利用水稻藍光受體隱花色素cry1基因改良植物的形態建成的制作方法

專利名稱：利用水稻藍光受體隱花色素cry1基因改良植物的形態建成的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術和植物學領域，具體地說，本發明涉及藍光受體CRY1基因的用途，以及應用所述藍光受體CRY1基因來制備矮化的植物和增強植物光反應的方法。
背景技術：
光是生命的產生和繁衍最重要的環境因子之一，光調控著植物自種子萌發一直到開花結實的整個生長發育過程。對于高等植物而言，它不僅是光合作用的能量來源，同時也是調節植物重要生命活動——光形態建成、光周期反應以及內在生物鐘節律性調節的信號來源。植物每時每刻都根據周圍光照時間長短、光照強度、光照周期等條件的變化，不斷調節自己生命活動過程，以最大限度地適應周圍的環境。
太陽光由七色光組成，其中最有效的光源是藍光，紅光和遠紅光。藍光要發揮其信號的調控作用，必須通過由藍光受體介導的信號傳導途徑來實現。在雙子葉模式植物擬南芥菜中，目前主要有四種藍光受體CRY1，CRY2，PHOT1，PHOT2。其中，CRY1、CRY2在植物光形態建成、開花時間、花色素苷合成和生物節律性等重要生理過程中發揮重要的調控作用。
與雙子葉植物相比，在形態上，單子葉植物不具有下胚軸和子葉，而具有中胚軸和胚芽鞘。在開花調控方面，雙子葉模式植物擬南芥菜是長日照植物，而單子葉的模式植物水稻是短日照植物。因此在光形態建成及開花調控這兩個重要生理過程方面，雙子葉植物和單子葉植物具有一定的區別。
水稻、玉米、大麥、小麥、高粱等單子葉植物都是我國重要的糧食作物，改進它們的產量和品質對確保我國農業持續穩定發展有十分重要的戰略意義。但是，目前對于各種單子葉植物藍光受體功能及機理的研究還不清楚。因此，迫切需要找到可影響單子葉植物光形態建成、增強植株光反應且使植株矮化的方法，以改進一些糧食作物的產量，或者改良觀賞類和園林綠化類經濟植物如草坪草等。

發明內容
本發明的目的在于提供藍光受體CRY1基因的用途，用于(i)制備矮化的植物；(ii)增強植物的光反應。
本發明的另一目的在于提供一種使植物矮化或增強植物光反應的方法。
本發明的另一目的在于提供一種制備具有組成型光形態建成表現型的植物的方法。
在本發明的第一方面，提供一種藍光受體CRY1基因的用途，用于(i)制備矮化的植物；或(ii)增強植物的光反應。
在本發明的另一優選例中，所述矮化的植物是指在種植條件、種植天數相同的前提下，比正常生長的同種類植物矮10％(更優選的為20％；最優選的為30％或大于30％)的植物。
在本發明的另一優選例中，所述的植物為單子葉植物。
在本發明的另一優選例中，所述的植物選自下組禾本科稻屬、禾本科大麥屬、禾本科羊茅族早熟禾屬、禾本科剪股穎族剪股穎屬、旋花科馬蹄金屬、豆科三葉草屬、桑科榕屬、棕櫚科散尾葵屬、或藍雪科補血草屬。
在本發明的另一優選例中，所述的植物為水稻。
在本發明的另一優選例中，所述的藍光受體CRY1基因是選自以下植物的藍光受體CRY1基因禾本科稻屬、禾本科大麥屬、禾本科羊茅族早熟禾屬、禾本科剪股穎族剪股穎屬、旋花科馬蹄金屬、豆科三葉草屬、桑科榕屬、棕櫚科散尾葵屬、或藍雪科補血草屬。
在本發明的另一優選例中，所述的藍光受體CRY1基因為水稻的藍光基因受體OsCRY1a，或OsCRY1b。
在本發明的另一優選例中，所述藍光受體CRY1基因編碼全長的藍光受體CRY1蛋白或其功能區(即植物CRY1蛋白C-末端約180-260個氨基酸，更優選的，為植物CRY1蛋白C-末端約190-220個氨基酸)。
在本發明的另一優選例中，所述的藍光受體CRY1基因選自下組(a)編碼藍光受體CRY1蛋白功能區的核苷酸序列；(b)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；(c)具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列；(d)具有SEQ ID NO1第1494-2133位的核苷酸序列；(e)具有SEQ ID NO2第1494-2103位的核苷酸序列；或(f)(a)-(e)任一基因與GUS基因的融合基因。
在本發明的第二方面，提供一種融合基因，包括第一部分和第二部分，其中，所述的第一部分為GUS基因；所述的第二部分為藍光受體CRY1基因。
在本發明的另一優選例中，所述的第一部分和第二部分之間還包括3-30個核苷酸的連接序列。
在本發明的另一優選例中，GUS基因位于融合基因的5’端，藍光受體CRY1基因位于融合基因的3’端。
在本發明的另一優選例中，所述的融合基因具有SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、或SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。
