專利名稱：人蒼白桿菌及其在降解植物秸稈或重要酶的制備中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi)，以及所述菌種在降解植物秸稈或重要酶的制備中的應用。
背景技術：
植物纖維，作為一類大量存在的天然纖維質(zhì)的重要資源，它的再生利用研究受到了廣泛的關注。由于利用物理或化學方法處理甘蔗渣都存在許多缺點，于是許多專家將目光聚焦到了微生物處理上。盡管可以利用纖維素和半纖維素的微生物比較多，并且有很多微生物也可利用木質(zhì)素，但相對來說都有一定的困難。如瑞氏木霉專利公開的菌種和綠色木霉文獻報道的菌種，其所存在的一個顯著缺陷是秸稈之所以很難在常規(guī)條件下降解，主要是因為秸稈中纖維素、半纖維素與木質(zhì)素的結合方式木質(zhì)素與半纖維素經(jīng)共價鍵形式結合，將纖維素分子包埋在中間，使降解纖維素的酶不易與纖維素分子接觸。木質(zhì)素的水不溶性、復雜的化學結構，也給降解帶來了很大困難。所以，要徹底降解纖維素，必須首先運用微生物解決木質(zhì)素的降解問題。降解木質(zhì)素的微生物種類在自然界中，能降解木質(zhì)素并產(chǎn)生相應酶類的微生物只占少數(shù)。木質(zhì)素的完全降解通常是真菌、細菌及相應微生物群落共同作用的結果，其中真菌起著主要作用。降解木質(zhì)素的真菌主要有白腐真菌(使木材呈白色腐朽)、褐腐真菌(使木材呈褐色腐朽)和軟腐菌，前兩者屬擔子菌綱，而軟腐菌屬半知菌類。白腐真菌降解木質(zhì)素的能力優(yōu)于其降解纖維素的能力。
植物纖維，如甘蔗渣是制糖工業(yè)的主要副產(chǎn)品，是甘蔗機械壓制后所剩的主要部分，屬于農(nóng)業(yè)固體廢棄物中的一種，它的成分主要有纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，與木質(zhì)材料差不多，可以作為替代部分木材的原料。因此，選擇一種菌種，使其能夠有效的降解植物纖維，達到再生利用的目的，是有關方面十分關注的課題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術問題是公開一種人蒼白桿菌及其在降解植物秸稈或重要酶的制備中的應用，以克服現(xiàn)有技術存在的上述缺陷。
本發(fā)明的人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi)是從華東理工大學校園內(nèi)的法國梧桐樹上的腐爛木塊中通過如下的方法篩選獲得的取樣(腐爛木塊-來在二球懸鈴木)——搖瓶培養(yǎng)——涂平板(M9+甘蔗渣+瓊脂)——搖瓶(M9+甘蔗渣)——涂平板分離——人蒼白桿菌(Ochrobactrumanthropi)。
所獲得菌種在2006年5月10日，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC M 206046 Ochrobactrum anthropi IBL01。
本發(fā)明的菌種具有如下的特性1.形態(tài)特征(1)細胞的形態(tài)和大小短桿狀，2.0～2.5×0.65～0.75μm；(2)孢子的形成無；(3)革蘭氏染色性陰性。
2.在各種培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)(1)LB瓊脂平板培養(yǎng)(30℃，48小時)菌落形狀圓形(Circular)；菌落成粘液狀扁平狀(Flat)，平滑(Smooth)大小4～6mm；
色調(diào)淺黃色。
(2)修飾后的M9+甘蔗渣+瓊脂平板培養(yǎng)(30℃，96小時)菌落形狀圓形(Circular)；菌落成粘液狀扁平狀(Flat)，平滑(Smooth)大小1.5～2mm；色調(diào)乳白色。
3.生理生化特征(1)葡萄糖同化試驗陽性(2)阿拉伯糖同化試驗陽性(3)甘露糖同化試驗陽性(4)甘露醇同化試驗陽性(5)乙酰基葡萄糖氨同化試驗陽性(6)麥芽糖同化試驗陽性(7)蘋果酸同化試驗陽性(8)檸檬酸三鈉同化試驗陽性(9)羊蠟酸同化試驗陽性(10)氧化酶陽性(11)尿素試驗陽性(12)硝酸鹽陰性(13)色氨酸陰性(14)氨基胍基戊酸陰性(15)枸櫞酸鹽陰性
(16)明膠陰性(17)葡萄糖酸鉀同化試驗陰性(18)脂肪酸同化試驗陰性(19)苯乙酸同化試驗陰性(20)4-硝基苯基-βD-葡萄糖酸試驗陰性根據(jù)文獻段永翔。API鑒定系統(tǒng)及其在細菌學檢驗中的應用，ModernPreventive Medicine，2004，Vol.31，No.5，提供的API 20 NE鑒定系統(tǒng)鑒定方法和上述的試驗結果表明，本發(fā)明的菌種屬于人蒼白桿菌類群，但又與原人蒼白桿菌有明顯的不同，其主要不同之處在于原種基本都是醫(yī)院從病人體內(nèi)獲得，而且它主要是極易造成醫(yī)療用具的污染，導致感染的發(fā)生，該菌主要感染創(chuàng)傷、器官移植、插入性操作以及使用抗腫瘤藥物和免疫抑制劑的患者，并沒有發(fā)現(xiàn)它在秸稈降解方面的作用。
