一種優化的單克隆抗體的制作方法

專利名稱：一種優化的單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體的說，本發明涉及在哺乳動物細胞中高效表達的載體，一種通過密碼子優化提高抗體在哺乳動物細胞中表達的技術，密碼子優化的抗CD20單克隆抗體序列，及采用優化的表達系統在哺乳動物細胞中高效表達抗CD20單克隆抗體。
背景技術：
對表達蛋白基因的編碼密碼子分析發現，氨基酸的編碼密碼子并不是平均使用的Ikemura T.J Mol Biol 1981，151(3)389；Grantham R et al.，Nucleic Acids Res1981，9(1)43。密碼子的使用可分三種水平，優選密碼子，較優選密碼子和非優選密碼子Hooper SD et al.，Nucleic Acids Res 2000，28(18)3517。另外，低等生物和高等生物對編碼密碼子的偏好也不相同，已證明真核表達的基因在原核表達系統中會因有些密碼子在原核中使用頻率很少而使表達停滯(Robison et al.，Nucleic Acids Res.1984 126663)。普遍認為稀少的密碼子會造成核糖體的終止，并使mRNA的3’端被細胞的核糖核苷酶分解。因此，在真核表達系統中表達微生物或病毒來源的基因時，已有通過優化編碼密碼子來提高表達水平的報道Yukie Koresawa et al.，J Biochem.2000 127367；Lisa H Nucleic Acids Res.1986143075；David B Mol.Biol.Evol.2002 191534。優化來源于真核細胞的基因優化也同樣可以提高其在微生物中的表達水平。但是，直觀的推理是在真核細胞中的高效率表達來源于真核細胞的基因是不需要經過密碼子的。尤其是對于在真核中表達水平較高的抗體產品，文獻中沒有關于密碼子優化的報道。
哺乳動物細胞如CHO/dhfr-細胞普遍用于真核蛋白的穩定表達。目前，已有開發了多種商業化的哺乳動物的表達載體。它們都采用的增強的啟動子如CMV，SV40來增強目的基因表達的啟動。但由于其插入基因組位點的差異，這些表達載體重組細胞株的表達量可相差幾百倍，技術人員需從數千個重組克隆中篩選到高表達的細胞株。因此，通過標記基因篩選到高表達的重組細胞株，從而減少篩選工作量已成為優化細胞株構建的主要方法之一。但由于共轉染的標記基因和目的基因的轉錄和翻譯并不緊密相連，通過篩選獲得高表達標記基因的同時高表達目的基因的克隆比例很低，并且長期培養于高選擇壓力下，表達產物的遺傳穩定性無法保證。
B淋巴細胞是真核生物免疫系統的重要組成部分，在宿主細胞中，每個B淋巴細胞都在其細胞表面表達不同的抗體蛋白。在人體中，B淋巴細胞能表達約107到108個抗體分子。當某種異源抗原被中和后，產生的特異中和抗體的B淋巴細胞的生長將被終止和大幅度減少。但有時會發生該特異B淋巴細胞仍繼續大量擴增的情況，這種細胞的擴增將導致癌癥的發生，這種癌癥被稱為B細胞淋巴瘤。
CD20分子(人B淋巴細胞限制性分化抗原Bp35)是一個33～37kD的磷酸化蛋白，作為B淋巴細胞的標志蛋白，它在前B淋巴細胞、未成熟B淋巴細胞、成熟B淋巴細胞和激活B淋巴細胞中有表達，而在干細胞和漿細胞中沒有表達，在人體血清中也無游離CD20的存在Ginaldi L.et al.，J Clin Pathol 1998 51364。CD20分子參與細胞周期起始和分化的活化過程，并且幾乎在所有B細胞淋巴瘤的細胞表面都表達CD20分子，這使得抗CD20的抗體成為了非常有前景的治療B細胞淋巴瘤疾病的約物Reff ME et al.，Blood 1994 83435；Golay J.etal.，Blood 2000 953900。
研究證明，當B淋巴腫瘤細胞表面蛋白CD20與其抗體結合后，能導致B淋巴腫瘤細胞的崩潰和消亡。抗CD20單克隆抗體主要通過誘導抗體依耐性細胞毒性作用(ADCC)，誘導補體介導的溶細胞作用(CDC)，誘導補體介導的細胞毒性作用(CDCC)及通過活化酪氨酸激酶和半胱氨酸蛋白酶信號傳導通路而誘導細胞的凋亡來殺傷腫瘤細胞Gazzano-Santoro H.et al.，J.Immunol Methods1997 202163；Harjunpaa A.et al.，Scand J Immunol 2000 51634；Flieger D.et al.，Cell Immunol 2000 20455。目前已有一些抗CD20單克隆抗體在臨床上用于非何杰金氏B細胞淋巴瘤的治療，如上市的產品有IDEC公司的RetuximabKai U.et al.，haematologica 2002 8733。但由于抗體的生產成本過高而使藥物無法大量使用，因此降低抗CD20單克隆抗體生產成本，提高蛋白表達量以滿足臨床應用是十分有意義的工作。
復雜的蛋白結構和糖基化形式使抗CD20單克隆抗體蛋白只能在哺乳動物細胞表達系統中表達才能有正常的生理活性。但哺乳動物細胞由于其生長速度緩慢，培養成本偏高，蛋白表達水平低等缺點使得抗體藥物表達成本很高。如有些抗體的商業化生產中其表達水平僅為100-500mg/L。因此，優化抗CD20單克隆抗體蛋白在哺乳動物細胞中的表達是其得到廣泛使用的必要條件。
位于小核糖核酸病毒和腦心肌炎病毒(EMCV)5’端非翻譯引導區的IRES(internal ribosomal entry sites)序列擁有特別的可結合真核生物核糖體的二級結構，從而引起內部翻譯起始。Belsham et al.，Microbiological Reviews 1996 60449；Etchison et al.，J Biol Chem 1982 25714806；Jackson et al.，Curr TopMicrobiol Immunol 1990 2031；Rueckert，Philadelphia，1996 pp.609。第二個順反子為標記基因的雙順反子結構能使目的基因和標記基因同時表達，使標記基因成為目的基因表達的真正選擇方式，幾乎所有的耐受細胞都能表達目的基因Gurtu et al.，Biochem Biophys Res Commun 1996 229295；Rees et al.，Bio Techniques 1996 2048。

發明內容
本發明的目的在于提供一種優化來源于真核細胞的蛋白(包括抗體)基因序列中的核苷酸密碼子的技術和方法，提供抗CD20單克隆抗體密碼子優化的基因序列和高效的哺乳動物細胞基因工程表達系統，及采用這些表達載體使抗CD20單克隆抗體基因序列在哺乳動物細胞中高效表達的方法。
本發明的目的在于提供一種優化抗體基因序列中的核苷酸密碼子的技術和方法，以及核苷酸密碼子優化的CD20嵌合抗體可變區基因序列。
在一個優選實例中，抗體的輕鏈可變區基因序列為SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4中所示的序列，優選的輕鏈可變區基因序列為SEQ ID NO3；重鏈可變區基因序列為SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所示的序列，優選的重鏈可變區基因序列為SEQID NO7。
在該實例中，該抗CD20單克隆抗體重鏈和輕鏈的可變區進行了核苷酸密碼子的優化，采用在小鼠中優選的密碼子代替部分較優選的密碼子和非優選的密碼子，用優選的密碼子或較優選的密碼子代替部分非優選的密碼子，從而避免了因細胞中密碼子合成不足而造成的蛋白表達障礙，提高抗CD20單克隆抗體蛋白在哺乳動物細胞中的表達量。