另一方面，本發明還提供了一種融合蛋白，所述的融合蛋白由所述的融合基因編碼而成。
在本發明的第三方面，提供所述的融合基因或其編碼蛋白的用途，用于(a)制備矮化的植物；(b)增強植物的光反應；或(c)制備具有組成型光形態建成(COP)表現型的植物。
在本發明的第四方面，提供一種制備矮化的植物或增強植物光反應的方法，包括
(1)使所述植物過量表達藍光受體CRY1基因；或(2)使所述植物表達所述的融合基因(更優選的，使所述植物過量表達所述的融合基因)。
在本發明的另一優選例中，所述的方法包括步驟(1’)將外源的藍光受體CRY1基因或所述的融合基因轉入植物細胞或組織，獲得轉化入外源藍光受體CRY1基因或所述的融合基因的植物細胞或組織；和(2’)將步驟(1)獲得的轉入了外源藍光受體CRY1基因或所述的融合基因的植物細胞或組織再生成植物植株。
在另一優選例中，將外源的藍光受體CRY1基因或所述的融合基因轉入植物細胞或組織的方法選自(a)農桿菌介導的轉化法；(b)基因槍法；(c)離子束介導法；(d)脂質體法；(e)激光微束法；或(f)超聲波法。
在本發明的另一優選例中，所述的植物為單子葉植物。
在本發明的另一優選例中，所述植物選自下組禾本科稻屬、禾本科大麥屬、禾本科羊茅族早熟禾屬、禾本科剪股穎族剪股穎屬、旋花科馬蹄金屬、豆科三葉草屬、桑科榕屬、棕櫚科散尾葵屬、或藍雪科補血草屬。
在本發明的另一優選例中，所述的植物為水稻。
在本發明的第五方面，提供一種制備具有組成型光形態建成表現型的植物的方法，所述的方法包括使所述植物表達所述的融合基因(更優選的，使所述植物過量表達所述的融合基因)。
在本發明的另一優選例中，所述的方法包括步驟(1)將所述的融合基因轉入植物細胞或組織，獲得轉化入所述的融合基因的植物細胞或組織；和
(2)將步驟(1)獲得的轉入了所述的融合基因的植物細胞或組織再生成植物植株。
本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了藍光(左)和黑暗(右)下生長7天的水稻幼苗。其中，箭頭所指的為水稻幼苗的形態結構圖；a為胚芽鞘的長；b為第一葉的葉長；c為第二葉的葉鞘長；d為第二葉的葉片長；α表示葉展角(即第二葉的葉片與Y軸的夾角)。
圖2顯示了OsCRY1b過表達的轉基因植株介導增強的藍光反應，而GUS-OsCRY1b，GUS-OsCCT1b，GUS-OsCCT1a呈現出黑暗下組成型的光形態(COP表現型，即葉鞘明顯變短，葉片與Y軸之間有個明顯夾角)和其它光質條件下的超敏感光反應。其中，OsCRY1b-ovx(27)是指過量表達OsCRY1b的轉基因植株。
圖3為Western印跡分析檢測部分OsCRY1b轉基因植株不同的獨立株系中OsCRY1b蛋白的表達水平。
圖4為Western印跡分析檢測部分GUS-OsCRY1b轉基因植株不同的獨立株系中GUS-OsCRY1b蛋白的表達水平。
圖5為Western印跡分析檢測部分GUS-OsCCT1b轉基因植株不同的獨立株系中GUS-OsCCT1b蛋白的表達水平。
圖6為Western印跡分析檢測部分GUS-OsCCT1a轉基因植株不同的獨立株系中GUS-OsCCT1a蛋白的表達水平。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，意外地發現藍光受體CRY1基因的過量表達能夠使單子葉模式植物水稻矮化，增強植物的光反應，從而減少植物對光的依賴性；并且還發現GUS基因與藍光受體CRY1基因的融合基因能夠使植物在黑暗下呈現組成型的光形態。基于此完成了本發明。
本發明的方法特別適用于改良單子葉植物。所述的植物包括但不限于禾本科稻屬、禾本科大麥屬、禾本科羊茅族早熟禾屬、禾本科剪股穎族剪股穎屬、旋花科馬蹄金屬、豆科三葉草屬、桑科榕屬、棕櫚科散尾葵屬、藍雪科補血草屬等。
在本發明的優選方式中，本發明的方法特別適用于改良水稻等糧食作物，獲得矮桿、半矮桿、抗倒伏、且生長茁壯、光利用率高的糧食作物，通過將糧食作物合理密植增加早期產量，從而提高土地光能利用率。
在本發明的優選方式中，本發明的方法特別適用于改良觀賞類和園林綠化類經濟植物如草坪草等。在用于草坪草時，可減少草坪草對光的依賴性，即使在背陰的地方也能茁壯生長；并且還可以根據蛋白表達的高低來選擇株形的高低，多方面地適應園林綠化的需求并且可以減少園林綠化的管理成本。
如本文所用，“藍光受體隱花色素CRY1”、“隱花色素CRY1”、藍光受體CRY1”、“CRY1”可互換使用。
如本文所用，所述的“藍光受體CRY1基因”編碼全長的藍光受體CRY1蛋白或所述的藍光受體CRY1蛋白的功能區。在單子葉植物水稻中，CRY1蛋白的功能區一般為在CRY1蛋白的C-末端約180-260個氨基酸，更優選的，為植物CRY1蛋白C-末端約190-220個氨基酸。
