專利名稱：一種鏈霉菌培養基及其優化過程和應用方法
技術領域：
本發明涉及一種鏈霉菌培養基及其優化過程和應用方法。
背景技術：
鏈霉菌FR-008是梁蓉芳等在研究農抗5192產生菌原生質體融合育種的過程中發現的一株新的產生抗生素的鏈霉菌。其次及代謝產物FR-008，經過初步的化學結構分析表明FR-008和Candicidin(殺念菌素)化學結構是相同的。上海交通大學鄧子新院士領銜的課題組在組合生物合成方面已經取得顯著成績，合成了一系列抗生素FR-008/Candicidin(殺念菌素)基因工程衍生化合物。其中包括糖基轉移酶基因fscMI中斷突變菌株CS101、酮糖轉氨酶基因fscMII中斷突變菌株CS102和細胞色素P450單氧化酶基因突變株CS103分別發酵培養得到的基因工程衍生物CS101、CS102和CS103。這些化合物中，有較強的抗真菌活性，且毒性較FR-008/Candicidin(殺念菌素)有明顯降低，具有較高的臨床開發前景。但是，這些基因工程抗生素的產量很低，制約了臨床試驗和產業化的進程，應用前景受到挑戰。
培養基成分是影響抗生素發酵水平的關鍵因素，原始的培養基配方為葡萄糖1％，麥芽糖提取物0.3％，酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，滅菌前pH7.2-7.5。該配方不僅產量低，副產物較多，而且成本很高。因此，急需對培養基成份進行優化。
發明內容
本發明需要解決的技術問題是公開一種鏈霉菌培養基及其優化過程和應用方法，以克服現有技術存在的上述缺陷。
本發明的培養基的組分和重量含量包括葡萄糖1～3％，淀粉1～3％，甘油1～3％，酵母粉0.1～0.5％工業氨基酸粉0.2～1％ 蛋白胨0.05～0.2％ NaCl 0.5～2％，FeSO4·7H2O0.01～0.1％，CuSO40.002～0.01％，以及余量的水；傳統的優化方法使用單因子設計，需要進行大量的實驗，并且結果不可靠。因此本發明將Plackett-Burman Design和Response SurfaceMethodology應用到FR-008/Candicidin(殺念菌素)及其系列基因工程衍生物發酵培養基的優化過程中，包括如下步驟首先根據Plackett-Burman Design，篩選出影響發酵水平的三個關鍵因素甘油、蛋白胨和CuSO4。其次是用Response Surface Methodology的方法，優化甘油、蛋白胨和CuSO4的最適培養濃度。我們首次發現銅離子在FR-008/Candicidin(殺念菌素)及其系列基因工程衍生物生物合成過程中，有明顯的促進作用。
優化后的培養基配方，應用到FR-008/Candicidin(殺念菌素)及其系列基因工程衍生物的發酵培養過程，抗生素產量不同程度的提高了3-10倍。而且去除了成本較高的碳源——麥芽糖提取物，降低了成本較高的氮源——蛋白胨的含量，補充了廉價的氮源——工業氨基酸粉，使生產成本大幅降低，為后續制備臨床試驗樣品和產業化奠定了堅實的基礎。本發明與以往文獻報道不同的是，首次發現CuSO4能夠明顯促進抗生素FR-008/Candicidin(殺念菌素)及其系列基因工程衍生物CS101、CS103等的合成。
本發明的目的之二在于公開上述培養基在基因工程抗生素發酵生產中的應用。
本發明的培養基制備方法包括如下步驟1.將葡萄糖、甘油、酵母粉、蛋白胨、NaCl加水溶解；2.在淀粉中加入淀粉重量的0.1～0.5％的淀粉酶，加熱至70～85℃，靜置10～20分鐘，加熱至沸騰；所說的淀粉酶購買于國藥集團化學試劑有限公司，生產的牌號為SCRC 64003436，該酶為液化型淀粉酶，能夠在高溫(70～85℃)環境下將淀粉水解為糊精；3.將工業氨基酸粉，加熱至溶液狀，真空抽濾，除去雜質；4.將步驟1、2和3的產物混合，按照比例加水，滅菌；5.稱取FeSO4·7H2O、CuSO4加50ml水溶解，加3ml濃度為1/4(v/v)的硫酸助溶，使溶液較澄清，用無菌過濾膜過濾.與步驟4的產物混合，用3～7mol/l的NaOH溶液調至6.90；本發明的培養基適應于抗生素FR-008/Candicidin(殺念菌素)及其系列基因工程衍生化合物。其中包括1)糖基轉移酶基因fscMI中斷突變菌株CS101培養得到的脫糖基的化合物CS101；2)酮糖轉氨酶基因fscMII中斷突變菌株CS102培養得到的脫氨糖的化合物CS102；3)細胞色素P450單氧化酶基因突變株CS103培養得到的毒性降低的化合物CS103；4)抗生素FR-008/Candicidin(殺念菌素)；5)其他的通過組合生物合成技術得到的FR-008/Candicidin(殺念菌素)的基因工程衍生物。
本發明的培養基，它既能滿足搖瓶實驗的需要，又能成功的將搖瓶發酵結果放大到發酵罐，而且副產物減少，利于下游的分離純化工作。該培養基配方和優化以前的培養基相比，抗生素產量不同程度的提高了3-10倍，而且生產成本大幅降低。
具體實施例方式
實施例11.按照葡萄糖2％，甘油1.389％，酵母粉0.3％，蛋白胨0.101％，NaCl 1％，FeSO4·7H2O 0.05％，CuSO40.00428％的比例稱取培養基各組分適量(淀粉和工業氨基酸粉除外)，加適量去離子水溶解。
2.按照0.2％的比例稱取適量淀粉，加入少量淀粉酶，加熱至80攝氏度左右，放置15分鐘，再加熱至沸騰，此時溶液成透明并略帶熒光裝。
