專利名稱：預測血管緊張素轉換酶抑制劑類藥物作用效果的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種通過測定血管和內皮功能調節、血管緊張素II降解通路上的重要酶基因的單核苷酸多態性(SNP)，預測含有血管緊張素轉換酶抑制劑類藥物作用效果的試劑盒。屬于醫藥領域。
背景技術：
高血壓病是我國及全球最常見的慢性疾病之一。高血壓病人全球約有6.9億人，發病率高達31.3％。流行病學研究顯示，血壓水平與心血管病發病率呈線性相關；血壓升高是腦卒中和冠心病發病的獨立危險因素。高血壓是引起危及生命的心、腦血管病如心肌梗死、腦卒中、腎臟功能不全等的主要原因。因此，有效控制血壓對防止高血壓患者心腦血管并發癥的發生具有重大的臨床意義。
腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)在機體血壓調節及高血壓發病中起著重要的作用。血管緊張素原在腎素作用下轉化成血管緊張素I，再經血管緊張素轉化酶(ACE)的作用，生成血管緊張素II，血管緊張素II可引起血管收縮、刺激醛固酮分泌，心肌肥厚，血管壁增厚等，從而導致血壓升高及促進高血壓的發生。
臨床上用于治療高血壓的藥物主要分為六類利尿劑、β-腎上腺素受體阻滯劑、α-腎上腺素受體阻滯劑、鈣拮抗劑、血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素II受體(AT1-R)拮抗劑。后兩者都是作用于RAAS系統的抗高血壓藥物。為了降低相關的病死率及致殘率，高血壓患者通常需要長期服用降壓藥物。
對血壓的認識和干預越來越完善，但是對于高血壓患者降壓治療的血壓達標率仍不滿意。雖然血壓的低控制率的原因是多方面的，如醫生對控制目標的認識不同，患者不能改變不良生活習慣，對藥物不耐受，治療依從性差，單藥治療的血壓控制率低(40％-50％)等，更重要的是，與臨床上缺乏有效的針對患者個體差異的藥物療效預測系統有關。臨床上用于預測藥物療效的方法僅僅憑借醫生的臨床經驗，這種預測方法具有明顯的滯后性及盲目性，不能給醫生選擇藥物提供準確的個體化信息。
苯那普利(benazepril)是一種非巰基血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)，目前廣泛用于降壓治療，它主要通過抑制RAAS系統中ACE酶的活性來發揮降壓藥效。但藥效存在著顯著個體差異，一般而言10mg的苯那普利約對50％的輕中度高血壓患者有效。藥物在人體內需要經過轉運(吸收、分布、排泄)和轉化(代謝)的過程才能發揮作用；藥物在體內發揮效應同樣需要一些介質的參與，如促進或抑制相應的酶的活性，激活或阻滯相應的受體等，之后再進行一系列的信號傳導，最終導致生物學效應。編碼參與上述過程的酶、受體等的基因發生突變可能導致酶活性及數量、受體功能等發生改變，從而產生不同的效應。
目前認為藥物的個體化差異是一個復雜的表型，是遺傳和環境因素共同作用的結果。已知藥物療效和副作用的個體差異與遺傳因素有關。在家系和雙生子研究中發現，約30％～60％的血壓變異是由遺傳因素造成的Lancet，1994；344169-171，并且存在小部分的單基因遺傳性高血壓。藥物反應的遺傳多態性表現為藥物代謝酶的多態性、藥物受體的多態性和藥物靶標的多態性等。這些多態性的存在可能導致許多藥物治療中藥效和不良反應的個體差異Science，2000；2871977-1978J Clin Invest，1994；94；1872-1882。
疾病相關或藥物反應相關的基因多態性，是藥物反應個體差異性的重要遺傳學基礎。藥物基因組學是利用高通量的基因組學和生物信息學的手段，分析和發現可能與疾病發病差異或藥物反應差異相關的候選因及其單核苷酸多態性(SNP)，為預測藥物反應的個體差異性提供遺傳性標志物(Genetic marker)。用以預測患者對某一種類或特定藥物可能產生的藥物反應(療效和/或毒副作用)，為臨床醫生根據個體特征選擇療效更高，毒副作用更低的更個體化的治療方案，減少可以避免的醫療費用，提供客觀參考依據。
SNP是指不同個體間在基因水平上的單核苷酸變異，平均每1000對堿基出現一個SNP，兩個無關個體間大約有300萬個SNP。SNP在個體化用藥上可謂是舉足輕重。影響藥物有效性的因素包括藥物前體因代謝而激活，藥物與靶細胞的結合能力，藥物與藥靶的結合和活性，活性藥物被代謝、降解和排出；而藥物的安全性則取決于藥物在體內的代謝、降解和排出環節以及藥物在體內的非特異性結合和活性。在這些環節上的任一處存在SNP位點基因型的個體遺傳特征差異，最終都可能表現為不同個體對同一藥物的不同反應差異(療效或副作用)，有時其差異可達數百倍。
目前發現原發性高血壓涉及到的相關基因已超過70個，不同的基因導致的藥物療效對高血壓患者有差別。多數研究集中于觀察基因多態性對降壓藥物治療引起的心血管反應的影響。例如，攜帶α-adducin基因460W等位子的高血壓患者，與應用其他類降壓藥治療相比，利尿劑治療出現心肌梗死和中風的幾率降低Lancet，1997；3491353-7。在降壓作用方面，發現一氧化氮合酶(NOE)基因多態性和利尿劑、α-adducin基因多態性和利尿劑、G蛋白α-亞型基因多態性和β-腎上腺素受體阻滯劑、ACE基因多態性和血管緊張素II受體(AT1-R)拮抗劑等都存在相互作用Drugs，2004；641801-1816。ACE插入缺失的多態性與ACEI存在相互作用，表現為不同基因型在AT1受體蛋白的mRNA表達、左心室肥大、動脈硬化等方面的差異。