如本文所用，“OsCRY1”是指水稻的藍光受體CRY1，“OsCRY1a”是指一個編碼水稻的藍光受體CRY1的基因，“OsCRY1b”是指另一個編碼水稻的藍光受體CRY1的基因。
如本文所用，“OsCCT1a基因”是指編碼水稻藍光受體OsCRY1a蛋白的C端功能區的OsCRY1a的基因片段；“OsCCT1b基因”是指編碼水稻藍光受體OsCRY1b蛋白的C端功能區的OsCRY1b的基因片段。
如本文所用，“GUS基因”是指β-葡糖苷酸酶基因，當它的產物-β-葡糖苷酸酶與特定的生色底物-X-Gluc試劑結合時，能產生特定的藍顏色反應，因此，以往的研究中一般作為植物轉基因研究中的報道基因。在本發明中，GUS基因與CRY1基因形成的融合基因在植物中表達或過表達能夠使植物在黑暗下呈現組成型的光形態。GUS基因的序列的GenBank登錄號為S69414。
如本文所用，“融合基因GUS-OsCRY1b”是指由GUS基因與全長的OsCRY1b融合而成的基因。
如本文所用，“融合基因GUS-OsCCT1a”是指由GUS基因與OsCCT1a基因融合而成的基因。
如本文所用，“融合基因GUS-OsCCT1b”是指由GUS基因與OsCCT1b基因融合而成的基因。
如本文所用，“光形態建成”是指依賴光控制細胞的分化、結構和功能的改變，最終匯集成組織和器官的建成的過程，亦即光控制發育的過程。
如本文所用，“組成型光形態建成”是指本身不受光啟動的光形態建成的過程。
藍光受體CRY1藍光受體CRY1基因是一種目前已知的基因，廣泛存在于各種植物中，其在各種植物中是較為保守的。CRY具有兩個明顯的功能區，一個是氨基末端區域PHR，與光裂解酶有很高的同源性；另一個是羧基末端區域，與目前已知的蛋白質沒有緊密地序列相似性。目前，有關擬南芥菜CRY的功能研究的最為詳細，其他的雙子葉植物如番茄和豌豆中，CRY功能的研究也有良好的進展。但是有關CRY在單子葉植物中的功能目前還沒有報道。
由于單子葉植物和雙子葉植物在形態及開花調控方面具有顯著的差別，因此本發明提供的水稻CRY1的例子，可以更好的應用到其它單子葉植物中。在水稻中，存在水稻CRY1a基因(即OsCRY1a)和水稻CRY1b(即OsCRY1b)基因，其中OsCRY1a基因的在NCBI中的登記號為AB073546，cDNA序列如SEQ ID NO1所示；OsCRY1b基因在NCBI中的登記號為AB073547，cDNA序列如SEQ ID NO2所示。
本發明中，可通過各種方法來獲得藍光受體CRY1，包括但不限于PCR擴增法、重組法、或人工合成法。
對于PCR擴增法，可根據已知的藍光受體CRY1的序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列，將所述序列克隆入載體，再轉化植物細胞或組織，培養所述植物細胞或組織，獲得轉基因植物。
一般的，本發明所用的載體為適合用于轉化植物細胞或植物組織的載體，包括但不限于pKYL71載體、pHB載體、或pCambia 1301、pCambia 1302、pCambia3301等。
通常，在單子葉植物中，所述的藍光受體CRY1基因還包括編碼CRY1蛋白的功能區的CRY1基因的片段，所述基因片段是位于CRY1的3’端的540-780個核苷酸；更優選的，所述基因片段是位于CRY1的3’端的570-660個核苷酸。
更特別的，以水稻為例，編碼OsCRY1a蛋白的功能區的OsCRY1a基因的片段(OsCCT1a)是位于OsCRY1a基因的3’端1494-2133位核苷酸；編碼OsCRY1b蛋白的功能區的OsCRY1b基因的片段(OsCCT1b)是位于OsCRY1a基因的3’端1494-2103位核苷酸。
GUS基因與CRY1基因的融合基因本發明構建了一種融合基因，包括第一部分和第二部分，其中，所述的第一部分為GUS基因；所述的第二部分為藍光受體CRY1基因。
本發明對制備所述融合基因的方法沒有特別的限制，可采用本領域常規用于制備融合基因的方法。
在制備融合基因時，可以將兩種基因片段直接相連接，在必要的情況下也可以在兩種基因片段之間設置一段連接序列。在本發明的一種方式中，所述的第一部分和第二部分之間還包括3-30個核苷酸的連接序列。
在本發明的一種方式中，GUS基因位于融合基因的5’端，藍光受體CRY1基因位于融合基因的3’端。
在本發明的優選方式中，所述的融合基因具有(i)SEQ ID NO3所示的核苷酸序列(即GUS基因與OsCRY1b基因的融合基因)；(ii)SEQ ID NO4所示的核苷酸序列(即GUS基因與OsCCT1a基因的融合基因)；或(iii)SEQ ID NO5所示的核苷酸序列(即GUS基因與OsCCT1b基因的融合基因)。
