專利名稱：一種重組流感病毒及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域中一種重組流感病毒及其制備方法與應(yīng)用，特別是涉及一種多質(zhì)粒系統(tǒng)拯救的重組流感病毒及其制備方法與以該重組流感病毒為流感減毒活疫苗的活性成分。
背景技術(shù)：
流感是一種由流感病毒引起的急性發(fā)熱性呼吸道傳染病，可引起嚴(yán)重的并發(fā)癥。流感病毒的抗原不斷發(fā)生變化，具有較強(qiáng)的傳染性，經(jīng)常造成大范圍流行。在正常的流行季節(jié)，全球約10％的人口即6億多人患流感，目前還未找到十分理想的防治藥物，接種流感疫苗仍是當(dāng)今預(yù)防流感的有效手段。給健康人群接種流感疫苗，70-80％的人會起到預(yù)防發(fā)病的效果(當(dāng)傳播的病毒毒株與疫苗采用毒株相同時)，更重要的是，給高危人群接種疫苗可以明顯降低流感的發(fā)生，減少住院及死亡率，所以研制高效、安全的新一代流感疫苗對預(yù)防流感發(fā)生具有重要意義。目前主要使用流感滅活三價全病毒疫苗、流感三價裂解病毒疫苗和亞單位疫苗，及流感三價減毒活疫苗投放市場。但流感三價滅活全病毒疫苗、裂解流感疫苗和亞單位疫苗注射免疫不能誘發(fā)有效的細(xì)胞免疫，經(jīng)鼻或口服免疫必須高濃度劑量免疫才能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其效果遠(yuǎn)不及減毒疫苗的免疫保護(hù)效果。應(yīng)用于臨床的流感病毒冷適應(yīng)性減毒活疫苗采用鼻通道免疫途徑，其抗原的制備通過重配技術(shù)，將每年相應(yīng)的甲乙型流感病毒流行株的HA、NA基因整合到減毒的冷適應(yīng)性的宿主病毒中，這種制備方法費(fèi)時、費(fèi)力。另外，減毒活疫苗存在毒力恢復(fù)的問題。發(fā)展起來的多質(zhì)粒拯救系統(tǒng)針對流感病毒這一特點(diǎn)，利用反義遺傳學(xué)的方法，可針對當(dāng)年流行的病毒株快速制備有效的流感病毒減毒疫苗，制備快速、省力、相對安全，為新一代流感減毒活疫苗的研制提供新的思路和方法。
流感病毒屬于正粘病毒科，其基因組為單股負(fù)義RNA，分為八個片段，胞質(zhì)連接蛋白與脂膜相連。A型流感病毒的基因組最少包括七個多肽，片段1-3編碼了RNA依賴的RNA多聚酶。片段1編碼多聚酶復(fù)合體蛋白PB2。片段2、3編碼多聚酶剩余部分蛋白PB1和PA。另外，有些流感病毒的流行株還編碼一種小的蛋白，PB1-F2由PB1讀碼框中的一段編碼。片段4編碼血凝素HA，它是一種與病毒附著感染有關(guān)的表面糖蛋白。片段5編碼核蛋白NP，是病毒RNA的主要結(jié)構(gòu)部分。片段6編碼神經(jīng)氨酸酶NA，是一種包膜蛋白。片段7編碼兩種胞質(zhì)結(jié)合蛋白M1和M2，由兩段不同拼接的mRNA翻譯而來。片段8編碼兩種非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2，也是由不同變異的mRNA拼接體翻譯過來的。B型流感病毒的8個基因片段編碼了11種蛋白，最大的基因片段編碼了RNA多聚酶的成分，PB1、PB2、PA。片段4編碼蛋白HA。片段5編碼NP。片段6編碼NA、NB蛋白，這兩種蛋白是由biscistronicmRNA重疊的讀碼框編譯。片段7也編碼兩種蛋白，分別是M1、BM2。B型流感病毒最小的片段編碼兩種蛋白，NS1是由全長的RNA翻譯而來，NS2是由變異拼接后的mRNA翻譯而來。
正因為流感病毒的基因組是負(fù)義RNA，因而不具有感染性，各個RNA片段必須與聚合酶蛋白(PB2、PB1、PA，統(tǒng)稱為P蛋白)及核蛋白(NP)結(jié)合在一起形成核糖核蛋白復(fù)合物即RNPs才有活性。流感病毒感染時，首先與宿主細(xì)胞表面的特異性HA受體結(jié)合，通過融膜進(jìn)入細(xì)胞后釋放出RNPs，RNPs進(jìn)入細(xì)胞核才開始病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，每個RNA片段單獨(dú)組成一個轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄出mRNA和互補(bǔ)RNA(cRNA)，mRNA翻譯合成病毒蛋白，cRNA復(fù)制生成病毒負(fù)鏈子代RNA，進(jìn)而在細(xì)胞漿中組裝成完整的病毒粒子。