脯氨酸羧肽酶(PRCP)是一種重要的血管緊張素II降解酶。由Yang HYT等于1968年首先發現。PRCP在pH等于5時，具有最佳的酶活性，當pH升高到7時酶活性只剩下最大時的20-50％。PRCP屬于絲氨酸蛋白酶家族，活性能被PMSF抑制。大量研究表明，PRCP能在內皮細胞的外膜表達。PRCP降解血管緊張素II，使得具有強烈縮血管活性的血管緊張素II轉變成具有舒血管活性的血管緊張素1-7，參與RAAS系統功能的調節。此外，PRCP還是一種獨立于XIIa之外的血漿激肽酶原激活物，能夠使得激肽酶原激活生成緩激肽。由于PRCP既能降解血管緊張素II，增加血管緊張素1-7的生成又能促進緩激肽的釋放，兩種作用都能使得NO的生成增多，進而舒張血管，起到降低血壓的作用。PRCP基因定位于人類染色體11q14區域。位于其外顯子上的一個A-C的堿基突變，導致了第112位氨基酸由谷氨酸(Glu)變成天門冬氨酸(Asp)。我們的研究發現，該多態性位點與PRCP的mRNA的表達及活性等有關。鑒于PRCP對RAAS系統和血壓的重要調節作用，該功能性單核苷酸多態性位點很有可能會影響到ACEI類藥物的療效。
高血壓患者的降壓療效與同型半胱氨酸(Hcy)通路的基因多態性有關。有研究表明亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C677T的基因多態性與ACEI類降壓藥療效有關Thrombosis Research 2004，113361-369。對于444名中國的原發性高血壓患者進行為期2周的ACEI類降壓藥物苯那普利的降壓治療，結果提示MTHFR C677T基因為TT的原發性高血壓患者與基因型為CT或者CC的患者相比較基礎血壓值明顯增高，而且對于ACEI類降壓藥物的降壓效果較好，尤其對于舒張壓的降壓效果較好。
由于藥物反應的個體差異是一個復雜表型特征，是由多種遺傳因素和多種環境因素交互作用的結果。今后根據個體患者的遺傳環境特征設計的個體化的用藥方案，需要醫生在選擇治療高血壓藥物時，能夠根據患者多種遺傳特征綜合地預期患者對特定的藥物產生的反應，選出對于相應患者個體最適的治療方案，指導醫生為患者提供個體化的醫藥服務。
發明內容
為了克服臨床選擇ACEI類藥物的盲目性，本發明為個體化用藥提供一種預測ACEI類藥物的作用效果的試劑盒，即通過測定生物樣品中調節血管和內皮功能的血管緊張素II降解通路上的脯氨酸羧肽酶(Prolylcarboxypeptidase，PRCP)基因的多態性位點基因型，預測ACEI類藥物的作用效果。在分析多態性位點基因型的基礎上，可以預測個體患者使用ACEI類藥物的有效性和安全性，指導臨床用藥，實施個體化醫療，早期有效地控制血壓，降低醫療成本。
本發明的預測苯那普利(benazepril)等血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)類藥物的作用效果的試劑盒，通過檢測生物樣品中對血管和內皮功能調節、血管緊張素II降解通路的重要酶為脯氨酸羧肽酶(PRCP)基因的多態性位點E112D(rs2298668)的基因型，預測血管緊張素轉化酶抑制劑類藥物的作用效果。本發明的預測試劑盒，還將為開發作用于脯氨酸羧肽酶的新藥實現個體化治療提供了更可靠的依據。
為實現上述發明目的，采取以下技術方案本發明的試劑盒，利用脯氨酸羧肽酶基因的E112D單核苷酸多態性位點基因型與血管緊張素轉換酶抑制劑類藥物作用效果的之間的關系，預測血管緊張素轉換酶抑制劑類藥物作用效果當基因型為112EE純合野生型時，血管緊張素轉換酶抑制劑類藥物的作用效果增強；當基因型為112ED雜合型或者112DD純合突變型時，血管緊張素轉換酶抑制劑類藥物的作用效果較差；該試劑盒包括用于檢測生物樣品中脯氨酸羧肽酶基因的E112D多態性位點基因型的多態性分型寡核苷酸，以及相應的反應體系。
本發明的試劑盒至少包括一種用于檢測生物樣品中脯氨酸羧肽酶基因的E112D多態性位點基因型的多態性分型寡核苷酸，以及，任選的，用于檢測反應的合適的緩沖體系和顯色體系，測定受檢者核酸模板的多態性位點基因型的試劑。
其中，所述的多態性分型寡核苷酸可以是(1)等位基因特異性核酸引物，用于擴增含有所述多態性位點的脯氨酸羧肽酶基因片斷；和/或(2)用于檢測脯氨酸羧肽酶基因的多態性位點基因型的寡核苷酸探針，其能特異地與含有脯氨酸羧肽酶基因的多態性位點的核酸雜交，優選地，寡核苷酸探針的長度為15-50個核苷酸。
具體而言，按照上述技術方案設計的試劑盒主要有兩種(一)基于核酸限制性內切酶能夠識別并切割特異性位點原理設計的試劑盒，包括用于擴增含E112D多態性位點的脯氨酸羧肽酶基因片斷的特異性引物，能夠特異性識別并切斷所述位點處的野生型序列或突變型序列的限制性內切酶及其緩沖液。
上述引物序列可以是正向引物5’ATGGTTTGCCAAAAGGTTCA 3’(SEQ ID No.1)反向引物5’TGTCACCAAAGGGGAGAGAC 3’(SEQ ID No.2)上述限制性內切酶優選AVaII，其識別片斷為G/GWCC其中W為A或T。
利用上述試劑盒預測血管緊張素轉換酶抑制劑類藥物作用效果的步驟包括(a)從取自受檢者的生物樣品中提取核酸模板；(b)用PCR方法擴增PRCP基因上的特異片斷；(c)用限制性內切酶對PCR產物進行酶切；(d)同時用陽性對照模板進行(b)(c)步驟；(e)電泳分離酶切產物，根據陽性模板的帶型特點鑒定并且判斷結果。
