一種抗t淋巴細胞瘤的自身t細胞疫苗及制備方法

專利名稱：一種抗t淋巴細胞瘤的自身t細胞疫苗及制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種疫苗，尤其是具有提高抗T淋巴瘤和其他類型腫瘤的抗T淋巴細胞瘤的自身T細胞疫苗，及其制備方法和用途。
背景技術：
自身反應性T細胞參與了自身免疫病的發(fā)生，接種未活化的自身反應性T細胞可以引起抗獨特型反應，從而減少此種引起自身免疫病的自身反應性T細胞。但是，接種減活的健康自身T細胞是否可以增加抗腫瘤反應，這點還尚未明了。
眾所周知，免疫系統(tǒng)的監(jiān)視功能可以在體內抑制腫瘤的生長。但是在許多情況下，腫瘤可以通過限制有效的免疫反應而逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。雖然在腫瘤細胞表面也有一些腫瘤抗原被認為可以介導抗腫瘤免疫反應使腫瘤細胞暫時消失，但是體內大部分的惡性腫瘤細胞不會被免疫系統(tǒng)所排斥。這牽涉了多方面的原因，比如，惡性腫瘤細胞可以通過多種機制介導免疫耐受。在惡性腫瘤病人中，免疫應答及對刺激因素的反應性都顯著低于正常個體。并且，由于一些抑制性細胞因子的分泌，如TGF-β、IL-10等使得惡性腫瘤細胞無法誘發(fā)有效的特異性免疫反應。因此，在研究及發(fā)展新的抗腫瘤治療中如何提高抗腫瘤免疫應答是首要任務。近來，對于惡性腫瘤病人治療的臨床試驗大都圍繞在誘導抗腫瘤的特異性免疫反應中。例如，DC疫苗是腫瘤免疫治療中最普遍的生物制劑療法。目前多種DC疫苗被研制開發(fā)，大都是通過基因修飾或負荷腫瘤抗原以期實現(xiàn)用更多的抗原在體內引發(fā)較強的抗腫瘤反應的目的。然而，由于DC疫苗制備的復雜性及較高的成本使之暫時還難以真正運用到臨床治療當中。
在抗腫瘤免疫反應中，T細胞發(fā)揮了重要作用。它參與了細胞毒性殺傷作用，免疫調節(jié)及保持免疫自穩(wěn)等。激活的CTL通過釋放顆粒酶B或通過Fas-FasL途徑介導調亡從而直接融解腫瘤細胞。并且，CD4+T細胞可以通過釋放一些細胞因子而引起腫瘤細胞的免疫排斥。然而，在惡性腫瘤患者的體內T細胞的活性被下調。例如，腫瘤病人細胞在體外對絲裂原或抗原的刺激顯示較低的反應性。因此，對于腫瘤治療來說，有效生物治療的關鍵就是增強抗腫瘤T細胞的功能。有證據(jù)表明，對腫瘤患者使用IL-2加INF-γ可以誘導腫瘤的消退。這些都更進一步說明，在腫瘤的生物治療中，增強抗腫瘤T細胞反應是重中之重。
給同系動物或病人注射經(jīng)照光的活化的自身反應性T細胞可能能夠誘導抗獨特型T細胞反應，從而在體內抑制自身反應性T細胞。但是到目前為止，國內外從未有過對于用健康活化滅活T細胞免疫接種后具有抗腫瘤的研究報道。
對于腫瘤病人，當手術切除了原發(fā)病灶以后，殘余的腫瘤細胞要靠放療或者化療進行清除，而這兩種治療方法副作用十分嚴重，而且往往不能完全消滅殘余腫瘤細胞。樹突狀細胞(DC)是體內最有效的抗原遞呈細胞，可以激發(fā)強大的主動抗腫瘤免疫。但是由于腫瘤抗原性弱、腫瘤患者DC細胞功能不成熟，因而通常情況下腫瘤患者無法產(chǎn)生有效的主動抗腫瘤免疫。
免疫系統(tǒng)具有免疫監(jiān)視而抑制體內腫瘤的生長。但是在大多數(shù)情況下，腫瘤細胞可以逃脫免疫監(jiān)視而在體內生長。雖然腫瘤也能夠表達特異性抗原，但是大多數(shù)腫瘤還是不能被免疫系統(tǒng)所排斥。惡性腫瘤細胞的生存與許多因素有關。如腫瘤細胞具有誘導免疫耐受的作用。在惡性腫瘤病人，免疫反應比健康人低的多。此外，惡性腫瘤細胞可以通過分泌抑制性細胞因子如TGF-β和IL-10而抑制免疫應答。因此，增強抗腫瘤免疫應答是設計和發(fā)展新型抗腫瘤治療的關鍵。最近，已經(jīng)發(fā)展了許多旨在提高病人的特異性抗腫瘤反應的臨床試驗。如樹突狀細胞腫瘤疫苗是最常用的腫瘤生物治療之一。DC疫苗通過在體內誘導T細胞對腫瘤的免疫反應而達到增強抗腫瘤的目的。但是，DC細胞少，制備十分繁瑣，因而限制了DC疫苗在臨床上的使用。
T細胞在抗腫瘤免疫中具有十分重要的作用。T細胞介導的細胞殺傷和免疫調節(jié)作用具有維持免疫平衡的作用?；罨臍訲細胞(CTL)可以通過釋放粒酶或通過Fas-FasL途徑而介導腫瘤細胞的裂解。此外，CD4+T細胞也能夠通過分泌細胞因子而介導抗腫瘤免疫。DC疫苗也必須通過活化T細胞才能達到抗腫瘤免疫。然而，腫瘤病人體內活化的T細胞表達下調。如腫瘤病人體內的T細胞對絲裂原或抗原刺激反應是降低的。因此，增強T細胞的抗腫瘤作用是提高抗腫瘤生物治療的關鍵。許多證據(jù)已經(jīng)表明，通過聯(lián)合使用IL-2和IFN-γ能夠在有效提高抗腫瘤作用，在某些病人甚至導致腫瘤消退。因此，增強T細胞功能是抗腫瘤生物治療的關鍵。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有提高抗T淋巴瘤的自身變構細胞接種疫苗。