優選的密碼子包括Ala(gcc)；Arg(cgc)；Asn(aac)；Asp(gac)；Cys(tgc)；Gln(cag)；Glu(gag)；Gly(ggc)；His(cac)；Ile(atc)；Leu(ctg)；Lys(aag)；Pro(ccc)；Phe(ttc)；Ser(agc)；Thr(acc)；Tyr(tac)和Val(ctc)。較優選的密碼包括Gly(ggg)；Ile(att)；Leu(ctc)；Ser(tcc)；Val(gtc)和Arg(agg)；Pro(cct)；Thr(aca)；Ala(gct)。
在一個優選實例中，輕鏈和重鏈可變區基因中的非優選密碼子替代率為10％-20％，20％-50％，50％-70％，70％-100％和100％。
在一個優選實例中，在保證非優選密碼子替換率的基礎上，優化的輕鏈和重鏈可變區基因中的CG序列個數降低或不明顯增加。
在一個優選實例中，合成基因的抗CD20單克隆抗體在哺乳動物細胞，如HEK-293細胞中的表達量是天然基因的抗CD20單克隆抗體的至少120％，150％甚至190％。
在一個優選實例中，該抗CD20單克隆抗體為嵌合抗體，其輕鏈的恒定區可為人κ和λ型序列，優選κ型序列，重鏈的恒定區為人IgG1，IgG2，IgG3，IgG4和IgM型序列，優選IgG1型序列。
本發明的目的在于提供一套高效表達的哺乳動物細胞表達載體。
在一個優選實例中，將neo基因與抗CD20單克隆抗體的重鏈基因構建在同一個操縱子中，位于抗CD20單克隆抗體的重鏈基因后IRES序列的后面，因而該載體弱化了選擇性標記基因neo的表達，使通過G418的篩選獲得neo基因和抗CD20單克隆抗體的重鏈基因同時高表達的重組CHO細胞克隆。
在一個優選實例中，將neo基因與抗CD20單克隆抗體的重鏈基因構建在同一個操縱子中，位于抗CD20單克隆抗體的重鏈基因后IRES序列的后面，將hyg基因和抗CD20單克隆抗體的輕鏈基因構建在同一個操縱子中，位于抗CD20單克隆抗體的輕鏈基因后IRES序列的后面，因而該載體弱化了選擇性標志基因neo和hyg的表達，使通過G418和hygmycin B的篩選獲得neo基因與抗CD20單克隆抗體重鏈基因同時高表達和hyg基因與抗CD20單克隆抗體輕鏈基因同時高表達的重組CHO細胞克隆。
在一個優選實例中，將neo基因與抗CD20單克隆抗體的重鏈基因構建在同一個操縱子中，位于抗CD20單克隆抗體的重鏈基因后IRES序列的后面，因而該載體弱化了選擇性標志基因neo的表達，使通過G418的篩選獲得neo基因與抗CD20單克隆抗體重鏈基因同時高表達的重組CHO細胞克隆。將dhfr基因和抗CD20單克隆抗體的輕鏈基因構建在同一個操縱子中，位于抗CD20單克隆抗體的輕鏈基因后IRES序列的后面，因而該載體弱化了擴增基因dhfr的表達，因而在MTX壓力培養條件下，能篩選到dhfr基因和抗CD20單克隆抗體輕鏈同時高表達的重組CHO細胞。
在一個優選實例中，在G418或G418加hygmycin B篩選下，優化的表達載體的表達量比原載體增加了50％；在另一個優選實例中，在MTX擴增下，優化的載體的平均表達量比原載體增加了10％和30％。
本發明的目的在于提供一個高效表達抗CD20單克隆抗體的方法，該方法包括a)提供一種密碼子優化的抗CD20單克隆抗體的DNA分子；b)提供多種優化的表達載體，該載體含有步驟a)DNA分子及表達該DNA分子的調控序列；c)用步驟a)所述的表達載體轉化宿主細胞，包含哺乳動物細胞，特別是HEK-293，CHO/dhfr-細胞；d)在適合所述單克隆抗體的培養條件下培養步驟b)所得的宿主細胞；和e)分離純化步驟c)所表達的所述單克隆抗體。


圖1多個核苷酸密碼子優化的抗CD20單克隆抗體對照表達載體的構建圖。
圖2a多個核苷酸密碼子優化的抗CD20單克隆抗體對照表達載體在HEK-293細胞中的瞬時表達趨勢圖。
圖2b多個核苷酸密碼子優化的抗CD20單克隆抗體對照表達載體在HEK-293細胞中第七天的瞬時表達量。
圖3a比較抗CD20單克隆抗體輕鏈可變區原始序列(L-wt)與優化后的序列L-3(SEQ ID NO3)。
圖3b比較抗CD20單克隆抗體重鏈可變區原始序列(H-wt)與優化后的序列H-3(SEQ ID NO7)。
圖4優化的pIRESneo3hygd-anti-CD20表達載體的構建圖。
圖5優化的pIRESneo3dhfr-anti-CD20表達載體的構建圖。
圖6抗生素篩選后，抗CD20單克隆抗體在三種表達載體中的表達量比較。
圖7MTX擴增后，抗CD20單克隆抗體在三種表達載體中的表達量比較。
圖8a純化抗CD20單克隆抗體的HP-SEC分析。
圖8b未純化和純化的抗CD20單克隆抗體在13％SDS-PAGE中的電泳圖。
具體實施例方式
本發明涉及一種通過核苷酸密碼子優化來提高抗體在真核細胞中表達水平的技術。該技術的發明和人的常規思維是相反的，一方面是因為抗體的表達水平通常較高，另一方面是因為大多數情況下抗體本身來源于真核細胞。常規的邏輯是來源于真核細胞的蛋白基因本身已經比較適合于在真核細胞中獲得高效表達，不需要再進行核苷酸密碼子優化。文獻中未見有關抗體基因核苷酸密碼子優化的報道。盡管本發明中采用的實例是一個來源于人和鼠的嵌合抗體，本發明中公布的技術可以很容易被本領域內普通的技術人員應用于其它種屬的抗體在真核細胞中的表達。也可以采用本發明的技術根據所選用的真核細胞種屬(如鼠源CHO細胞，人源293細胞等)按著該種屬中密碼子使用的頻率對抗體基因的核苷酸密碼子進行更針對性的優化，所采用的基本原理是一致的，本領域的普通技術人員可以參照本發明的技術方案完成。本發明公布的核苷酸密碼子優化技術也同樣可以應用于其他來源于真核細胞的重組蛋白在真核細胞中的表達。
本發明涉及抗CD20嵌合抗體的核苷酸密碼子優化并提供一系列的優選方案。非優選的密碼子替代率可以任意選擇，可以是0-20％，20％-50％，50％-70％，或70-100％。本領域內普通的技術人員可以選擇某一具體的密碼子替代率并可在不同的基因序列中進行替換，所得到的基因序列將會與本發明中公布的具體實例不完全一樣，但同樣屬于本發明的范圍。
本發明還涉及通過優化真核細胞的表達載體來提高目標產品在真核細胞中的表達水平。本領域的普通技術人員可以按本發明的方案，采用其他的真核表達載體對優化的抗體進行表達。
實施例一、抗CD20單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區基因的優化抗CD20單克隆抗體的原始序列來源于IDEC公司的專利US.5,736,137，其表達基因為本公司所收藏，抗體的可變區序列也可通過寡核苷酸鏈連接獲得。
表達糖基化的抗CD20單克隆抗體的宿主細胞可來源于多種組織，但優選脊椎動物細胞。可用的細胞系有SV40轉化的猴腎CV1細胞系(ATCC CRL 1651)，人胚胎腎細胞(293或懸浮培養的293)Graham et al.，J.Gen Virol.1977 3659，嬰幼倉鼠腎細胞(BHK-21 ATCC CCL 10)，中國倉鼠卵巢細胞(CHO/dhfr-ATCCCRL 9096)，猴腎細胞(CV1 ATCC CRL90)，非洲綠猴腎細胞(VERO-76 ATCCCRL 1587)，人子宮癌細胞(HELA ATCC CCL 2)，犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL34)，人肺細胞(W138，ATCC CCL95)，人肝細胞(Hep G2，HB 8065)等。優選表達抗CD20單克隆抗體的宿主細胞為CHO/dhfr-和HEK-293細胞。
