專利名稱：一種β－葡萄糖苷酶基因工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組的β-葡萄糖苷酶基因工程菌----大腸埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.1626，以及該菌種在制備有效霉亞基胺A化合物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
有效霉素復(fù)合物中的多個(gè)組分以及一系列降解產(chǎn)物或者以它們?yōu)榛A(chǔ)的許多半合成化合物都具有不同程度的糖苷酶抑制活性，顯示這類物質(zhì)在抗糖尿病應(yīng)用方面具有潛在的開發(fā)價(jià)值。其中已開發(fā)成功的典型例子是伏格列波糖(Voglibose)以及阿卡波糖(Acarbose)。
有效霉亞基胺類(validoxylamines)是上述這些糖苷酶抑制活性物質(zhì)中的一組，它們?cè)谖⑸锇l(fā)酵生產(chǎn)的有效霉素復(fù)合物中有少量存在。其中有效霉亞基胺A(validoxylamine A，結(jié)構(gòu)式見圖1)尤其對(duì)很多生物的海藻糖酶都有強(qiáng)烈的抑制作用。雖然通過(guò)化學(xué)手段水解有效霉素復(fù)合物中的主要組分有效霉素A(validamycin A，結(jié)構(gòu)式見圖1)可以獲得有效霉亞基胺A，但卻存在很多缺點(diǎn)如成本高、反應(yīng)要求高、副產(chǎn)物多、分離純化難、污染多等。另外據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道以有效霉素A通過(guò)生物轉(zhuǎn)化的方法也可以制備得到有效霉亞基胺A。其中的關(guān)鍵點(diǎn)就是通過(guò)生物體產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶將有效霉素A上的β-葡萄糖苷鍵水解斷開。
但β-葡萄糖苷酶是一類來(lái)源廣泛的糖基水解酶，其底物專一性差別很大(文獻(xiàn)報(bào)道的底物有纖維二糖、纖維糊精、芳基葡萄糖苷(如熊果甙、水楊甙及生色化合物p-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷)，烷基葡萄糖苷(甲基-β-D-葡萄糖苷)，β-1，3-葡萄糖苷(昆布二糖)及β-1，2-葡萄糖苷(槐糖)等)。本發(fā)明人就曾采用了一些其他生物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶來(lái)水解有效霉素A，但效果并不理想。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，一些有效霉素A降解菌株中含有可專一性水解有效霉素A的β-葡萄糖苷鍵的酶，對(duì)于轉(zhuǎn)化過(guò)程中主要步驟的推定反應(yīng)線路如圖1。由此可見用這些微生物的菌體或其破碎上清(粗酶)進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化是一個(gè)系列反應(yīng)，據(jù)推測(cè)該過(guò)程涉及到數(shù)個(gè)構(gòu)成酶，因此底物有效霉素A經(jīng)β-葡萄糖苷酶作用生成有效霉亞基胺A(validoxylamine A)后很快又會(huì)被后續(xù)的酶(有效霉亞基胺A 3-脫氫酶、C-N裂解酶等)反應(yīng)所降解，因此很難用現(xiàn)有菌種直接降解底物來(lái)制取并分離得到量大且純度高的有效霉亞基胺A產(chǎn)物。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是從根瘤土壤桿菌HCCB 20052全染色體中克隆得到了β-葡萄糖苷酶基因bgl，將其連接到大腸埃希氏菌(E.coli)表達(dá)載體pET30a(+)上，構(gòu)建得表達(dá)質(zhì)粒pLY72，轉(zhuǎn)化E.coli BL21后獲得重組工程菌HCCB 20097，該菌株已于2006年3月1日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)登記保藏，保藏號(hào)CGMCC No.1626。該重組菌在含有50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)，經(jīng)IPTG或乳糖誘導(dǎo)可獲得目的蛋白的高表達(dá)，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單處理得到的β-葡萄糖苷酶粗酶對(duì)有效霉素A的降解表現(xiàn)出很高的效率。同時(shí)，重組工程菌的靜息細(xì)胞也對(duì)降解有效霉素A生成有效霉亞基胺A呈現(xiàn)很高效率，說(shuō)明底物及降解產(chǎn)物能夠有效地透過(guò)菌體細(xì)胞壁屏障，這也為這一轉(zhuǎn)化過(guò)程實(shí)現(xiàn)工業(yè)化提供了更多的便利。用粗酶或靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化有效霉素A的過(guò)程，轉(zhuǎn)化溫度為30-40℃，pH5.0-8.0。
本發(fā)明通過(guò)分子生物學(xué)手段對(duì)供體菌株根瘤土壤桿菌HCCB 20052中編碼β-葡萄糖苷酶的基因進(jìn)行了克隆表達(dá)，這種選擇性的方式排除了供體菌中共存的其他一系列酶的干擾，使工程菌對(duì)有效霉素A的轉(zhuǎn)化只限于β-葡萄糖苷鍵水解這一步單純的反應(yīng)，故轉(zhuǎn)化產(chǎn)物也僅限于成分單一的有效霉亞基胺A?；谶@樣的機(jī)理，用本發(fā)明方法制備有效霉亞基胺A其反應(yīng)條件溫和易控，轉(zhuǎn)化效率高，產(chǎn)物穩(wěn)定單一，副產(chǎn)物生成少，非常有利于產(chǎn)物的分離純化，得到的目標(biāo)產(chǎn)物有效霉亞基胺A量大且純度高。
圖1一些微生物菌種轉(zhuǎn)化有效霉素A的主要反應(yīng)步驟圖2根瘤土壤桿菌轉(zhuǎn)化有效霉素A的HPLC圖譜圖3本發(fā)明工程菌CGMCC No.1626的靜息細(xì)胞對(duì)底物有效霉素A的轉(zhuǎn)化(HPLC圖譜)。
轉(zhuǎn)化pH7.5，溫度35℃，(a)轉(zhuǎn)化時(shí)間0小時(shí)(起始點(diǎn))(b)轉(zhuǎn)化時(shí)間30分鐘(c)轉(zhuǎn)化時(shí)間2小時(shí)具體實(shí)施方式
以下是本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實(shí)施例1.