(二)基于核酸雜交原理的試劑盒，包括用于擴增含E112D多態性位點的脯氨酸羧肽酶基因片斷的特異性引物，檢測脯氨酸羧肽酶基因E112D多態性位點的野生型探針和/或突變型探針。
上述引物可以是正向引物5’GTTTGCCAAAAGGTTCAGTGACTT 3’(SEQ ID No.3)反向引物5’TCTCCATAGTATCGATGTTCAGCAAAC 3’(SEQ ID No.4)上述探針優選Taqman探針，如VIC-5’CATAGCTTTCAGTTCCTCA 3’-NFQ(SEQ ID No.5)對應于“T(或Glu)”等位基因，攜帶VIC熒光報告集團。
FAM-5’ATAGCTTTCAGGTCCTCA 3’-NFQ(SEQ ID No.6)對應于“G(或Asp)”等位基因，攜帶FAM熒光報告集團。
利用上述試劑盒預測血管緊張素轉換酶抑制劑類藥物作用效果的檢測步驟，包括(a)從取自受檢者的生物樣品中提取核酸模板；(b)用Taqman方法擴增PRCP基因上的特異片斷；(c)鑒定并判斷結果。
為了方便使用，這兩種試劑盒還可以進一步包括核酸提取試劑、PCR反應試劑(含有四種脫氧單核苷酸、耐熱DNA聚合酶及其反應緩沖液)和陽性對照模板。
其中，核酸提取試劑用于提取來自受試者的生物樣品中的核酸模板。所述的生物樣品選自血液樣品、體液樣品、組織樣品、組織樣分泌物、排泄物樣本和培養細胞，優選的，所述樣品為血液樣品。其中血液樣品包括外周血細胞、白細胞、血清等，體液樣品包括尿液、唾液、組織液、腦脊液、體腔滲出液等，組織樣品包括口腔粘膜試子、毛發、皮膚、活檢組織等。
以含有脯氨酸羧肽酶基因E112D多態性位點的核酸作為陽性對照模板。所述陽性對照模板包括含有脯氨酸羧肽酶基因E112D多態性位點的純合野生型、雜合型和純合突變型序列的PCR產物、克隆核酸、克隆質粒、直接合成的核酸序列或基因組DNA。
此外，本發明的試劑盒還可以是一種基因芯片，其中包含本發明所述的用于測定血管和內皮功能調節、血管緊張素II降解通路上的關鍵酶基因PRCP基因的多態性位點基因型的多態性分型寡核苷酸。優選的，所述基因芯片是DNA芯片的形式。
在本發明的試劑盒中，所述脯氨酸羧肽酶基因的多態性位點E112D的基因型還可以通過該多態性位點附近與之存在連鎖不平衡的其它多態性位點的基因型來確定，所述的其它多態性位點包括無義突變位點、錯義突變位點以及位于基因內含子部位、基因調節部位的多態性位點。
常見的單核苷酸多態性(SNP)位點可以位于基因的外顯子部位、內含子部位和非編碼區部位，優選為外顯子部位，尤其是能改變編碼的氨基酸序列的多態性位點。
在本發明中，所述的血管緊張素轉換酶抑制劑類藥物的作用效果除了降壓作用還涉及因降壓導致的靶器官保護作用，包括腎臟功能保護，預防PTCA術后再狹窄以及預防動脈硬化、冠狀動脈硬化性心臟病、心絞痛、心肌梗死、心力衰竭、外周血管疾病、腦出血、腦梗塞、腔隙性腦梗塞、視網膜動脈硬化等并發癥。
在本發明的實施方案中，所述藥物為含有ACEI的藥物，所述待預測的藥物及其組合物的作用效果包括降低血壓的作用效果。具體的，ACEI類藥物主要通過影響腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)而起到調節血壓的作用效果。ACEI通過與血管緊張素I轉換酶結合，抑制血管緊張素轉化酶(ACE)的活性，以此達到抑制血管緊張素II的生成，減少醛固酮的分泌；另外，限制緩激肽的降解，進而激活一氧化氮合成酶，保護血管內皮細胞功能，降低交感神經引發的血管壁張力，最終實現血壓調節作用效果。用于本發明所述含有的ACEI類藥物選自苯那普利(benazepril)、卡托普利(captopril)、依那普利(enalapail)、西拉普利(cilazapril)、培哚普利(perindopril)、地拉普利(delapril)、喹那普利(quinapril)、賴諾普利(lisinopril)、雷米普利(ramipril)、咪達普利(imidapril)、佐芬普利(zofenopril)、群多普利(trandolapril)、和福辛普利(fosinopril)等。其中依那普利、苯那普利和賴諾普利是ACEI類藥物中常用的、具有代表性的藥物。優選為依那普利、苯那普利、賴諾普利或福辛普利。
本發明所述的試劑盒中，所述的PRCP E112D(rs2298668)多態性位點和包括苯納普利在內的ACEI藥物的降壓療效發生有關，具有顯著預測效果。具體的，當(1)所述PRCP多態性位點基因型為112ED雜合突變基因或者多態性位點基因型為112DD純合突變型時，預測上述含有ACEI類藥物的藥物組合物降低血壓作用效果弱；(2)所述PRCP多態性位點基因型為112EE純合野生型時，預測上述藥物組合物降低血壓的作用效果增強。
本發明預測ACEI藥物作用效果的試劑盒，具體實施可包括以下步驟1)利用上述多態性分型寡核苷酸試劑盒檢測來自個體的生物樣品中所述關鍵酶基因的多態性位點基因型；2)建立含有檢測樣品PRCP多態性位點基因型的預測模型；3)根據所述多態性位點基因型預測AECI藥物的作用效果。
在本發明所述的試劑盒中，可用于預測含有AECI藥物的作用效果的多態性位點至少包含上述PRCP的E112D(rs2298668)多態性位點，還可以進一步包含同一基因上與之存在連鎖不平衡的其他多態性位點來確定，這樣的多態性位點包括無義突變位點、錯義突變位點以及位于基因內含子部位、基因調節部位的多態性位點及其位點。