為能在哺乳動物細胞，如HEK-293和CHO/dhfr-細胞，特別是CHO/dhfr-細胞中獲得更高的蛋白表達量，將重鏈和輕鏈可變區基因原始序列進行了密碼子的優化。密碼子優化可參考的文獻有Koresawa et al.，J.Biochem，2000，127(3)367；Robinson et al.，Nucleic Acids Res.1984 126663。
選用在小鼠中優選的密碼子和較優選的密碼子代替非優選的密碼子，見表1，主要考慮Ser，Leu，Val，Thr，Ala，Asn，Lys，Arg和Gly密碼子的優化，并同時考慮優化序列中CG的個數。優化后的輕鏈可變區的核苷酸序列L-1見SEQ ID No1，其非優選密碼子的替代率為20％，CG個數為9；優化后的輕鏈可變區的核苷酸序列L-2見SEQ ID No2，其非優選密碼子的替代率為40％，CG個數為11；優化后的輕鏈可變區的核苷酸序列L-3見SEQ ID No3，其非優選密碼子的替代率為70％，CG個數為3；優化后的輕鏈可變區的核苷酸序列L-4見SEQ ID No4，其非優選密碼子的替代率為85％，CG個數為12，見表2。優化后的重鏈可變區的核苷酸序列見H-1見SEQ ID No5，其非優選密碼子的替代率為20％，CpG個數為9；優化后的重鏈可變區的核苷酸序列H-2見SEQ IDNo6，其非優選密碼子的替代率為40％，CG個數為8；優化后的重鏈可變區的核苷酸序列H-3見SEQ ID No7，其非優選密碼子的替代率為60％，CG個數為10；優化后的重鏈可變區的核苷酸序列H-4見SEQ ID No8，其非優選密碼子的替代率為85％，CG個數為9，見表3。
表1(Genbank)

表2

表3

優化的抗CD20單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區基因序列可采用寡核苷酸鏈拼接的方式獲得，也可由其他公司全基因合成獲得(Invitrogen)。其中，輕鏈可變區序列的5’端設計BamH I位點，3’端設計BsiW I位點，重鏈可變區序列的5’端設計EcoR V位點，3’端設計Nhe I位點。
抗CD20單克隆抗體輕鏈可為人κ和λ型序列，優選κ型序列，重鏈的恒定區可為IgG1，IgG2，IgG3，IgG4和IgM，優選IgG1。將wt-L，L-1，L-2，L-3和L-4與人κ相連，將wt-H，H-1，H-2，H-3和H-4與IgG1恒定區相連。分別將wt-L和wt-H，L-1和H-1，L-2和H-2，L-3和H-3，L-4和H-4的完整抗體序列構建到表達載體中。
實施例二、抗CD20單克隆抗體基因的制備(1)人κ輕鏈恒定區及人IgG1重鏈恒定區的制備收集新鮮人全血5ml，300g離心5min沉淀紅細胞和白細胞。按BBI公司的classical total RNA isolation kit說明書的操作方案提取白細胞RNA。按BBI公司的MMLV first strand cDNA synthesis kit說明書的操作方案將白細胞mRNA反轉錄為cDNA。反應體系為11μl RNA(2.7μg)，5×reaction buffer 4μl，RNaseinhibitor(20U/μl)1μl，dNTP mix(10mmol/L)2μl，M-MuLV reverse transcriptase1μl，總反應體積為20μl。
根據已知的人κ和IgG1序列設計PCR引物。以反轉錄的cDNA為模板，PCR擴增獲得目的基因。
合成引物序列L-F/BamH I5’GCGGGATCCCGTACGGTGGCTGCACCATCT 3’(SEQ ID NO9)L-R/Xho I5’GCGCTCGAGCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC 3’(SEQ IDNO10)H-F/Eco52 I5’GCGCGGCCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGG 3’(SEQ IDNO11)H-R/Xho I5’GCGCTCGAGGATCCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC 3’(SEQ ID NO12)PCR反應體系20μl 10*Pyrobest buffer，16μl 2.5mM dNTP，14μl 10μM重鏈或輕鏈恒定區引物對，4μl人白細胞cDNA，2μl 5U/μl Pyrobest DNAPolymerase，反應體系為200μl。
擴增條件變性94℃4min；變性94℃1min，退火60℃1min，延伸72℃1min，30個循環；延伸72℃5min。
(2)多個抗CD20單克隆抗體輕鏈的制備采用本領域技術人員熟知的常規分子生物學技術薩幕布魯克J等，《分子克隆試驗指南》，北京科學出版社，κ基因的PCR產物分別用BamH I和Xho I(TaKaRa)雙酶切，在30μl體系中加入3μl 10×K buffer，κPCR純化產物20μl，Xho I 2μl，BamH I 3μl，37℃酶切1h。pcDNA3(Invitrogen)載體也用BamH I和Xho I雙酶切，在30μl體系中加入3μl 10×K buffer，pcDNA3 10μl，Xho I 2μl，BamH I 3μl，37℃酶切1h。用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1試劑盒將κ分別插入到pcDNA3中，構建為pcDNA3-κ，轉化細菌后保存。
抗CD20單克隆抗體的輕鏈可變區基因L-wt，L-1，L-2，L-3，L-4和pcDNA3-κ分別用Kpn I(TaKaRa)酶切，酶切體系為在50μl體系中加入5μl 10×L buffer，輕鏈可變區基因30μl或pcDNA3-κ10μl，Kpn I 3μl，37℃酶切1h。酶切產物使用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System純化試劑盒進行純化，再分別使用BsiW I(ToYoBo)酶切，酶切體系為在50μl體系中加入5μl 10×Hbuffer，輕鏈可變區基因Kpn I酶切產物30μl或pcDNA3-κKpn I酶切產物30μl，BsiW I 3μl，37℃酶切1h。膠回收400bp左右的輕鏈可變區Kpn I和BsiW I酶切產物，并用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1試劑盒將輕鏈可變區插入pcDNA3-κ載體，構建為pcDNA3-L-wt，pcDNA3-L-1，pcDNA3-L-2，pcDNA3-L-3，pcDNA3-L-4，轉化細菌后保存。
(3)多個抗CD20單克隆抗體重鏈的制備IgG1 Fc基因的PCR產物分別用Eco52 I和Xho I(TaKaRa)酶切，在30μl體系中加入3μl 10×H buffer，IgG1 Fc PCR純化產物20μl，Xho I 2μl，37℃酶切1h。酶切產物使用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System純化試劑盒進行純化，再使用Eco52 I酶切，酶切體系為在在30μl體系中加入3μl10×Basal buffer，IgG1 Fc Xho I酶切產物20μl，0.1％BSA 3μl，Eco52 I 2μl，37℃酶切1h。pcDNA3載體也用Eco52 I和Xho I雙酶切，在30μl體系中加入3μl10×H buffer，pcDNA3 20μl，Xho I 2μl，37℃酶切1h。酶切產物使用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System純化試劑盒進行純化，再使用Eco52 I酶切，酶切體系為在在30μl體系中加入3μl 10×Basal buffer，pcDNA3 Xho I酶切產物20μl，0.1％BSA 3μl，Eco52 I 2μl，37℃酶切1h。用TaKaRa的DNALigation Kit Ver.2.1試劑盒將IgG1 Fc插入到pcDNA3中，構建為pcDNA3-IgG1Fc，轉化細菌后保存。
