專利名稱：同步檢測沙眼衣原體和細小脲原體的熒光定量pcr試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種性傳播疾病病原體基因檢測技術，尤其涉及一種同步檢測沙眼衣原體和細小脲原體熒光定量PCR(聚合酶鏈式反應)試劑盒，適用于沙眼衣原體和細小脲原體同步定性定量檢測。
背景技術：
沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，CT)和細小脲原體(Ureaplasmaparvum，UP)是非淋菌性尿道炎(或宮頸炎)的主要病原體，是引起自然流產的主要病原微生物，由這兩種病原體感染并發的前列腺炎及不孕不育癥也日益增多。解脲脲原體分為兩個生物群和14個血清型。這兩個生物群可從表型和遺傳上進行鑒定。但越來越多的證據表明它可分為兩個種，即Ureaplasma parvum(命名為細小脲原體，以前的生物群1，包括血清型1，3，6，14)和Ureaplasmaurealyticum(以前的生物群2，包括血清型2，4，5，7～13，保留原來的名稱解脲脲原體)。在人類泌尿生殖道定殖或引起感染的絕大部分為生物群1-細小脲原體。
近年來各種報道顯示，淋菌性尿道炎發病率下降，而非淋菌性尿道炎卻不斷上升，居性傳播疾病的首位。非淋菌性尿道炎可有癥狀或無癥狀，亞臨床感染可持續存在多年。無論有癥狀還是無癥狀，其后果同樣嚴重除尿道炎、眼結膜炎外，可引起其他生殖器官炎癥，如附睪炎、前列腺炎、輸精管炎、宮頸炎、陰道炎、輸卵管炎及盆腔炎等，最后導致不育癥和異位妊娠，也可感染嬰兒引起結膜炎和肺炎。男性同性戀者，可患直腸炎及咽炎。非淋菌性尿道炎常與淋病同時感染。前者先出現淋病癥狀，經抗淋病治療后，淋球菌被青霉素殺死，而衣原體、支原體依然存在。在感染1-3周后發病。臨床上很易被誤認為淋病未治愈或復發。由此可見，非淋菌性尿道炎給人們的身心健康造成了極大的傷害，必須找到正確有效的診斷方法。
近年來發展起來的熒光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR，FQ-PCR)技術以其靈敏度高、速度快、特異性強等優點在基因表達水平分析(Nellemann C，Vinggaard AM，Dalgaard M，et al.Quantification of Antiandrogen EffectDetermined by LightCycler Technology[J].Toxicology，2001，16329-38)、病原體的定性(McGoldrick A，Lowings JP，Ibata G，et al.A Novel Approachto the Detection of Classical Swine Fever Virus by RT-PCR with aFluorogenic Probe(TaqMan)[J].J.Virol.Methods，1998，72125-135.；Bhudevi B，Weinstock D.Fluorogenic RT-PCR assay(TaqMan)for Detectionand Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus[J].Vet.Microbiol.，2001，831-10.)和定量檢測(Desire N，Dehee A，Schneider V，et al.Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral Load bya TaqMan Real-Time PCR Assay[J].J.Clin.Microbiol，2001，391303-1310.；Martell M，Gomez J，Esteban JI，et al.High-ThroughputReal-Time Reverse Transcription-PCR Quantitation of Hepatitis C Virus RNA[J].J.Clin.Microbiol，1999，37327-332.；Kearns AM，Turner AJL，Eltringham GJA，et al.Rapid Detection and Quantification of CMV DNA inUrine using Lightcycler-based Real-time PCR[J].J.Clin.Virol，2002，24131-134；Florence KP，Glaucia PB，Mireille S，et al.Quantitationof HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry[J].J.Virol.Methods，2001，95111-119.)等方面得到廣泛應用，并且已經成為當前病毒核酸定量的主要方法，國內目前已有關于丙肝、乙肝、支原體、艾滋病、結核定量檢測的試劑盒上市。
