專利名稱：Hla－a中分辨度配型芯片的制備及應用的制作方法
背景技術：
HLA抗原位于人的第6號染色體短臂的一個狹窄區域，是人體內最復雜的遺傳多態性系統，在免疫調控過程中發揮重要作用。HLA多態性檢測在醫學實踐和科研中具有十分重要意義，為器官、組織移植配型，疾病相關性研究，人類學及法醫學上的應用等領域的發展提供了可靠的技術方法和有價值的資料。血清學方法是HLA-B抗原傳統的經典分型方法，但是隨著對HLA研究的深入和對分型技術要求的不斷提高，以及越來越多的等位基因陸續被發現和命名，血清學方法已經無法獲得足夠的單特異性抗體，不能夠分辨出所有的特異性，而且標準抗血清的篩選技術復雜，難度大，人力物力消耗大，另外血清學方法之間存在較多，較強的交叉反應，使HLA-A類抗原亞型的分辨較為困難。
隨著生物學技術的不斷發展，基因分型已成為HLA分型的主要方法。近年來對A類抗原的基因分型研究取得了較大進展。其中PCR-SSP、PCR-SSO、PCR-SSCP(單鏈構像多態性分析)3種分型方法對抗原的分型均獲得成功.但這些方法也存在一些明顯的不足，如PCR-SSP方法，主要依賴于PCR技術，對某一基因個體進行分型時往往要設計大量的引物，這將很難避免接下來的PCR過程中的污染問題而導致的假陽性，而且操作復雜，需要通過多次的電泳來判斷最后的結果，不適合大批量樣本的分型，使其在臨床上的應用受到限制；PCR-SSCP法對分析小于400bpPCR擴增產物十分有效，但此法僅能探知基因變異的存在，而無法確定變異的確切位置及內容，一般僅用作HLA匹配程度的分析，而不用來進行HLA的具體分型。
基因芯片是近年來興起的一項前沿生物技術，是對傳統生物技術如檢測、DNA雜交、分型和測序技術重大的飛躍和創新，是涉及到生物信息學，微電子技術，計算機科學，半導體技術等諸多自然學科的綜合性技術，在生命科學領域中顯出了巨大的潛能和誘人前景。基因芯片是指將許多特定的寡核昔酸片段或基因片段作為探針，有規律的排列固定于支持物上，然后與待測的標記過的樣本基因進行特異性雜交，通過激光共聚焦熒光檢測系統對芯片進行掃描，并配以計算機系統對每一個探針上的熒光信號進行檢測，從而得出大量信息。基因芯片具有高度集成和并行處理的特點，所需試劑和樣本量少，結果由計算機軟件自動分析，是解決HLA眾多等位基因分型的有效方法。由于HLA個體遺傳學差異的本質是在編碼其抗原產物的基因水平上，所以分析HLA基因型無疑是對HLA型別分析的最準確的方法，其準確性遠高于血清與細胞學分型，并已逐漸取代了前兩者的位置，因此HLA抗原的DNA分型成為必然趨勢。
發明內容
本發明采用寡核苷酸芯片分型方法，依據第十三屆國際組織相容性工作會議報告及相關文獻，同時考慮遺傳的連鎖不平衡，及強脊炎，幼年型糖尿病等與HLA密切相關的遺傳病等因素，選擇了中國人群基因頻率較高的等位基因，根據HLA-A不同基因亞型的獨特序列，完成了探針的設計與篩選，最后設計了HLA-A56條探針制成基因分型芯片，這些探針可完成中分辨度分辨，完全可以滿足臨床配型工作的需要。通過帶熒光標記的引物將待測樣本經PCR擴增后所要目的片斷帶上熒光標記，帶有熒光標記的PCR產物與芯片上的探針雜交，根據雜交信號強弱及位置確定樣品的基因型。本發明在玻片上固定探針，完全可以完成HLA基因分型、骨髓移植器官移植的HLA配型、與HLA有密切關系的遺產性疾病的人群篩查。
本發明的目的是針對HLA-A基因設計了一套探針(見表1)。將這些探針固定在環氧處理的芯片片基上，制成完整的HLA-A類基因寡核苷酸芯片，并提供包含實驗操作所必需的所有組分，組成了一套完整的試劑盒。可用于HLA基因分型、骨髓移植器官移植的HLA配型、與HLA有密切關系的遺產性疾病的人群篩查。
優點及效果本發明的實施實現了對HLA-A基因快速、準確、高通量分型，可實現一張芯片多人份，滿足臨床器官移植的配型要求，適于臨床推廣，并可用于其他相關領域，具有重大的社會和經濟效益。
實施方法下面結合
本發明的具體實施方法圖1芯片外觀1玻片表面處理環氧玻片處理普通玻片，洗液浸泡，清水沖洗，蒸餾水洗三遍，晾干備用。
2％3-glycidoxypropyltriethoxysilane乙醇溶液超聲2min混合，放入玻片1hr浸泡，95％乙醇洗兩次5min，自然晾干。
2引物設計及PCR條件HLA-A選擇有意義外顯子片段，設計自己的引物。在HLA-A座位的exon2和exon3區域分別設計上下游引物，為雙下游和雙上游引物進行嵌套氏PCR，產物長度在800bp左右，序列如下正鏈5’-GGCCTCTGT/CGGGGAGAAGCAA-3’，5’-GTCCCAATTGTCTCCCCTCCTT-3’，反鏈5’-AGCCGCGCCG/TGGAAGAGGGTCG-3’，5’-GGCCCCTGGTACCCGTGCGCTG-3’。擴增條件為第一次PCR96℃3min；96℃25s、65℃45s、72℃30s，26個循環；96℃25s、55℃1min、72℃2min，4個循環；72℃5min。第二次PCR(Nested PCR)96℃3min；96℃30s、56℃30s、72℃ 30s，30個循環；96℃30s、56℃1min、72℃2min，4個循環；72℃5min。方法同前選擇最佳條件，建立引入熒光標記的PCR體系。
