一種β－葡萄糖苷酶基因啟動子及其應用的制作方法

專利名稱：一種β－葡萄糖苷酶基因啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種玉米β-葡萄糖苷酶基因啟動子及其應用。
背景技術：
植物病害給農作物生產帶來嚴重的影響，人類與植物病害的斗爭貫穿于農業生產的始末。興起于20世紀初期的經典遺傳學使人們能夠通過雜交育種成功地培育出新抗病作物品種，大幅度地提高糧食產量。近年來，分子生物學理論和技術的不斷發展，植物遺傳分析和遺傳工程技術的不斷革新，使人們不但能夠從分子水平上進一步研究植物與病原菌的相互作用機制，而且還可以通過基因工程這一現代生物技術直接、快速和高效地培育新抗病作物品種。植物抗病基因工程指的是用基因工程(遺傳轉化)的手段提高植物的抗病能力，并獲得轉基因植物的方法。自從1992年克隆到第一個抗病基因(Hm1)(JOHALGS，BRIGGS SP.Reductase activity encoded by the HM1 diseaseresistance gene in maize.Science，1992，258985-987)，人們已經克隆得到了上百個抗病相關基因，這些抗病基因大多數由異源組成型啟動子(如CaMV 35S)驅動在植物中組成型表達，這樣的表達可以達到抗病的效果。但是由于在一些非必要組織中大量表達外源蛋白，不僅無謂消耗植物體內的能源，增加植物生長負擔，影響植物本身的優良性狀，而且過多的在作物食用組織中積累抗性蛋白(大多數抗性蛋白是毒性蛋白)增加了轉基因生物安全風險，引起更大的轉基因生物安全爭論。因此，現今植物抗病基因工程迫切需要合適的啟動子，使植物抗病基因能在植物特定的發育階段和部位表達。植物基因工程中常用的啟動子按其作用方式及功能可分為三類組成型啟動子、組織特異型啟動子和誘導型啟動子。組織特異性啟動子，可以使基因的表達僅限于某些特定的器官或組織部位，并降低對植物的負面影響。在有些時候，如果用組織特異性或誘導型啟動子來驅動抗病基因在特定的時候或地方特異性的表達，不僅可以達到抗病的目的，還能減少對植物本身優良性狀的沖擊并降低轉基因安全性風險。
近年來，玉米苗期病害越來越嚴重，已由過去的次要病害上升為主要病害。一般年份平均發病率約為10％，重病田塊往往缺苗30％～50％，形成矮化不育株甚至毀種而減產(晉齊鳴，駢躍斌，宋淑云，李紅，沙洪林，張偉.玉米苗期病害診斷與防治技術研究.吉林農業大學學報，2004，26(4)355～359)。玉米苗期病害可初步分為侵染性和非侵染性病害。非侵染性病害主要包括缺素癥、環境脅迫和藥害等因素引起的病害。使用優良品種，加強田間管理等農業技術措施即可以控制非侵染性病害。侵染性病害主要是受病原菌(致病真菌、細菌、病毒)侵入引起，主要病原菌有禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)、串珠鐮孢菌(Fusarium moniliforme)、玉米圓斑離蠕孢菌(Helminthosporiumcarbo2num)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、串珠鐮孢菌膠孢變種(Flmoniliforme varlsubglutinans)、絲軸團散黑粉菌(Sporisoriumreilianum)和玉米假單胞桿菌(Pseudomonas zeae Hsia et Fang)等。對于侵染性病害，傳統上一般采用種衣劑處理來防治，這樣要消耗大量的人力物力。轉基因技術的出現為人類提供了一個廉價的方法。玉米苗期的侵染性病害大多是從根部侵入。土壤中存在著大量的病原菌，肥料中也存在病原菌，有時種子自身亦帶有病原菌，這些病原菌在種子萌發后通過根系侵入植株，如腐霉菌、串珠鐮刀菌和絲核菌等。另外有些苗期蟲害也是根系蟲害，如地老虎。因此應用基因工程技術提高玉米苗期抗病性的重點在于保護根系。
至今分離和研究過的植物組織特異性啟動子多達上百種，植物的許多組織中如根、葉、花粉、維管束和種子等都先后分離到了能組織特異性驅動報告基因表達的啟動子，但是特異在苗期強烈表達、特別是在根中強烈表達的啟動子還未見報道。
ZmGLU1是一種能特異性水解細胞分裂素β-葡萄糖苷復合體并釋放活性細胞分裂素的酶。它特異性的分布在細胞分裂旺盛的組織中，特別是在細胞分裂旺盛的苗期含量非常高，因此，該基因的啟動子可能在玉米苗期具有很高的活性。