植物的轉基因植物的轉基因是指將目的基因轉化進入植物并整合到植物基因組中的技術。用重組DNA轉化植物可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。所述技術包括但不限于(a)農桿菌介導的轉化法；(b)基因槍法；(c)離子束介導法；(d)脂質體法；(e)激光微束法；或(f)超聲波法。
轉基因植株的基因能否表達，還要對其進行篩選，需要區分轉化的植株或細胞，為了能更早地篩選轉基因植株或細胞，在構建載體時，將一些具有特殊標記的報告基因構建到載體上，也可用分子生物學方法進行檢測，例如分子雜交，包括點雜交(Dot Blot)，Southern印跡，Northern印跡，Western印跡和PCR等方法。
使植物矮化或增強植物光反應的方法本發明還提供了一種使植物矮化或增強植物光反應的方法，包括(1)使所述植物過量表達藍光受體CRY1基因；或(2)使所述植物表達GUS與CRY1的融合基因。
在本發明的優選方式中，所述的方法包括步驟(1’)將外源的藍光受體CRY1基因或所述的融合基因轉入植物細胞或組織，獲得轉化入外源藍光受體CRY1基因或所述的融合基因的植物細胞或組織；和(2’)將步驟(1)獲得的轉入了外源藍光受體CRY1基因或所述的融合基因的植物細胞或組織再生成植物植株。
在本發明的一個實施例中，通過過量表達所述CRY1基因的全長而使功能增強。在本發明的另一個實施例中，通過過量表達GUS與編碼CRY1蛋白功能區的CRY1基因片段的融合基因而呈現出組成型的增強光反應的表型。
當使所述植物表達GUS基因和藍光受體CRY1基因(如GUS-OsCRY1b、GUS-OSCCT1a、GUS-OSCCT1b)時，即可達到使植物矮化或增強植物光反應的目的。更優選的，使所述植物過量表達GUS基因和藍光受體CRY1基因的融合基因。通過過量表達所述融合基因，可減少植物對光的依賴性，即使在背陰的地方也能茁壯生長。
本發明的方法特別適合于使單子葉植物矮化以及增強單子葉植物的光反應。在本發明的優選方式中，所述植物選自下組禾本科稻屬、禾本科大麥屬、禾本科羊茅族早熟禾屬、禾本科剪股穎族剪股穎屬、旋花科馬蹄金屬、豆科三葉草屬、桑科榕屬、棕櫚科散尾葵屬、或藍雪科補血草屬。
在本發明的優選例中，所述的植物為水稻。并且，當所述的植物為水稻時，所述的藍光受體CRY1基因為水稻的藍光基因受體OsCRY1a基因，或OsCRY1b基因。
在本發明的優選方式中，使所述植物過量表達藍光受體CRY1基因或GUS基因與CRY1基因的融合基因的方法選自(a)農桿菌介導的轉化法；(b)基因槍法；(c)離子束介導法；(d)脂質體法；(e)激光微束法；或(f)超聲波法。
通過過量表達CRY1基因獲得矮化及增強光反應的植株適用于各種單子葉植物。可采用本領域已知的各種方法來使CRY1基因過量表達。在本發明的優選方式中，以水稻為例，通過PCR方法分別獲得OsCRY1a，OsCRY1b cDNA全長，分別插入pKYL71載體[參見Schardl，C.L.，Byrd，A.D.，Benzion，G.，Altschuler，M.A.，Hildebrand，D.F.，和Hunt，A.G.(1987).“Design andconstruction of a versatile system for the expression of foreign genesin plants”.Gene 61，1-11]或pHB載體[參見Jian Mao，Yan-Chun Zhang，Yi Sang，Qing-Hua Li，and Hong-Quan Yang(2005)A role for Arabidopsiscryptochromes and COP1 in the regulation of stomatal opening.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，102，12270-12275.]中的35S啟動子后面獲得過量表達OsCRY1a，OsCRY1b的植物表達載體。再將這些載體分別轉化植物，獲得轉基因植株。分別在中等強度藍光下(20μmol.m-2.s-1)篩選胚芽鞘明顯變短(正常的約為3-5mm，明顯變短的約為2-3mm)的小苗，獲得的轉基因植株為過量表達OsCRY1a，OsCRY1b的轉基因植株。
使植物呈現黑暗下的組成型光形態的方法使植物呈現黑暗下的組成型光形態的方法包括使所述植物表達GUS與CRY1基因的融合基因。
在本發明的優選方式中，所述的方法包括步驟(1)將所述的融合基因轉入植物細胞或組織，獲得轉化入所述的融合基因的植物細胞或組織；和(2)將步驟(1)獲得的轉入了所述的融合基因的植物細胞或組織再生成植物植株。