3探針處理探針經NH2-修飾后用于芯片點樣。通過NH2與環氧基的化學結合，探針固定在環氧片基上。將濃度為100umol/L的寡核苷酸探針與點樣緩沖液(0.2M NaOH)1∶1混合加在96孔板里，用點樣儀點成所需矩陣(見圖1)。從左往右，每五個點代表一條探針，共分三個矩陣，分別是陽性對照，HLA-A，陰性對照的三組探針。點樣后封閉過夜，待其自然干燥后，130℃烘烤30min、95℃水浴1min、封閉待其自然干燥、-20℃保存備用。
4雜交將10ul雜交buffer，18ulPCR產物與1ul鮭精DNA(鮭精DNA用來降低雜交背景)充分混合，將同一樣本的陽性對照，HLA-A陰性對照的三種不同PCR產物用移液器加樣到相應點樣區域，根據區域大小選擇合適大小的蓋玻片，蓋上蓋玻片。放入分子雜交儀雜交，雜交條件為40℃，1小時。
5洗滌取出芯片，5×洗脫液(20*SSC)洗脫，浸泡5分鐘；取出芯片，放入3×洗脫液中浸泡5分鐘ddH2O洗2次(每一步浸泡清洗后，都必須迅速離心)。將洗過的芯片置于室溫自然晾干，干燥后用ScanarryGX掃描。
6掃描通過分析軟件，將直觀的信號強弱轉化為信號比值，根據比值及具體位置上標記的探針序列，即可確定樣本的基因型。在圖2中，最左邊是陽性定位點，最右邊是陰性定位點，用于分析軟件識別行列和定位。當帶熒光標記的PCR產物與芯片上的探針雜交時，探針如果與PCR產物完全互補，則掃描出的雜交信號強，顏色在黃白之間；如果與PCR產物完全不互補，掃描出的信號弱，顏色為藍或無色；如果與PCR產物部分互補，則掃描出的信號和顏色介于兩者之間。通過特定分析軟件，將直觀的顏色強弱轉化為信號的比值，可以方便的得出分型結果。HLA配型芯片設計了陽性對照和陰性對照而且每個探針都有5次重復，使系統的可靠性、穩定性、科學性得到了有效保證。
圖2雜交結果顯示7結果芯片檢測結果用國際知名的one lambda公司的Micro SSPTM Class I&II Generic Tray進行平行對照試驗。基因分型結果與用國際公認的one lambda試劑盒所得出的基因分型結果基本一致。
對不一致的樣本進行了測序對照，測序結果與芯片分析結果完全一致。1HLA配型芯片可分辨HLA-A抗原特異性21個，等位基因196個(見表6)。
表6基因芯片分辨HLA-A位點等位基因及其對應的抗原特異性
注()內為可分辨的等位基因數。
序列表1<110>天津醫科大學<120>HLA-A中分辨度配型芯片的制備及應用<160>56<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>1TATTTCTTCA CATCCGTGT 19<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>2TATTTCTACA CCTCCGTGT 19<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>3TCTACACTTC CGTGTCCCG 19<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>4TACACCTCCA TGTCCCGGC 19<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>5CAGGAGAGGC CTGAGTATT 19<210>6
<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>6GACGAGGAGA CAGGGAAAG 19<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>7GGGACCGGAA CACACGGAA 19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>8GGGACCTGCA GACACGGAA 19<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>9GGAACACACG GAAAGTGAA 19<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>10GGGACGGGGA GACACGGAA 19<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>11
ACACGGAATA TGAAGGCCC 19<210>12<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>12GACACGGAAT GTGAAGGCC 19<210>13<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>13TCTGTGACTG GGCCT 15<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>14TGAAGGCCCA CTCACAGA 18<210>15<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>15GTCAGTCTGT GAGTGG 16<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>16TCACAGACTC