發明內容
(一)要解決的技術問題本發明的目的是提供一種β-葡萄糖苷酶基因啟動子。
(二)技術方案本發明所提供的β-葡萄糖苷酶基因啟動子，是玉米體內細胞分裂素動態平衡過程中活化糖苷細胞分裂素的β-葡萄糖苷酶ZmGLU1基因的啟動子。具有下述核苷酸序列序列表中SEQ ID NO1或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為雜交后用含1×SSC、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
具有序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列的啟動子命名為ZmGLU1P，由1907個堿基組成。
本發明還包括含有β-葡萄糖苷酶基因啟動子的載體、所述載體轉化的宿主細胞(包括動植物細胞系和宿主菌)。
(三)有益效果本發明β-葡萄糖苷酶基因啟動子，可啟動報告基因gusA基因在除了成熟種子外的其它組織中高效表達。特別是在幼苗的根中活性最高，比CaMV 35S啟動子還強，說明它能使目的基因在植物的大部分組織中特別是幼苗的根中高效表達，但在成熟種子中微量表達，既可達到轉基因提高植物抗性的目的，又可減少外源蛋白在種子中的積累，從而減少對轉基因植物種子品質的影響。該啟動子將在植物抗病和轉基因玉米種子改良中發揮重要作用。


圖1為RT-PCR擴增得到的用于篩庫的片段的電泳圖譜；圖2A為第一輪篩選玉米基因組文庫的雜交顯影的X光片掃描圖；圖2B為第二輪篩選玉米基因組文庫的雜交顯影的X光片掃描圖；圖2C為第三輪篩選玉米基因組文庫的雜交顯影的X光片掃描圖；圖2D為驗證第三輪篩選得到的單克隆雜交顯影的X光片掃描圖；圖3A為lambda DNA的酶切電泳圖譜；圖3B為lambda DNA酶切后的雜交圖譜；圖4A為ZmGLU1啟動子驅動的GUS酶在轉基因煙草各個組織中的活性比較以及與CaMV 35S驅動子驅動的GUS酶活性比較圖；圖4B為ZmGLU1啟動子驅動的GUS酶在轉基因煙草果實成熟和種子萌發過程中的活性變化圖。
具體實施例方式
以下實施例進一步說明本發明的內容，但不用來限制本發明所要保護的范圍。
實施例中所涉及到的數量詞×溶液表示的是多少倍濃度的該溶液，例如“20×SSC”表示20倍濃度的SSC，在使用時需要將其稀釋，比如使用時是“2×SSC”表示的是將上述溶液稀釋了10倍使用；所述的單位M表示mol/L。
材料的準備1、菌株與質粒大腸桿菌(E.coli)DH5α、農桿菌LBA4404均購自博大公司、λ噬菌體的宿主菌LE392購自Clontech公司。
2、工具酶及生化試劑各種限制性內切酶和pGEM-T Easy載體試劑盒購自Promega公司；普通Taq酶和Trizol RNA小量提取試劑盒購自天根公司；ExTaq酶購自Takara公司；dNTP混合物購自上海生工；T4 DNA連接酶購自Promega公司；萘乙酸(NAA)、氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、鏈霉素(Sm)和噻孢霉素(Cef)購自欣經科公司；同位素α-32P dCTP購自北京亞輝生物公司；尼龍膜購自Amersham公司；4-甲基傘型酮(4-MU)和4-甲基傘型酮酰-β-葡萄糖醛酸酐酶(4-MUG)均購自上海生工。
3、培養基LB液體培養基(1升)10g NaCl，5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，pH7.0LB固體培養基(1升)1升液體LB培養基加15g瓊脂YEB液體培養基(1升)1g酵母提取物，10g蛋白胨，0.5gMgSO4·7H2O，5g蔗糖，pH 7.5YEB固體培養基(1升)1升YEB液體培養基加15g瓊脂MS基本培養基(1升)MS大量元素，MS微量元素，MS有機物，各組份的基本成分參照Murashige，T&Skoog，F.