步驟，可將包含有信號序列的cDNA片段從cDNA文庫中分離出來。通過這部分cDNA片段為探針，通過如PCR方法，可在cDNA文庫中得到全長的cDNA序列，所述序列編碼的蛋白是分泌型蛋白或為跨膜蛋白。
因此，本發明的方法可用于針對多種疾病的相關細胞或組織，構建所述疾病相關的細胞或組織的cDNA文庫，從中鑒定出編碼分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA。進而可進一步鑒定出疾病相關的特異性的分泌型蛋白標志物。
優選的，所述的cDNA文庫中富集了疾病特異性cDNA，其中扣除了一些非該疾病特異性的cDNA。比如可通過差減雜交的方法來進行所述扣除。從這些疾病特異性的cDNA中找到能夠編碼分泌到細胞外的蛋白的cDNA，則該cDNA對應的蛋白很可能是一種疾病相關標志物。
所述的疾病可以是任何一種在正常個體與患病個體中蛋白表達呈現差異(優選顯著差異)的疾病；更特別的，所述的疾病為腫瘤，比如肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌等。
分泌型蛋白的分析通過如上方法獲得分泌型蛋白后，進一步的，可通過許多方法來對所述的分泌型蛋白進行分析，以從中找到有價值的蛋白標志物，用于臨床診斷和分析。
優選的，可采用斑點印跡和Northern印跡分析，所述分析手段能夠進一步驗證基因表達是否屬于相關組織(如肺組織)，或者是否具有相關組織或疾病(如肺癌)的特異性。此外，利用DNA測序和計算機搜尋同源序列，可以得知所獲得的帶有信號序列的cDNA是編碼新的基因，還是編碼已知基因，如圖7所示。
如果cDNA編碼新的基因，而且表達模式具有組織特異性，可分離全長的cDNA，進而獲得其編碼的蛋白。然后利用DNA和蛋白質的同源性搜索，尋找可能存在的模體以幫助鑒定蛋白質的功能。
另外，還可制備該基因產物的抗體。制備抗體的方法有好幾種，可以通過在細菌中合成GST-cDNA融合蛋白，然后膠純化或者按照cDNA序列直接合成肽鏈，將兩種方法得到的蛋白送往商業公司由他們在家兔體內制備抗體。抗體將應用親和純化法進行純化，并利用Western Blot和免疫組化檢測，以估計組織(如肺組織)的特異性和相關疾病(如肺癌)的選擇性。如果抗體可以用來鑒別組織(如肺組織)的特異性(作為理想中的組織特異性蛋白)，EILSA經過發展后就可以用來監測正常個體和患有疾病(如肺癌)的個體血清中的組織(如非組織)特異性蛋白。
此外，可用以上所描述的方法純化蛋白質和抗體，并研究它們對細胞生長的影響。還可構建有義和反義哺乳動物表達載體，并將其穩定地轉入相關的細胞系，以調控蛋白質的表達。用上述兩個方法可以監測細胞生物功能的變化。可以通過一批放射雜交繪制基因圖譜，這樣可以判斷該基因是否與相關疾病(如腫瘤)中的變化相一致。而且，在將來的實驗中還可以研究敲除該基因的小鼠，也可以研究組織(如肺組織)特異性蛋白的編碼序列的啟動增強子區域，從而鑒定組織(如肺組織)的特異轉錄因子。
分泌型蛋白的應用這些通過本發明的方法初步獲得的cDNA或其編碼的蛋白也可構成一個篩選庫，以便于人們最終可以從中篩選出能夠用于臨床疾病診斷和分析的有用的蛋白標志物。
經過鑒定，可從中找到疾病相關的特異性的cDNA或其編碼的蛋白，它們可作為判斷相關疾病的發生和發展的標志物，從而能夠及時地判斷出疾病高危人群、進行疾病早期診斷、或對疾病的發生和發展作出準確的分析。
針對一種疾病，通過本發明的方法可以找到多種相關的分泌型蛋白標志物。這些找到的分泌型蛋白標志物可單一地或復合地用于相關疾病的檢測，以達到正確分析的目的。同時或先后對多個分泌型蛋白標志物進行檢測，可更準確地反應疾病的狀況，提高疾病診斷、預后的準確率，避免假陽性或假陰性的發生。
或者，通過本發明的方法獲得的疾病相關的分泌型蛋白標志物，還能夠用于對疾病進行輔助性地診斷或分析，便于醫師能夠對疾病的發生以及發展做出更準確的判斷，提高臨床方案的有效性。