本發明的試劑盒可以基于以下的差異核酸分析技術來測定所述多態性位點的基因型聚合酶鏈反應(PCR)、聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)、PCR-等位基因特異性寡核苷酸探針法、PCR-序列特異寡核苷酸法、測序法、PCR-序列特異性引物法、PCR-熒光法、PCR指紋圖法、寡核苷酸連接分析、熒光能量共振轉移的檢測法、生物芯片、核酸芯片、質譜技術、基因掃描、單鏈構象多態性、變性梯度凝膠電泳、酶或化學錯配切割法、Taqman生物檢測方法。其中優選的檢測方法為PCR、PCR-RFLP、Taqman技術、生物芯片、核酸芯片或者試劑盒。
試劑盒常用的檢測方法包括PCR、PCR-RFLP、生物芯片、測序法、Teqman基因掃描技術，都是本領域技術人員常規使用的方法。Taqman技術是一種運用熒光技術進行實時定量PCR的方法。生物芯片是指采用廣島原位合成或微量點樣等方法，將大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細胞等生物樣品有序地固化于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體)的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器如激光共聚焦掃描儀或電荷偶聯攝影相機(CCD)對雜交信號的強度進行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數量或質量。
本發明對于位點基因型的預測試劑盒所用檢測方法的說明，并非是對于檢測方法的限定，任何本領域技術人員采用常規的生物技術方法通過檢測本發明的多態性位點基因型來預測以含有ACEI類藥物的降壓藥物的作用效果為核心的其他風險均屬于本發明內容，還可以進一步包括采用常規的生物技術方法通過檢測本發明的多態性位點功能型基因型的轉錄產物和/或者表達產物的差異間接反映相關聯的多態性位點來預測含有ACEI類藥物的作用效果的事例。
本發明提到的試劑盒至少包括測定PRCP基因的E112D或多個以上的多態性位點，還可以進一步包括測定上述的PRCP的其他多態性位點中的一個或者一個以上的多態性位點，也包括上述多態性位點的不同的排列組合，該試劑盒用于預測ACEI類藥物的降壓作用的效果。所述試劑盒除了包含測定上述多態性位點所需要的特定引物或者探針之外，還包含運用PCR擴增而進行檢測的試劑盒的常規組件、試劑、緩沖液等，或者包含運用芯片、微檢測系統等方法進行檢測的試劑盒的常規組件、試劑、緩沖液等，本領域技術人員熟悉這些常規組件和檢測方法。
基于PRCP基因，針對其不同的多態性位點，可以設計并且獲得各種診斷劑和試劑盒以用于預測ACEI類藥物的降壓作用的效果。基于本發明的預測方法和用途獲得的各種診斷劑和試劑盒也屬于本發明范圍。
本發明中的“試劑盒”不限于試劑盒的固有形式，可以表現為微芯片、微檢測系統或者依賴于各種載體的檢測系統，以及包括前述檢測系統的統一包裝形式，如微孔板系統、紙質載體、玻璃載體、尼龍膜載體，塑料載體、硅膠載體、凝膠載體、膜質載體等。
具體的，PRCP的多態性位點基因型檢測預測試劑盒主要通過檢測PRCP的多態性位點基因型，通過把檢測結果加入含有PRCP多態性位點基因型的預測模型分析，最終為開展預測ACEI的降壓療效，指導醫生根據患者個體特點選擇治療方案，提供療效控制不良反應提供客觀依據。
常見的單核苷酸多態性(SNP)位點可以位于基因的外顯子部位、內含子部位和非編碼區部位，優選為外顯子部位，尤其是能改變編碼的氨基酸序列的多態性位點。
本發明涉及的研究發現脯氨酸羧肽酶(Prolylcarboxypeptidase，PRCP)是一種重要的血管緊張素II降解酶。由Yang HYT等于1968年首先發現。PRCP在pH等于5時，具有最佳的酶活性，當pH升高到7時酶活性只剩下最大時的20-50％。PRCP屬于絲氨酸蛋白酶家族，活性能被苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制。大量研究表明，PRCP能在內皮細胞的外膜表達。PRCP是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)和激肽-緩激肽系統(KKS)之間的調節劑，是血管和內皮功能的另一種重要的調節系統。PRCP降解血管緊張素II，使得具有強烈縮血管活性的血管緊張素II轉變成具有舒血管活性的血管緊張素1-7，參與RAAS系統功能的調節。此外，PRCP還是一種獨立于XIIa之外的血漿激肽酶原激活物，能夠使得激肽酶原激活生成緩激肽。由于PRCP既能降解血管緊張素II，增加血管緊張素1-7的生成又能促進緩激肽的釋放，兩種作用都能使得NO的生成增多，進而舒張血管，起到降低血壓的作用。
脯氨酸羧肽酶(PRCP)基因于1993年被克隆，定位于人類11號常染色體的長臂上(11q14)，編碼一種溶酶體酶，作用是酶切如血管緊張素II、血管緊張素III和緩激肽等肽類與脯氨酸連接的C末端氨基酸。位于其外顯子上的一個A-C的堿基突變，導致了第112位氨基酸由谷氨酸(Glu)變成天門冬氨酸(Asp)。我們研究發現，該多態性位點與PRCP的mRNA的表達及活性等有關。鑒于PRCP對RAAS系統和血壓的重要調節作用，該功能性單核苷酸多態性位點很有可能會影響到ACEI類藥物的藥物作用。但與ACEI類藥物降壓作用的關系及其預測方法、試劑盒尚無文獻報道。