在1962年發表的MS培養基成分(Murashige，T&Skoog，F. A revised medium for rapidgrowth and bioassays with tobacco tissue culture.Physiol.Plant.1962，15473-497)MS鹽溶液只含有MS大量元素和微量元素MS固體培養基1升MS基本培養基中加30g蔗糖，8g瓊脂，pH5.6-5.8煙草分化固體培養基1升MS基本培養基中加30g蔗糖，8g瓊脂，3mg 6-BA，0.2mg NAA，pH 5.6-5.8煙草誘導生根培養基1升MS基本培養基加30g蔗糖，8g瓊脂，pH5.6-5.84.篩選基因組文庫所需溶液1)20×SSC175.3gNaCl(3.0M)88.2g 檸檬酸三鈉(0.3M)用NaOH調pH至7.0，定容至1升，室溫保存備用。
2)20×SSPE175.3gNaCl(3.0M)27.6g 磷酸二氫鈉(0.2M)40ml 0.5M EDTA(終濃度0.02M)用NaOH調pH至7.4，定容至1升，室溫保存備用。
3)50×Denhardt液5.0g聚蔗糖(Ficoll)5.0g聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone)5.0gBSA(組分V)加水定容至500ml，-20℃保存備用。
4)20％SDS
5)10×lambda稀釋緩沖液58.3g NaCl(0.1M)24.65gMgSO4·7H2O(0.1M)350ml 1.0M Tris-HCl(pH7.5)(終濃度0.35M)加水定容至1000ml。
5.PCR引物Probe-F5′-ACCTAGTAGGACCCAACAATGAGAG-3′Probe-R5′-CTCTTATCTAGGAAGCCGCCGTAC-3′P1735-F5′-CCGTCTAGAGGTGGAAATATCTTCTCAAGC-3′P1735-R5′-TCCATGGCCCCCCCTTTGCT-3′GUS-F5′CAGGAAGTGATGGAGCATCAG3′GUS-R5′TCGTGCACCATCAGCACGTTA3′以上引物均由上海生工合成。
實施例1玉米β-葡萄糖苷酶基因ZmGLU1基因5’側翼序列的克隆一、探針的制備根據GenBank中ZmGLU1基因的cDNA序列(Accession No.X74217)設計一對引物(Probe-F和Probe-R)。用Trizol RNA提取試劑盒提取萌發4天的玉米幼苗總RNA，提取步驟按試劑盒說明書提供的方法操作。以提取的玉米幼苗總RNA為模板，進行反轉錄。
取1μL Oligo(dT)18加到10μL濃度為200ng/μL的總RNA溶液中，70℃，5分鐘后置于冰上冷卻5分鐘，然后加入以下成分試劑 體積5×反轉錄緩沖液(試劑盒中提供) 5μLdNTP混合物(每種10mM) 2.5μLRNasin核糖核酸酶抑制劑(濃度為50U/μL) 1μL
AMV反轉錄(30U/μL)3μLDEPC處理水定容至25μL參照Promega公司AMV Reverse Transcriptase使用說明書設定如下的反應條件25℃ 10min，42℃ 60min，70℃ 10min，冰浴2min。然后以合成的cDNA第一鏈為模板，以Probe-F和Probe-R為引物進行PCR擴增。
反應體系為試劑 體積10×緩沖液 (試劑盒中提供) 5μLdNTP混合物 (每種10mM) 1μL引物Probe-F(濃度為10μM) 1μL引物Probe-R(濃度為10μM) 1μLEx-Taq (5U/μL)1μL反轉錄產物 (濃度為10ng/μL)5μL滅菌水 定容至50μL反應條件94℃ 5min；94℃ 1min，53℃ 30s，72℃ 1min(7個循環)；94℃ 1min，59℃ 30s，72℃ 1min(30個循環)；72℃ 7min；4℃ 保存。
將得到的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示，表明擴增得到一條500bp左右的片段，將此片段作為篩選玉米基因組文庫的探針。圖1中，左邊泳道為1kb ladder marker；中間泳道為目的片段；右邊泳道為負對照。
二、篩選玉米基因組文庫得到ZmGLU1基因5’側翼序列1、玉米基因組文庫玉米基因組文庫購自Clontech公司，目錄號為FL1032D。
2、文庫滴度的測定1)挑取一個宿主菌(LE392)的單斑于10ml LB液體培養基(含10mM MgSO4、0.2％麥芽糖)中，在200rpm、37℃條件下振蕩過夜，使OD600達2.0左右。