本發(fā)明是利用健康的減活的自身活化T細胞作為疫苗。
該疫苗能加強免疫增生的能力，并能有效的抵御淋巴細胞的激活誘導凋亡(AICD)，從而更好的抑制腫瘤細胞的增長。
在本發(fā)明中，我們證明了用正常滅活的自體T細胞皮下接種后，可以在體內誘導T細胞的活化，并在體外引起T細胞的強烈增殖。更為重要的是，此種免疫增強了抗腫瘤反應，在接種了T淋巴瘤的小鼠體內可使腫瘤生長抑制。其中CD4+T細胞可通過分泌大量的細胞因子如白介素、腫瘤壞死因子、γ干擾素等提高患者的腫瘤免疫力、CD8+T細胞則可以直接識別殺傷表達腫瘤抗原的癌細胞、NK對腫瘤細胞的殺傷力也增強，從而達到抑制腫瘤細胞的目的。因此，本法制備的自體T細胞對于手術切除的腫瘤患者，有助于預防復發(fā)及消除殘余的癌細胞；對于無法手術治療的患者，能使瘤塊縮小，阻止其轉移和擴散，提高生存率。是良好的輔助治療腫瘤的方法，可用于臨床的腫瘤輔助治療。
以下結合附圖及實例詳述本發(fā)明。


圖1自身T細胞免疫反應引起的T細胞增殖。對照組和免疫的C57小鼠的脾臟細胞在包含10％的FCS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)中加入ConA(2μg/ml)作為陽性對照。用3H標記的胸腺嘧啶脫氧核苷摻入來測量細胞增殖。標記的培養(yǎng)基表示在培養(yǎng)基中包含10％FCS。標記的ConA表示在培養(yǎng)基中含有ConA。
圖2由自身T細胞免疫反應引起的T細胞活化與增殖。脾臟細胞在包含10％FCS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，1×106的細胞被CD3，CD4，CD8以及CD62L的羊抗鼠抗體標記，用流式細胞儀進行檢測。開放的和黑色的條帶表示從免疫組和對照組中分離出來的細胞。A免疫組和對照組中增殖的T細胞亞群。B用CD62L作為激活標志對T細胞進行活性分析。
圖3體外免疫組小鼠脾臟細胞的抗AICD反應。在包含10％FCS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后用Annexin-V plus-PI雙標記檢測脾臟細胞凋亡，并用流式細胞儀進行分析。只有Annexin-V+/PI-的細胞被認為是凋亡細胞。分析凋亡的T細胞亞群，細胞被Annexin-V，PI和CD4或CD8抗體標記同時發(fā)生。A在對照組(左)和免疫組(右)中設門分析調出的凋亡抑制細胞。B培養(yǎng)48小時后凋亡細胞的百分比。C培養(yǎng)48小時后T細胞亞群凋亡情況。開放條帶代表對照組凋亡細胞百分比。黑色條帶代表免疫組小鼠脾臟細胞百分比。
圖4在不同的時間點分析免疫組和對照組小鼠Fas和FasL的轉錄。免疫組和對照組小鼠脾臟細胞在包含10％FCS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)0小時，24小時，48小時，72小時，96小時，抽提RNA并用real-timePCR檢測mRNA水平的Fas和FasL的翻譯。在同一個樣本中Fas表達用內源性GAPDH的表達進行標準化，用免疫組小鼠的ΔCT值和內參(GAPDH)的差異來計算表達。計算Fas/FasL基因的相對表達以及表達2-ΔΔCT。A對照組和免疫組中的Fas表達。B對照組和免疫組中的FasL表達。
圖5免疫組小鼠T細胞高表達GADD45β。免疫組小鼠T細胞在包含10％FCS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，GADD45β的表達用real-time PCR和Western blot進行檢測。在0小時，2小時，8小時，16小時，24小時，48小時抽提RNA進行real-time PCR檢測。在同一個樣本中GADD45β表達用內源性GAPDH的表達進行標準化.。用免疫組小鼠的ΔCT值和內參(GAPDH)的差異來計算表達。計算GADD45β基因的相對表達以及表達2-ΔΔCT。
圖6對于腫瘤威脅的免疫保護作用。將小鼠分為兩組，每組5只。對照組(n＝5)接受1×106的EL-4細胞接種而不接種稀釋的自身T細胞。免疫組五只小鼠在接種1×106的EL-4細胞之前每五天免疫三次，另外在第5天和第10天時免疫兩次。在腫瘤細胞接種后每兩天測量一次腫瘤體積，當腫瘤體積達到2.0cm3時停止觀察。處死小鼠獲得血清做細胞因子和NK CTL檢測。AEL-4細胞接種后腫瘤體積與時間的關系。B免疫組與對照組細胞因子的表達。C免疫組與對照組的NK細胞的細胞毒性。D免疫組與對照組的CTL細胞的細胞毒性。
具體實施例方式