臨床檢測上傳統的培養法和血清學方法具有靈敏度低、特異性差、假陽性、耗時費力等缺點；常規PCR法雖然有簡便、快速、靈敏的優勢，但是有不能精確定量和PCR后處理產生污染導致的假陽性等問題；因此焏待開發精確、靈敏、快速、無污染的臨床檢驗方法。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術存在的缺點和不足，提供一種同步檢測沙眼衣原體和細小脲原體的熒光定量PCR試劑盒。
本發明采用以下技術方案一、PCR試劑盒該試劑盒包括a)DNA裂解液，b)熒光定量PCR反應液，c)UP標準陽性模板pU-UP，d)CT標準陽性模板pU-CT，e)陰性質控標準品；熒光定量PCR反應液含有沙眼衣原體特異性引物對和熒光探針，以及細小脲原體特異性引物對和熒光探針；細小脲原體(UP)正向引物為5′-CATTGATGTTGCACAAGGAGAAA-3′，反向引物為5′TTAGCACCAACATAAGGAGCTAAATC-3′；熒光探針序列為5′-TTGACCACCCTTACGAG-3′；熒光探針5′端標記報告熒光基團HEX，3′端標記不發光的淬滅基團標記，并連接小型凹槽結合物-MGB基團(TaqMan MGB探針)，可以大大提高探針的退火溫度(Tm值)，標準陽性模板pU-UP是含有細小脲原體高度保守基因-脲酶基因的111個堿基對的核苷酸片段構成的pUCm-T載體，該載體可在大腸桿菌DH5α中增殖。
沙眼衣原體(CT)正向引物為5′-TTCAGTTGGGCCAGATCATG-3′，反向引物為5′-CTCTTCATCGGTGGCTAATGTATAAA-3′；熒光探針序列為5′-AGGCTCGTCCTGACTCATGCATTTCG-3′；熒光探針5′端標記FAM，3′端標記TAMRA基團，標準陽性模板pU-CT是含有沙眼衣原體高度保守基因trp基因73個堿基對的核苷酸片段構成的pUCm-T載體，該載體可在大腸桿菌DH5α中增殖。
具體地說a)DNA裂解液DNA裂解液包含50mmo1/L NaOH，10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，體積分數為1％Triton X-100，體積分數為1％NP-40，0.5mmol/L EDTA pH 8.0。
b)熒光定量PCR反應液熒光定量PCR反應液包含PCR 10×buffer 3.0μl，10μmol/L UP正向引物和反向引物各1.0μl，10μmol/L CT正向引物和反向引物各0.7μl，UP 5μmol/L熒光探針1.0μl，CT5μmol/L熒光探針0.7μl，25mmol/L MgCl23μl，10mmol/LdNTPs 0.7μl，2.5U/μl HOTSTART Taq DNA聚合酶0.6μl，無菌雙蒸水5.6μl，反應液總體積18μl。其中熒光探針為所示的核苷酸序列，UP熒光探針5′端標記HEX，3′端標記MGB，CT熒光探針5′端標記FAM，3′端標記TAMRA。
c)UP標準陽性模板pU-UPUP標準陽性模板pU-UP是含有細小脲原體高度保守基因ureE基因111個核苷酸片段構成的pUCm-T重組質粒，該重組質粒轉化大腸桿菌DH5α增殖后用堿裂解法提取，經DNA純化試劑盒純化，用分光光度計測A260定量并稀釋至109拷貝/μl，-20℃保存。貯存濃度為109拷貝/μl，使用前進行10倍梯度的系列稀釋。
d)CT標準陽性模板pU-CTCT標準陽性模板pU-CT是含有沙眼衣原體trp基因73個核苷酸片段構成的pUCm-T重組質粒，該重組質粒轉化大腸桿菌DH5α增殖后用堿裂解法提取，經DNA純化試劑盒純化，用分光光度計測A260定量并稀釋至109拷貝/μl，-20℃保存。貯存濃度為109拷貝/μl，使用前進行10倍梯度的系列稀釋。
e)陰性質控標準品陰性質控標準品為無菌雙蒸水。
本試劑盒的工作原理在本發明提供的同步快速定量檢測沙眼衣原體和細小脲原體熒光定量PCR試劑盒中，有標記了熒光基團的特異性熒光探針，在探針完整時，兩基團在空間結構上距離相互靠近，5′端報告基團產生的熒光因為熒光共振能量轉移(FRET)而被3′端淬滅基團淬滅，故體系中沒有熒光信號的變化。在PCR退火和延伸過程中，探針與模板特異性結合，隨著引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5′→3′外切活性對探針進行切割釋放出報告基團，這樣破壞了兩基團之間的熒光共振能量轉移(FRET)，報告基團所釋放的熒光可以被內置在定量檢測儀內的熒光計檢測，熒光量的增加與PCR產物的積累量呈比例關系。對沙眼衣原體和細小脲原體的定量可通過與標準品的循環域值(Ct，Threshold Cycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中，熒光量的積累超過基底熒光量的循環個數，Ct值與起始模數呈一定比例關系，Ct值越小，起始模板數越多，相反，Ct值越大，起始模板數越少。利用陽性梯度標準模板的Ct值制成標準曲線，再根據待測樣品的Ct值可準確測出該樣品的起始拷貝數。