2)文庫噬菌體的稀釋a.從購買的玉米基因組文庫中取2μLλ噬菌體原種加到1ml 1×lambda稀釋緩沖液中(稀釋比為1∶500)。
b.從上述稀釋緩沖液中取出20μL加到980μL 1×lambda稀釋緩沖液中(稀釋比為1∶50)。
c.在六支試管加入100μL 1×lambda稀釋緩沖液，200μL宿主菌，然后分別加入稀釋噬菌體緩沖液(步驟b所得)0μL、5μL、10μL、50μL、100μL和250μL。
3)、將上述六管在37℃水浴20分鐘左右。
4)、然后加4ml溶解的0.7％LB頂層培養基(50℃左右)，充分混勻后鋪到15％LB固體平板上，快速旋轉培養皿使頂層培養基均勻分布于整個平板。
5)、室溫靜置10分鐘，待頂層培養基凝固后，在37℃倒置培養6-7hr.。
6)、統計每個平板上長出的噬菌斑個數，根據下面的公式計算文庫的滴度(pfu/ml)
將六個平板測得的滴度求平均值為8.22×108pfu/ml。文庫的滴度大于108pfu/ml，所以該文庫可以用于篩選。
3、用DNA探針篩選文庫1)鋪板宿主菌的準備；接種λ噬菌體的宿主菌LE392單菌落于LB液體培養基(MgSO410mM，麥芽糖0.2％)，37℃，200rpm，振蕩培養至OD600為2.0，取出備用。
2)λ噬菌體侵染宿主菌及鋪板取15ml溶化的頂層培養基加到侵染后的噬菌體和宿主菌的混合物中，充分混勻，迅速均勻地鋪在預先準備好的1.5％LB固體平板上。室溫靜置10分鐘，待頂層培養基凝固后，在37℃倒置培養5-8hr.。當噬菌體長到不同噬斑間邊緣剛彼此接觸時，取出平板放于4℃，以備后面的轉膜。
3)噬菌斑原位吸附固定至尼龍膜a.剪取適當大小(比培養皿略小)的尼龍膜。在每張膜上剪三個不對稱的缺口，并用鉛筆在膜上標號。
b.將與平板編號相同的膜輕輕放到平板培養基上，盡量不產生氣泡。
c.用滅菌牙簽插在預先在膜上剪好的三個不對稱缺口處，作為膜回位標記。2分鐘后用無菌鑷子小心地揭起尼龍膜，吸附有噬菌體的一面朝上，放于干凈濾紙上，室溫晾干。
d.將晾干的膜分別在變性液(1.5M NaCl、0.5M NaOH)和中和液(1.5M NaCl、0.5M Tris-HCl pH8.0)中分別放5min。然后轉到2×SSC(0.3M NaCl，0.03M檸檬酸三鈉)中漂洗一下，把膜放到干凈濾紙上，室溫晾干。
e.80℃，烘膜2hr.，用保鮮膜包好后放于4℃備用。
4)預雜交按以下成分配制預雜交液

預雜交液配制好后，將保存于4℃的膜取出放入預雜交液中，42℃，40rpm，預雜交4hr.以上。
5)標記探針取4μL濃度為20ng/μL的DNA探針加入26μL水中，在沸水中變性5min，接著冰浴5min，然后依次加入以下成分5×標記緩沖液(試劑盒中提供)10μLdATP、dGTP、dTTP(每種1.5mM)2μLBSA(10mg/ml) 2μLKlenow片段(5U/μL) 1μLα-32P-dCTP(10μCi/μL)5μL加入上述成分后，在37℃標記4hr.左右。其中，5×標記緩沖液的成分如下250mM Tris-HCL(pH8.0)、25mM MgCl2、10mM DTT、1M HEPES(pH6.6)和6堿基隨機脫氧核苷酸引物。
6)雜交將標記好的探針在沸水中變性10min，在冰上迅速冷卻后加入預雜交液中。在42℃，40rpm條件下雜交16-20小時。
7)洗膜和壓X光片以及陽性克隆的挑選雜交結束后，加入洗膜緩沖液1(2×SSC，0.5％SDS)，42℃，40rpm洗1hr.。然后再分別用緩沖液2(1×SSC，0.1％SDS)和緩沖液3(0.2×SSC)，65℃，40rpm各洗1hr.。洗膜結束后，用干凈濾紙吸去膜上的大部分液體，然后用保鮮膜將膜包裹后壓在X光片之下。根據X光片上影像在膜上標出陽性斑的位置。然后再將膜放入對應編號的培養平板上，缺口和平板上的牙簽對齊。根據膜上的標號挑出含陽性斑的培養基放入1.5ml離心管中，加入1ml滅菌1×lambda稀釋液，室溫放置1-2hr.，使噬菌體從培養基上擴散出來，然后12000rpm離心10分鐘，收集上清液，用于下一輪篩選。經過3輪篩選和驗證，共得到7個陽性單克隆(圖2A-圖2D)。