抗CD20單克隆抗體的重鏈可變區基因H-wt，H-1，H-2，H-3，H-4和pcDNA3-IgG1 Fc分別用EcoRV(TaKaRa)酶切，酶切體系為在50μl體系中加入5μl 10×H buffer，重鏈可變區基因30μl或pcDNA3-IgG1 Fc 10μl，EcoR V 3μl，37℃酶切1h。酶切產物使用promega Wizard SV Gel and PCR clean-up System純化試劑盒進行純化，再分別使用Nhe I(TaKaRa)酶切，酶切體系為在50μl體系中加入5μl 10×M buffer，重鏈可變區基因EcoR V酶切產物30μl或pcDNA3-IgG1 Fc EcoR V酶切產物30μl，Nhe I 3μl，37℃酶切1h。膠回收420bp左右的重鏈可變區EcoR V和Nhe I酶切產物，并用TaKaRa的DNA LigationKit Ver.2.1試劑盒將重鏈可變區插入pcDNA3-IgG1 Fc載體，構建為pcDNA3-H-wt，pcDNA3-H-1，pcDNA3-H-2，pcDNA3-H-3，pcDNA3-H-4，轉化細菌后保存。
實施例三、抗CD20單克隆抗體表達載體的構建抗CD20單克隆抗體基因在真核細胞中的表達需要借助于一個高效的真核表達載體將抗體基因介導進入宿主細胞。這些載體中需要含有信號序列，復制起點，1個或多個標記基因，增強子序列，啟動子和轉錄終止序列。本發明采用商品化的pIRESneo3和pIREShyg(Clontech)為基礎，利用IRES可形成的多順反子的原理對表達載體進行了優化，使多個標記基因弱化，從而篩選抗CD20單克隆抗體高表達的細胞克隆。
采用本領域技術人員熟知的常規分子生物學技術，將CD20單克隆抗體重鏈插入到本公司制備的哺乳動物表達載體pIRESneo3d(通過在pIRESneo3載體中插入dhfr表達盒而獲得)多克隆位點區中薩幕布魯克J等，《分子克隆試驗指南》，北京科學出版社。具體操作為pIRESneo3d經EcoR V和BamH I雙酶切，酶切體系為50μl體系中加入5μl 10×K buffer，pIRESneo3d 15μl，EcoR V 3μl，BamH I 3μl，37℃酶切1h。重鏈表達質粒pcDNA3-H-wt，pcDNA3-H-1，pcDNA3-H-2，pcDNA3-H-3，pcDNA3-H-4載體經EcoR V和BamH I雙酶切后膠回收1.4Kb的酶切片段，酶切系統同上。用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1試劑盒將重鏈片段與pIRESneo3d載體進行粘端連接。獲得的重組質粒pIRESneo3d-H-wt，pIRESneo3d-H-1，pIRESneo3d-H-2，pIRESneo3d-H-3，pIRESneo3d-H-4轉化DH5α細菌后保存。
再將CD20單克隆抗體的輕鏈插入到pIRESneo3d-H載體中。具體操作為重鏈表達質粒pIRESneo3d-wt，pIRESneo3d-H-1，pIRESneo3d-H-2，pIRESneo3d-H-3，pIRESneo3d-H-4載體經Nru I單酶切，酶切體系為在50μl體系中加入5μl 10×basal buffer，重鏈表達質粒15μl，0.1％BSA 0.5μl，Nru I 3μl，37℃酶切1h。酶切產物使用promega Wizard SV Gel and PCR clean-up System純化試劑盒進行純化，再用CIAP酶去磷酸化，在50μl體系中10×AlkalinePhosphatase Buffer 5μl，CIAP 2μl，重鏈表達質粒Nru I酶切產物43μl，50℃反應30min，65℃加熱處理30min以上使CIAP酶失活。輕鏈表達質粒pcDNA3-L-wt，pcDNA3-L-1，pcDNA3-L-2，pcDNA3-L-3，pcDNA3-L-4用NruI和Nae I分別酶切，酶切體系為在50μl體系中加入5μl 10×basal buffer，輕鏈表達質粒30μl，0.1％BSA 0.5μl，Nru I 3μl，37℃酶切1h。酶切產物使用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System純化試劑盒進行純化，再用Nae I進行酶切，酶切體系為50μl體系中加入5μl 10×L buffer，輕鏈表達質粒Nru I酶切產物30μl，Nae I 3μl，37℃酶切1h。膠回收含輕鏈表達盒的1.8kb的Nru I～Nae I片段，并用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1試劑盒將輕鏈表達盒分別與pIRESneo3d-H-wt，pIRESneo3d-H-1，pIRESneo3d-H-2，pIRESneo3d-H-3，pIRESneo3d-H-4載體進行平端連接。獲得的重組質粒pIRESneo3d-anti-CD20-wt，pIRESneo3d-anti-CD20-1，pIRESneo3d-anti-CD20-2，pIRESneo3d-anti-CD20-3，pIRESneo3d-anti-CD20-4轉化DH5α細菌后保存。圖1為CD20單克隆抗體的表達載體的構建圖。
實施例四、抗CD20單克隆抗體在HEK-293細胞中的瞬時表達抗CD20單克隆抗體轉染哺乳動物宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主細胞為293細胞時，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法Jordan et al.，Nucleic Acids Res.1996 244，脂質體包裝法(如lipofectamine 2000)Audouy S.et al.，Mol Membr Biol.2001 18(2)129，電穿孔法和顯微注射法Morrison et al.，Science 1985 2291202。我們采用lipofectamine2000(Catinvitrogen)轉染法，按其使用說明，平行制備1.6μg表達載體質粒和4.0μl lipofectamine 2000的混合物，各轉染12孔板的一個孔中8×105個HEK-293貼壁細胞，轉染4h后，用DMEM+10％FBS培養基清洗細胞一次，再加入適量的DMEM+10％FBS培養基，每天取樣到第7天。
抗CD20單克隆抗體的ELISA定量檢測采用夾心法進行ELISA檢測。包被液為50μl的1μg/ml的山羊抗人IgG(Fc)多克隆抗體(KPL)，封閉液為2％BSA，室溫下封閉3h，標準品為Human IgG1，KAPPA(Sigma)，室溫放置4h，第二抗體為50μl 1∶2000稀釋的辣根酶標記山羊抗人IgG(H+L)(北京中杉金橋有限公司)，37℃下溫育2h，TMB顯色。OD450下讀值。結果見圖2a，相比原始序列，密碼子優化的抗CD20單克隆抗體的表達量均有所提高，第七天的表達量與原始序列相比所提供的倍數見圖2b。以優化后的L-3和H-3組合的抗體的表達量最高(圖3a和圖3b)。
