專利名稱：一種檢測冠心病易感性的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種疾病易感性檢測用的試劑盒，尤其是一種檢測冠心病易感性的試劑盒，通過同時檢測三磷酸腺苷結合盒轉運體A1基因(ATP-binding cassette，sub-family A，member 1，ABCA1)的單核苷酸多態性(SNP)位點與對氧磷酯酶1基因(paraoxonase 1，PON1)的單核苷酸多態性位點來預測個體對冠心病的易感性。
背景技術：
冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease)指冠狀動脈粥樣硬化使血管腔狹窄或阻塞，或(和)因冠狀動脈功能性改變(痙攣)導致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病，統稱冠狀動脈性心臟病(coronary heart disease)，簡稱冠心病(CHD)，亦稱缺血性心臟病(ischemic heartdisease)。
冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是動脈粥樣硬化導致器官病變的最常見類型，也是嚴重危害人民健康的常見病。本病多發生在40歲以后，男性多于女性。發達國家常見，美國約有700萬人患本病，每年約50余萬人死于本病，占人口死亡數的1/3～1/2，占心臟病死亡數的50％～75％。在我國，近年來呈增長趨勢。20世紀70年代北京、上海、廣州本病的人口死亡率分別為21.7/10萬人口、15.7/10萬人口和4.1/10萬人口；90年代我國城市男性本病死亡率為49.2/10萬人口，女性為32.2/10萬人口。
冠心病的發病隨年齡的增長而增高，程度也隨年齡的增長而加重。有資料表明，自40歲開始，每增加10歲，冠心病的患病率增1倍。男性50歲，女性60歲以后，冠狀動脈硬化發展比較迅速，同樣心肌梗塞的危險也隨著年齡的增長而增長。年輕的男性患者比年輕的女性患者多，但絕經后的女性以及年過六十的婦女，其危險就幾乎與男性相等了，甚至大于男性。老年人心臟病發作的可能性較高。
其發病機理是復雜的，綜合性的較長過程。可歸納為四個步驟1.心血管內皮細胞損害，平滑肌細胞增生。2.血小板粘附于受損的血管壁后，釋放出血清素，血栓素A2、血小板IV、VIII因子等。3.低密度脂蛋白由受損的內皮細胞滲入內膜下的平滑肌細胞，并被吞噬，進入細胞后被細胞內溶酶體的水解酶分解而釋放出游離膽固醇，后者與亞油酸結合，成為重要發病環節。4.在上述病理變化基礎上，最終發生冠狀動脈纖維化、鈣化。
冠心病是一種有遺傳因素和環境因素相互作用而發病的多基因病，尋找冠心病相關基因進而闡明冠心病發病的遺傳機制已經成為目前研究的熱點。
三磷酸腺苷結合盒轉運體A1基因(ABCA1)蛋白是一種整合膜蛋白，它以ATP為能源，促進細胞內游離膽固醇和磷脂的流出，在膽固醇逆轉運(RCT)和HDL生成的起始步驟中起重要作用，被稱作RCT守門人。核受體PPARs、LXRs和FXR對abcal蛋白的表達具有調控作用。人體50種組織中存在有ABCA1mRNA，在胰、肝、肺、腎上腺和胎兒組織中ABCA1表達水平最高，ABCA1功能障礙將導致巨噬細胞內大量的膽固醇沉積而成為泡沫細胞，繼而浸潤血管壁，促進冠心病的發生發展。
PON1為paraoxonase 1(對氧磷脂酶1)編碼基因，血清中的對氧磷脂酶1可以作為抗氧化劑，對低密度脂蛋白LPL等生物大分子進行水解并降低氧化水平。從而降低血管內的氧化勢，起到對血管的保護作用。基因發生缺陷后，導致對低密度脂蛋白LPL等生物大分子進行水解并降低氧化水平下降，造成對血管壁的損傷，帶來心腦血管的疾病。
SNP(single nucleotide polymorphism)，即單核苷酸多態性標記，是一類基于單堿基變異引起的DNA多態性，被遺傳學界稱為第三代遺傳標記。主要是指由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態性，包括單堿基轉換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。它是基因組中最為廣泛存在的一類多態性標記，占大約90％。這些基因組序列變異可以導致個體間表型的差異以及不同個體對疾病，特別是復雜疾病的易感性、和對環境因素、藥物反應的差異。研究表明，ABCA1基因上的rs2230806號SNP位點(SEQ ID NO1所示序列中136位)的多態性(G/A)會引起基因編碼蛋白的的第219個氨基酸發生改變(Arg/Lys)，而其中Lys氨基酸的表達可提高血漿高密度脂蛋白含量，對心腦血管疾病的發生有一定保護作用；PON1基因上的rs662號SNP位點(SEQ ID NO2所示序列中146位)的多態性(A/G)會引起基因編碼蛋白的第192個氨基酸由Gln變為Arg，而冠心病患者帶有Arg的頻率明顯高于正常人群，PON1基因的Gln192Arg多態性與冠心病嚴重性、冠狀動脈粥樣硬化進展程度、血脂水平和降血脂藥物治療效果相關。國內外的大量的關聯分析表明，ABCA1的Lys多態(SNP位點基因型為A)能夠降低冠心病的發生；PON1基因的Gln多態(SNP位點基因型為A)能夠降低冠心病的易感性、延緩冠狀動脈粥樣硬化進展程度。這兩個SNPs位點的多態性可用于評估個體對冠心病的易感性，目前已通過中國科學院國家生物基因檢測技術應用評估認證中心的認證。
發明內容
基于ABCA1基因上的rs2230806號SNP位點與PON1基因上的rs662號SNP位點可用來評估個體對冠心病的易感性的基礎上，本發明提供一種檢測冠心病易感性的試劑盒。
該試劑盒包括檢測ABCA1基因SEQ ID NO1中第136位SNP的特異性引物對及特異性熒光探針、檢測PON1基因SEQ ID NO2中第146位SNP的特異性引物對及特異性熒光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液、去離子水。