4、λ噬菌體DNA提取1)將7個陽性單克隆分別鋪板，每個陽性克隆鋪兩個200mm平板。當每個平板的表面幾乎完全被噬菌斑覆蓋時，取出平板并直接加入15ml的lambda稀釋緩沖液(20mM Tris-HCl pH7.4，100mM NaCl，10mM MgSO4)，室溫放置1-2hr.，使噬菌體從上層培養基中擴散出來。
2)將lambda稀釋緩沖液從培養皿中移入50ml離心管中，4℃，8000rpm離心20min，除去細菌碎片。
3)將上清移入一新的離心管中，加入RNaseA(終濃度為2μg/ml)，DNase(終濃度為1μg/ml)，37℃消化30min。
4)加PEG8000(終濃度為10％)，NaCl(終濃度為1M)于lambda稀釋緩沖液中，充分混勻，冰浴1hr.以上。
5)4℃，11000rpm，離心10min。棄上清，收集管壁上噬菌體顆粒。
6)加1ml 1×lambda稀釋緩沖液重懸噬菌體，并將重懸后噬菌體分裝到1.5ml離心管中(500μL/管)。向每管中加RNaseA至終濃度1μg/ml，DNaseI至終濃度5μg/ml，37℃消化20min。
7)加EDTA至終濃度20mM，終止酶反應；然后加入蛋白酶K至終濃度為100μg/ml，破壞噬菌體外殼蛋白，同時將RNase A和DNase消化掉，加SDS至終濃度0.5％，65℃水浴1小時。
8)等體積苯酚、氯仿抽提兩次，氯仿抽提一次。
9)上清加入等體積的異丙醇，沉淀lambda DNA。
10)70％乙醇洗滌沉淀，抽干后溶于適量TE緩沖液，取少量電泳檢測，其余-20℃保存備用。
5、Lambda噬菌體DNA酶切分析與亞克隆片段測序取7個陽性克隆中的1個λ噬菌體DNA用多種酶進行單酶切和雙酶切分析，它們的組合如下1.Sal I/XbaI，2.Sal I/Kpn I，3.Sal I/HindIII，4.Sal I/BamH I，5.Sal I/EcoRV，6.EcoR I，7.BamH I，8.Sal I，9.HindIII，10.Sal I/Sma I。
單酶切體系10×緩沖液(試劑盒中提供) 5μLLambda DNA30μL限制性內切酶 6μL滅菌水定容至50μL。
雙酶切體系10×緩沖液(試劑盒中提供)5μL
Lambda DNA30μL限制性內切酶I 5μL限制性內切酶II5μL滅菌水定容至50μL。
將酶切產物電泳、轉膜后用篩選文庫的探針進行雜交，具體步驟如下1、電泳及轉膜1)將酶解完全的DNA每管加入5μl 10×loading buffer(70％甘油，0.5×TBE，0.2％SDS，20mM EDTA，0.2％溴酚藍)，混勻。樣品于1×TAE(40mM Tris-乙酸，1mM EDTA)電泳緩沖液，0.8％瓊脂糖凝膠，在40cm電泳槽中100v電壓下使得所有樣品從點樣孔進入凝膠，然后在30v恒壓下，電泳16hr.。
2)將電泳后的凝膠切去多余膠邊，并切一小角以表明方向，置于0.25M HCl中輕搖15min。
3)將一磁盤加入0.4M NaOH溶液，架上一塊玻璃板，上放4層寬于凝膠的吸水紙，兩頭浸于液體中，濾紙間不能有氣泡。
4)膠用蒸餾水沖洗后，點樣孔向下置于濾紙之上，排盡其間氣泡，膠塊四周放好隔水條。
5)剪長寬比膠塊大1mm的尼龍膜(Hybond-N+，Amersham)，置于0.4M NaOH中均勻浸透后鋪于膠上，再鋪上四張與膜相同大小的濾紙，其間均不能有氣泡。
6)加數層紙巾，其上壓一塊玻璃板及750g重物，吸印20～24小時。
7)吸印完畢后，用鉛筆做標記，2×SSC(0.3M NaCl，0.03M檸檬酸，pH7.0)浸泡10分鐘。
8)將膜移至濾紙上，超凈臺吹干。
9)將膜夾于濾紙和兩塊玻璃之間，于80℃烘箱中烘1～2小時，用保鮮膜包裹，4℃保存備用。
2、雜交轉膜完畢之后的雜交方法與篩選玉米基因組文庫時所用的雜交方法完全相同，雜交所用的探針也是篩選文庫時所用的探針。酶切結果如圖3A所示，酶切結果表明所用的幾種限制性內切酶對λ噬菌體DNA的酶切都比較完全，不同大小的條帶基本都已分開。酶切片段的雜交結果如圖3B所示，根據已知的ZmGLU1基因cDNA序列可知在距起始密碼子2.1kb處有一SalI切點，要得到5’側翼序列至少大于2kb，并且盡可能長些，但太長了又不容易做亞克隆，故選取1.Sal I/Xba I雙酶切的約4kb陽性條帶(箭頭所示)回收并亞克隆到pGEM-3Zf(-)的SalI和XbaI酶切位點之中，由聯合基因公司完成此4kb序列中的5’端的約2kb的測序，測序結果表明該2kb片段全長為1907bp，其中有1735bp是ZmGLU1基因起始密碼ATG上游的5’側翼序列，另外的172bp序列為ZmGLU1基因序列。將1907bp的序列提交GenBank中進行比對，其中3’端172bp序列與ZmGLU1 cDNA序列同源性為100％，5’端序列未發現任何同源序列。說明所得到的1735bp序列確為ZmGLU1基因的5’側翼序列，并且是新發現的序列。