其生理生化特性如下極易造成醫(yī)療用具的污染，導致感染的發(fā)生，該菌主要感染創(chuàng)傷、器官移植、插入性操作以及使用抗腫瘤藥物和免疫抑制劑的患者。另外國外有文章報道它具有產(chǎn)乙內(nèi)酰脲酶的能力，還可以分裂頭孢菌素；本發(fā)明的人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi)可以利用蔗糖、葡萄糖、果糖、濾紙、乙基纖維素、木糖、半乳糖、淀粉、甘油、瓊脂等作為唯一碳源生長，但是它不能利用乳糖、甘氨酸、醋酸鈉作為唯一碳源生長。
采用本發(fā)明的人蒼白桿菌Ochrobactrum anthropi(保藏號CCTCC M206046 Ochrobactrum anthropi IBL01)降解植物秸稈或秸稈渣的方法包括如下步驟將人蒼白桿菌(保藏號CCTCC M 206046 Ochrobactrum anthropiIBL01)單菌落接種到M9培養(yǎng)基與秸稈或秸稈渣的混合物的種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基的pH為6.5～7.5，30～37℃、180～220rmp的條件下在搖瓶中培養(yǎng)2～6天，然后將種子培養(yǎng)物接種到M9培養(yǎng)基與秸稈或秸稈渣的混合物的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵條件與種子培養(yǎng)相同，培養(yǎng)時間為4～6天，后細胞數(shù)可達1.4*109；種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中，秸稈或秸稈渣的含量為4～6g/L；基于1L發(fā)酵培養(yǎng)基的體積，種子培養(yǎng)物接種量為0.2～0.8ml；所說的秸稈包括玉米稈、麥稈、稻草、或高粱稈等，所說的秸稈渣包括甘蔗渣、玉米稈渣、或木屑；所說的M9培養(yǎng)基在組分和含量在文獻Amira A.EI-Gammal，Zeinatkamel and Zenat Adeeb.Biodegradation of lignocellulosic substances andproduction of sugars and lignin degradation intermediates by four selectedmicrobial strains.Polymer Degradation n and Stability 61(1998)535-542.中已經(jīng)有公開的報道，本發(fā)明的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的重量百分比配方如下(1)液體培養(yǎng)基Na2HPO40.6％、KH2PO40.3％、NH4Cl 0.1％、NaCl0.05％、甘蔗渣0.5％，余量為蒸餾水。
(2)固體培養(yǎng)基Na2HPO40.6％、KH2PO40.3％、NH4Cl 0.1％、NaCl0.05％、甘蔗渣0.5％，瓊脂1.5～2.0％，余量為蒸餾水。
按照本發(fā)明優(yōu)選的方案，秸稈或秸稈渣先經(jīng)過酸處理，在重量濃度10～20％的鹽酸中，浸漬處理3小時，然后65～75℃烘干，粉碎，過篩。
人蒼白桿菌產(chǎn)生纖維素酶應用濾紙法可以測得，人蒼白桿菌產(chǎn)生木質(zhì)素過氧化物酶Lip可參考如下方法測得0.2mol/L酒石酸緩沖液(pH3.0)1.5mL，15mmol/L藜蘆醇1.0mL，粗酶液0.4mL，15mmol/L H2O20.1mL啟動反應，25℃水浴3min，于310nm測其光密度，以1.0mL緩沖液代替藜蘆醇作空白對照，定義每分鐘使1μmol的藜蘆醇氧化成藜蘆醛所需的酶量為一個酶活力單位(U)。人蒼白桿菌產(chǎn)生錳過氧化物酶Mnp可參考如下方法測得0.11mol/L乳酸鈉緩沖液(pH4.5)3.4mL，40mmol/LMnSO40.1mL，粗酶液0.4mL，1.6mmol/L H2O20.1ml，啟動反應，25℃水浴5min，于240nm測其光密度，以0.1ml緩沖液代替MnSO4作空白對照，定義每分鐘氧化1μmol Mn2+成為Mn3+，所需的酶量為一個酶活力單位(u)。