實施例五、抗CD20單克隆抗體表達載體的優化(1)pIRESneo3hygd-anti-CD20表達載體的構建a)pIREShyg-L-3的構建抗CD20單克隆抗體輕鏈基因的PCR擴增獲得含EcoT22 I和Not I酶切位點的L-3輕鏈基因，合成引物為CD20-L-F1/EcoT22 I5’GCGATGCATATGGATTTTCAGGTGCAGATT 3’(SEQID NO13)
CD20-L-R1/Not I5’GCGGCGGCCGCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG 3’(SEQ ID NO14)采用本領域技術人員熟知的常規分子生物學技術，將CD20單克隆抗體輕鏈插入到哺乳動物表達載體pIREShyg(Clontech)的多克隆位點區中。具體操作為pIREShyg經EcoT22 I酶切，酶切體系為50μl體系中加入5μl 10×H buffer，pIREShyg 15μl，EcoT22 I 3μl，37℃酶切1h。酶切產物使用promega Wizard SVGel and PCR clean-up System純化試劑盒進行純化。再用Not I進行酶切，酶切體系為50μl體系中加入5μl 10×H buffer，5μl 0.1％BSA，5μl 0.1％Triton X-100，pIREShyg EcoT22 I 15μl，Not I 3μl，37℃酶切1h。輕鏈PCR產物經EcoT22 I和Not I雙酶切，酶切系統同上。用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1試劑盒將輕鏈片段與pIREShyg載體進行粘端連接。獲得的重組質粒pIREShyg-L-3，轉化DH5α細菌后保存。
b)pIRESneo3hygd-anti-CD20表達載體的構建將CD20單克隆抗體的輕鏈插入到pIRESneo3d-H-3載體中。具體操作為重鏈表達質粒pIRESneo3d-H-3載體經Nru I單酶切，酶切體系為在50μl體系中加入5μl 10×basal buffer，pIRESneo3d-H-3 15μl，0.1％BSA 0.5μl，Nru I 3μl，37℃酶切1h。酶切產物使用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System純化試劑盒進行純化，再用CIAP酶(TaKaRa)去磷酸化，在50μl體系中10×AlkalinePhosphatase Buffer 5μl，CIAP 2μl，pIRESneo3d-H-3 Nru I酶切產物43μl，50℃反應30min，65℃加熱處理30min以上使CIAP酶失活。
輕鏈表達質粒pIREShyg-L-3經Nru I酶切，酶切體系為在50μl體系中加入5μl 10×basal buffer，0.5μl 0.1％BSA，pIREShyg-L-330μl，Mlu I 3μl，37℃酶切1h。酶切產物使用promega Wizard SV Gel and PCR clean-up System純化試劑盒純化后用Xho I酶切，酶切體系為在50μl反應體系中，10×H Buffer 5μl，pIREShyg-L-3Nru I酶切產物38μl，Xho I 2μl，37℃反應1h。使用promegaWizard SV Gel and PCR clean-up System純化試劑盒膠回收4kb左右片段。Klenow(TaKaRa)酶補平酶切產物，在50μl反應體系中，10×Klenow FragmentBuffer 5μl，pIREShyg-L-3 NruI～Xho I酶切產物38μl，dNTP(2.5mM)5μl，Klenow酶(4U/μl)2μl。37℃反應1h。用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1試劑盒將輕鏈表達盒與pIRESneo3d-H-3載體進行平端連接。獲得的重組質粒pIRESneo3hygd-anti-CD20，轉化DH5α細菌后保存。圖4為pIRESneo3hygd-anti-CD20抗CD20單克隆抗體的表達載體的構建圖。
(2)pIRESneo3dhfr-anti-CD20表達載體的構建a)pIRESdhfr-L-3的構建抗CD20單克隆抗體輕鏈基因的PCR擴增獲得含EcoR V和BamH I酶切位點的L-3輕鏈基因，合成引物為CD20-L-F2/EcoR V 5’GCGGATATCATGGATTTTCAGGTGCAGATT 3’(SEQ IDNO15)CD20-L-R2/BamH I5’GCGGGATCCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG 3’(SEQID NO16)采用本領域技術人員熟知的常規分子生物學技術，將CD20單克隆抗體輕鏈插入到本公司制備的哺乳動物表達載體pIRESdhfr(通過將pIRESneo3中的neo基因替換為dhfr基因獲得)的多克隆位點區中。具體操作為pIRESdhfr經EcoRV和BamH I雙酶切，酶切體系為50μl體系中加入5μl 10×K buffer，pIRESdhfr15μl，EcoR V 3μl，BamH I 3μl，37℃酶切1h。輕鏈PCR產物經EcoR V和BamH I雙酶切，酶切系統同上。用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1試劑盒將輕鏈片段與pIRESdhfr載體進行粘端連接。獲得的重組質粒pIRESdhfr-L-3，轉化DH5α細菌后保存。
b)pIRESneo3-H-3的構建采用本領域技術人員熟知的常規分子生物學技術，將CD20單克隆抗體重鏈插入到哺乳動物表達載體pIRESneo3(Clontech)多克隆位點區中。具體操作為pIRESneo3經EcoRV和BamH I雙酶切，酶切體系為50μl體系中加入5μl 10×Kbuffer，pIRESneo3 15μl，EcoR V 3μl，BamH I 3μl，37℃酶切1h。重鏈表達質粒pcDNA3-H-3載體經EcoR V和BamH I雙酶切后膠回收1.4Kb的酶切片段，酶切系統同上。用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1試劑盒將重鏈片段與pIRESneo3載體進行粘端連接。獲得的重組質粒pIRESneo3-H-3，轉化DH5α細菌后保存。
c)pIRESneo3dhfr-anti-CD20表達載體的構建將CD20單克隆抗體的輕鏈插入到pIRESneo3-H-3載體中。具體操作為重鏈表達質粒pIRESneo3-H-3載體經Nru I單酶切，酶切體系為在50μl體系中加入5μl 10×basal buffer，重鏈表達質粒15μl，0.1％BSA 0.5μl，Nru I 3μl，37℃酶切1h。酶切產物使用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System純化試劑盒進行純化，再用CIAP酶(TaKaRa)去磷酸化，在50μl體系中10×AlkalinePhosphatase Buffer 5μl，CIAP 2μl，重鏈表達質粒Nru I酶切產物43μl，50℃反應30min，65℃加熱處理30min以上使CIAP酶失活。