實施例2、ZmGLU1啟動子的克隆及其真核表達載體的構建及轉化煙草一、ZmGLU1啟動子的克隆及其真核表達載體的構建1、從ZmGLU1基因5’側翼序列中擴增ZmGLU1啟動子根據測序得到的ZmGLU1基因的5’側翼序列設計了2條引物P1735-F和P1735-R。以連接在測序載體上的4kb序列為模板，通過PCR擴增方法從ZmGLU1基因5’側翼序列中擴增出一條1735bp左右的片段。
擴增體系10×緩沖液(試劑盒中提供) 5μLdNTP混合物(每種10mM) 1μLP1735-F(10μM)1μLP1735-R(10μM)1μLTaq酶(5U/μL) 0.5μL模板(濃度為10ng/μL) 0.5μL滅菌水定容至50μL擴增條件為94℃ 5min94℃ 1min，55 ℃ 30s，72℃ 2min(30個循環)72℃ 10min4℃保存。
將用引物P1735-F與P1735-R擴增得到的片段命名為ZmGLU1P(序列1，1735bp)。
將擴增出的ZmGLU1P片段連接到pGEM-T Easy測序載體上。測序結果與所得的1907bpZmGLU1基因的5’側翼序列比較，一致性為100％，表明擴增沒有出現錯配。
2、真核表達載體的構建根據引物P1735-F和P1735-R兩端設計的酶切位點，用XbaI和NcoI將ZmGLU1P片段從pGEM-T Easy載體切下，把酶切后回收的ZmGLU1P片段與經XbaI和NcoI酶切的pCAMBIA3301載體片段相連。將連接產物轉化DH5a菌株中，提取質粒DNA，用XbaI和NcoI酶切鑒定。將構建好的載體命名為p3301-ZmGLU1P。
二、轉化煙草大量提取構建的表達載體(p3301-ZmGLU1P)的質粒DNA，取20μL(約1μg)轉化農桿菌LBA4404感受態細胞，在28℃、YEB培養基(含卡那霉素Kan 100μg/ml，鏈霉素Sm 125μg/ml)上培養兩天。各挑選兩個克隆做菌液PCR鑒定，均擴增出目標條帶。
將含有表達載體的農桿菌接種于YEB培養基(含卡那霉素100μg/ml，鏈霉素125μg/ml)，28℃振蕩培養至OD600為0.6-0.8，室溫離心10分鐘(4000rpm)。沉淀用MS鹽溶液(pH7.0)懸浮，并稀釋至原體積的30倍。取煙草無菌苗葉片，切去葉片邊緣和主脈，將葉片切成約0.4×0.6cm2左右大小，放入制備好的菌液中浸泡5-10min，用無菌濾紙吸干表面菌液，轉入表面鋪有一層濾紙的MS固體培養基(含3mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA，pH 5.8)中，28℃暗培養。三天后，轉入MS篩選培養基(含3mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA，含卡那霉素100μg/ml，噻孢霉素250μg/ml，pH 5.8)中，28℃光照培養，每日光照12-16小時。每2周繼代一次，每次將變黃的葉片或愈傷組織丟掉，大的愈傷組織切割成小塊，經2-3次繼代后，培養的愈傷組織陸續分化出幼苗。將幼苗轉移入罐頭瓶裝的MS固體培養基(含卡那霉素100μg/ml，鏈霉素125μg/ml，pH 5.8)中，28℃光照培養，待其根系發育完全后，移栽到溫室中。
實施例3、煙草轉基因后代的分子檢測及ZmGLU1P啟動子活性的檢測一、煙草轉基因后代的分子檢測1、煙草總DNA小量提取取煙草幼嫩葉片150mg左右于1.5ml離心管中，研成粉末。加800μL 65℃預熱的SDS裂解緩沖液(0.1M Tris-HCl，0.05M EDTA，0.5M NaCl，1％SDS)，振蕩混勻。65℃水浴20分鐘，加入250μL 5MKAc，冰浴5分鐘，4℃、12000rpm離心10分鐘。取上清于另一1.5ml離心管中，4℃、12000rpm再離心5分鐘。將上清轉入另一干凈離心管，加 600μL異丙醇，充分混勻，4℃ 12000rpm離心15分鐘。最后用70％乙醇清洗沉淀2次，真空干燥后，加80μL滅菌重蒸水溶解DNA。