肺癌特異性分泌蛋白的篩選在本發明的優選方式中，本發明人改造了酵母株YT455使其SUC2基因不表達；因此，改造后的酵母株不能生長在以蔗糖為唯一碳源的培養基(如YEP-SA培養基)中。將野生型的SUC2基因克隆到pRB420載體中，刪除掉信號序列的SUC2基因(SUC2ΔSP)克隆到pRB576載體中，如圖2所示。當包含SUC2基因的質粒pRB420轉化酵母株YT455，酵母株能夠在YEP-SA培養基中生長。但是當包含SUC2ΔSP的質粒pRB576轉化酵母株YT455，酵母株則不能在YEP-SA培養基中生長，因為SUC2ΔSP不能合成分泌形式的蔗糖轉化酶。
在本發明的優選方式中，本發明人用肺癌的cDNA文庫替代SUC2中的信號序列，并用構建好的質粒轉化酵母株YT455，這樣就能從cDNA文庫中篩選到大量的肺癌特異性的分泌蛋白和/或跨膜蛋白的序列。只有包含有信號序列的cDNA轉化的酵母才能在YEP-SA培養基上長出克隆。接下來，本發明人可從陽性克隆中抽提質粒，質粒中包含的cDNA片段編碼的蛋白要么是分泌蛋白要么是跨膜蛋白。用該cDNA片段作為探針，將分離出全長的cDNA用以檢測其編碼的蛋白表達的特異性。更特別的，還可制備抗該蛋白的抗體，從而在肺癌病人的血清中檢測該蛋白表達的特異性和敏感性，從而可進一步篩選到具有臨床應用價值的肺癌血清標志分子。
本發明的主要優點在于(1)本發明的方法可方便地鑒別出一些新的疾病特異性的分泌型蛋白；所述方法在簡單，快速的同時，又具有很高的靈敏度和特異性。
(2)針對一種疾病同時找到多個疾病相關的分子標志物，擁有不只一個的蛋白標志物，從而可以大大的降低假陽性和假陰性的發生率。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例1酵母株的改造和載體構建采用定點突變的方法，對釀酒酵母株YT455(ade2-101，ura3-52)(購自ATCC，編號為208956)進行改造，改變SUC2基因中編碼SUC蛋白第9位氨基酸的位點，經改變后，該酵母株不能表達蔗糖轉化酶。本發明人將該酵母細胞株命名為YT455(SUC2Δ9P，ade2-101，ura3-52)。
以下實施例中采用的載體pRB420、pRB576和pRB576L的結構示意圖見圖2。
在質粒YCp50(購自ATCC編號87555)的EcoRI和Hind III位點中插入野生型的SUC2基因(GenBank登錄號854644)，構成質粒pRB420/SUC2，見圖2(a)。
在質粒YCp50(購自ATCC編號87555)的EcoRI和Hind III位點中插入缺失信號序列(第3-第20個密碼子)的SUC2基因，構成質粒pRB576/SUC2Δsp，見圖2(b)。
將pRB576/SUC2Δsp中的起始密碼子刪除，插入一個Not I酶切位點，構成pRB576L/SUC2Δsp，見圖2(c)。
實施例2pRB576L/SUC2Δsp系統的有效性試驗在本實施例中，本發明人將人類的轉化生長因子TGF-β-1基因(GenBank登錄號NM_000660)編碼序列中含有信號序列的5’-區域(前述序列的前384個核苷酸)接入pRB576L/SUC2Δsp載體的Hind III/NotI酶切位點中，作為陽性對照。
當用前述構建的質粒轉化酵母YT455時，酵母可在僅以蔗糖作為唯一糖源的YEP-SA培養基平板上生長。相反，轉入沒有TGF-β-1基因信號序列的pRB576L/SUC2Δsp質粒，則酵母不能夠在蔗糖上生長，見圖8。
用含有野生型SUC2基因，刪除信號序列的SUC2基因(SUC2Δsp)或者TGF-β信號序列的載體轉化酵母菌株YT455(SUC2Δ9P，ade2-101，ura3-52)，然后將酵母涂在SDA(0.66％酵母氮基，2％葡萄糖，200μg/ml腺嘌呤)平板上估計轉化效率；將酵母涂在YEP-EA(1％酵母抽提物，2％蛋白胨，2％蔗糖，1μg/ml抗霉素A)平板上觀察蔗糖酶的能力，平板在30℃條件下培養3天，拍照。在SUC2Δsp中引入TGF-β的信號序列就能使酵母在蔗糖培養基上生長。
圖8中，A為用含野生型SUC2基因的pRB420載體轉化酵母菌株YT455，將酵母涂于SDA平板上，酵母能夠生長。
圖8B為用含野生型SUC2基因的pRB420載體轉化酵母菌株YT455，將酵母涂于YEP-EA平板上，酵母能夠生長。
圖8C為用含刪除信號序列的SUC2基因(SUC2Δsp)的pRB576L/SUC2Δsp載體轉化酵母菌株YT455，將酵母涂于SDA平板上，酵母能夠生長。
