專利名稱：新型微核糖核酸定量pcr(聚合酶鏈式反應)檢測方法
技術領域：
本發明專利涉及微RNA(microRNAs)和小干擾RNA(siRNAs)的檢測和表達定量分析；本發明還涉及其他與人類疾病相關(如癌癥)核糖核酸如非編碼RNA(non-coding RNA)、mRNA剪接變異體(mRNA splice Variant)的檢測和表達定量分析。
背景技術：
本發明運用實時定量PCR(Reai-time PCR)并結合分子信標探針(Molecular Beacon)技術，適用于以多種不同制備方法得到的RNA樣本(如總RNA、細胞裂解物等)為模板，對小干擾RNA、生物細胞內微小RNA及其他核糖核酸靶序列的特異性檢測和表達定量分析。微RNA(microRNAs)核糖核酸(RNA)很長一段時間內被人們認為只是起到將基因組DNA內儲存的遺傳信息轉錄出來并翻譯成蛋白質的功能。隨著人類基因組計劃的開展和深入，人們發現絕大部分的基因組DNA并不編碼蛋白質，而是轉錄出大量的非編碼RNA(non-coding RNA)(Wong et al.2001，Genome Research111975-1977)。近來，大量的小的非編碼RNA(small non-coding RNA)相繼被發現，人們將這種小的非編碼RNA統稱為微小RNA(microRNAs)。最早發現的微小RNAlin-4和let-7，被認為在線蟲不同生長發育階段都起著重要的調控作用(Lee et al.1993，Cell 75843-854；Reinhart et al.2000，Nature 403901-906)。微小RNA廣泛存在于各種不同生物體內，并且表現出多種多樣的表達差異，這些都提示著microRNAs可能有非常廣泛的生物功能(Ke et al.2003，Curr.Opin.Chem.Biol.7516-523)。近來的研究工作表明，microRNAs可在包括早期發育、細胞增殖、細胞凋亡、細胞死亡、脂肪代謝和細胞分化等多個水平上進行基因表達調控。研究者們相信，microRNAs很可能代表在一個新發現層次上的基因表達調控方式。
MicroRNAs(microRNAs)是生物體內天然產生的一群高度保守的短的單鏈RNA(約21～25個堿基)。細胞內microRNAs以兩種形式即前體和成熟體的形式存在，只有短的成熟體具備生物活。該成熟體由具有發夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工而成。(Ambros et al.2003，RNA9277-279)。到目前為止，已經有超過700余種microRNAs相繼在人類、線蟲、小鼠、植物體中被發現，microRNAs數據庫如Sanger Institute也相繼建立。根據現有的發現可將microRNAs的特點概括如下(Ke et al.2003，Curr.Opin.Chem.Biol.7516-523)1.microRNAs成熟體是長約21～25個堿基單鏈RNA；2.microRNAs成熟體由具有發夾結構的約70-90個堿基大小的microRNAs前體分子經過Dicer酶加工而成。
3.MicroRNAs由特定基因編碼，但不翻譯成蛋白質；越來越多的證據表明，microRNAs在基因表達調控中起著非常重要的作用。最早被發現的兩個microRNAs——lin-4 and let-7被認為是通過不完全互補結合到目標靶mRNA3’非編碼區端，以一種未知方式誘發蛋白質翻譯抑制，進而抑制蛋白質合成，阻斷mRNA的翻譯(Lee et al.1993，cell75843-854；Reinhart et al.2000，Nature 403901-906)。MicroRNAs與其靶RNA的互補可以引發靶RNA的降解，盡管許多microRNAs和其潛在的目標靶之間并非完全互補(Hut-vanger and Zamore 2002，Science2972056-2060)。MicroRNAs的重要功能已經使其成為當前基因功能研究領域內的一個新的熱點。