一、材料和方法老鼠雌性C57/B1/6鼠購自于上海試驗動物中心，中國科學院。飼養(yǎng)于無菌環(huán)境，于4～8周齡使用；制備自體活化T細胞于完全必需培養(yǎng)基DMEM10％小牛血清，10mMHEPES，50uMβ巰基乙醇，2mML-谷氨酰胺，50IU/ml青鏈霉素；使分離純化的脾細胞(3×106/ml)用2ug/mlConA(VectorLaboratories，Burlingama，CA)刺激72小時。收集細胞，PBS(PH7.4)洗滌三次。接著用特異性抗體包被的磁珠(Dynal Biotech，Oslo，Norway)通過陰選純化T細胞。所得T細胞純度大于92％。純化后的T細胞經(jīng)照光儀使用3000rad照光，作為后續(xù)免疫接種所用的自體活化T細胞。
用照光自體T細胞免疫的最佳試驗條件分別用1×106(lower dose)，5×106(middle dose)and 10×106(high dose)三種不同T細胞量進行免疫。純化的T細胞經(jīng)3000rad照射后和100ulPBS腹腔注射入小鼠體內，并另外單獨皮下注射100ulPBS。同樣的方法每隔五天注射一次，共三次。對照用同樣方法注射200ulPBS。第三次注射五天后，收集小鼠脾臟細胞。
增殖試驗簡單說來，新鮮分離的脾臟細胞(2×105per well)于含有三倍完全DMEM的培養(yǎng)板中加ConA或者不加ConA(2ug/ml)置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時。在收集細胞前的16-18小時加入1uCi[3H]脫氧嘧啶胸苷。用以測定CPM值。T細胞增殖的能力通過[3H]脫氧嘧啶胸苷的參入來決定。刺激指數(shù)(SI)(免疫鼠T細胞的CPM值/未免疫鼠的CPM)用來反應對于絲裂原的反應能力。
流式細胞術分析細胞表面分子為了研究T細胞活化及亞群分型情況，將細胞體外孵育在含10％FCS的完全培養(yǎng)基中24小時，收集細胞并用HBSS緩沖液洗滌兩次，1×106細胞用特異性羊抗鼠的CD3，CD4，CD8及CD62L抗體染色，并用流式細胞儀檢測。對于Fas及FasL的分析，培養(yǎng)的細胞分別于24、48、72、96及120小時收集，并用HBSS緩沖液洗滌兩次，1×106細胞用特異性羊抗鼠的Fas、FasL染色，并用流式細胞儀檢測。簡單說來，將細胞重懸在含有1％BSA及0.1％疊氮化納的PBS中，和標記有FITC或PE的抗體或同種對照抗體在冰上共孵育30分鐘。Fas、FasL抗體購自BDBioscience。樣品分析所用儀器為FACS CaliblerTM(Becton Dickinson，San Jose，CA)。
調亡試驗調亡細胞用FITC標記的Annexin V及PI染色，并通過流式細胞儀檢測。對于T細胞亞群中調亡的檢測來說，脾細胞同時要用Annexin V，PI及抗CD4或CD8抗體(Cy5標記)標記。未免疫鼠及免疫過鼠的細胞培養(yǎng)在含10％FCS的完全培養(yǎng)基中并于48小時檢測調亡。調亡細胞的數(shù)量用Annexin V+/PI-表示。調亡細胞的百分比通過Annexin V+/PI-細胞數(shù)與總細胞數(shù)之比計算。
實時PCR檢測mRNA表達細胞分別培養(yǎng)24，48，72小時并收集。細胞用HBSS緩沖液沖洗兩次，細胞總RNA用迷你試劑盒從1×106細胞沉淀物中提取出來。基因組DNA在cDNA合成之前用不含RNA酶的DNA酶消化以利于RNA純化。RNA保存在-80度。針對每一個RNA樣本使用Sensiscript RT試劑盒合成第一條鏈cDNA。使用任意六聚物引導cDNA的合成。FAS，F(xiàn)ASL，和GADD45β的mRNA表達用SYBR Green主要的混合物的實時PCR確定的。熱循環(huán)條件包括一個起始保持在50度兩分鐘，然后95度十分鐘，接下來的兩步PCR程序包括40個循環(huán)的95度十五秒和60度六十秒。通過ABI-7900定量PCR檢測系統(tǒng)收集和定量分析數(shù)據(jù)。小鼠β肌動蛋白基因用來做內源性控制，以標準化每個樣本的RNA的量的差異。PCR的引物對如下所述Fas，5’-GCAGAAAGTCCAGCTGCTCC 3’-TTCTGCGACATTCGGCTTTT和FasL，5’-CACAACCACTCCCACTGCC 3’-CAGAGCCACCAGAACCATGAMouse GADD45β5’-CCTGGCAGAAATCGCTATGAA和3’-TGGAGTAGTTTTGAGTGTGGAAGGMouseβ-actin 5’-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3’和5’-AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAG A-3’.