在本發明提供的同步檢測沙眼衣原體和細小脲原體熒光定量PCR試劑盒中，針對沙眼衣原體和細小脲原體檢測中的特殊性，對不同的靶片段進行反應體系，如引物和探針濃度、Mg2+濃度、退火溫度等的優化，并將FQ-PCR技術(熒光定量PCR技術)和定量檢測系統相結合，將其用于沙眼衣原體和細小脲原體同步定量檢測。通過優化方案，反復實驗，建立了同步檢測沙眼衣原體和細小脲原體熒光定量PCR方法，并研制出同步檢測沙眼衣原體和細小脲原體熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個反應體系中檢出10拷貝，可以滿足快速診斷沙眼衣原體和細小脲原體的要求。
二、本發明的使用方法包括下列步驟a)對貯存濃度為109拷貝/μl標準陽性模板pU-UP和pU-CT進行10倍的系列稀釋，制備陽性標準品，用紫外分光光度計測定A260對標準品定量；b)用DNA裂解液從待測標本中提取UP，CT DNA；c)分別取b)步中的DNA和同樣量的系列稀釋的a)步中的兩種陽性標準品加入到含HOTSTART Taq DNA聚合酶和熒光定量反應液的PCR反應體系中用熒光定量檢測儀進行PCR檢測；d)通過比較待測樣品和相應標準品的循環域值Ct值，對待測樣品的起始拷貝數進行定量。
本發明與現有技術相比具有以下優點和效果1、特異性好，靈敏度高，定量準確；2、檢測速度快，僅1小時，加上樣品DNA的提取制備，共僅需2小時；3、使用步驟簡單，可重復性高；4、可同步檢測沙眼衣原體和細小脲原體；5、可同時進行高通量的樣品檢測。
本試劑盒可對沙眼衣原體和細小脲原體進行同步定量檢測，并可替代一直沿用的傳統的培養法和ELISA(酶聯免疫吸附試驗)診斷方法。
具體實施例方式
下面結合具體實施實例，進一步闡述本發明。
應當理解，這些實施實例僅用于說明本發明而不用于限制本發明要求保護的范圍，下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等主編，科學出版社，1992，分子克隆實驗指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學出版社，2001，細胞實驗指南；呂鴻聲，科學出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。
實施例1試劑盒組成與配制a、DNA提取試劑(裂解液)為自己配制，裂解液50mmol/L NaOH，10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，體積分數為1％ Triton X-100，體積分數為1％ NP-40，0.5mmol/L EDTA pH 8.0。
b、熒光PCR 10×Buffer組成500mM KCl、100mM Tris-HCl(PH9.0 25℃)、1.0％ Triton X-100；c、熒光定量PCR反應液PCR 10×buffer 3.0μl，10μmol/L UP正向引物和反向引物各1.0μl，10μmol/L CT正向引物和反向引物各0.7μl，UP 5μmol/L熒光探針1μl，CT5μmol/L熒光探針0.7μl，25mmol/L MgCl23μl，10mmol/LdNTPs 0.7μl，2.5U/μl HOTSTART Taq DNA聚合酶0.6μl，無菌雙蒸水5.6μl組成。
d、標準陽性模板貯存液濃度為109拷貝/μl標準陽性模板pU-UP，濃度為109拷貝/μl標準陽性模板pU-CT。
e、陰性質控標準品為無菌雙蒸水實施實例2使用試劑盒同步檢測沙眼衣原體和細小脲原體a、在標本試管中加入1ml無菌生理鹽水，充分震蕩搖勻，轉至1.5ml離心管中，10000g離心5min，再重復洗滌1次。沉淀直接加50μl DNA提取液充分混勻，沸水浴10min，10000g離心5min，取上清液2μl做PCR反應。
b、將陽性標準模板(試劑d)系列稀釋為108拷貝/μl、107拷貝/μl、106拷貝/μl、105拷貝/μl、104拷貝/μl、103拷貝/μl。
c、分別取熒光定量PCR反應液(試劑c)各18μl，取第a)步所得UPDNA和第b)步稀釋的UP陽性標準模板各1μl，取第a)步所得CTDNA和第b)步稀釋的CT陽性標準模板各1μl，并設陰性對照，分別加入不同的PCR反應管，在熒光定量檢測儀上平行做PCR檢測。循環條件為95℃預變性400s；95℃10s，58℃40s，擴增40個循環。把熒光檢測的程序設置在每個循環的第二步結束時進行，同步檢測波長為556nm(UP-HEX)和510nm(CT-FAM)。