輕鏈表達質粒pIRESdhfr-L-3經Mlu I(TaKaRa)酶切，酶切體系為在50μl體系中加入5μl 10×H buffer，pIRESdhfr-L-330μl，Mlu I 3μl，37℃酶切1h。酶切產物使用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System純化試劑盒膠回收3.5Kb片段，Klenow(TaKaRa)補平Mlu I酶切位點，在50μl反應體系中，10×Klenow Fragment Buffer 5μl，pIRESneo3-L-3Mlu I酶切產物38μl，dNTP(2.5mM)5μl，Klenow酶(4U/μl)2μl。37℃反應1h。用TaKaRa的DNA LigationKit Ver.2.1試劑盒將輕鏈表達盒分別與pIRESneo-H-3載體進行平端連接。獲得的重組質粒pIRESneo3dhfr-anti-CD20，轉化DH5α細菌后保存。圖5為pIRESneo3dhfr-anti-CD20抗CD20單克隆抗體的表達載體的構建圖。
實施例六、抗CD20單克隆抗體在CHO/dhfr-細胞中的表達本發明中，產生抗CD20單克隆抗體細胞，如CHO細胞可培養于多種培養基中。商業化的培養基如DMEM，MEM，Ham’s F12，RPMI-1640(Gibco)都可用于宿主細胞的培養。此外，Ham et al.，Meth.Enz.1979 5844；Barnes et al.，Anal.Biochem.1980 102255；U.S.Pat.Nos.4,767,707；4,657,866；4,927,762中的培養基均可用于培養宿主細胞。宿主細胞的培養條件，如溫度，pH值等也是本領域技術人員熟知的常規條件。
抗CD20單克隆抗體轉染宿主細胞，如CHO/dhfr-細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。我們采用脂質體lipofectamine 2000(invitrogen)轉染法，按其使用說明，三種載體各制備1.5μg表達載體質粒和4.5μl lipofectamine 2000的混合物，各轉染6×105個CHO/dhfr-細胞，過夜轉染后，將細胞平均分配到1塊96孔板中進行選擇基因的篩選。
抗CD20單克隆抗體pIRESneo3d-anti-CD20和pIRESneo3dhfr-anti-CD20轉染的CHO細胞在DMEM+5％dFBS+1.0mg/ml G418下進行篩選，CD20單克隆抗體pIRESneo3hygd-anti-CD20轉染的CHO細胞在DMEM+5％dFBS+1.0mg/mlG418+0.6mg/ml hygromycin B下進行篩選，2～3天更換篩選培養基，培養2-3周各獲得30多個篩選細胞克隆。將三種抗CD20單克隆抗體表達載體轉染CHO細胞各取30個單克隆按相同的密度傳至24孔板中，在0.5ml DMEM+5％dFBS培養基中培養5天，ELISA檢測培養基上清液中CD20單克隆抗體的表達量，其中表達量高于5mg/L的克隆結果見圖6。
為了使G418或G418加hygmycin B篩選的抗CD20單克隆抗體細胞更高效的表達，每種載體重組細胞各挑選10個高表達細胞用MTX進行擴增表達。具體操作為，重組CHO細胞在DMEM+5％dFBS培養基中培養，并在培養過程中加入逐步增加的MTX濃度，培養過程中持續監測抗體的表達水平，當MTX濃度增加到細胞生長無法耐受時停止增加MTX濃度。當MTX增至300nM時，細胞按相同的數量接入含5ml DMEM+5％dFBS+300nM MTX培養基的T25培養瓶中，培養五天后ELISA檢測培養基清液中CD20單克隆抗體的表達量，結果見圖7。
實施例七、CD20單克隆抗體的純化及SDS-PAGE分析CHO細胞培養液20L經過Prostak切向流系統0.45μm過濾澄清。過濾后培養液進Protein A Sepharose FF.柱親和純化Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.1983 621，0.1M pH2.7檸檬酸緩沖液洗脫。親和層析洗脫峰用1M Tris pH9.0調pH3.5，室溫孵育1hr。樣品加入固體NaCl至終濃度1.5M，調pH7.5，0.45μm過濾后進Butyl Sepharose FF疏水層析分離，20mM Na3PO4，pH 7.5洗脫。HIC洗脫峰用6M HCl調pH6.3，進CM Sepharose FF分離，50mM Citrate/250mMNaCl pH7.3洗脫。最終產品0.22μm過濾后凍干保存。終產品經HP-SEC檢測純度97％以上(圖8a)。13％SDS-PAGE電泳可見清洗的重鏈和輕鏈條帶(圖8b)。
序列表(1)一般信息(i)申請人神州細胞工程有限公司(ii)發明名稱一種優化的單克隆抗體(iii)序列數目16(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度384(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(A)描述抗CD20單克隆抗體輕鏈可變區密碼子優化序列-1(iii)序列描述SEQ ID NO1ATGGACTTTC AGGTGCAGAT TATCAGCTTC CTGCTAATCA GCGCTTCAGT CATAATGTCC60CGCGGGCAAA TTGTGCTCTC CCAGTCTCCC GCAATCCTGA GCGCATCTCC AGGGGAGAAG 120GTCACAATGA CTTGCAGGGC CAGCTCAAGT GTAAGTTACA TCCACTGGTT CCAGCAGAAG 180CCAGGCTCCT CCCCCAAACC CTGGATTTAT GCCACATCCA ACCTGGCTAG CGGCGTCCCT 240GTTCGCTTCA GTGGCAGTGG GTCTGGGACT TCTTACTCTC TCACAATCAG CAGAGTGGAG 300GCTGAAGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTGGACTA GTAACCCACC CACCTTCGGA 360GGGGGGACCA AGCTGGAAAT CAAA 384(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度384(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(A)描述抗CD20單克隆抗體輕鏈可變區密碼子優化序列-2(iii)序列描述SEQ ID NO2ATGGATTTTC AGGTGCAGAT TATCAGCTTC CTGCTAATCA GCGCTTCCGT CATAATGTCC60CGCGGGCAAA TTGTGCTCTC CCAGTCCCCT GCCATCCTGA GCGCATCCCC AGGGGAGAAA 120