工程菌CGMCC No.1626的構(gòu)建根據(jù)已報(bào)道的Agrobacterium tumefaciens str.C58基因全序列(GenBank accession no.NC_003063)中一段β-葡萄糖苷酶基因序列設(shè)計(jì)并合成特異性PCR擴(kuò)增引物，兩條引物的5’端分別含有單一的HindIII和SacI酶切位點(diǎn)。
P15’-GCAAGCTTTCACCCCTTCACCACACC-3’(劃線為HindIII酶切位點(diǎn))，P25’GCGGGAGCTCATGGATAGAAAGGCCTCT-3’(劃線為SacI酶切位點(diǎn))。以Agrobacterium sp.HCCB-20052的基因組為模板，用引物P1、P2的β-葡萄糖苷酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μl，含有5ng Agrobacterium sp.HCCB-20052總DNA，25μl Premix Taq，50pmol每種引物。反應(yīng)條件先在94℃變性5min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的94℃變性1min -55℃退火1min -72℃延伸1.5min，72℃加熱10min終止反應(yīng)。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到載體pUC19上獲得pLY71質(zhì)粒，pLY71經(jīng)SacI-HindIII酶切回收片段插入到表達(dá)載體pET30a的多克隆位點(diǎn)的Sad和HindIII位點(diǎn)上獲得表達(dá)質(zhì)粒pLY72。pLY72中β-葡萄糖苷酶編碼基因位于6×His標(biāo)簽編碼基因的下游。將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21菌株獲得本發(fā)明工程菌。
實(shí)施例2.
工程菌的培養(yǎng)將重組工程菌接種到含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)液中37℃震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600至0.6左右)，加入1mM的IPTG或乳糖，37℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)。
實(shí)施例3粗酶的獲得及粗酶對(duì)有效霉素A的轉(zhuǎn)化經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)好的重組菌培養(yǎng)液室溫下4000rpm離心15min收集菌體，用PBS緩沖液將菌體洗滌三次，再用1/10體積的0.05M，pH5.5的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液將菌體重懸，超聲破碎，在4℃以 離心25min，取上清作為粗酶。
粗酶液稀釋20倍，取出20ml，加入0.1g有效霉素A底物，32℃下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。轉(zhuǎn)化1小時(shí)后轉(zhuǎn)化率達(dá)54％實(shí)施例4粗酶對(duì)有效霉素A的轉(zhuǎn)化按實(shí)施例2方法收獲經(jīng)洗滌的濕菌體，用1/10體積的0.05M，pH7.0的磷酸氫二鉀/磷酸二氫鉀緩沖液將菌體重懸，超聲破碎，在4℃以 離心25min，取上清作為粗酶。
粗酶液稀釋20倍，取出20ml，加入0.1g有效霉素A底物，40℃下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。轉(zhuǎn)化1小時(shí)后轉(zhuǎn)化率達(dá)67％實(shí)施例5靜息細(xì)胞對(duì)有效霉素A的轉(zhuǎn)化按實(shí)施例2得到的工程菌培養(yǎng)液，離心洗滌后得到濕菌體，取1.0g濕菌體重懸于10ml 0.05M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)，加入0.1g有效霉素A，35℃振蕩反應(yīng)2小時(shí)。經(jīng)HPLC分析，此條件下有效霉素A的轉(zhuǎn)化率可達(dá)100％
權(quán)利要求
1.一種β-葡萄糖苷酶基因工程菌——大腸埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.1626。
2.權(quán)利要求1所述的工程菌在用有效霉素A制備有效霉亞基胺A化合物中的應(yīng)用方法。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于工程菌用于制備有效霉亞基胺A可以通過(guò)來(lái)自于菌體的粗酶來(lái)實(shí)現(xiàn)有效霉素A底物的轉(zhuǎn)化。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其特征是粗酶是用經(jīng)培養(yǎng)獲得的濕菌體，重懸于緩沖液中進(jìn)行超聲破碎，離心取上清所得。
5.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于工程菌用于制備有效霉亞基胺A可以通過(guò)其靜息細(xì)胞實(shí)現(xiàn)有效霉素A底物的轉(zhuǎn)化。
6.權(quán)利要求3所述的方法，用工程菌粗酶進(jìn)行有效霉素A轉(zhuǎn)化時(shí)，過(guò)程溫度30-40℃，pH5.0-8.0。
7.權(quán)利要求5所述的方法，用工程菌靜息細(xì)胞進(jìn)行有效霉素A轉(zhuǎn)化時(shí)，過(guò)程溫度30-40℃，pH5.0-8.0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種β－葡萄糖苷酶基因工程菌——大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)CGMCC No.1626，以及該菌種在制備有效霉亞基胺A化合物中的應(yīng)用。利用該工程菌轉(zhuǎn)化有效霉素A可得到有效霉亞基胺A產(chǎn)物，具有轉(zhuǎn)化效率高、成本較低、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物純度高、分離純化容易、化學(xué)污染少等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P1/04GK101050447SQ20061002550
公開日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2006年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月7日
發(fā)明者殷瑜, 朱麗, 楊志鈞, 陶正利, 陳代杰, 王天嬌 申請(qǐng)人:上海來(lái)益生物藥物研究開發(fā)中心有限責(zé)任公司, 浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