微RNA(microRNAs)與人類疾病對人類基因組的研究表明，microRNAs在人類的生長發育和疾病的發生中都起著非常重要的作用，許多疾病已經證實和microRNAs及其作用機制密切相關。例如脊髓性肌萎縮癥(SMA)，該病是一類由于脊髓前角細胞變性導致近端肌無力、肌萎縮的常染色體隱性遺傳性疾病。SMN基因(survival motor neuron)被認為是SMA的決定性基因。SMN基因復合體中的兩個蛋白質Gemin3和Gemin4同樣也是miRNP(microRNAs復合體)的組成成分(Paushkin et al.2002，Curr.Opin.Cell Biol.14305-312)。另外的研究發現miR-224與脆性X染色體腦發育遲緩癥(FXMR)同樣具有密切的關系(Dostie et al.2003，RNA9180-186)。
在慢性淋巴細胞白血病(CLL)中研究發現，miR-15a和miR-16-1存在缺失或下調，miR-15a和miR-16-1的表達與CLL中Bc12的表達相反，這兩個microRNA在轉錄后的水平上對Bc1-2起負調節作用。在白血病細胞系中已經觀察到，含有9bp Bc1-2互補序列的miR-15a和miR-16-1，通過抑制Bc1-2蛋白表達，誘導腫瘤細胞凋亡。miR-15a和miR-16-1是Bc1-2天然的反義作用因子，可以用于治療Bc1-2過表達的腫瘤(Cimmino A，et al.Proc Natl Acad Sci USA.2005Sep 27；102(39)13944-9.)。
microRNA的表達情況與包括I期腫瘤在內的肺腺癌的生存相關。單因素分析表明，hsa-mir-155高表達和hsa-let-7a-2低表達與預后不良有關；多因素分析表明，hsa-mir-155高表達是預后不良的因素(Yanaihara N，et al.Unique microRNA molecular profiles inlung cancer diagnosis and prognosis.Cancer Cell.2006 Mar；9(3)189-98.)。
俄亥俄州立大學的Stefano Volinia等人通過分析來自肺部、胸部、胃部、前列腺、結腸和胰腺等處的癌細胞樣品540份，發現了由過量表達的大部分microRNAs組成的實體癌癥miRNA信號，在這些miRNA中包括miR-17-5p、miR-20a、miR-21、miR-92、miR-106a和miR-155。而對于編碼蛋白的腫瘤抑制子和致癌基因，這些microRNAs差異表達作用的靶目標會大量富集，其中得到證實的是腫瘤抑制子RB1和TGFBR2。這說明microRNAs在實體腫瘤的癌癥發病機理中發揮著重要的作用(Stefano Volinia，George A.Calin，PNAS February14，2006，103(7)2257-2261)。
有理由相信，隨著對miRNA介導的基因表達調控作用機制的不斷深入理解和發現，將促進新的治療方法的發展并可能帶來臨床用藥的革命(Nelson et al.2003，TIBS28534-540)。小干擾RNA(siRNAs)和RNA干擾(RNA interference)RNA干擾(RNA interfe ring，RNAi)現象是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引發的廣泛存在于生物體內的序列特異性基因轉錄后的沉默過程(Fire et al.1998，Nature391806-811)。細胞中的核糖核酸酶III家族成員之一的，dsRNA特異性的核酸酶Dicer將dsRNA裂解成由21-25個核苷酸組成的小干擾RNA(smallinterfering RNA，siRNA)(Lipardi et al.2001，Cell107297-307)，隨后siRNA作為介導子與RISC蛋白復合物結合并激活該復合物，引起特異性地降解相同序列的mRNA，從而阻斷相應基因表達的轉錄后基因沉默機制(Zhang et al.2002，EMBO J.215875-5885；Nyknenet al.2001，Cell107309-321)。