腫瘤生長抑制測定在這項研究中使用小鼠淋巴細胞瘤細胞系EL-4。C57B1/6小鼠分成兩組?？刂平M沒免疫的小鼠皮下接種1×106EL-4腫瘤細胞。免疫接種組C57小鼠在接種0.5×106EL-4腫瘤細胞前免疫三次。每天測定腫瘤體積。在這組中，每周注射活化的T細胞直到控制組小鼠死亡。
NK細胞毒性測定YAC-1細胞，一種髓細胞性白血病細胞系，在加入了10％胚牛血清的RPMI-1640完全細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細胞懸液洗三次，并重新在RPMI-1640懸浮，作為所有試驗的靶細胞。單個脾細胞從自然和免疫的小鼠中獲取作為效應細胞。NK的細胞毒性的細胞毒性用乳酸脫氫酶釋放試驗來估價。總之，在測定緩沖液中的5×104恒量的靶細胞，加入到96個圓孔底的培養(yǎng)平板。在研究中效應細胞對效應靶細胞的數(shù)目的比例為40∶1，20∶1，10∶1，5∶1。在37度5％CO2中培育四個小時后，100μL上清液轉到相應的平底微量滴定平板。隨后，加入100μL乳酸脫氫酶混合物。隨后，在37度孵育五分鐘后，在全自動定量繪圖酶標儀上吸光度為490nm時檢測。細胞毒性按照如下公式計算，吸光毒性＝(試驗測得-效應細胞自然釋放-靶細胞自然釋放的LDH量)/(靶細胞最大釋放-靶細胞自然釋放LDH量)×100。
CTL細胞毒性測定在這項測定中，EL-4，一種小鼠淋巴母細胞在10％FCS RPMI-1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細胞懸液用PBS洗滌三次，并在RPMI-1640重新懸浮作為靶細胞。CD8+T細胞從新鮮的用Dynol beads陰性選擇的脾細胞。CTL的細胞毒活性用乳酸脫氫酶釋放試驗評估，如在以上的NK測定。一系列的效應細胞與效應靶細胞之比為10∶1，5∶1，2.5∶1和1.25∶1，操作步驟如同以上的NK測定一樣。
ELISA測定細胞因子血清從免疫的和自然的處死的小鼠中獲取。血清樣本中細胞因子(IL-12，IL-10，IL-4和TNF-α含量)用ELISA法測定。簡述之，微量滴定板用小鼠單克隆抗體覆蓋在4度下過夜，在室溫下用含3％牛血清白蛋白的PBS封閉2小時，并用含0.02％ Tween 20的PBS洗滌。每個樣本和它的對照加入臨近的孔并在4度下培養(yǎng)過夜。沖洗四次后，加入適當?shù)纳锼貦z測抗體，并培養(yǎng)2個小時。板沖洗四次，并用稀釋為1∶2000的抗生物素蛋白接合的辣根過氧化物酶培養(yǎng)2個小時。在檸檬酸鹽緩沖液中的0123％四甲基聯(lián)苯胺0.008％H2O2作為底物。顏色的變化可通過2N H2SO4中止。光密度用ELISA酶標儀在450nm測定，細胞因子的濃度可計算。
統(tǒng)計分析組之間的增殖和腫瘤體積的不同由Mann-Whitney U試驗檢測。一個學生的測定用來分析組間的不同，做單向方差分析決定在使用配對或不配對的學生T TEST檢驗是否存在顯著的差異。P值小于0.05被認為有顯著統(tǒng)計學意義。
結果一、自體T細胞免疫誘導的T細胞自發(fā)性增殖活性增強。
為檢測是否自體T細胞免疫可增強T細胞反應，從免疫的C57小鼠中獲取的新鮮的脾細胞在10％FCS，帶有ConA或不帶有ConA完全的DMEM中培養(yǎng)。細胞增殖在培養(yǎng)后72小時測定。結果顯示，從免疫的小鼠中獲取的脾細胞，在沒有其它的刺激物的情況下，在10％FCS完全的培養(yǎng)基中呈高水平自發(fā)增殖。對照，用PBS處理的小鼠的脾細胞不顯示自發(fā)增殖。在免疫的和未免疫小鼠中有顯著不同。然而，從免疫的或未免疫小鼠獲取的脾細胞用ConA刺激后的增殖水平?jīng)]有顯著不同。