ACCGAGTGG 19<210>17<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>17CACAGATTGA CCGAGTGGA 19<210>18<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>18ACAGACTGAC CGAGTGGAC 19<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>19CCGAGCGAAC CTGGGGACC 19<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>20CCGAGTGGAC CTGGGGAC 18<210>21<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>21CCGAGAGAAC CTGCGGAT 18<210>22<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>22ACCGAGAGAG CCTGCGGAT 19<210>23<211>19<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>23CCGAGAGAAC CTGGGGACC 19<210>24<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>24GTGGACCTGG CGACCCTGC 19<210>25<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>25CACACCATCC AGATAATGT 19<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>26CACACCGTCC AGAGGATGT 19<210>27<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>27TACCGGCAGG ACGCCTACG 19<210>28<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>28TACCAGCAGGACGCTTACG 19<210>29
<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>29TATGAACAGC ACGCCTACG 19<210>30<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>30TACCACCAGT ACGCCTACG 19<210>31<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>31TACCAGCAGG ACGCCTACG 19<210>32<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>32TCGCCTTGAA CGAGGACC 18<210>33<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>33TCGCCCTGAA AGAGGACC 18<210>34<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>34
CCTGCGCTCT TGGACCGCG 19<210>35<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>35TCAGATCACC CAGCGCAAG 19<210>36<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>36TCAGARCACC AAGCGCAAG 19<210>37<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>37TCAGACCACC AAGCACAAG 19<210>38<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>38GGAGGCGGCC CATGTGGCG 19<210>39<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>39GGAGACGGCC CATGAGGCG 19<210>40<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>40GGAGGCGGCC CATGAGGCG 19<210>41<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>41CCTCATGGGC CGCC 14<210>42<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>42AGGCGGCCCA TGCGGCGGA 