人蒼白桿菌中纖維素酶、木聚糖酶、木質(zhì)素過氧化物酶、漆酶以及錳過氧化物酶粗酶的分離及制備的大致過程為人蒼白桿菌發(fā)酵液超聲破碎后離心得到上清液，上清液用飽和的硫酸銨沉淀的蛋白，將蛋白復性后過Bio-Gel P30凝膠柱過濾分離，然后將穿出的不同峰及洗脫的不同峰再分別過DEAE.Sephadex A50陰離子交換柱、CM.Sephadex A50陽離子交換柱、Sephadex G-25層析柱等不同的離子柱，最后經(jīng)過透析、濃縮和干燥便可以得到纖維素酶、木聚糖酶、木質(zhì)素過氧化物酶、漆酶以及錳過氧化物酶的粗酶制劑。
由上述公開的技術方案可見，本發(fā)明的菌種和采用本發(fā)明的菌種降解植物秸稈或秸稈渣，具有十分顯著的降解效果，目前用來降解纖維素或木質(zhì)素的微生物主要是霉菌或白腐菌、褐腐菌等真菌，而且這些菌體用來降解甘蔗渣的培養(yǎng)周期較長達約15天左右；我們篩得的人蒼白桿菌是細菌，它的生長周期比較短大約一周左右，并且該人蒼白桿菌不但可以產(chǎn)生降解纖維的酶類而且還可以產(chǎn)生降解半纖維素的酶類和降解木質(zhì)素的酶類。
圖1為人蒼白桿菌在M9+甘蔗渣(5g/L)中的生長曲線圖。
圖2為菌體降解纖維素的效果圖。
具體實施例方式
實施例1
人蒼白桿菌的發(fā)酵試驗從平板上挑取人蒼白桿菌單菌落接種到M9+甘蔗渣(5g/L)的種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基的pH為6.7，裝液量為50ml/250ml搖瓶，30℃、200rmp的條件下在搖瓶中培養(yǎng)四天細胞數(shù)數(shù)可達8.0*109左右。取0.5ml接種到M9+甘蔗渣(5g/L)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵條件于種子相同，培養(yǎng)五天后細胞數(shù)可達1.4*1010。經(jīng)測定我們制備的甘蔗渣中含有的淀粉、粗蛋白、可溶性糖和糖醛酸的總量為102mg/g，這些可供菌體生長的小分子物質(zhì)僅僅可以供菌體上到109左右，由此可見菌體還利用了木質(zhì)纖維素等大分子物質(zhì)。此外我們已經(jīng)測的菌體可以產(chǎn)生纖維素酶、半纖維素酶和木質(zhì)素酶。
種子培養(yǎng)基重量組分如下Na2HPO40.6％、KH2PO40.3％、NH4Cl 0.1％、NaCl 0.05％、甘蔗渣0.5％、余量為蒸餾水。
發(fā)酵培養(yǎng)基的重量組分和含量如下Na2HPO40.6％、KH2PO40.3％、NH4Cl 0.1％、NaCl 0.05％、甘蔗渣0.5％、余量為蒸餾水。
采用濾紙法進行檢驗，發(fā)酵培養(yǎng)物中，人蒼白桿菌產(chǎn)生纖維素酶的含量為2000U/L，人蒼白桿菌產(chǎn)生木質(zhì)素過氧化物酶Lip的含量為1000U/L，其降解效果較明顯。
實施例2～4人蒼白桿菌在以煮沸處理、酸處理或堿處理的甘蔗渣為唯一碳源的“修飾的M9培養(yǎng)基“中的生長情況的比較試驗甘蔗渣1甘蔗渣——煮沸30min(水體積∶甘蔗渣＝2∶1)連續(xù)煮沸三次——65℃烘干——粉碎——過40目篩。
甘蔗渣2甘蔗渣——重量濃度20％的鹽酸中，浸漬處理3小時——70℃烘干——粉碎——過40目篩。
甘蔗渣3甘蔗渣——重量濃度2％NaOH中，浸漬處理2小時——70℃烘干——粉碎——過40目篩。
分別以甘蔗渣1、2、3為唯一碳源的“修飾的M9培養(yǎng)基“為發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵條件同例1。
培養(yǎng)1天、2天、4天、6天后分別計數(shù)得出如下結論 用血球計數(shù)板計數(shù)可見甘蔗渣經(jīng)過酸處理比堿處理更有利于人蒼白桿菌的利用。
實施例5纖維素酶定性試驗固體培養(yǎng)基Na2HPO40.6％、KH2PO40.3％、NH4Cl 0.1％、NaCl0.05％、羧甲基纖維素鈉1％、瓊脂2％、余量為蒸餾水。
種子培養(yǎng)基Na2HPO40.6％、KH2PO40.3％、NH4Cl 0.1％、NaCl0.05％、甘蔗渣0.5％、余量為蒸餾水。
種子發(fā)酵條件同實施例1相同。種子發(fā)酵兩天后取種子液0.1ml稀釋適當?shù)奶荻群笸科桨?，平板放置?7℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周后菌落約1.5mm，向平板中加入0.1％的剛果紅染色半小時候用1當量的NaCl脫色1.分鐘結果見圖2，出現(xiàn)明顯的透明圈，因為剛果紅可以與羧甲基纖維素結合所以平板顯紅色，如果菌體可以降解纖維素那么菌體周圍就會出現(xiàn)透明圈。
實施例6
種子培養(yǎng)條件及發(fā)酵培養(yǎng)條件同實施例1。