為了評估是否免疫接種誘導抗TCR抗體，TCR抗體在體外可調節(jié)T細胞增殖，免疫過的小鼠取出的血清加入從免疫和天然的小鼠中的脾細胞，然后，在體外培養(yǎng)三天。測量增殖情況，結果顯示，從免疫的小鼠中獲得的血清不能啟動T細胞的增殖。不論細胞用免疫的或是未免疫小鼠的血清共同培養(yǎng)，都沒有增殖。而且，我們分析免疫小鼠的CTL的細胞毒性作用，結果顯示當CTL用CD4T細胞培養(yǎng)未發(fā)現(xiàn)細胞毒性。這表明，免疫既不能誘導足量的可參與TCR抗TCR抗體和活化T細胞增殖，也不能誘導抗TCR的殺傷。
二、自體T細胞免疫誘導T細胞在體內擴增和活化。
為確定是否T細胞在免疫后增殖，T細胞亞群用特異抗體標記后，經(jīng)流式細胞儀分析。結果顯示來自免疫小鼠的CD3+T，CD4+T，CD8+T高于未免疫小鼠，表明用自體T細胞免疫能刺激T細胞數(shù)量在體內擴增。而且，為表明是否增殖的T細胞被免疫接種活化，實施抗CD62L抗體染色測定。結果表明，從免疫小鼠獲取的CD62L陽性的T細胞高于同樣情況的未免疫小鼠細胞的五倍。兩組的細胞計數(shù)有顯著差異。這些結果表明，用未被照射的自身T細胞的免疫能增加體內T細胞的數(shù)量和誘導T細胞的活化，并進一步導致T細胞自發(fā)在體外的增殖。
三、免疫小鼠的脾細胞在體外對抗激活誘導凋亡活性。
為表明是否在體外，免疫接種增加T細胞抵抗活化誘導的細胞死亡，凋亡細胞用Annexin-V加PI染色檢測，當細胞在體外培養(yǎng)48小時后用流式細胞儀分析。結果顯示在選定細胞群中，未免疫小鼠淋巴細胞中有比免疫的小鼠更多的Annexin-V+和PI-的細胞，表明未免疫小鼠的凋亡細胞比從免疫的小鼠獲得的凋亡細胞要多。而且，我們在48小時培育的T細胞亞群用Annexin V，PI和抗CD4或CD8抗體標記脾細胞，來識分析凋亡細胞的數(shù)量。在未免疫小鼠，CD4+T和CD8+T細胞顯示了同樣的更高程度的凋亡。而在免疫小鼠，T細胞亞群顯示了更少的凋亡，特別是CD4+T細胞顯示了更少的凋亡。
由于FAS和FASL是調節(jié)AICD的主要分子，我們通過實時PCR，檢測免疫小鼠和未免疫小鼠FAS和FASL在T細胞的動態(tài)表達。結果顯示在體外FAS表達是增加的。動態(tài)表達表明，F(xiàn)AS轉錄在24小時時開始，并維持更高的表達直到96小時后。在每個檢測點，在免疫小鼠的FAS表達都高于在未免疫小鼠。相反的，F(xiàn)AS配體表達要低于未免疫小鼠。這些結果顯示，用失活的自體T細胞免疫后增加了FAS分子的轉錄，但是不能增加在體外培養(yǎng)的T細胞FAS配體的分子的表達。
四、GADD45β在免疫小鼠T細胞中的高表達。
用實時定量PCR方法檢測從免疫小鼠獲取的T細胞GADD45β的表達。結果顯示，在不同的檢測點，GADD45β的mRNA水平高于天然小鼠。在新鮮分離的T細胞，GADD45β的表達比未免疫小鼠高3倍。這表明，自體T細胞免疫啟動了在體內的基因轉錄。在體外研究中，細胞培養(yǎng)在10％FCS的完全培養(yǎng)基中，在16小時時，GADD45β的mRNA增加達到了最高水平。此后，GADD45β的mRNA的轉錄緩慢減低。對比一下，在未免疫小鼠，GADD45β的mRNA的水平逐漸上升并在8小時處達到最高水平。但是在8小時后，GADD45β水平快速下降并在48小時降到基線。這個結果顯示了GADD45β轉錄在體內通過免疫激活并保持了在體外脾細胞對刺激的敏感性。
五、自身T細胞接種后增強免疫反應具有抑制腫瘤生長活性。
為了檢測由自身反應性T細胞介導的細胞增殖是否引起了抗腫瘤反應的增強，在免疫過的小鼠體內接種小鼠T淋巴母細胞瘤細胞EL-4，在免疫組和對照組觀察腫瘤生長情況。圖6A顯示，在最后一次免疫后，腫瘤生長減慢。12天后免疫組的腫瘤體積比對照組明顯減小，在觀察結束時免疫組的腫瘤體積也比對照組明顯減小。以上結果顯示在免疫組小鼠體內腫瘤生長發(fā)生停滯。
六、免疫組小鼠血清IL-12濃度增高。
在小鼠被處死前收集兩組小鼠的血清，血清樣本做ELISA來檢測IL-12，IL-10，IL-4和TNF-α的表達。結果顯示只有IL-12的表達是免疫組明顯高于對照組，另外三種細胞因子在兩組之間并沒有明顯差別。以上實驗說明免疫組小鼠分泌的大量的IL-12可能是激活了體內的抗腫瘤細胞反應的機制之一。