在本發明的一種優選方式中，通過使植物過量表達GUS與CRY1基因(包括編碼CRY1蛋白功能區的CRY1基因片段)的融合基因而使植物呈現黑暗下的組成型光形態。
本發明的主要優點在于(1)本發明首次證實過表達藍光受體CRY1基因能夠使單子葉植物矮化或增強單子葉植物光反應。
(2)本發明首次證實過量表達GUS與CRY1基因的融合基因能夠使單子葉植物呈現出增強光反應的表型，以及使植物呈現出黑暗下的組成型光形態。
(3)本發明提供了使單子葉植物矮化或增強植物的光反應的方法，可減少單子葉植物對光的依賴性，從而可改進許多糧食作物(如水稻、玉米等)的產量和品質。并且可以用來改良園林綠化植物如草坪草等的光形態建成，以便更好地適應園林綠化建設。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明，而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如分子克隆實驗手冊(Molecular cloningAlaboratory manual，3rd ed.，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，2001)和植物分子生物學實驗手冊(Plant Molecular Biology-A LaboratoryMannual，Clark等，Springer-Verlag，1997)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例1過量表達OsCRY1b，OsCRY1a轉基因植株的構建根據GenBank登錄號AB073546所提供的序列合成OsCRY1a全長，或通過PCR方法從常規的水稻基因組文庫中獲得OsCRY1a的功能區序列，使其與GUS融合后，插入載體pHB中的HindIII和SacI酶切位點獲得可過量表達OsCRY1a的植物表達載體。
根據GenBank登錄號AB073547所提供的序列合成OsCRY1b全長，或通過PCR方法從常規的水稻基因組文庫中獲得OsCRY1b全長，插入載體pHB中的35S啟動子后面HindIII和SacI獲得可過量表達OsCRY1b的植物表達載體。
再將上述載體分別轉化水稻愈傷組織，培養水稻愈傷組織，獲得轉基因植株。在中等強度藍光(20μmol.m-2.s-1)篩選葉鞘或者胚芽鞘明顯變短的小苗，獲得的轉基因植株為過量表達OsCRY1b的轉基因植株。
實施例2融合基因GUS-OsCCT1a，GUS-OsCCT1b和GUS-OsCRY1b的構建通過常規的PCR方法擴增GUS基因(GenBank登錄號S69414)，將獲得的GUS基因與前述獲得的OsCRY1b融合，獲得融合基因GUS-OsCRY1b，所述融合基因的序列見SEQ ID NO3所示。
同樣地，采用常規的技術將GUS基因分別與OsCCT1a和OsCCT1b融合，獲得融合基因GUS-OsCCT1a和GUS-OsCCT1b，所述融合基因的序列見SEQ ID NO4和SEQ ID NO5所示。
將上述獲得的融合基因采用常規的農桿菌介導的水稻成熟胚的轉化方法分別轉化水稻。
實施例3光形態建成反應的研究1.光形態建成研究去殼的水稻穎果先用70％的酒精滅菌兩分鐘，然后再用20％漂白劑滅菌40分鐘。無菌水沖洗4-6次后種植于含有0.8％瓊脂粉和2％蔗糖的MS培養基上，并且放置于30℃培養箱中，黑暗下處理兩天誘導發芽。將發芽的種子移植到新鮮的MS培養基容器中。容器的尺寸為77×77×97mm，型號為Sigma，Magentavessel GA-7 V8505。
2.光源植物生長時所用的光源是E-30 LED生長培養箱，藍光的波長為469納米，紅光的波長為680納米，遠紅光的波長為730納米，在連續光照條件下的溫度是22℃。光譜測定用的儀器是美國ASD公司的便攜式光譜儀，光強測定用的儀器是美國Li-Cor公司的Li250光量子測定儀。
實施例4過量表達OsCRY1b對植株的影響首先本發明人觀測了分別在黑暗下和藍光下生長了7天的野生型的水稻幼苗，發現黑暗下野生型幼苗的胚芽鞘，第一葉(不含葉片，只有葉柄，也稱不完全葉)，第二葉的葉片和葉柄都明顯的長于藍光下幼苗的相應部分。這表明藍光抑制胚芽鞘和第一葉的伸長。除此之外，黑暗下第二葉的葉片是蜷曲的，不張開的，垂直生長，與Y軸之間沒有夾角，而藍光下生長的幼苗，第二葉的葉片完全張開并且伸展，與Y軸之間有個明顯的夾角，即具有明顯的葉展角，如圖1所示。
為了檢測OsCRY1b是否參與此反應，本發明人制備了過量表達OsCRY1b的轉基因植株。本發明人共獲得9株獨立的轉基因植株，可采用Western印跡的方法來檢測植物中目的蛋白的表達水平。圖3為Western印跡分析檢測部分OsCRY1b轉基因植株不同的獨立株系(代號為OsCRY1b(25)、OsCRY1b(26)、OsCRY1b(27))中OsCRY1b蛋白的表達水平。