圖8D為用含刪除信號序列的SUC2基因(SUC2Δsp)的pRB576L/SUC2Δsp載體轉化酵母菌株YT455，將酵母涂于YEP-EA平板上，酵母不能生長。
圖8E為用含TGF-β信號序列且含刪除信號序列的SUC2基因(SUC2Δsp)的pRB576L/SUC2Δsp載體轉化酵母菌株YT455，將酵母涂于SDA平板上，酵母能夠生長。
圖8F為用含TGF-β信號序列且含刪除信號序列的SUC2基因(SUC2Δsp)的pRB576L/SUC2Δsp載體轉化酵母菌株YT455，將酵母涂于YEP-EA平板上，酵母不能生長。
上述結果說明，利用pRB576L/SUC2Δsp的系統是有效的。
實施例3編碼肺癌分泌型(或跨膜)蛋白的cDNA的鑒別腫瘤標志物通常具有兩個特性組織特異性和腫瘤特異性。不過，所述特性對本實施例沒有影響。腫瘤標志物通常不是特異地在某種腫瘤中存在，而是在組織的不同發育階段特異地存在。胚胎細胞中可能合成大量的某種蛋白，但是在同種組織中的正常細胞有可能低表達這種蛋白。比如說，PSA并不是特異地表達在前列腺癌細胞中，而是特異地表達在前列腺組織的細胞中。
在本實施例中，本發明人選擇來源于腺癌的H125細胞株(購自中國細胞庫典藏細胞中心，編號QK10231)構建cDNA文庫，從中篩選肺癌分泌型蛋白標志物。腺癌在北美是發病率最高的一種肺癌，占所有肺癌的40％，因此其是具有代表性的。
首先，采用常規的方法，用非小細胞肺癌細胞株H125構建一個cDNA文庫，并用差減雜交的方法扣除骨肉瘤細胞株MG63(購自ATCC，編號CRL-142)、前列腺細胞株LNCaP(購自ATCC，編號CRL-1740)和粒細胞白血病細胞株HL60(購自ATCC，編號CCL-240)三株非肺癌細胞株的mRNA，以富集肺癌特異性的基因。
具體操作流程見圖3。根據Invitrogen提供的差減雜交試劑盒(SubtractorKit，Invitrogen，CA)的使用說明，本發明人用反轉錄酶和隨機引物從H125細胞株的mRNA合成cDNA的第一條鏈。用生物素標記的MG63、LNCaP和HL60細胞株的mRNA的混合物與合成的cDNA第一條鏈雜交，用酚/氯仿便可抽提掉與鏈霉親和素結合的雜交混合物，從而扣除掉非肺癌特異性的cDNAs。
因為信號序列大多數定位于基因的氨基酸末端區域，所以本發明人采用PCR方法富集5’末端的cDNA，具體步驟見圖4，簡述如下將經減除的肺癌細胞系H125特異性的單鏈cDNA的3’末端加上dC-尾巴；然后將經減除的肺癌細胞系H125特異性cDNA與含Hind III位點的引物(5’ATGCTCGGACTGCAAGCTTCGAAGGGGGGGGGG 3’(SEQ ID NO1))退火；接著合成第二鏈；然后超聲降解雙鏈cDNA并鈍化；接著在3’端連接Not I酶切位點(使用NotI的雙鏈連接片斷)；最后通過使用以下引物僅擴增cDNA文庫的5’片段5’GCTCGGACTGCAAGCTTCGAA 3’(SEQ ID NO2)；5’CACCTCATTACCATGCGG CCGCCTCT 3’(SEQ ID NO3)。
基于上述PCR程序，本發明人在每條cDNA的5’-末端添加了Hind III酶切位點，3’-末端添加了Not I酶切位點，然后將各cDNA片斷用Hind III/Not I酶切后，凝膠電泳分離400-1000bp的cDNA片段，將所述片段插入到質粒pRB576L/SUC2Δsp的相應Hind III/Not I酶切位點中，構建含有肺癌特異性cDNA的pRB576L/SUC2Δsp載體，具體見圖5。
將上述構建的含有肺癌特異性cDNA的pRB576L/SUC2Δsp載體轉化酵母細胞YT455(SUC2Δ9P，ade2-101，ura3-52)。將所述酵母細胞涂在以蔗糖作為唯一糖源的YEP-SA培養平板上，30℃培養。
經過培養，能夠存活下來的陽性克隆即為能夠分泌蔗糖轉化酶的酵母克隆，轉化入該酵母的質粒中的cDNA含有信號序列，也即轉化入該酵母的質粒中攜帶分泌或跨膜相關的cDNA。
從酵母中分離攜帶分泌或跨膜相關的cDNA的質粒，轉化大腸桿菌擴增質粒，見圖6。
通過PCR技術、DNA測序、斑點印跡和Northern印跡分析驗證，這些質粒載有信號序列及其起始密碼。