本發明發現并證明PRCP基因E112D(Glu112Asp)多態性或與其存在連鎖關系的其它基因多態性可以用于預測苯那普利等ACEI類藥物的降壓效果及研制預測試劑盒；本發明所述預測方法中，PRCP E112D(rs2298668)多態性位點和包括苯納普利在內的含有ACEI類藥物的藥物的降壓療效有關，具有顯著預測效果。具體的，當(1)所述PRCP多態性位點基因型為112ED雜合突變基因或者多態性位點基因型為112DD純合突變型時，預測上述含有ACEI類藥物的藥物組合物降低血壓作用效果弱；(2)所述PRCP多態性位點基因型為112EE純合野生型時，預測上述藥物組合物降低血壓的作用效果增強。
本發明發現并證明在高血壓的患者中(表1)，PRCP 112DD純合突變型和112ED雜合型的降壓幅度比112EE純合野生型患者降壓幅度顯著減弱，收縮壓降低幅度差異更大。經過矯正調整了年齡、地域、性別、職業、煙酒嗜好、教育程度、基線血壓和BMI等因素后，發現PRCP 112DD純合突變型基因型和112ED雜合型比PRCP 112EE純合野生型基因型的收縮壓的血壓下降值少8.61mmHg(95％CI4.51-10.71mmHg，p＜0.001)；舒張壓的血壓下降特征與收縮壓具有同樣趨勢，下降值少6.10mmHg(95％CI4.60-7.60mmHg，p＜0.001)。結果提示脯氨酸羧肽酶基因(PRCP)的E112D(Glu112Asp)多態性與苯那普利的降壓效果有關，攜帶112D(112Asp)等位基因的個體對苯那普利的反應差，血壓下降幅度小。舒張壓下降的幅度比收縮壓的更小。這一結果在兩個不同地區的人群中相互得到了有力證實(表2)。
因此，PRCP基因E112D(Glu112Asp)多態性或與其附近的存在連鎖關系的其它基因多態性可以用于預測苯那普利等ACEI類藥物的作用效果及研制預測試劑盒；上述結果也為開發作用于脯氨酸羧肽酶的新藥提供了依據。為臨床醫生更科學地為患者提供個體化的用藥方案，預測和把握藥物作用，提高ACEI類藥物的有效性提供客觀依據。
圖1是實施例1檢測PRCP基因的E112D多態性位點基因型的凝膠電泳圖。
圖2是實施例2檢測PRCP基因的E112D多態性位點基因型的熒光圖譜。
其中1——167bp片斷；2——101bp片斷；3——66bp片斷；4——發出FAM熒光區域； 5——發出兩種熒光區域；6——發出VIC熒光區域。
具體實施例方式
實施例1試劑盒(1)及其實施方法(以PCR-RFLP檢測方法為基礎)一種預測AECI藥物的降壓作用效果的試劑盒，由以下組分組成(1)紅細胞裂解液NH4Cl，KHCO3，EDTA；(2)白細胞裂解液蛋白酶K、RNase A、NaCl、Tris、EDTA、SDS；(3)蛋白沉淀液7.5M乙酸胺(pH7.4)(4)核酸儲存液1M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl，pH8.0)；(5)PCR反應混合液1.0ml[100mM Tris-HCl，100mM KCl，pH8.3(20℃)]；5.0μMMgCl2；各0.4mM dATP，dCTP，dGTP，dTTP，無菌雙蒸水配制，pH7.0；PRCP基因的多態性位點基因型檢測引物；(6)Taq DNA聚合酶(5U/μl)保存緩沖液20mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％NP40，0.5％(v/v)Tween 20，50％甘油；(7)陽性質粒含有PRCP基因的多態性位點雜合基因型個體全血標本，或者含有PRCP基因的多態性位點雜合基因型的質粒；(8)陰性對照經DNAase I處理的雙蒸水；(9)內切酶緩沖體系(10×)；(10)限制性內切酶；(11)PCR用水；(12)10×電泳上樣緩沖液0.25％溴酚蘭，40％(w/v)蔗糖水溶液。
利用上述試劑盒測定PRCP基因的E112D(rs2298668)多態性位點基因型(PCR-RFLP法)(1)提取宿主細胞的基因組DNA按照常規的分子生物學方法操作。
(a)在全血中加入30ml紅細胞裂解液，緩慢搖勻，室溫靜置10分鐘，期間，搖動數次，徹底裂解紅細胞；(b)于4℃、2000轉離心/分，10分鐘，去上清，將沉淀之白細胞在旋轉震蕩器上打散，加蛋白酶40μl、RNA酶50μl，搖勻，加白細胞裂解液置15ml，混勻37℃水浴20分鐘后取出，置冷水中；(c)加冷的蛋白沉淀液4ml，混勻后放在-20℃冰箱5分鐘，取出于4℃、3000轉/分離心10分鐘。將上清液倒入已加好15ml異丙醇的50ml離心管中緩慢搖動數次，至DNA絮狀物析出；(d)將析出的DNA絮狀物移至另一1.5ml已裝入75％乙醇的濾紙上，使液體揮發干。
(e)加DNA水化液1.5ml，置搖床，搖動過夜，備用；(f)DNA濃度的測定采用紫外分光光度法，分別測定260nm及280nm兩個波長下的OD值，以OD260nm×50所得值為DNA濃度。并以OD260nm/OD280nm比值估計DNA純度；(2)使用PCR和限制性酶切片段長度多態性分析方法(PCR-RFLP)檢測PRCPE112D多態性位點根據PRCP E112D基因序列設計PCR特異性引物，包括PCR正向引物和PCR反向引物，按如下條件進行常規PCR擴增。
引物序列正向引物5’ATGGTTTGCCAAAAGGTTCA 3’(SEQ ID No.1)反向引物5’TGTCACCAAAGGGGAGAGAC 3’(SEQ ID No.2)PCR反應體系基因組DNA 15ng/μl，上下游引物10pmol(20μmol/L)，dNTPs 1.25mmol/l，10×buffer 1.0μl，Gold Taq DNA聚合酶3U，dH2O補足總體積至6.55μl。