定量PCR(Real-time PCR)技術定量PCR技術是近年來發展起來的一種新型的PCR技術，它是在傳統PCR反應體系的基礎上添加了具有熒光標記的探針，將熒光信號強弱與PCR擴增情況結合在一起，通過監測PCR反應管內熒光信號的變化來實時觀測PCR反應進行的情況，解決了傳統PCR難以對擴增起始模板的量進行測定的難題，并具有快速、避免交叉污染等特點，在基因檢測、基因表達、SNP分析等領域得到廣泛的應用。
microRNAs和siRNAs的檢測只有21～25個堿基左右大小并且又時常處于低水平表達狀態的microRNAs需要一種靈敏的檢測定量分析方法。但由于缺乏其他有效的檢測方法，現在多數的研究者不得不采用傳統的Northern blot或核酸酶保護實驗的方法來檢測分析樣本中的microRNAs(Reinhart et al.2000，Nature403901-906；Lagos-Quintana et al.2001，Science294853-858；Lee and Ambros 2001.Science 294862-864)。也有報道用引物步移(Primer extension)的方法來檢測miRNAs(Zengand Cullen 2003，RNA9112-123)。以上方法具有一個共同特點就是都需要進行凝膠電泳及繁瑣冗長的實驗操作步驟，這就導致了很低的檢測靈敏度和精確度，同時還要大量消耗RNA樣本，對于某些寶貴的組織樣本而言，用上述方法尤其是Northern blot或核酸酶保護實驗來研究microRNAs幾乎是不可行的。
與Northern blot的方法相比，利用基因芯片來檢測microRNAs在高通量方面有了長足的進步。然而，基于固相或液相雜交的基因芯片檢測技術同樣要求高濃度的RNA樣本來保證足夠高的雜交效率和檢測信號，因此對于那些稀少的表達量很低的microRNAs，基因芯片往往很難檢測。此外，在應用基因芯片進行雜交之前，需要預先將microRNAs從RNA樣本中分離純化出來，以避免microRNAs前體分子的干擾及其造成的背景信號(Krichevsky et al.2003，RNA 91274-1281)。基因芯片技術適合于從眾多microRNAs分子中初篩感興趣的目標分子，然后再用更為靈敏的檢測方法如定量PCR來進行驗證。
2003年Grad等人報道了應用PCR技術來檢測microRNAs，由于該方法需要預先從凝膠中回收microRNAs，因此只適合于miRNA的克隆，而很難成為實驗室常規的檢測方法(Grad et al.2003，Mol.Cell 111253-1263)。2004年Schmittgen等人報道了一種應用定量PCR分析microRNAs前體分子的方法，但這種方法仍未能解決對microRNAs成熟體進行檢測的難題(Schmittgen et al.2004，Nucleic Acids Res.32e43)。2005年Caifu Chen等人報道了應用TaqMan-MGB探針對microRNAs分子進行定量PCR檢測的方法，該方法與其他方法相比具有檢測靈敏度高、樣本消耗量少的特點，但是TaqMan-MGB熒光探針合成價格昂貴又使其的應用受到限制(Caifu Chen et al.2005，NucleicAcids Res.33e179)。
本發明應用靈敏的定量PCR技術對樣本中的microRNAs及siRNAs進行檢測，只需1～10ngRNA樣本即可進行檢測，解決了傳統Northern blot、基因芯片技術樣本消耗量大，實驗操作繁瑣，檢測靈敏度低等缺點；新型分子信標探針的采用，解決了TaqMan-MGB探針合成價格昂貴的缺陷，是一種方便、快捷、經濟的檢測方法。