19<210>43<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>43AGGCGGCCCG TCGGGCGGA 19<210>44<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>44AGGCGGCCCG TGTGGCGGA 19<210>45<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>45GGAGCAGCGG AGAGTCTAC 19<210>46<211>19<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>46GGCGGAGCAG TTGAGAGCC 19<210>47<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>47GGCGGAGCAG TGGAGAGCC 19<210>48<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>48GGCGGAGCAG CAGAGAGCC 19<210>49<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>49CCTGGATGGC ACGTGCGTG 19<210>50<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>50GCACGTGCGT GGAGTGGC 18<210>51<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>51GCCGGTGCGT GGACGGGC 18<210>52
<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>52GGCGAGTGCG TGGAGTGGC 19<210>53<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>53GCACGTGCGT GGACGGGC 18<210>54<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>54GCCGGTGCGT GGAGTGGC 18<210>55<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>55GGCGAGTGCG TGGACGGGC 19<210>56<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據多態性位點及Tm值設計<400>56TGCGTGGACG GGCTCCGCA 19。
權利要求
1 一種HLA-A基因中分辨度分型方法，其特征在于根據中國人群HLA-A類常見的基因位點以及臨床應用中對分型分辨度的實際需要，設計特異性寡核苷酸中分辨度分型探針，制成基因分型芯片。采用帶熒光標記的引物，用合適的PCR方法擴增HLA-A類抗原上的多態性區域，產物與芯片上探針雜交。雜交結果經熒光掃描并用特定軟件分析判斷陽性探針，以此確定樣品基因型，以及該方法的試劑組成和在臨床及科學研究中的應用。芯片試劑盒組分如下檢測用片基、信號標記系統、寡核苷酸探針、引物、洗滌液、點樣液。
2 根據權利要求1所述的方法，片基上每孔固相化的探針為寡核苷酸探針，其序列依據第十三屆國際組織相容性工作會議報告及相關文獻，同時考慮遺傳的連鎖不平衡，及強脊炎，幼年型糖尿病等與HLA密切相關的遺傳病等因素，選擇了中國人群基因頻率較高的等位基因，根據HLA-A不同基因亞型的獨特序列，完成了探針的設計與篩選，最后設計了HLA-A的56條探針制成基因分型芯片，其長度范圍在14-30個堿基，一般為18個堿基，其Tm值在滿足上述基因中等分辨度分型需要。
3 根據權利要求1所述的辦法，其各種引物是根據HLA-A基因序列特點設計，在HLA-A座位的exon2和exon3區域分別設計上下游引物，為雙下游和雙上游引物進行嵌套氏PCR，引物長度在18-25個堿基之間，分別用于上述基因的擴增。
4 根據權利要求書1所述的辦法，用于信號顯示的信號分子標記是針對HLA-A基因序列擴增的引物。
5 根據權利要求書4，用于信號顯示的信號分子為CY3。
6 根據權利要求書1所述方法，可應用于醫院或血站對人群HLA-A基因所有座位進行分型，為組織配型和干細胞移植提供依據。也可應用于科研單位、法醫領域為分析與HLA-A相關的遺傳疾病及個人識別提供依據。
全文摘要
根據中國人群HLA－A類常見的基因位點以及臨床應用中對分型分辨度的實際需要，設計特異性寡核苷酸中分辨度分型探針，制成基因分型芯片。采用帶熒光標記的引物，用合適的PCR方法擴增HLA－A類抗原上的多態性區域，產物與芯片上探針雜交。雜交結果經熒光掃描并用特定軟件分析判斷陽性探針，以此確定樣品基因型，以及該方法的試劑組成和在臨床及科學研究中的應用。
文檔編號C12Q1/68GK1995381SQ20061001301
公開日2007年7月11日 申請日期2006年1月6日 優先權日2006年1月6日
發明者郭剛, 張瑞, 張鏡宇, 梁東春, 王寶利 申請人:天津醫科大學