PCR反應條件94℃預變性3min后；94℃變性45sec，62℃退火45sec，72℃延伸1sec，38個循環周期；最后72℃延伸7min。；得到167bp的擴增片段。
酶切條件及體系(15μl)PRCP E112D位點PCR產物目的片段長度為167bp，總的酶切體系為15μl，其中PCR產物10μl，10×NEBuffer#2 1.5μl，AVaII內切酶4U(0.4μl)，和3.1μl ddH2O，37℃過夜。
基因型結果判定將DNA酶切后的產物點樣在2.5％瓊脂糖膠上，37℃酶切過夜后，在紫外燈下讀取膠圖(如圖1所示)并進行基因型分析。個體基因型鑒定如下酶切片段為167bp，PRCP基因型為112EE(野生型)；酶切片段為167+101+66bp，PRCP基因型為112ED(雜合子)；酶切片段為101+66bp，PRCP基因型為112DD(純合子)。
實施例2試劑盒(2)及其實施方法(以Taqman方法為基礎)一種預測妊娠先兆子癇風險的試劑盒，由以下組分組成(1)紅細胞裂解液含有NH4Cl，KHCO3，EDTA；(2)白細胞裂解液含有蛋白酶K、RNase A、NaCl、Tris、EDTA、SDS；(3)蛋白沉淀液7.5M乙酸胺(pH7.4)(4)核酸儲存液1M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl，pH8.0)；(5)PCR反應混合液Taq DNA聚合酶及其反應緩沖液；各0.4mM dATP，dCTP，dGTP，dTTP；(6)PRCP基因的多態性位點基因型檢測引物和Taqman探針；(7)陽性質粒含有PRCP基因的多態性位點雜合基因型個體全血標本，或者含有PRCP基因的多態性位點雜合基因型的質粒；(8)陰性對照經DNAase I處理的雙蒸水；(9)PCR用水。
利用上述試劑盒測定PRCP基因的E112D(rs2298668)多態性位點基因型(一)測定PRCP基因的E112D(rs2298668)多態性位點基因型(Taqman法)(1)在標準的操作方法和操作規程上采用同實施例1中所述的常規方法提取宿主細胞的基因組DNA(2)使用Taqman方法檢測PRCP基因的Glu112Asp(E112D)多態性位點基因型(a)用PCR儀擴增PRCP功能基因多態位點及其側翼序列，在5μl PCR反應體系中含有基因組DNA 10ng，2.5μl的Taqman 2X Universal PCR Master Mix NoAmpERAASe UNG(組成成份包括AmpliTaq Gold DNA PolymeRAASe，dNTPs withDutp，Passive Reference，以優化的緩沖液)，及0.90μM的正向引物，0.90μM的反向引物及兩段帶熒光報告集團的等位基因特異性探針各0.25μM。
引物序列為正向引物5’GTTTGCCAAAAGGTTCAGTGACTT 3’(SEQ ID No.3)反向引物5’TCTCCATAGTATCGATGTTCAGCAAAC3’(SEQ ID No.4)等位基因特異性探針的序列為VIC-5’CATAGCTTTCAGTTCCTCA 3’-NFQ(SEQ ID No.5)對應于“T(或Glu)”等位基因，攜帶VIC熒光報告集團。
FAM-5’ATAGCTTTCAGGTCCTCA 3’-NFQ(SEQ ID No.6)對應于“G(或Asp)”等位基因，攜帶FAM熒光報告集團。
PCR反應條件95℃10min，1個循環；92℃15s，60℃1min，50個循環。
(b)在ABI Primer 7900型熒光定量PCR儀上檢測熒光信息進行基因型的鑒定將完成PCR反應的PCR板放入7900型熒光定量PCR儀上，選用SDS 2.1軟件中“Allelic Discrimination”程序，進行掃描與結果的判斷(如圖2所示)發出FAM熒光者的基因型為Asp/Asp純合子；發出VIC熒光者的基因型為Glu/Glu純合子；發出兩種熒光者的基因型為Asp/Glu雜合子。
實施例3.苯那普利的降壓療效與PRCP E112D多態性的相關分析在高血壓的患者中，PRCP 112DD純合突變型和112ED雜合型的降壓幅度比112EE純合野生型患者降壓幅度顯著減弱，收縮壓降低幅度差異更大(表1)。經過矯正調整了年齡、地域、性別、職業、煙酒嗜好、教育程度、基線血壓和BMI等因素后，發現PRCP 112DD純合突變型基因型和112ED雜合型比PRCP 112EE純合野生型基因型的收縮壓的血壓下降值少8.61mmHg(95％CI4.51-10.71mmHg，p＜0.001)；舒張壓的血壓下降特征與收縮壓具有同樣趨勢，下降值少6.10mmHg(95％CI4.60-7.60mmHg，p＜0.001)。結果提示脯氨酸羧肽酶基因(PRCP)的E112D(Glu112Asp)多態性與苯那普利的降壓效果有關，攜帶112D(112Asp)等位基因的個體對苯那普利的反應差，血壓下降幅度小。舒張壓下降的幅度比收縮壓的更小。這一結果在兩個不同地區的人群中相互得到了有力證實(表2)。
表1.PRCP基因E112D多態性基因型和苯納普利降壓療效的相關分析
注(1)調整變量為Age，Age2，County，Gender，Occupation，Drinking and Smoking Status，Education，Baseline SBP and DBP，Body Mass Index.(2)EE代表純合野生型；ED代表雜合型；DD代表純合突變型。