本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對SEQ ID NO1中第136位SNP與SEQ ID NO2中第146位SNP位點而設計，能特異性擴增出SEQ ID NO1中包含第136位SNP位點的DNA片段與SEQ ID NO2中包含第146位SNP位點的DNA片段的引物對。設計這類引物對是本領域技術人員能夠輕易完成的。優選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO3和4所示序列的引物對以及具有SEQ ID NO5和6所示序列的引物對。特異性引物對可用常規的合成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發明的引物不限于這兩對引物。
本試劑盒中所述的特異性熒光探針是指針對SEQ ID NO1中第136位SNP與SEQ ID NO2中第146位SNP位點而設計，能通過熒光定量PCR技術特異性檢測出這兩個SNPs位點冠心病易感基因型的探針。設計這類探針是本領域技術人員能夠輕易完成的。優選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO7和8所示序列的Taqman探針。特異性熒光探針可用常規的合成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發明的特異性熒光探針不限于這兩條探針，所有可用于熒光定量PCR檢測SEQ ID NO1中第136位SNP與SEQID NO2中第146位SNP位點的探針均在本發明范圍內。
本發明試劑盒的組分和含量包括1μl 10X熒光定量PCR反應緩沖液，0.1μl 25mM dNTP混合液，0.6μl 25mM MgCl2溶液，0.025μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶，20μM特異性引物對(四條)各0.225μl，10μM特異性熒光探針(兩條)各0.25μl，去離子水4.875μl。
本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20℃。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照廠商所建議的條件。
實施例1.檢測試劑盒的使用步驟1DNA模板的抽取用硅膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。
步驟2熒光定量PCR反應使用可檢測冠心病易感性的熒光定量PCR檢測試劑盒，其中，含有下列引物對和熒光探針有義引物15’-TGTGCAATGGATCAAAATCAG-3’(SEQ ID NO3)Tm值為54℃反義引物15’-GTGAGCAAGTCTACTCAC-3’(SEQ ID NO4)Tm值為54℃有義引物25’-GGACCTGAGCACTTTTATG-3’(SEQ ID NO5)Tm值為56℃反義引物25’-TTGGACTATAGTAGACAACA-3’(SEQ ID NO6)Tm值為54℃熒光探針15’-ACCAAGGGAGAAACTGGCTGC-3’(SEQ ID NO7)Tm值為66℃熒光探針25’-CGATCCTGGGAGATGTATTTGG-3’(SEQ ID NO8)Tm值為64℃有義引物1，反義引物1和熒光探針1特異地針對檢測ABCA1基因上的rs2230806號SNP位點(SEQ IDNO1所示序列中136位)多態性；有義引物2，反義引物2和熒光探針2特異地針對檢測PON1基因上的rs662號SNP位點(SEQ ID NO2所示序列中146位)多態性。
熒光定量PCR反應體系為總體積10μl，包含濃度為20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X熒光定量PCR反應緩沖液、0.1μl 25mM dNTP混合液、0.6μl 25mM MgCl2溶液、0.025μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、20μM的有義引物1和2各0.225μl、20μM的反義引物1和2各0.225μl、10μM的熒光探針1和2各0.25μl，去離子水4.875μl。
在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為50℃、2分鐘，95℃、10分鐘，進行60個循環的95℃、30秒，60℃、1分鐘。反應結束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。
步驟3SNP基因型分析將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量和正常對照相對比，熒光探針1最終的熒光信號明顯高于正常對照，說明被檢測DNA的ABCA1基因上rs2230806號SNP位點基因型攜帶有G型，為冠心病易感型；熒光探針2最終的熒光信號與正常對照相差不多，說明被檢測DNA的PON1基因上的rs662號SNP位點基因型攜帶為A型，非冠心病易感型。
實施例2.指導人們主動預防冠心病的服務目前在上海主健生物工程有限公司已經開展了這項服務。
步驟1DNA提取對被檢測者進行服務前咨詢，由被檢測者簽署知情同意書，填寫生活飲食習慣問卷調查表。依照取樣盒中的指示使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用硅膠吸附法進行口腔上皮細胞的DNA抽提。
步驟2基因分型檢測使用本發明提供的試劑盒，對被檢測者DNA的ABCA1基因上的rs2230806號SNP位點與PON1基因上的rs662號SNP位點同時進行熒光定量PCR檢測，確定這兩個SNPs位點的基因型。
步驟3指導人們主動預防冠心病通過對被檢測者SNPs基因型的分析，出具基因分型檢測報告和被檢測者個體化健康指導報告。基因檢測報告詳細說明了被檢測者冠心病易感程度的高低以及患病的概率大小。個體化健康指導報告以被檢測者的基因分型檢測結果為基礎，結合其生活飲食習慣問卷調查結果，評估被檢測者冠心病遺傳易感的相對風險。同時制定出針對于被檢測者的個性化健康行動方案，方案包括在飲食習慣、生活方式上的改進建議等，并為被檢測者普及預防冠心病的健康知識。