纖維素酶的制備取發(fā)酵液20ml超聲破碎1小時，5000r/min離心10min取上清液加入65％飽和硫酸銨沉淀蛋白，5000r/min離心10min.沉淀蛋白復性后過Bio-Gel P30凝膠柱，根據(jù)分子量的差異得到幾種蛋白組分，據(jù)纖維素酶的分子量取其中一種組分過DEAE.Sephadex A50陰離子交換柱后再經(jīng)過透析、濃縮和干燥便得到1.2～1.3mg纖維素酶的粗酶制劑。
木聚糖酶的制備發(fā)酵液處理同上，取過Bio-Gel P30凝膠柱后的另一種蛋白組分分別過DEAE.Sephadex A50陰離子交換柱、CM.Sephadex A50陽離子交換柱后再經(jīng)過透析、濃縮和干燥便得到1.5～1.7mg木聚糖酶的粗酶制劑。
木質(zhì)素酶的制備條件同上，分別過Bio-Gel P30凝膠柱、DEAE.Sephadex A50陰離子交換柱、CM.Sephadex A50陽離子交換柱和G-25為Sephadex G-25層析柱，最后的2.0～2.3mg木質(zhì)素酶的粗酶制劑。
權利要求
1.一種人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthrop)CCTCC M 206046Ochrobactrum anthropi IBL01。
2.采用權利要求1中所述的人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthrop)CCTCCM 206046 Ochrobactrum anthropi IBL01可用于生產(chǎn)具有高活性的纖維素酶、木質(zhì)素酶和半纖維素酶。
3.從人蒼白桿菌中分離提取纖維素酶、木聚糖酶、木質(zhì)素過氧化物酶、漆酶以及錳過氧化物酶等粗酶的方法。
4.采用人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi)CCTCC M 206046Ochrobactrum anthropi IBL01降解植物植物秸稈的方法，其特征在于，包括如下步驟將人蒼白桿菌CCTCC M 206046 Ochrobactrum anthropi IBL01單菌落接種到M9培養(yǎng)基與秸稈或秸稈渣的混合物的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將種子培養(yǎng)物接種到M9培養(yǎng)基與秸稈或秸稈渣的混合物的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
5.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6.5～7.5。
6根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中，秸稈或秸稈渣的含量為4～6g/L。
7.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所說的秸稈包括玉米稈、麥稈、稻草或高粱稈，所說的秸稈渣包括甘蔗渣、玉米稈渣、或木屑等。
8.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，基于1L發(fā)酵培養(yǎng)基的體積，種子培養(yǎng)物接種量為0.2～0.8ml。
9.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，秸稈或秸稈渣先在重量濃度10～20％的鹽酸中，浸漬處理3小時，然后65～75℃烘干，粉碎，過篩。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人蒼白桿菌(Ochrobactrumanthropi)CCTCC M206046 Ochrobactrum anthropi IBL01及其在降解植物秸稈方面的應用。本發(fā)明的菌種和采用本發(fā)明的菌種降解植物秸稈或秸稈渣，具有十分顯著的降解效果，同時可生產(chǎn)高活性的纖維素酶、木質(zhì)素酶和半纖維素酶。本發(fā)明還公開了人蒼白桿菌中纖維素酶、木聚糖酶、木質(zhì)素過氧化物酶、漆酶以及錳過氧化物酶的粗酶制備方法。本發(fā)明篩得的人蒼白桿菌是細菌，它的生長周期比較短大約一周左右，并且該人蒼白桿菌不但可以產(chǎn)生降解纖維的酶類而且還可以產(chǎn)生降解半纖維素的酶類和降解木質(zhì)素的酶類。
文檔編號C12N9/42GK1932005SQ20061002714
公開日2007年3月21日 申請日期2006年5月31日 優(yōu)先權日2006年5月31日
發(fā)明者童望宇, 魏東芝, 劉曉玲 申請人:華東理工大學