這一趨勢在兩個不同地區的人群中相互得到了有力證實(表2)。
因此，PRCP基因E112D(Glu112Asp)多態性或與其存在連鎖關系的其它基因多態性可以用于預測苯那普利等ACEI類藥物的降壓效果及研制預測試劑盒；本發明所述的預測試劑盒，PRCP E112D(rs2298668)多態性位點和包括苯納普利在內的含有ACEI類藥物的藥物的降壓療效有關，具有顯著預測效果。具體的，當(1)所述PRCP多態性位點基因型為112ED雜合突變基因或者多態性位點基因型為112DD純合突變型時，預測上述含有ACEI類藥物的藥物組合物降低血壓作用效果弱；(2)所述PRCP多態性位點基因型為112EE純合野生型時，預測上述藥物組合物降低血壓的作用效果增強。
上述結果也為開發作用于脯氨酸羧肽酶的新藥提供了依據。為臨床醫生更科學地為患者提供個體化的用藥方案，提高含ACEI類藥物的降壓藥物的有效性提高了客觀依據。
表2、兩研究地區PRCP基因E112D多態性基因型和苯納普利降壓療效分析比較
注(1)調整變量為Age，Age2，County，Gender，Occupation，Drinking and Smoking Status，Education，Baseline SBP and DBP，Body Mass Index.(2)EE代表純合野生型；ED代表雜合型；DD代表純合突變型。
實施例4.通過測定個體基因型參數及其他生理參數預測含有ACEI類藥物作用效果1、獲得如本實施例相似的數據資料結果，即PRCP E112D多態性位點基因型參數和基本生理參數年齡、性別、吸煙史、飲酒史、職業、教育程度、基礎收縮壓、基礎舒張壓和體重指數。
2、根據多元線性回歸分析，得到用來預測含有ACEI類藥物的作用效果的預測模型。
預測方程分別為降壓療效的預測方程(1)舒張壓下降幅度的預測方程Δdbp＝C1+a1×112DD+b1×112ED-c1×年齡+d1×BMI+e1×性別-f1×飲酒史+g1×吸煙史+h1×職業+j1×教育程度+k1×基礎舒張壓Δdbp為治療后的舒張壓的下降值。
(2)收縮壓下降幅度的預測方程Δsbp＝C2+a2×112DD+b2×112ED-c2×年齡+d2×BMI+e2×性別-f2×飲酒史+g2×吸煙史+h2×職業+j2×教育程度+k2×基礎收縮壓Δsbp為治療后的收縮壓的下降值。
以上步驟中的基因型參數值的取值方式如下按照測定的PRCP基因型多態性位點的基因型取值。當個體的基因型為DD純合突變型時，預測方程中112DD基因型參數取值為1，112ED基因型參數取值為0；當個體的基因型為112ED雜合型時，預測方程中112DD基因型參數取值為0，112ED基因型參數取值為1；當個體的基因型為EE純合野生型時，預測方程中112DD基因型參數取值為0，112ED基因型參數取值為0。
以上步驟中的基本生理參數值的取值方式如下年齡參數取實際年齡數值，單位為歲；BMI(體重指數)參數為體重(公斤)/身高(米)2(kg/m2)；性別參數為男性取0，女性取1；飲酒史參數為從不飲酒取0，曾經飲酒或者現在飲酒取1；吸煙史參數為從不吸煙取0，曾經吸煙或者現在吸煙取1；身高參數取實際身高值，單位為厘米(cm)；體重參數取實際體重值，單位為公斤(kg)；職業參數為農民取0，非農民取1；教育程度參數為中等以上教育程度取0，其他為1；基礎收縮壓參數為實際基礎收縮壓值，單位為毫米汞柱(mmHg)。
實施例5預測ACEI的降壓療效采用病例-對照研究方法，對高血壓患者根據其位點基因型檢測結果，預測其服用ACEI類藥物后血壓下降達到衛生部標準的比例，其隨訪結果歸納如表3表3.PRCP基因E112D多態性位點基因型對降壓療效預測作用
注(1)依據中國衛生部標準，定義“有效”為服用后dbp下降＞10mmHg或dbp降至＜90mmHg或sbp下降＞＝30mmHg；定義“無效”為服用后血壓仍為異常，且下降幅度不滿足dbp下降＞10mmHg和dbp降至＜90mmHg和sbp下降＞＝30mmHg中的任何一個標準。(2)EE代表純合野生型；ED代表雜合型；DD代表純合突變型。(3)敏感性＝149/180*100％＝83％；特異性＝50/239*100％＝21％；陽性預告值(PV+)＝149/338*100％＝44％；陰性預告值PV-＝50/81*100％＝62％。(4)*卡方值＝4.691，p＝0.030。
上述結果表明純合野生型112EE位點基因型的患者中，服用ACEI類藥物后降壓達到有效的比例較高，而雜合型112ED位點基因型和純合突變型112DD位點基因型患者降壓有效的比例較低，，這與本發明方法的預測結果一致。
序列表(SEQUENCE LISTING)<110>安徽省生物醫學研究所<120>預測血管緊張素轉換酶抑制劑類藥物作用效果的試劑盒<130>JSP060103<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1atggtttgcc aaaaggttca 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2tgtcaccaaa ggggagagac 20<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>3gtttgccaaa aggttcagtg actt 24<210>4<211>27