七、免疫組小鼠體內NK細胞和CTL殺傷活性增加。
收集兩組小鼠的脾臟細胞，通過LDH釋放反應分析NK細胞的細胞毒性活性。結果顯示NK細胞和CTL的細胞毒性活性免疫組比對照組明顯升高。分析NK細胞，把脾臟細胞作為效應細胞，免疫組脾臟細胞的細胞毒性活性根據(jù)不同效應細胞與靶細胞比例(E∶T)呈現(xiàn)明顯的劑量依賴反應。在對照組沒有看到上述現(xiàn)象。分析CTL的細胞毒性，CTL與EL-4細胞孵育后免疫組小鼠的CD8+T細胞顯示高的OD值，提示免疫組小鼠的CTL對于EL-4細胞有較強殺傷活性，也呈明顯的劑量依賴性。這些數(shù)據(jù)顯示免疫組NK細胞和CTL細胞毒性增加。
通過本發(fā)明，我們用同品系健康小鼠活化的、滅活的T細胞給小鼠皮下接種3次以后可以誘發(fā)小鼠體內T細胞的活化。表現(xiàn)為小鼠的T細胞對絲裂原和異種抗原的反應能力增強、在體外存活時間延長、活化的細胞增多、CD8+T細胞增多。而且小鼠的NK和CTL活性也增強。這些經(jīng)過免疫的小鼠對于T細胞型腫瘤細胞(EL-4)的抵抗力增強，表現(xiàn)為經(jīng)免疫后的小鼠，在接種EL-4細胞株以后，出現(xiàn)腫瘤的時間晚、腫瘤生長小。與對照組相比有顯著差異(p＜0.01)。而且，我們的初步實驗證實，這一方法不僅對于EL-4腫瘤細胞具有抑制作用，而且對于小鼠的黑色素腫瘤也具有抑制作用(實驗數(shù)據(jù)未顯示)。提示這一自體活化T細胞疫苗可能具有廣泛的抗腫瘤活性。因此，我們擬就這一方案擴大到臨床使用。
討論眾所周知的是，將同系的動物或者病人體內活化的自身免疫型T細胞經(jīng)過放射處理之后，它們能在體內誘導抗獨特型T細胞，從而在某些案例中出現(xiàn)抑制和清除自身免疫型T細胞的結果[34，35]。例如，在多發(fā)性硬化癥的病例中，大量的實驗結果證實，調節(jié)性T細胞能夠調節(jié)自身免疫型T細胞并在外周循環(huán)中將其清除，減輕癥狀。T細胞疫苗的臨床研究證實，將滅活的自身T細胞接種回體內是安全有效的[32，33]。在本試驗中我們首次發(fā)現(xiàn)，把自身活化的T細胞減活后免疫宿主能誘發(fā)腫瘤的生長，從而引起體內T細胞的活化。
在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)小鼠接種新鮮滅活T細胞后，其脾細胞能能在體外自發(fā)增殖。這種增殖現(xiàn)象，不需要任何其他的刺激物，只需要在10％的FCS的條件下即可發(fā)生。這預示著，給予宿主自體滅活T細胞免疫能在體內激發(fā)T細胞。這種接種誘導的T細胞增殖與自身免疫病中所用的T細胞疫苗不同，不是由于抗自身反應性T細胞的TCR而其作用，因為本發(fā)明中的免疫小鼠的血清不能誘導免疫小鼠的T細胞增生。這在使用免疫小鼠的抗血清和用CTL殺傷免疫小鼠CD4T細胞的實驗中得到反映。這說明，15天內免疫小鼠3次并不能誘導足夠的抗TCR抗體，也不能誘導足夠的抗獨特型CTL。但是我們試驗的免疫方法的確超越了TCR途徑轉化了T細胞的活化，并使其對外源蛋白和絲裂原的刺激更為敏感。
為了進一步證明T細胞群能對免疫做出應答，我們通過特殊抗體染色，通過流式細胞儀檢測了體內T細胞的擴增情況。結果顯示，免疫之后，CD3+的細胞群發(fā)生了擴增。這說明，自身T細胞免疫能激發(fā)體內T細胞的擴增。另外，我們也檢測了免疫后T細胞的活化。因為10％FCS中培養(yǎng)的T細胞標記上抗CD62L抗體后，陽性細胞能夠被流式細胞儀所捕獲。結果顯示，相對于對照的天然小鼠，CD62L能在免疫后的小鼠的T細胞上顯著的高表達。這說明，光照后的自身T細胞免疫不但能使體內T細胞群增殖，還能使T細胞活化。這進一步導致了體外T細胞自發(fā)的增殖。