序列表<110>上海主健生物工程有限公司<120>一種檢測冠心病易感性的試劑盒<160>8<210>1<211>300<212>DNA<213>人屬，人種(Homo sapiens，human)<400>1ctctttgcat gaaatgcttc caggtatttt tgcaaggcta ccagttacat ttgacaagtc 60tgtgcaatgg atcaaaatca gaagagatga ttcaacttgg tgaccaagaa gtttctgagc120tttgtggcct accaagggag aaactggctg cagcagagcg agtacttcgt tccaacatgg180acatcctgaa gccaatcctg gtgagtagac ttgctcactg gagaaacttc aagcactaat240gctttcggaa tgtgaggctt ttccttggac agcatgactt tgttttgtag aaaagtacgg300<210>2<211>300<212>DNA<213>人屬，人種(Homo sapiens，human)<400>2ccagttaata atcctgtaat gttcaatacc ttcaccttat atattatgtg tgtatgtttt 60aattgcagtt tgaatgatat tgttgctgtg ggacctgagc acttttatgg cacaaatgat120cactattttc ttgaccccta cttacaatcc tgggagatgt atttgggttt agcgtggtcg180tatgttgtct actatagtcc aagtgaagtt cgagtggtgg cagaaggatt tgattttgct240aatggaatca acatttcacc cgatggcaag tatgtgaact ctctgaaatg tagtggattt300<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3tgtgcaatgg atcaaaatca g 21
<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4gtgagcaagt ctactcac 18<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5ggacctgagc acttttatg19<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6ttggactata gtagacaaca 20<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>探針<400>7accaagggag gaactggctg c 21<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>8cgatcctggg agatgtattt gg2權利要求
1.一種檢測冠心病易感性的試劑盒，其特征在于包括同時檢測ABCA1基因SEQ ID NO1中第136位SNP位點與PON1基因SEQ ID NO2中第146位SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液、去離子水。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對SEQ ID NO1中第136位SNP與SEQ ID NO2中第146位SNP位點而設計，能特異性擴增出包含SEQ ID NO1中第136位SNP位點的DNA片段與包含SEQ ID NO2中第146位SNP位點的DNA片段的引物對。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針是指針對SEQ ID NO1中第136位SNP與SEQ ID NO2中第146位SNP位點而設計，能通過熒光定量PCR技術特異性檢測出這兩個SNPs位點冠心病易感基因型的探針。
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對選自具有SEQ ID NO3和4所示序列的引物對以及具有SEQ ID NO5和6所示序列的引物對。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選自具有SEQ ID NO7和8所示序列的Taqman探針。
6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括1μl 10X熒光定量PCR反應緩沖液，0.1μl 25mM dNTP混合液，0.6μl 25mM MgCl2溶液，0.025μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶，20μM特異性引物對(四條)各0.225μl，10μM特異性熒光探針(兩條)各0.25μl，去離子水4.875μl。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20℃。
全文摘要
本發明公開了一種檢測冠心病易感性的試劑盒。該試劑盒包括同時檢測ABCA1基因SEQ ID NO1中第136位SNP位點和PON1基因SEQ ID NO2中第146位SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、用于熒光定量PCR檢測的常規組件等。本發明的試劑盒通過同時檢測分析個體的ABCA1基因與PON1基因上SNPs位點基因攜帶型來預測個體對冠心病的易感性。
文檔編號C12Q1/68GK101093195SQ20061002806
公開日2007年12月26日 申請日期2006年6月23日 優先權日2006年6月23日
發明者馮哲民, 鄒祖燁, 樓屹 申請人:上海主健生物工程有限公司