2、PCR檢測根據gusA基因的序列設計一對引物GUS-F和GUS-R，用這對引物檢測用SDS法提取的轉基因煙草DNA。其中，PCR反應體系組成如下10×緩沖液 2.5μLdNTP混合物(每種10mM) 0.5μLP45F(濃度為10μM)0.5μLP46R(濃度為10μM)0.5μLTaq酶(濃度為5U/μL) 0.5μL轉基因煙草總DNA(濃度為20ng/μL) 1μL滅菌水 定容至25μL。
PCR檢測結果表明陽性煙草植株與待檢測煙草植株的株數比為74％。
二、β-葡萄糖苷酶基因啟動子活性的檢測將PCR檢測結果為陽性的煙草植株，提取其6-8片葉小苗的根、莖、莖基和葉，花的萼片、花瓣、花柄、雌蕊和雄蕊，完全伸張開的成熟葉片，開花后20天的未成熟種子和成熟種子的總蛋白，定量檢測gusA基因編碼蛋白β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase)的活性，分析ZmGLU1P的組織特異性驅動活性。取開花后0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50天的果實和萌發后0，1，2，3，4，5，6，7，9，11，13，15天的種子(幼苗)的總蛋白，定量檢測gusA基因編碼蛋白β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase)的活性，分析ZmGLU1P在果實發育和種子萌發過程中的驅動活性變化。具體步驟如下1、標準曲線的制作用反應終止液(0.2mol/L Na2CO3)將4-MU(4-甲基傘形酮)配制成0.00、6.25、12.50、50.00、100.00、250.00、500.00、1000.00pmol的系列標準濃度，通過測定它們的熒光強度，作出一條標準曲線。
2、總蛋白提取與蛋白濃度的測定1)取0.1g材料于1.5ml離心管中，加入液氮，研成粉末。
2)加600μL酶提取液(0.05M pH7.0磷酸緩沖液，0.1％SDS，0.01MpH8.0 EDTA，20％甲醇，0.1％Triton X-100，0.1％巰基乙醇)，在13000rpm 4℃離心10min，取上清于一新的離心管中，-20℃保存備用。
3)取上清，用考馬斯亮藍G250法測定蛋白的含量。
3、β-葡萄糖苷酸酶的酶促反應及其熒光定量1)取50μL含GUS的上清，加入到450μL 37℃預熱的檢測液(2mmol/L 4-MUG溶液)中，迅速充分混勻。
2)立刻取出50μL加入到950μL反應終止液(0.2mol/L Na2CO3)，將該管作為酶促反應的0點。
3)分別在10min、20min、30min、45min和60min從反應液中取出50μL，轉入950μL的反應終止液中。
4)酶促反應結束后，用熒光分光光度計在激發波長365nm、發射波長455nm下，測定不同時間點的熒光值。
5)根據測定的熒光值以及參與反應的總蛋白，求出GUS活性，GUS活性＝單位時間內反應生成的MU/蛋白量(單位nmol4-MU.min-1.mg-1蛋白)。
β-葡萄糖苷酶基因啟動子驅動的β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase)活性測定及與CaMV 35S啟動子驅動的β-葡萄糖苷酸酶活性比較結果如圖4所示，表明(1)ZmGLU1基因起始密碼子ATG上游1907bp的序列(ZmGLU1P)足以啟動報告基因gusA表達。(2)ZmGLU1P驅動的gusA基因在小苗的根中表達活性最強，比35S啟動子在相同組織中的驅動活性強大約3倍，在葉、葉柄、莖、雄蕊、花柄、萼片中的活性比35S稍低，但在成熟種子中的表達量卻只有35S啟動子在成熟種子中的1/30，是它本身在未成熟種子中的1/50，萌發的幼苗的1/300(圖4A)。(3)開花后10天內啟動子在果實中活性變化不明顯，隨后隨著果實的發育，啟動子活性急劇下降，到35天的時候下降到非常低的水平，大概是開花期的五十分之一。而隨著種子的萌發，啟動子活性又很快升高，萌發11天后的幼苗中活性達到最高，是成熟種子的300倍(圖4B)。以上結果充分說明ZmGLU1P啟動子是一個在小苗根中和幼苗中表達活性很強，但在成熟種子特異性微量表達的啟動子。