用Hind III/Not I進行酶切，從攜帶分泌或跨膜相關的cDNA的質粒中切出所述的分泌或跨膜相關的cDNA。以該cDNA為探針，通過PCR反應，從前述構建的非小細胞肺癌細胞株H125 cDNA文庫中獲得全長的cDNA，即為編碼分泌型(或跨膜)蛋白的cDNA。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院<120>鑒別分泌型蛋白標志物的系統及方法<130>063625<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1atgctcggac tgcaagcttc gaaggggggg ggg33<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2gctcggactg caagcttcga a 21<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3cacctcatta ccatgcggcc gcctct2權利要求
1.一種鑒別分泌型蛋白或跨膜蛋白的系統，其特征在于，所述的系統包括(a)一種酵母細胞，所述的酵母細胞不表達有功能的分泌型蔗糖轉化酶；和(b)一種表達載體，所述的表達載體含有蔗糖轉化酶基因表達盒，所述的蔗糖轉化酶基因表達盒含有缺失信號序列的蔗糖轉化酶基因。
2.如權利要求1所述的系統，其特征在于，所述的蔗糖轉化酶基因表達盒從5’至3’依次含有多克隆位點、缺失信號序列的蔗糖轉化酶基因、和終止密碼子。
3.如權利要求2所述的系統，其特征在于，所述多克隆位點包括HindIII位點和Not I位點。
4.一種鑒別編碼分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)將外源的cDNA片段插入到含有缺失信號序列的蔗糖轉化酶基因的表達載體中；(2)將步驟(1)獲得的表達載體導入不表達有功能的分泌型蔗糖轉化酶的酵母細胞中，并在蔗糖作為唯一碳源的培養基上培養，獲得能夠生長的酵母細胞；(3)鑒別從步驟(2)獲得的酵母細胞中的外源cDNA片段的信息，基于該信息獲得編碼分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的酵母轉化酶基因表達盒從5’至3’依次含有多克隆位點、缺失信號序列的酵母轉化酶基因、終止密碼子；并且，將外源的cDNA片段插入所述的表達載體的多克隆位點中。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的cDNA片段來源于cDNA文庫，并且所述的cDNA片段是富集了5’端cDNA的cDNA片段。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的cDNA文庫為疾病相關的細胞或組織的cDNA文庫。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的cDNA文庫中富集疾病特異性或組織特異性cDNA。
9.一種酵母細胞，其特征在于，所述的酵母細胞不表達有功能的分泌型酵母轉化酶基因。
10.一種通過權利要求5所述的方法獲得的分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA，以及由該cDNA編碼的蛋白。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，公開了一種鑒別分泌型蛋白或跨膜蛋白的系統。本發明還公開了一種從cDNA文庫中鑒別編碼分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA的方法。本發明所述方法具有很高的靈敏度和特異性，可方便地鑒別出一些新的疾病特異性的分泌型蛋白，例如篩選和鑒別肺癌特異性的分泌型蛋白標志物。
文檔編號C12Q1/00GK101093226SQ20061002806
公開日2007年12月26日 申請日期2006年6月23日 優先權日2006年6月23日
發明者謝東 申請人:中國科學院上海生命科學研究院