上述的9株轉基因植株呈現出增強的藍光反應，但在其他光質條件下如紅光，遠紅光以及黑暗條件下與野生型沒有明顯差別(圖2)。
本發明人測量了所有光質條件下幼苗的胚芽鞘長，第一葉長，第二葉的葉鞘長和葉片長，如表1所示(測量藍光、紅光和遠紅光條件下7天以及黑暗下9天的水稻幼苗的胚芽鞘長、第一葉長、第二葉的葉鞘和葉片長；每種基因型測量20個單株；SD為標準偏差)，過量表達OsCRY1b的轉基因植株，其胚芽鞘，第一葉，第二葉的葉鞘和葉片的長度在藍光下明顯短于野生型。而在其他光質條件下和野生型沒有明顯差別。
這些數據表明OsCRY1b可作為水稻藍光受體，介導在早期幼苗發育中藍光抑制的胚芽鞘及葉片伸長的反應。
表1 水稻胚芽鞘和葉長的測量

因此，過量表達OsCRY1b的轉基因植株呈現出藍光下胚芽鞘及葉片明顯縮短的表現型。
實施例5 GUS-OsCCT1a，GUS-OsCCT1b和GUS-OsCRY1b轉基因植株介導水稻中的COP表現型1.GUS-OsCCT1a和GUS-OsCCT1b的轉基因植物的表現型本發明人將攜帶GUS-OsCCT1a和GUS-OsCCT1b片段的載體轉入野生型水稻中，分別獲得了5株GUS-OsCCT1a過量表達和12株GUS-OsCCT1b過量表達的轉基因植株。
可采用Western印跡的方法來檢測植物中目的蛋白的表達水平。圖5為Western印跡分析檢測部分GUS-OsCCT1b轉基因植株不同的獨立株系(代號為GUS-OsCCT1b(10)、GUS-OsCCT1b(8)、GUS-OsCCT1b(5))中GUS-OsCCT1b蛋白的表達水平。其中，WT表示野生型。
圖6為Western印跡分析檢測部分GUS-OsCCT1a轉基因植株不同的獨立株系(代號為GUS-OsCCT1a(1)、GUS-OsCCT1a(2)、GUS-OsCCT1a(10))中GUS-OsCCT1a蛋白的表達水平。其中，WT表示野生型。
觀察發現，這些轉基因植株在黑暗下種植時，呈現出COP表現型，即第二葉完全伸展并張開，葉鞘變短，第二葉的葉片與Y軸之間有個明顯的葉展角(圖2和表1)。這個形態在野生型中通常只有光下才能看到(圖1，左)。
進一步研究發現GUS-OsCCT1a和GUS-OsCCT1b的幼苗在藍光，紅光和遠紅光的光質條件下也呈現出明顯矮化的表型(圖2和表1)。
2.GUS-OsCRY1b融合基因的轉基因植物的表現型本發明人將構建好的GUS與OsCRY1b的融合基因轉入野生型水稻中，共獲得21株轉基因植株。
圖4為Western印跡分析檢測部分GUS-OsCRY1b轉基因植株不同的獨立株系(代號為GUS-OsCRY1b(2)、GUS-OsCRY1b(5)、GUS-OsCRY1b(7))中GUS-OsCRY1b蛋白的表達水平。其中，WT表示野生型。
這些植株呈現出黑暗下的COP表現型，并且在藍光，紅光和遠紅光的光質條件下呈現出矮化的表現型(圖2和表1)，這種表型與GUS-OsCCT1a和GUS-OsCCT1b的轉基因植株的表現型是相似的。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院<120>利用水稻藍光受體隱花色素CRY1基因改良植物的形態建成<130>062253<160>5<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2133<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<400>1atgtcagcgt cgccgtcgtc gatgagcggc gccggcgccg gcgaggcggg ggtgcggacg 60gtggtgtggt tcaggcggga cctgcgcgtg gaggacaacc cggcgctggc ggcggcggcg 120cgggcggccg gggaggtggt gccggtgtac gtgtgggcgc cggaggagga cgggccgtac 180tacccggggc gggtgtcccg gtggtggctc agccagagcc tcaagcacct ggacgcctcg 240ctccggcggc tcggcgccag caggctcgtc acccgccgct ccgccgacgc cgtcgtcgcg 300ctcatcgagc tcgtccgcag catcggcgcc acgcatctct tcttcaacca cctctacgac 360ccgctgtcgc tggtgaggga ccaccgggtg aaggcgctgc