眾所周知，AICD是刺激之后淋巴細胞活化增殖的正常免疫反應，接著，這些細胞沿著程序直到死亡或者凋亡。這個過程在免疫系統(tǒng)的動態(tài)平衡上起到了非常重要的作用[34，35]。在AICD這一過程中有許多重要的因素參與。Fas和FasL是AICD中最為重要的介質[36，37]。Fas表達于活化的T細胞，并且是T細胞活化的標志之一。當淋巴細胞受到抗原刺激之后，F(xiàn)as分子開始轉錄并表達于細胞的表面。接著，活化的淋巴細胞產(chǎn)生FasL并表達于細胞的表面。FasL能和外膜的Fas分子連接，并啟動胞漿內Fas相關的死亡區(qū)域。一旦FasL和表達于自身或其他細胞的Fas相連，F(xiàn)as下游的caspases級聯(lián)反應程序就將啟動。這將導致細胞的凋亡，它能阻斷淋巴細胞的進一步活化，被稱為AICD[38]。正常情況下，當沒有外來刺激物作用時，體外培養(yǎng)的淋巴細胞在很短的時間內就會死亡。當存在外來刺激時，淋巴細胞會增殖后再凋亡。
為了了解免疫后小鼠T細胞的最終結果，我們檢測了天然的和免疫T細胞增殖后的凋亡模式。結果顯示，免疫后小鼠的凋亡細胞比天然小鼠的要少。在免疫小鼠的凋亡細胞中，CD4+T細胞對凋亡的敏感性比CD8+T要低。但是在天然小鼠中，這些T細胞亞群之間就沒有區(qū)別了。這些數(shù)據(jù)顯示，免疫小鼠的淋巴細胞不但能在體外增殖的更快，還能存活的更久。這說明，免疫小鼠的淋巴細胞能對外來增殖的刺激更敏感，而對于誘導死亡(AICD)有一定的抵抗能力。
為了進一步探索免疫細胞對于抵抗AICD介導的死亡的機制，我們在培養(yǎng)過程中，利用熒光定量PCR每24小時檢測Fas和FasL的轉錄情況。免疫小鼠脾細胞的mRNA的水平要高于天然小鼠，但是免疫小鼠FasL的轉錄要低于天然的小鼠。之前所述的多數(shù)監(jiān)測點的結果顯示，免疫小鼠的FasL明顯的低于天然的小鼠。這說明，免疫過程能誘導T細胞中Fas的表達上調，而Fas分子參與了這些T細胞在體外的活化和增殖。但是FasL的轉錄并沒有同時上調。眾所周知，T細胞的高Fas，低FasL能維持細胞的活化并抵御AICD。而免疫接種后，究竟是什么分子參與了凋亡的這個模式，又是什么基因參與了AICD的抵御呢？GADD(生長抑制和DNA損傷誘導)家族包括三個基因(GADD45α，GADD45β and GADD45γ)，它們非常的保守。并且當它們過度的表達于細胞株表面時，它們的分子功能和基因產(chǎn)物都非常的相近。但是，這些基因的調控各有不同，因此在體內，它們的功能也有差異。GADD45β能作用于細胞周期，凋亡，信號轉導和細胞的存活。對T細胞而言，GADD45β能通過T細胞受體(TCR)和炎癥信號而被迅速激活。CD4+T細胞的GADD45β的缺陷將削弱其對于炎癥因子TCR刺激的反應。之前的研究顯示，在許多的腫瘤和細胞株中，GADD45β能通過NF-kB下游的JNK信號途徑來抑制細胞的凋亡。另外，最近的報道顯示，T細胞和B細胞中的GADD45β能通過NF-kB有效的抵御AICD中Fas介導的死亡信號，維持細胞的生存。
由于GADD45β是AICD潛在的抑制物，我們在實驗中定時檢測了GADD45β的表達。相對于未免疫小鼠，免疫的C57小鼠的T細胞中GADD45β的轉錄更高。這說明，免疫能促進GADD45β在體內的表達。體外試驗證明，F(xiàn)CS存在時，免疫后能使GADD45β的mRNA的量明顯增高，并在16小時達到最高峰，隨之緩慢下降。但是在每個監(jiān)測點，免疫小鼠中GADD45β的水平都高于天然的小鼠。相反，在FCS的刺激下，未免疫小鼠GADD45β表達的mRNA能更快的達到最高峰，但是之后就快速下降。這些結果說明，免疫能在體內促進GADD45β的轉錄，并且能使該轉錄維持的相對久些。由于GADD45β的水平比較高，T細胞便能抵御Fas介導的凋亡。但是GADD45β是如何抵御Fas介導的凋亡呢，這個疑問目前仍沒有解開。Akanksha報道，TCR的刺激能誘導核內NF-kB的暫時聚集，從而活化GADD45β的表達，并相應的抵御Fas介導的凋亡。但是在我們的實驗中，免疫引起的T細胞的活化和Fas的表達并不是以TCR接合為前提的，因此這和Akanksha所述說的情況不同。所以，這就有必要探索GADD45β是如何阻斷Fas介導的AICD的，但是這個阻斷機制目前還仍處于研究階段。