發明內容
隨著基因組功能、表達調控研究的不斷深入及對miRNAs的不斷發現，研究者們愈來愈需要一種便捷、靈敏、經濟并且能夠從復雜的RNA樣本中特異性地檢出miRNAs和siRNAs的檢測方法。本發明解決了前面所述的傳統檢測方法在特異性、靈敏度、檢測成本等方面的不足，可從極少量的RNA樣本(低至1ng總RNA)中特異性地檢出miRNAs；避免了miRNAs前體分子的干擾，即使相差一個堿基的高度同源miRNAs也可被精確區分；在2個小時內得到檢測結果，大大縮短了實驗操作時間并降低了實驗成本。
本發明解決其技術問題所采用的技術方案是1.應用莖環狀的逆轉錄引物(Reverse Transcript primer)將RNA樣本中的miRNAs分子逆轉錄成cDNA。設計的RT引物5’端和3’端臨近堿基序列互補，形成莖環狀結構；3’端最后5～7個堿基與靶miRNA分子的3’端互補，以實現對靶miRNA分子的結合并完成逆轉錄反應。在整個逆轉錄反應過程中，RT引物都不會改變其莖環狀的結構。這種莖環狀的結構較之常規的線性RT引物具有更高的特異性和逆轉錄效率。莖環狀結構所造成的空間位阻效應可以避免miRNAs前體分子的非特異性結合，同時也可以排除雙鏈的基因組DNA對逆轉錄反應造成的干擾。這種RT引物的采用，大大降低了對RNA模板的要求，即使簡單地將細胞裂解不做進一步處理，也可作為逆轉錄反應的底物。同時，應用該RT引物可在同一反應體系內進行多個逆轉錄反應，從而實現對多種不同miRNA分子的同時檢測。
2.應用逆轉錄引物中的部分序列作為PCR的引物。為保證PCR(聚合酶鏈式反應)的高效進行并保證一定的序列特異性，一般PCR引物的長度都在20個堿基左右，一對PCR引物堿基序列在40個堿基左右。因此對于只有21～25個堿基的微小RNA而言，應用PCR技術對其進行擴增和檢測是一個巨大的挑戰。為解決這個問題，本發明采用逆轉錄引物中的部分序列作為PCR的引物之一，然后根據靶miRNA設計PCR的另一個引物，從而實現對靶miRNAs的擴增。
3.應用分子信標(Molecular Beacon)探針監測miRNAs的擴增并對模板中miRNAs進行定量分析。分子信標探針是一種發夾狀的寡核苷酸探針，由5～7個GC配對的莖區和序列特異性的loop環區構成。熒光基團和熒光淬滅基團通常標記在探針的5’端和3’端。當探針的莖區處于關閉狀態時，拉近了熒光基團和淬滅基團的物理距離，使得熒光基團發出的熒光信號被淬滅基團吸收。在PCR的退火階段，當miRNAs或擴增子模板存在時，探針序列特異性的loop環區與模板結合，可使探針打開發夾狀的二級結構，從而產生熒光信號。分子信標探針的特點在于具有很強的序列特異性，當序列特異性的環區與模板之間存在不匹配堿基時，探針將仍然保持發夾狀結構而不與模板結合。
4.另外一個影響分子信標探針與模板結合的因素是定量PCR的退火溫度。本發明利用RT引物3’端的臨近堿基作為探針5’端莖區和loop環區的構成部分，在探針的3’端設計5’端互補序列以形成發夾結構。這種設計達到的效果是避免了探針與引物之間二聚體的形成同時又保證探針了具有足夠高的Tm值，使其在定量PCR的退火階段能與模板發生特異性的結合。
本發明采用靈敏的定量PCR技術，可在2個小時內從低至1ng的總RNA中特異性的檢出靶miRNA，解決了傳統Northern blot及基因芯片技術樣本消耗量巨大，實驗操作繁瑣，檢測靈敏度低等缺點；采用莖環狀結構的逆轉錄引物，提高了逆轉錄反應的特異性和效率，降低了對樣本RNA的要求，即使簡單地將細胞裂解而不作進一步處理，也可作為RT及PCR反應的底物；應用改進的分子信標探針，提高了定量PCR反應的特異性，避免了microRNA前體分子和基因組DNA污染對定量PCR反應的影響。
下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。
