專利名稱：一種消化卵母細胞透明帶的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地說涉及一種消化卵母細胞透明帶的方法。
背景技術：
透明帶是一均質而明顯的半透膜，是由卵泡細胞和卵母細胞形成的細胞間質，可以被蛋白分解酶如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶所溶解。在哺乳動物卵裂球分離或胚胎細胞做供體核進行克隆時均需要消化透明帶以獲得卵裂球。
目前取得卵裂球的方法主要有三種一種是用蛋白酶消化透明帶，然后用微管把胚胎分散成單個卵裂球；另一種方法是用尖銳的吸管穿過透明帶吸出胚胎中的卵裂球；第三種是用酸化法消化透明帶。酸化法(Tyrode’s，pH2.5)作用時間快，但要求操作迅速，時間過長所獲得的卵裂球容易裂解死亡，時間不夠時透明帶不能完全溶解；酶化法對卵裂球的體外發育沒有不利影響，但一定要掌握好處理條件和時間，而且利用酶消化透明帶的費用較高，每克胰蛋白酶182.7美元。因此，上述方法均有不足之處。
發明內容
(一)要解決的技術問題本發明目的在于針對上述不足提供一種新的消化卵母細胞透明帶的方法。
(二)技術方案谷胱甘肽是一種小分子水溶性巰基，作為一種還原劑，可以反映細胞的抗氧化活性而成為細胞內氧化還原的指示劑。經研究發現，谷胱甘肽溶于生理鹽水后，還原型谷胱甘肽被空氣中的氧所氧化生成氧化型谷胱甘肽，釋放出H+，多余的H+可降解透明帶糖蛋白基質而達到消化透明帶的目的。
將卵母細胞置于谷胱甘肽制溶液中，適當消化，即可去掉透明帶。谷胱甘肽溶液優選為其生理鹽水溶液，這樣不易損傷細胞，其濃度為0.1～0.3g/mL。根據谷胱甘肽的濃度，其消化時間宜為0.5～7分鐘。優選地，谷胱甘肽的濃度為0.2g/mL，消化時間為1分鐘。
(三)有益效果本發明應用谷胱甘肽來消化卵母細胞透明帶，操作簡單，消化時間短，不易損傷細胞，并且成本低廉。
圖1為透明帶消化前卵母細胞示意圖；圖2為透明帶消化后卵母細胞示意圖；圖3為臺盼藍染色后卵母細胞示意圖。
具體實施例方式
以下實施例進一步說明本發明的內容，但不用來限制本發明所要保護的范圍。
實施例1 應用谷胱甘肽消化卵母細胞透明帶谷胱甘肽的配制稱取1.00克還原型谷胱甘肽溶于5ml滅菌的生理鹽水中，分裝成小管后儲存于-20℃冰箱中備用。
操作將冷凍的谷胱甘肽溶液解凍，然后將卵母細胞置于谷胱甘肽溶液中，消化一分鐘后取出。
實施例2 應用谷胱甘肽消化卵母細胞透明帶將卵母細胞置于新鮮制備的0.1g/mL谷胱甘肽溶液中，消化7分鐘后取出。
實施例3 應用谷胱甘肽消化卵母細胞透明帶將卵母細胞置于新鮮制備的0.3g/mL谷胱甘肽溶液中，消化0.5分鐘后取出。
實施例4 去除透明帶的卵母細胞死活鑒定臺盼藍常用于鑒定細胞的死活，細胞死亡時，細胞膜通透性發生改變，喪失原有功能及增殖能力，可被臺盼藍染成藍色；如果細胞膜完整，細胞不為臺盼藍染色，則為正常細胞。
將去除透明帶的卵母細胞置于臺盼藍染色液中染色一分鐘，后用PBS pH 7.4洗滌2～3次，在顯微鏡下觀察膜的完整性。結果表明卵母細胞未被臺盼藍染成藍色，說明卵母細胞膜仍保持完整性，即使用谷胱甘肽溶液消化透明帶后并沒有對膜造成損傷(圖1、圖2及圖3)。
臺盼藍染液配制稱取4克臺盼藍，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100毫升，用濾紙過濾，4℃保存。使用時，用PBS(pH 7.4)稀釋母液至0.4％(v/v)即可。
權利要求
1.一種消化卵母細胞透明帶的方法，其特征在于，將卵母細胞置于谷胱甘肽溶液中進行消化。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，谷胱甘肽溶液為0.1～0.3g/mL的生理鹽水溶液，消化時間為0.5～7分鐘。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，谷胱甘肽溶液為0.2g/mL的生理鹽水溶液，消化時間為1分鐘。
全文摘要
本發明涉及一種消化卵母細胞透明帶的方法。所述的方法是將卵母細胞置于谷胱甘肽溶液中進行消化。本發明利用谷胱甘肽來消化透明帶，操作簡單，消化時間短，不易損傷細胞，并且成本低廉。
文檔編號C12N5/08GK101082040SQ200610012029
公開日2007年12月5日 申請日期2006年5月29日 優先權日2006年5月29日
發明者田見暉, 成文敏, 安磊 申請人:中國農業大學