GTCACAATGA CCTGCAGGGC CAGCTCAAGT GTGAGTTACA TCCACTGGTT CCAGCAGAAG 180CCAGGCTCCT CCCCCAAACC CTGGATTTAT GCCACATCCA ACCTGGCTAG CGGCGTCCCT 240GTTCGCTTCA GTGGCAGTGG GAGCGGGACT TCTTACTCTC TCACAATCAG CAGAGTGGAG 300GCTGAAGACG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTGGACTA GTAACCCCCC CACCTTCGGA 360GGGGGGACCA AGCTGGAAAT CAAA 384(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度384(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(A)描述抗CD20單克隆抗體輕鏈可變區密碼子優化序列-3(iii)序列描述SEQ ID NO3ATGGACTTCC AGGTGCAGAT CATCAGCTTC CTGCTGATCA GTGCCAGCGT CATTATGTCC60CGCGGCCAGA TTGTGCTCTC CCAGTCCCCA GCCATCCTGT CTGCCAGCCC TGGGGAGAAG 120GTGACCATGA CCTGCAGGGC CAGCTCCAGT GTGAGCTACA TCCACTGGTT CCAGCAGAAG 180CCAGGCTCCT CCCCCAAGCC CTGGATCTAT GCCACCTCCA ACCTGGCCTC TGGGGTGCCT 240GTGCGCTTCA GTGGCTCTGG CTCTGGGACC TCCTACTCTC TCACCATCAG CAGGGTGGAG 300GCTGAGGATG CTGCCACCTA TTACTGCCAG CAGTGGACCA GCAACCCACC CACCTTCGGA 360GGGGGCACCA AGCTGGAGAT CAAG 384(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度384(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(A)描述抗CD20單克隆抗體輕鏈可變區密碼子優化序列-4(iii)序列描述SEQ ID NO4ATGGACTTCC AGGTGCAGAT CATCAGCTTC CTGCTGATCA GTGCCAGCGT CATTATGTCC60CGCGGCCAGA TTGTGCTCTC CCAGTCCCCC GCCATCCTGA GCGCCAGCCC TGGGGAGAAG 120GTGACCATGA CCTGCAGGGC CAGCTCCAGC GTGAGCTACA TCCACTGGTT CCAGCAGAAG 180CCCGGCTCCT CCCCCAAGCC CTGGATCTAC GCCACCTCCA ACCTGGCCAG CGGGGTGCCT 240
GTGCGCTTCA GTGGCTCTGG CTCTGGGACC TCCTACTCTC TCACCATCAG CAGGGTGGAG 300GCTGAGGACG CTGCCACCTA TTACTGCCAG CAGTGGACCA GCAACCCACC CACCTTCGGA 360GGGGGCACCA AGCTGGAGAT CAAG 384(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度420(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(A)描述抗CD20單克隆抗體重鏈可變區密碼子優化序列-1(iii)序列描述SEQ ID NO5ATGGGCTGGA GCCTCATCCT CCTGTTCCTT GTCGCAGTAG CTACTCGTGT GCTGTCCCAG60GTGCAATTGC AGCAGCCCGG AGCTGAGCTG GTAAAACCTG GTGCCTCAGT GAAGATGTCC 120TGCAAGGCAT CTGGCTACAC ATTTACCAGC TACAATATGC ACTGGGTCAA GCAGACACCT 180GGCAGAGGCC TGGAATGGAT TGGGGCCATT TACCCCGGCA ATGGTGATAC ATCCTACAAC 240CAGAAGTTCA AAGGCAAGGC CACCCTGACT GCAGACAAGT CCTCCAGCAC GGCCTACATG 300CAGCTCAGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCGGTGTATT ACTGTGCCCG CAGCACCTAC 360TATGGTGGGG ACTGGTACTT CAATGTCTGG GGAGCTGGGA CCACGGTCAC CGTGTCTGCT 420(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度420(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(A)描述抗CD20單克隆抗體重鏈可變區密碼子優化序列-2(iii)序列描述SEQ ID NO6ATGGGCTGGA GCCTTATCCT CCTGTTCCTG GTGGCTGTCG CTACACGTGT GCTGTCCCAG60GTCCAACTGC AGCAGCCAGG TGCTGAGCTG GTGAAACCTG GGGCCTCAGT GAAGATGTCC 120TGCAAGGCCT CTGGCTACAC ATTTACCAGC TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGACACCT 180GGCAGAGGCC TGGAATGGAT TGGTGCTATT TACCCCGGCA ATGGGGATAC CTCCTACAAC 240CAGAAGTTCA AAGGCAAGGC CACCCTCACT GCAGACAAGT CCTCCAGCAC TGCCTACATG 300CAGCTCAGCA GCCTGACCTC CGAGGACTCT GCGGTGTATT ACTGTGCCCG CAGCACCTAC 360
TATGGTGGGG ACTGGTACTT CAATGTATGG GGAGCTGGCA CCACGGTCAC CGTGTCTGCT 420(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度420(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(A)描述抗CD20單克隆抗體重鏈可變區密碼子優化序列-3(iii)序列描述SEQ ID NO7ATGGGCTGGA GCCTGATCCT GCTGTTCCTG GTGGCGGTGG CCACGCGTGT GCTGTCCCAG60GTGCAACTGC AGCAGCCAGG GGCTGAGCTG GTGAAGCCTG GGGCCTCAGT GAAGATGTCC 120TGCAAGGCCT CTGGCTACAC CTTTACCAGC TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGACCCCT 180GGCCGGGGCC TGGAATGGAT TGGGGCCATT TATCCGGGCA ATGGGGATAC CTCCTACAAC 240CAGAAGTTCA AAGGCAAGGC CACCCTGACT GCAGACAAGT CCTCCAGCAC GGCCTACATG 300CAGCTCAGCA GCCTGACCAG TGAGGACTCT GCGGTGTATT ACTGTGCCCG CAGCACCTAC 360TATGGTGGGG ACTGGTACTT CAATGTCTGG GGAGCTGGGA CCACGGTCAC CGTGTCTGCT 420(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度420(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(A)描述抗CD20單克隆抗體重鏈可變區密碼子優化序列-4(iii)序列描述SEQ ID NO8ATGGGCTGGA GCCTGATCCT GCTGTTCCTG GTGGCTGTGG CCACTAGGGT GCTGTCCCAG60GTGCAACTGC AGCAGCCCGG GGCTGAGCTG GTGAAGCCTG GGGCCAGCGT GAAGATGTCC 120TGCAAGGCCT CCGGCTACAC CTTTACCAGC TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGACCCCT 180GGCAGGGGCC TGGAGTGGAT TGGGGCCATT TACCCCGGCA ACGGGGACAC CTCCTACAAC 240CAGAAGTTCA AAGGCAAGGC CACCCTGACT GCAGACAAGT CCTCCAGCAC TGCCTACATG 300CAGCTCAGCA GCCTGACCAG CGAGGACTCT GCTGTGTACT ACTGTGCCCG CAGCACCTAC 360TATGGTGGGG ACTGGTACTT CAACGTGTGG GGGGCTGGGA CCACTGTGAC CGTGTCTGCT 420
(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度30(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(A)描述引物(iii)序列描述SEQ ID NO9GCGGGATCCC GTACGGTGGC TGCACCATCT30(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度34(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(A)描述引物(iii)序列描述SEQ ID NO10GCGCTCGAGC TAACACTCTC CCCTGTTGAA GCTC 34(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度31(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(A)描述引物(iii)序列描述SEQ ID NO11GCGCGGCCGG CTAGCACCAA GGGCCCATCG G 31(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度40
(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(A)描述引物(iii)序列描述SEQ ID NO12GCGCTCGAGG ATCCTCATTT ACCCGGAGAC AGGGAGAGGC40(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度30(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(A)描述引物(iii)序列描述SEQ ID NO13GCGATGCATA TGGATTTTCA GGTGCAGATT 30(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度33(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(A)描述引物(iii)序列描述SEQ ID NO14GCGGCGGCCG CCTAACACTC TCCCCTGTTG AAG 33(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度30(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性
(ii)分子類型DNA(A)描述引物(iii)序列描述SEQ ID NO15GCGGATATCA TGGATTTTCA GGTGCAGATT 30(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度31(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(A)描述引物(iii)序列描述SEQ ID NO16GCGGGATCCC TAACACTCTC CCCTGTTGAA G 3權利要求
1.一種根據宿主細胞種屬所特有的蛋白基因密碼子使用頻率來優化重組蛋白(包括抗體)的表達水平的技術方案，其特征為a)確定宿主細胞中蛋白基因密碼子的使用頻率；b)選擇各氨基酸的密碼子使用頻率最高的為優選密碼子，使用頻率第二高的為次優選密碼子；c)將蛋白基因序列中一定比例的非優選密碼子替換成優選密碼子；d)檢查CG序列的個數，在保證非優選密碼子替換率的基礎上盡量減少或不增加CG序列的數目；e)將密碼子優化的蛋白基因插入一個真核表達載體；f)將含有目標蛋白基因的表達載體轉染哺乳動物細胞進行高效表達。
2.權利要求1所述的技術，其特征在于非優選密碼子替換比例是10-100％。
3.權利要求1所述的技術，其特征在于所優化的蛋白質是一種來源于真核細胞的抗體，比如人抗體，鼠抗體，人源化抗體，嵌合抗體，兔抗體等。
4.權利要求1所述的技術，其特征在于所優化的基因序列是一種來源于真核細胞的抗體組成部分，包括a)抗體片段；b)抗體輕鏈；c)抗體重鏈；d)抗體Fab片段；e)單鏈抗體。
5.權利要求1所述的技術，其特征在于所優化的蛋白質是一種來源于真核細胞的抗體Fc與任何來源的蛋白組成的融合蛋白。
6.權利要求1所述的技術，其特征在于所優化的蛋白質是抗CD20抗體。
7.權利要求1所述的技術，其特征在于所優化的抗CD20抗體的來源是高等生物(即真核)，包括鼠源抗體、人源抗體、人源化抗體、人鼠嵌合抗體。
8.一種密碼子優化的抗CD20單克隆抗體DNA分子。
9.權利要求8所述的抗體DNA分子，其特征在于抗體的輕鏈可變區的DNA分子的序列為SEQ ID NO3，重鏈可變區的DNA分子為SEQ ID NO7。
10.一種優化的抗CD20單克隆抗體表達載體，其特征在于表達載體所含的標記基因neo和hyg均位于IRES序列后，分別與重鏈和輕鏈在同一個操縱子中表達。
11.權利要求10所述的表達載體，其特征在于可在低濃度的G418和hygmycin B下的篩選到重鏈和輕鏈基因均高效表達的細胞株。
12.一種優化的抗CD20單克隆抗體表達載體，其特征在于表達載體所含的標記基因neo和擴增基因dhfr均位于IRES序列后，分別與重鏈和輕鏈在同一操縱子中表達。
13.權利要求12所述的表達載體，其特征在于可在低濃度G418下篩選到重鏈高表達的細胞株，在低濃度MTX擴增下獲得輕鏈高表達的細胞株。
14.一種抗體表達方法，其特征在于用權利要求10或權利要求12所述的表達載體在中國倉鼠卵巢細胞中表達抗體蛋白。
全文摘要
本發明提供了真核細胞表達蛋白(包含抗體)的核苷酸密碼子的優化方法。本發明還提供了核苷酸密碼子優化的抗CD20單克隆抗體的可變區DNA分子，該優化的抗CD20單克隆抗體在宿主細胞中的表達有明顯的增加。本發明還提供了優化的哺乳動物細胞表達載體。本發明還提供了使用包含核苷酸密碼子優化的抗CD20單克隆抗體DNA分子的優化的載體在CHO細胞中更高效的表達抗CD20單克隆抗體的方法。
文檔編號C12N15/13GK101058807SQ20061001200
公開日2007年10月24日 申請日期2006年5月26日 優先權日2006年5月26日
發明者謝良志 申請人:神州細胞工程有限公司