由于流感病毒的兩個表面抗原血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)經(jīng)常發(fā)生抗原漂移和轉(zhuǎn)換，流感病毒變異現(xiàn)象時有發(fā)生，這也是現(xiàn)有疫苗無法應(yīng)對所有流感爆發(fā)的主要原因。WHO在全世界建立了完整的監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，分離、鑒定世界各地的流感毒株，并每年2-3月份組織專家召開會議，推薦流感流行季節(jié)疫苗中應(yīng)包括的毒株，以便生產(chǎn)廠家在疫苗制備過程中采用與流行株一致的毒株，使疫苗達(dá)到最佳保護(hù)效力。然而即使這樣，生產(chǎn)流感病毒疫苗仍存在許多亟待解決的問題1、生產(chǎn)周期較長，生產(chǎn)的流感疫苗往往錯過流感流行季節(jié)。等再一次流感流行時，或許生產(chǎn)的疫苗已經(jīng)失效。目前，美國所有商品化的流感疫苗都是由雞胚來培養(yǎng)的。雖然流感病毒在雞胚中生長良好，但疫苗的產(chǎn)量仍有賴于雞胚的可獲得性及其質(zhì)量。雞胚的提供必須有組織性，疫苗的生產(chǎn)周期較長，因為雞胚供應(yīng)不及時而限制了該種疫苗的生產(chǎn)。
2、近幾年來，用細(xì)胞培養(yǎng)的方法生產(chǎn)疫苗也得到了發(fā)展。選擇好的宿主細(xì)胞可以永久傳代，這就克服了由雞胚培養(yǎng)所帶來的不便。然而，并不是所有的流感病毒株在組織細(xì)胞中都能很好生長。例如，象一些適合制備疫苗的病毒株，如溫度敏感株等，用現(xiàn)有的方法并不能在組織細(xì)胞中培養(yǎng)。
3、全病毒滅活疫苗、裂解流感疫苗和亞單位疫苗免疫保護(hù)效果遠(yuǎn)不及減毒疫苗，而利用傳統(tǒng)方法制備的流感減毒疫苗又存在著毒力恢復(fù)等缺陷。
基于以上情況，為了克服現(xiàn)有流感病毒疫苗生產(chǎn)中的不足，基于反向遺傳操作技術(shù)，利用多質(zhì)粒拯救系統(tǒng)能夠顯著增加流感疫苗生產(chǎn)的靈活性，同時能將組織細(xì)胞培養(yǎng)的方法更好地應(yīng)用于該種疫苗的生產(chǎn)，使得制備的疫苗具有很好的時效性。同時利用反義遺傳學(xué)和基因定點(diǎn)突變的方法，既保存了流感病毒減毒疫苗的免疫原性，又提高了其安全性。
反向遺傳操作技術(shù)(reverse genetics)是近幾年快速發(fā)展的一項新的生物技術(shù)，應(yīng)用于病毒研究又叫“病毒拯救(rescue of virus)”，病毒拯救技術(shù)是在了解病毒復(fù)制特點(diǎn)等基礎(chǔ)上利用分子生物學(xué)技術(shù)而建立和完善起來的，是指通過人工操作基因，用病毒核酸的適當(dāng)形式，在一定條件下轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生有感染性的病毒子。由于RNA不穩(wěn)定，病毒拯救技術(shù)尤其是完全以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的操作技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在cDNA水平上對RNA病毒的操作和方便地人工制造病毒，這是20世紀(jì)90年代RNA病毒研究中的重大突破，成為至今生命科學(xué)研究熱點(diǎn)。現(xiàn)在，病毒拯救指的就是使用以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的系統(tǒng)，即從克隆的cDNA產(chǎn)生病毒的過程，在對病毒的生活周期、基因結(jié)構(gòu)與功能、致病基礎(chǔ)、新型疫苗構(gòu)建、表達(dá)外源蛋白等方面的研究中顯示了良好的應(yīng)用前景。
流感病毒的反向遺傳操作技術(shù)的建立難度較大，因為要同時在細(xì)胞內(nèi)形成8個功能性核糖核蛋白復(fù)合物(RNPs)，而且與大多數(shù)其它負(fù)義RNA病毒不同，流感病毒基因組在細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制，因此流感病毒拯救技術(shù)的發(fā)展落后于其它負(fù)義RNA病毒，但經(jīng)過10年的發(fā)展，終于在1999年Neumann等和Fodor等分別報道了完全以多質(zhì)粒為基礎(chǔ)的技術(shù)，這是流感病毒拯救技術(shù)發(fā)展史上的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。其優(yōu)點(diǎn)是不再象早期的方法那樣，需要為RNA合成提供功能蛋白的輔助病毒一起感染細(xì)胞，從而避免了大量的篩選工作。為了減少共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒數(shù)，Hoffmann等首次建立了8質(zhì)粒拯救系統(tǒng)，其啟動子和終止序列為RNA聚合酶I/II即pol I-pol II系統(tǒng)，利用同一個載體實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞內(nèi)的病毒RNA(vRNA)轉(zhuǎn)錄和病毒蛋白合成，進(jìn)而包裝成病毒。Hoffmann后來又對克隆載體作過一些修改。8質(zhì)粒病毒拯救系統(tǒng)已應(yīng)用于A型和B型流感病毒的拯救，多數(shù)都是對從人分離的病毒進(jìn)行研究。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種重組流感病毒及其制備方法。