tgacggccga gggcatcgcc 420gtgcagtcgt tcaacgccga cctgctgtac gagccatggg aggtggtcga cgacgacggc 480tgcccgttca ccatgttcgc gccgttctgg gacaggtgcc tgtgcatgcc cgacccggcg 540gcgccgctgc tgccgcccaa gaggatcgcg cccggcgagc tgccggcgag gaggtgcccc 600tccgacgagc tggtgttcga ggacgagtcc gagcggggga gcaacgcgct gctggcgagg 660gcgtggtcgc ccgggtggca gaacgccgac aaggcgctgg ccgcgttcct caacgggcca 720ctcatggact actcggtgaa ccggaagaag gccgacagcg ccagcacgtc actgctgtcg 780ccgtacctgc acttcggcga gctcagcgta cgcaaggtgt tccaccaggt gaggatgaag 840cagctcatgt ggagcaacga ggggaaccac gccggcgacg agagctgcgt cctcttcctc 900cggtccatcg gcctcaggga gtactcgagg tacctcacgt tcaaccaccc gtgcagcctg 960gagaagccac tcctggcgca cctcaggttc ttcccctggg tggtcgacga ggtgtacttc 1020aaggtgtgga ggcaggggag gacagggtac cctctcgtcg acgccgggat gcgcgagctc 1080tgggccaccg gctggctgca cgaccggata cgcgttgtcg tctccagctt cttcgtcaag 1140gtgctccagc ttccatggcg ctgggggatg aagtacttct gggacaccct gctcgacgcc 1200gacctcgaga gcgacgcgct cggctggcag tacatctccg gctctctccc cgatggccgt 1260gagctcgacc gcatcgacaa ccctcagctt gaaggataca agtttgatcc gcacggggag 1320tatgtccggc gatggctgcc ggagctggca aggctgccga cggagtggat acaccaccca 1380tgggacgcac cggagtcggt gctccaggct gcagggattg agctaggctc caactatcct 1440ctccccatcg tggagctgga cgcggcgaag accaggctgc aggatgcact gtcagagatg 1500tgggagctcg aggccgcgtc acgcgcagcg atggagaacg gaatggagga gggcctcggc 1560gactcctccg acgtgccgcc gatcgccttc ccaccggagc tgcagatgga agttgaccga 1620gcaccggccc agcctactgt tcacggaccg acaacggctg gccggcgacg agaggatcag 1680atggttccca gcatgacctc ctcgctggtc agagctgaaa cagaactttc agcggatttt 1740gacaacagca tggacagtag gccggaggtg ccgtcgcagg tgctcttcca gcctcggatg 1800gaaagggaag aaacagtgga cggcggcggt ggcggcggaa tggtcggcag gagcaacggc 1860ggcggccacc aaggccaaca ccagcagcaa cagcacaact ttcagactac aattcaccgg 1920gcacggggcg ttgcgccgtc tacgtcagag gcatcaagca actggactgg gagagaaggc 1980
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<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>融合基因<400>5atgttacgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca 60ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa 120gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt 180cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 240ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat 300aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg 360tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtatc accgtttgtg tgaacaacga actgaactgg 420cagactatcc cgccgggaat ggtgattacc gacgaaaacg gcaagaaaaa gcagtcttac 480ttccatgatt tctttaacta tgccggaatc catcgcagcg taatgctcta caccacgccg 540aacacctggg tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagactg taaccacgcg 600tctgttgact ggcaggtggt ggccaatggt gatgtcagcg ttgaactgcg tgatgcggat 660
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1.一種藍光受體CRY1基因的用途，其特征在于，用于(i)制備矮化的植物；或(ii)增強植物的光反應。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的植物為單子葉植物。
3.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的植物選自下組禾本科稻屬、禾本科大麥屬、禾本科羊茅族早熟禾屬、禾本科剪股穎族剪股穎屬、旋花科馬蹄金屬、豆科三葉草屬、桑科榕屬、棕櫚科散尾葵屬、或藍雪科補血草屬。
4.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的藍光受體CRY1基因是選自以下植物的藍光受體CRY1基因禾本科稻屬、禾本科大麥屬、禾本科羊茅族早熟禾屬、禾本科剪股穎族剪股穎屬、旋花科馬蹄金屬、豆科三葉草屬、桑科榕屬、棕櫚科散尾葵屬、或藍雪科補血草屬。
5.一種融合基因，包括第一部分和第二部分，其特征在于，所述的第一部分為GUS基因；所述的第二部分為藍光受體CRY1基因或CRY1C端功能區編碼序列。
6.權利要求5所述的融合基因或其編碼蛋白的用途，其特征在于，用于(a)制備矮化的植物；(b)增強植物的光反應；或(c)制備具有組成型光形態建成表現型的植物。
7.一種制備矮化的植物或增強植物光反應的方法，其特征在于，包括(1)使所述植物過量表達藍光受體CRY1基因；或(2)使所述植物表達權利要求5所述的融合基因。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(1’)將外源的藍光受體CRY1基因或權利要求5所述的融合基因轉入植物細胞或組織，獲得轉化入外源藍光受體CRY1基因或權利要求5所述的融合基因的植物細胞或組織；和(2’)將步驟(1)獲得的轉入了外源藍光受體CRY1基因或權利要求5所述的融合基因的植物細胞或組織再生成植物植株。
9.一種制備具有組成型光形態建成表現型的植物的方法，其特征在于，所述的方法包括使所述植物表達權利要求5所述的融合基因。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(1)將權利要求5所述的融合基因轉入植物細胞或組織，獲得轉化入權利要求5所述的融合基因的植物細胞或組織；和(2)將步驟(1)獲得的轉入了權利要求5所述的融合基因的植物細胞或組織再生成植物植株。
全文摘要
本發明公開了藍光受體CRY1基因的用途，它被用于制備矮化的植物或用于增強植物的光反應。本發明還公開了一種使植物矮化或增強植物光反應的方法。本發明還公開了一種制備具有組成型光形態建成表現型的植物的方法。本發明的方法可減少單子葉植物對光的依賴性，從而可改進許多糧食作物或園林植物的產量和品質。
文檔編號C12N15/62GK101054585SQ200610025709
公開日2007年10月17日 申請日期2006年4月14日 優先權日2006年4月14日
發明者楊洪全, 張艷春, 龔頌福 申請人:中國科學院上海生命科學研究院