序列表<110>中國農業大學<120>一種β-葡萄糖苷酶基因啟動子及其應用<130>
<160>1<170>Patent In version 3.3<210>1<211>1907<212>DNA<213>玉米屬玉米(Zea mays L.)<400>1atgtatgcct ctgcaatgga agcctcaatt ttgcatttat ttctacattt ctttcgaata 60gtatttagac atctctcgat tggatagcac caacgtccct gcactggccc cccattcgtg120cctcataggg gagatgaaga atcaaatgct gcattggatt gaagaagcca ggtggaaata180tcttctcaag ctcacggcca tgtttagtga tcattttcaa atttcgagta catatgatat240catgacatgt ggataagtgg acaagtttca tgattttcaa attttatcac agctttctcg300aaacattttc aaaattttta ttacagcctg tacatatgat atcatgacac gtggacaagt360ttcatgattt tctgactttg tttgtatttt atataatttt taaacatgta gatggcaagt420tcacggccat gtttagtgag catgttgctc gaagtttctg gtccgctcct gaaatcggtc480gtaacttatg ctaagtaaca tgaatatcat ttttgcatga acggtttttc aagtttcgag540tgacctgcag ttcaaatctg gattttccgg agaaattcaa ataaacgaat taaatctact600aacgattgaa aactctgtta taattgtcca caaatgatac atgtaggttt acatagtgca660ggaatatacc acaaaaagtt tgggagacaa aatctaaaaa ataaaaatat gctttgccga720gtgtccaagg aagacactcg gcaaagagtt ctttgccgag tgccaaccat cggccctcgg780
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1.一種玉米β-葡萄糖苷酶基因啟動子，具有下述核苷酸序列序列表中SEQ ID NO1或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID NO1所示的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.含有權利要求1所述的β-葡萄糖苷酶基因啟動子的載體。
3.由權利要求2所述載體轉化的宿主細胞。
4.權利要求1所述的β-葡萄糖苷酶基因啟動子在植物基因工程中的應用。
5.權利要求1所述的β-葡萄糖苷酶基因啟動子在玉米基因工程中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種β－葡萄糖苷酶基因啟動子及其應用。該啟動子具有下述核苷酸序列序列表中SEQ ID NO1或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發明的β－葡萄糖苷酶基因啟動子可啟動報告基因gusA在植物的幼苗和小苗根系中特異性高效表達，表達水平高于雙子葉植物基因工程中常用的CaMV35S啟動子。該啟動子可用于植物基因工程，特別是用于在植物幼苗和小苗根系中表達特定的目的基因。
文檔編號C12N15/82GK101082047SQ20061001206
公開日2007年12月5日 申請日期2006年5月31日 優先權日2006年5月31日
發明者王國英, 頋日良, 趙麗, 張穎 申請人:中國農業大學