3.按照0.5％的比例稱適量工業氨基酸粉，加熱至溶液狀，此時顏色會稍深，但含不溶性固體，真空抽濾3～4遍除去雜質。
4.將上述成分放在同一燒杯中，再加水定容，放入反應器中滅菌。
5.稱取FeSO4·7H2O、CuSO4加50ml水溶解，加3ml濃度為1/4(v/v)的硫酸助溶，使溶液較澄清，用無菌過濾膜過濾.后加入反應器中，調節pH至6.90，即獲得所說的培養基。
實施例2使用上述培養基，發酵培養以下菌株1)糖基轉移酶基因fscMI中斷突變菌株CS101；2)細胞色素P450單氧化酶基因突變株CS103；3)抗生素FR-008/Candicidin(殺念菌素)。
培養基成分
葡萄糖2％淀粉1％甘油1.389％酵母粉0.3％工業氨基酸粉0.5％蛋白胨0.101％NaCl 1％FeSO4·7H2O 0.05％CuSO40.00428％滅菌前，pH使用5mol/l的NaOH溶液調到6.90。
培養方法接種時間為30小時，接種量10％，28度搖床，200rpm培養，放瓶檢測抗生素CS101、CS103和FR-008/Candicidin的發酵水平分別為216mg/l、40mg/l和252mg/l。
對比實施例1使用原始培養基，培養以下菌株1)糖基轉移酶基因fscMI中斷突變菌株CS101；2)細胞色素P450單氧化酶基因突變株CS103；3)抗生素FR-008/Candicidin(殺念菌素)。
培養基成分葡萄糖1％，麥芽糖提取物0.3％，酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，滅菌前pH7.0-7.5。培養方法接種時間為30小時，接種量10％，28度搖床，200rpm培養，放瓶檢測抗生素CS101、CS103和FR-008/Candicidin的發酵水平分別為18mg/l、9mg/l和52mg/l。
對比實施例2使用不加銅離子的培養基，培養以下菌株1)糖基轉移酶基因fscMI中斷突變菌株CS101；2)細胞色素P450單氧化酶基因突變株CS103。
培養基成分葡萄糖2％淀粉1％甘油1.389％酵母粉0.3％工業氨基酸粉0.5％蛋白胨0.101％NaCl 1％FeSO4·7H2O 0.05％
滅菌前，pH使用5mol/l的NaOH溶液調到6.90。
培養方法接種時間為30小時，接種量10％，28度搖床，200rpm培養，放瓶檢測抗生素CS101和CS103的發酵水平分別為111mg/l和29mg/l。
權利要求
1.一種鏈霉菌培養基，其特征在于，組分和重量含量包括葡萄糖1～3％，淀粉1～3％，甘油1～3％，酵母粉0.1～0.5％工業氨基酸粉0.2～1％蛋白胨0.05～0.2％NaCl 0.5～2％，FeSO4·7H2O0.01～0.1％，CuSO40.002～0.01％，以及余量的水。
2.根據權利要求1所述的鏈霉菌培養基的優化方法，其特征在于，包括如下步驟首先根據Plackett-Burman Design，篩選出影響發酵水平的三個關鍵因素甘油、蛋白胨和CuSO4。其次是用Response Surface Methodology的方法，優化甘油、蛋白胨和CuSO4的最適培養濃度。
3.根據權利要求1所述的鏈霉菌培養基的培養基制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1).將葡萄糖、甘油、酵母粉、蛋白胨、NaCl加水溶解；(2)在淀粉中加入淀粉重量的0.1～0.5％的淀粉酶，加熱至70～85℃，靜置10～20分鐘，加熱至沸騰；(3)將工業氨基酸粉，加熱至溶液狀，真空抽濾，除去雜質；(4)將步驟1、2和3的產物混合，按照比例加水，滅菌；(5)稱取FeSO4.7H2O、CuSO4加50ml水溶解，加3ml濃度為1/4(v/v)的硫酸助溶，使溶液較澄清，用無菌過濾膜過濾.與步驟4的產物混合，用3～7mol/l的NaOH溶液調至6.90。
4.權利要求1所述的鏈霉菌培養基在基因工程抗生素發酵生產中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所說的基因工程抗生素包括抗生素FR-008/Candicidin(殺念菌素)及其系列基因工程衍生化合物，其中包括1)糖基轉移酶基因fscMI中斷突變菌株CS101培養得到的脫糖基的化合物CS101；2)酮糖轉氨酶基因fscMII中斷突變菌株CS102培養得到的脫氨糖的化合物CS102；3)細胞色素P450單氧化酶基因突變株CS103培養得到的毒性降低的化合物CS103；4)抗生素FR-008/Candicidin(殺念菌素)；5)其他的通過組合生物合成技術得到的FR-008/Candicidin(殺念菌素)的基因工程衍生物。
全文摘要
本發明涉及一種鏈霉菌培養基及其優化過程和應用方法，組分和重量含量包括葡萄糖1～3％，淀粉1～3％，甘油1～3％，酵母粉0.1～0.5％，工業氨基酸粉 0.2～1％蛋白胨0.05～0.2％NaCl 0.5～2％，FeSO
文檔編號C12P1/04GK1844358SQ20061002571
公開日2006年10月11日 申請日期2006年4月14日 優先權日2006年4月14日
發明者沈亞領, 魏東芝, 毛相朝, 楊亮, 鄧子新, 陳實 申請人:華東理工大學, 上海交通大學