循環結束后，運用儀器自帶軟件，讀取待檢樣品拷貝數。結果為UP標準陽性模板108拷貝/μl、107拷貝/μl、106拷貝/μl、105拷貝/μl、104拷貝/μl、103拷貝/μl的Ct值分別為12.11，15.62，18.33，22.98，26.59，30.02；CT標準陽性模板108拷貝/μl、107拷貝/μl、106拷貝/μl、105拷貝/μl、104拷貝/μl、103拷貝/μl的Ct值分別為12.61，15.92，19.06，23.25，27.34，31.47；陰性對照為0；反復重復試驗3次，得到Ct值進行統計學分析P＞0.05，數據差異無顯著意義，說明其不同批次之間的檢測結果具有可比性，具有良好的重復性。
從上述實例可以說明，熒光定量PCR方法定量重復性好，定量準確，而且，熒光定量PCR檢測試劑盒對樣品的檢測僅需2個小時就能完成，而傳統的細胞培養法約需1周左右才能完成，并且傳統方法對于這兩種病原體的檢測只能分開進行，往往周期長，成本高。因此，使用該試劑盒可以大大縮短檢測時間。
該試劑盒的操作只需1人即可完成整個定量操作過程，一次可檢測32-384個(由定量檢測儀的型號決定)樣品，這樣也減少了人力資源的浪費。
權利要求
1.一種同步檢測沙眼衣原體和細小脲原體熒光定量PCR試劑盒，其特征在于由DNA裂解液、熒光定量PCR反應液、標準陽性模板pU-UP、標準陽性模板pU-CT、陰性質控標準品組成；熒光定量PCR反應液含有沙眼衣原體特異性引物對和熒光探針，以及細小脲原體特異性引物對和熒光探針；①UP正向引物為5′-CATTGATGTTGCACAAGGAGAAA-3′，反向引物為5＇-TTAGCACCAACATAAGGAGCTAAATC-3′；熒光探針序列為5′-TTGACCACCCTTACGAG-3′；熒光探針5′端標記報告熒光基團HEX，3′端標記不發光的淬滅基團標記，并連接小型凹槽結合物-MGB基團，可以大大提高探針的退火溫度，標準陽性模板pU-UP是含有細小脲原體高度保守基因-脲酶基因的111個堿基對的核苷酸片段構成的pUCm-T載體，該載體在大腸桿菌DH5α中增殖；②CT正向引物為5′-TTCAGTTGGGCCAGATCATG-3′，反向引物為5′-CTCTTCATCGGTGGCTAATGTATAAA-3′；熒光探針序列為5′-AGGCTCGTCCTGACTCATGCATTTCG-3′；熒光探針5′端標記FAM，3′端標記TAMRA基團，標準陽性模板pU-CT是含有沙眼衣原體高度保守基因trp基因73個堿基對的核苷酸片段構成的pUCm-T載體，該載體在大腸桿菌DH5α中增殖；所述的PCR即聚合酶鏈式反應，所述的UP即細小脲原體，所述的CT即沙眼衣原體。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征是熒光定量PCR反應液是由PCR10×buffer，10μmol/L的UP正向引物和反向引物，10μmol/L的CT正向引物和反向引物，5μmol/L UP熒光探針，5μmol/L CT熒光探針，25mmol/L MgCl2，10mmol/L dNTPs和無菌雙蒸水組成。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征是UP標準陽性模板pU-UP包含的ureE基因的核苷酸序列為CATTGATGTTGCACAAGGAGAAAAAATTCCTCGTAAGGGTGGTCAAGGNATGATTAAATCAGAMTTATTTATTATTAATAAAGTTGATTTAGCTCCTTATGTTGGTGCTAA；NG或者A；MT或者C；CT標準陽性模板pU-CT包含的trp基因的核苷酸序列為TTCAGTTGGGCCAGATCATGCCGAAATGCATGAGTCAGGACGAGCCTTTTATACATTAGCCACCGATGAAGAG。
全文摘要
本發明公開了一種快速同步檢測沙眼衣原體和細小脲原體熒光定量PCR試劑盒，涉及一種性傳播疾病病原體基因檢測技術，適用于沙眼衣原體和細小脲原體快速同步定性定量檢測。本發明由DNA裂解液、熒光定量PCR反應液、標準陽性模板pU－UP、標準陽性模板pU－CT、陰性質控標準品組成；熒光定量PCR反應液含有沙眼衣原體特異性引物對和熒光探針，以及細小脲原體特異性引物對和熒光探針。本發明特異性好，靈敏度高，定量精確，快速簡便，可重復性高，可同步檢測沙眼衣原體和細小脲原體，并可替代傳統的培養法和ELISA(酶聯免疫吸附試驗)診斷方法。
文檔編號C12Q1/68GK1873025SQ200610018768
公開日2006年12月6日 申請日期2006年4月14日 優先權日2006年4月14日
發明者王業富, 曹軒 申請人:武漢大學