T細胞在腫瘤免疫中起到了非常重要的作用?；罨腃TL和CD4+T細胞都在體內發(fā)揮了重要的清除腫瘤細胞的作用。眾所周知，CTL和NK細胞能夠通過釋放顆粒酶B，或通過Fas-FasL介導的凋亡，或通過TNF-TNFR系統(tǒng)中的任意一條途徑直接殺傷腫瘤細胞。CD4+細胞能夠通過分泌細胞因子抑制腫瘤細胞的生長。正如之前介紹的，我們發(fā)現(xiàn)免疫后T細胞能夠活化并有效抵御AICD。我們試圖在體內找到這些活化細胞抗腫瘤的生物學功能。為此，我們建立了一個試驗模型，用來證明是否免疫后T細胞的活化能抑制體內腫瘤的生長。在實驗中，該小鼠在接受EL-4腫瘤細胞接種前就先接受了3次的免疫，腫瘤細胞接種后又接受了兩次額外的免疫。觀察發(fā)現(xiàn)，這些小鼠的腫瘤生長情況相對于對照組有明顯的抑制。免疫后NK和CTL的殺傷活性都增強了。與此同時，細胞因子的監(jiān)測顯示，免疫小鼠體內的IL-12的濃度相對較高。
近來，大量的文獻報道，IL-12能上調GADD45β的表達。另一方面，GADD45β的表達能誘導IL-12的分泌。GADD45β的表達和IL-12的分泌之間存在著正循環(huán)。就我們的結果而言，可以推斷GADD45β不僅抑制Fas介導的凋亡，還能促進IL-12的分泌。
我們的實驗結果顯示，利用減活的自身活化T細胞作為免疫苗能有效的抵御體內腫瘤的生長。這一抗腫瘤機制主要有多種因素所用，包括T細胞的活化，對AICD的抵抗，高水平NK和CTL的細胞毒性作用。但是，關于T細胞免疫是如何發(fā)揮這些效用的研究還處于探索階段。
我們的研究首次報道了這一事實，那就是，在小鼠模型中利用健康的減活的自身活化T細胞作為免疫苗能加強免疫增生的能力并能有效的抵御AICD，從而更好的抑制腫瘤細胞的增長。同樣的原理可以用于人體的抗腫瘤輔助治療。
用同樣的方法測定對于小鼠黑色素腫瘤的體內抗瘤實驗。初步實驗證實，給小鼠接種了同種系健康活化滅活的T細胞后，同樣能夠抑制小鼠的黑色素腫瘤的生長。提示這一自體活化T細胞疫苗不僅對于EL-4腫瘤細胞具有抑制作用，可能具有更加廣泛的抗腫瘤活性。顯示其作為潛在的腫瘤輔助治療作用。因此，在臨床使用中，將有重大意義。
權利要求
1.一種抗T淋巴細胞瘤的自身T細胞疫苗，是利用健康的減活的自身活化T細胞作為疫苗。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種抗T淋巴細胞瘤的自身T細胞疫苗的制備方法是自體活化T細胞于培養(yǎng)基DMEM中，所述培養(yǎng)基DMEM10％小牛血清，10mMHEPES，50uMβ巰基乙醇，2mML-谷氨酰胺，50IU/ml青鏈霉素；使分離純化的脾細胞3×106/ml，用2ug/mlConA刺激72小時，收集細胞，PH7.4之PBS洗滌三次；最后用特異性抗體包被的磁珠通過陰選純化T細胞，純化后的T細胞經(jīng)照光儀使用3000rad照光，作為后續(xù)免疫接種所用的自體活化T細胞。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種抗T淋巴細胞瘤的自身T細胞疫苗的用途，該疫苗用于抑制T淋巴瘤和其他腫瘤細胞在體內的生長。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗T淋巴細胞瘤的自身T細胞疫苗，及其制備方法和用途。一種抗T淋巴細胞瘤的自身T細胞疫苗，是利用健康的減活的自身活化T細胞作為疫苗。該疫苗的制備方法是自體活化T細胞于培養(yǎng)基DMEM中，于10％小牛血清、10mMHEPES、50uMβ巰基乙醇、2mML－谷氨酰胺、50IU/ml青鏈霉素中；使分離純化的脾細胞3×10
文檔編號C12N5/08GK1875987SQ20061002715
公開日2006年12月13日 申請日期2006年5月31日 優(yōu)先權日2006年5月31日
發(fā)明者李寧麗, 沈佰華, 王利 申請人:上海交通大學醫(yī)學院