圖1是本發明對miRNAs進行定量RT-PCR檢測的技術線路圖。
圖2是本發明采用的逆轉錄引物圖例。
圖3是分子信標探針圖例。
圖4是分子信標探針的熔解雜交曲線。
圖5是以合成的Let-7a和Let-7b microRNAs為模板進行Real-time RT-PCR。
圖6是Let-7a定量PCR標準曲線。
圖7是以抽提的總RNA為模板對Let-7a進行定量PCR檢測。
圖中1.逆轉錄引物通過5’端和3’端臨近堿基形成莖環狀結構，2.逆轉錄引物的microRNA序列特異性區域，3.莖環狀分子信標探針的5’端和逆轉錄引物的3’端具有相同序列，4.Let-7a分子信標探針隨溫度的不斷降低而關閉莖環結構，5.Let-7a分子信標探針與Let-7a模板的雜交曲線，6.Let-7a分子信標探針與Let-7b模板的雜交曲線，7.Let-7a分子信標探針與Let-7a模板的擴增曲線，8.Let-7b分子信標探針與Let-7b模板的擴增曲線，9.Let-7a分子信標探針與Let-7b模板未出現擴增，10.Let-7b分子信標探針與Let-7a模板未出現擴增。
具體實施例方式
1.Let-7a和Let-7b引物和探針的設計設計Let-7a RT引物為“5’-CCTGCGGCAAGTCTACGAACATATAGCATTCACCCGCAGGAACTAT-3’”，如圖2；其中5’端堿基序列“5’-CCTGCGG”和3’端“CACCCGCAGGAACTAT-3’”中的“CCGCAGG”互補，使RT引物形成莖環狀結構，3’端“AACTAT-3”與Let-7a的3’端互補。以RT引物中的部分序列“GGCAAGTCTACGAACAT”為PCR引物之一，根據Let-7a序列設計PCR的另一個引物為“GCTTGAGGTAGTAGGTTG”。以RT引物3’端“CCGCA”序列為Let-7a分子信標探針的5’端莖部，設計探針序列為“FAM-5’-CCGCAGGAACTATACATGCGG-3’-DABCYL”，如圖3，其中FAM為熒光報告基團，DABCYL為熒光淬滅基團。
按照同樣的原則設計Let-7b的RT引物“5’-CCTGCGGCAAGTCTACGAACATATAGCATTCACCCGCAGGAACCAC-3’”及PCR引物“GGATTGAGGTAGTAGGTTGT”和“GGCAAGTCTACGAACAT”，Let-7b分子信標探針序列為“FAM-5’-CCGCAGGAACCACACTGCGG-3’DABCYL”。
2.用合成的Let-7a探針互補鏈“GGTTGTATAGTTCCTGCGGGTGAA”及Let-7b探針互補鏈“GGTTGTGTGGTTCCTGCGGGTGAA”分別與Le t-7a分子信標探針進行熔解曲線和雜交實驗。熔解曲線反應體系為40ul，0.2uM探針，5×qPCR Buffer 0.8ul；雜交實驗反應體系為40ul，0.2uM探針，0.5uM Let-7a探針互補鏈或0.5uM Let-7b探針互補鏈，5×qPCR Buffer0.8ul。溫度變化為從90℃每個循環降低0.5℃并持續25秒，依次降至40℃并采集熒光信號。Let-7a探針的熔解曲線實驗反映當溫度逐漸降低時，探針的莖環結構也逐漸關閉，導致反應管內熒光信號的降低，如圖4中曲線4所示。Let-7a探針與Let-7a探針互補鏈的雜交實驗表明當反應體系內存在探針的互補模板時，探針可與之結合并打開莖環狀結構，導致反應管內熒光信號增強，如圖4中曲線5所示。Let-7a探針與Let-7b探針互補鏈的雜交實驗表明，當模板與探針存在不匹配堿基時，探針將仍保持關閉狀態而不與之結合，如圖4曲線6所示。3.在25ul RT反應體系(5×RT reaction buffer 5ul，100U MMLV)中加入0.01nM的合成Let-7a和Let-7b RNA各1ul，逆轉錄反應(16℃30分鐘，42℃30分鐘，85℃5分鐘)后取4ul逆轉錄產物加入40ul定量PCR反應體系(5×qPCR buffer 8ul，0.2uM primer sets，0.2uMLet-7a probe，3mM Mg2+，2U Taq酶)，進行定量PCR反應(94℃3分鐘，94℃15秒，55℃25秒，72℃25秒，40個循環)后分別得到Let-7a和Let-7b的擴增曲線，其Ct值分別為13.44和12.56，如圖5所示。