<212>DNA<213>人工序列<400>4tctccatagt atcgatgttc agcaaac 27<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>5catagctttc agttcctca 19<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>6atagctttca ggtcctca18
權利要求
1.一種用于預測血管緊張素轉換酶抑制劑類藥物作用效果的試劑盒，利用脯氨酸羧肽酶基因的E112D單核苷酸多態性位點基因型與血管緊張素轉換酶抑制劑類藥物作用效果的之間的關系，預測血管緊張素轉換酶抑制劑類藥物作用效果當基因型為112EE純合野生型時，血管緊張素轉換酶抑制劑類藥物的作用效果增強；當基因型為112ED雜合型或者112DD純合突變型時，血管緊張素轉換酶抑制劑類藥物的作用效果較差；該試劑盒包括用于檢測生物樣品中脯氨酸羧肽酶基因的E112D多態性位點基因型的多態性分型寡核苷酸，以及相應的反應體系。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的多態性分型寡核苷酸是(1)等位基因特異性核酸引物，用于擴增含有所述多態性位點的脯氨酸羧肽酶基因片斷，和/或(2)用于檢測所述脯氨酸羧肽酶基因的多態性位點基因型的寡核苷酸探針，其能特異地與含有所述脯氨酸羧肽酶基因的多態性位點的核酸雜交。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述寡核苷酸探針的長度為15-50個核苷酸。
4.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括用于擴增含E112D多態性位點的脯氨酸羧肽酶基因片斷的特異性引物，能夠特異性識別并切斷所述位點處的野生型序列或突變型序列的限制性內切酶及其緩沖液。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述特異性引物序列為正向引物5’ATGGTTTGCCAAAAGGTTCA 3’，反向引物5’TGTCACCAAAGGGGAGAGAC 3’。
6.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述限制性內切酶為AVaII。
7.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括用于擴增含E112D多態性位點的脯氨酸羧肽酶基因片斷的特異性引物，檢測脯氨酸羧肽酶基因E112D多態性位點的野生型探針和/或突變型探針。
8.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述特異性引物序列為正向引物5’GTTTGCCAAAAGGTTCAGTGACTT 3’，反向引物5’TCTCCATAGTATCGATGTTCAGCAAAC 3’；
9.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述探針為Taqman探針，其序列為VIC-5’CATAGCTTTCAGTTCCTCA 3’-NFQ對應于“T”等位基因，攜帶VIC熒光報告集團，FAM-5’ATAGCTTTCAGGTCCTCA 3’-NFQ對應于“G”等位基因，攜帶FAM熒光報告集團。
10.如權利要求4或7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進一步包括核酸提取試劑、PCR反應試劑和/或陽性對照模板。
11.如權利要求10所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應試劑含有四種脫氧單核苷酸、耐熱DNA聚合酶及其反應緩沖液。
12.如權利要求10所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對照模板包括含有脯氨酸羧肽酶基因E112D多態性位點的純合野生型、雜合型和/或純合突變型序列的PCR產物、克隆核酸、克隆質粒、直接合成的核酸序列或基因組DNA。
13.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述血管緊張素轉換酶抑制劑類藥物選自苯那普利、卡托普利、依那普利、西拉普利、培哚普利、地拉普利、喹那普利、賴諾普利、雷米普利、咪達普利、佐芬普利、群多普利、和福辛普利。
全文摘要
本發明提供了一種試劑盒，利用血管和內皮功能調節通路上的重要酶脯氨酸羧肽酶基因的單核苷酸多態性位點E112D基因型與ACEI類藥物作用效果之間的關系，來預測含有ACEI類藥物作用效果當基因型為112EE純合野生型時，ACEI類藥物作用效果較好；當基因型為112ED雜合型或者112DD純合突變型時，ACEI類藥物作用效果較差。該試劑盒含有用于檢測生物樣品中脯氨酸羧肽酶基因的E112D多態性位點基因型的多態性分型寡核苷酸，以及相關試劑。本發明可指導醫生實施預測用藥，根據個體差異進行選擇，提高了臨床用藥的有效性與安全性。同時研究結果也為開發作用于PRCP用于治療高血壓新藥的個體化應用提供了依據。
文檔編號C12Q1/68GK101063166SQ200610011839
公開日2007年10月31日 申請日期2006年4月30日 優先權日2006年4月30日
發明者邢厚恂, 張巖, 王濱燕, 李志平, 吳滌, 臧桐華, 徐希平 申請人:安徽省生物醫學研究所