4.在含有Let-7a、Let-7b探針的定量PCR反應體系中分別加入Let-7b、Let-7a逆轉錄產物4ul進行定量PCR反應(94℃3分鐘，94℃15秒，55℃25秒，72℃25秒，40個循環)。Let-7a和Let-7b只存在兩個堿基的差異，同源性高達90％；應用本方法對其分子信標探針的特異性進行檢測，實驗結果為Let-7a、Let-7b兩分子信標探針均未出現非特異性檢出。說明本方法可顯著區分高度同源的microRNAs分子。結果如圖5所示。
5.Let-7a的定量PCR擴增標準曲線。在25ul RT反應體系(5×RT reaction buffer 5ul，100U MMLV)中加入從5×10-3fM至5×104fM的合成的Let-7a RNA，進行逆轉錄反應(16℃30分鐘，42℃30分鐘，85℃5分鐘)；取4ul逆轉錄產物加入40ul定量PCR反應體系(5×qPCR buffer 8ul，0.2uM primer sets，0.2uM Let-7a probe，3mM Mg2+，2U Taq酶)，進行定量PCR反應后得到Let-7a的標準曲線，如圖6所示。標準曲線的Y軸截距44.4，斜率-4.07，相關系數1.0，均方差0.09。
6.將從組織細胞中抽提得到的總RNA按250ng、50ng 5倍梯度稀釋至0.016ng分別作為逆轉錄反應模板進行RT反應后，取4ul RT產物進行定量PCR反應，得到的Ct值分別為14.71，17.60，20.04，23.01，25.84，28.82，32.02，如圖7所示。說明本方法與起始模板加入量具有很好的相關性，并且可從極低量的總RNA中檢出目標microRNA分子。
權利要求
1.一種對非編碼RNA如微小RNA、小干擾RNA的擴增、檢測、鑒別、定量分析的方法，其特征是應用熒光標記的分子信標探針對靶核酸進行定量PCR檢測和分析。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征是設計逆轉錄引物的5’端和3’端臨近堿基互補，以形成莖環狀結構；利用莖環狀逆轉錄引物的3’端堿基與靶核酸分子配對結合；應用逆轉錄酶進行逆轉錄反應，合成靶核酸分子的互補DNA鏈；應用莖環狀逆轉錄引物中的部分序列作為定量PCR的引物之一；應用熒光標記的分子信標探針對逆轉錄得到的cDNA進行定量PCR檢測分析。
3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征分子信標探針的5’端與逆轉錄引物的3’端臨近堿基具有相同序列；探針具有和靶核酸相同或互補的序列；探針的5’端和3’端序列互補以形成莖環狀結構；探針標記有熒光基團。
4.一個對非編碼RNA如微小RNA、小干擾RNA的擴增、檢測、鑒別、定量分析的試劑盒，該試劑盒具備逆轉錄反應、PCR反應組分和熒光標記的分子信標探針。
全文摘要
一種新的微小RNA(microRNAs)和小干擾RNA(siRNAs)定量PCR檢測方法。它應用逆轉錄引物的5′端和3′端臨近堿基互補形成莖環狀結構，利用逆轉錄引物3′端與靶核酸互補結合，應用逆轉錄酶進行逆轉錄反應；以逆轉錄引物中的部分序列作為PCR引物之一，對逆轉錄反應得到的cDNA進行擴增；應用熒光標記的分子信標探針對定量PCR進行實時監測。
文檔編號C12Q1/68GK101082060SQ20061002721
公開日2007年12月5日 申請日期2006年6月1日 優先權日2006年6月1日
發明者譚玉龍, 張中華, 段春曉, 張佩琢 申請人:上海吉瑪制藥技術有限公司