本發(fā)明提供的制備重組流感病毒的方法，由以下步驟組成1)將來自于A型或B型流感病毒冷適應(yīng)株的PB2編碼基因、PB1編碼基因、PA編碼基因、M編碼基因、NS編碼基因和NP編碼基因，以及來自于當(dāng)年流行的A或B型流感病毒毒株的HA編碼基因和NA編碼基因分別插入真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒中得到8個重組表達(dá)質(zhì)粒；所述8個重組表達(dá)質(zhì)粒為含有PB2編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒、含有PB1編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒、含有PA編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒、含有M編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒、含有NS編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒、含有NP編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒、含有HA編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒和含有NA編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒；2)將所述8個重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳細(xì)胞中，培養(yǎng)所述哺乳細(xì)胞，得到重組A型流感減毒病毒或重組B型流感減毒病毒。
在實(shí)際應(yīng)用中，所述當(dāng)年流行的流感病毒毒株采用WHO確定流行的流感病毒毒株。所述A型流感病毒的冷適應(yīng)株可為A/AnnArbor/6/60變異體。
所述B型流感病毒的冷適應(yīng)株可為B/AnnArbor/1/66變異體變異體。
所述真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒優(yōu)選為如圖1所示的pAD3000，pAD3000以pHW2000為基礎(chǔ)構(gòu)建，其特點(diǎn)具有雙向表達(dá)系統(tǒng)，可以使流感病毒的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)運(yùn)用同一質(zhì)粒系統(tǒng)，且不需要輔助病毒的存在。
所述8個重組表達(dá)質(zhì)粒選自下述三個共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組中的任意一組1)A型H1N1亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組pADAPB2、pADAPA、pADANP、pADAAM、pADANS、pADAPB1、pADA1NA和pADA1HA；2)A型H3N2亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組pADAPB2、pADAPA、pADANP、pADAAM、pADANS、pADAPB 1、pADA3NA和pADA3HA。
3)B型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組pADBPB2、pADBPA、pADBNP、pADBM、pADBNS、pADBPB1、pADBHA和pADBNA。
所述方法中，可用于培養(yǎng)病毒的哺乳細(xì)胞均可，如293T細(xì)胞、COS7細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、Vero細(xì)胞、WI-38(人胚肺細(xì)胞株)、HL-8(恒河猴胚細(xì)胞株)、Hela細(xì)胞(人子宮頸癌細(xì)胞系)或Chang C/I/L/K(人結(jié)腸C、腸I、肝L與腎K細(xì)胞系)等。
由上述方法制備的重組流感病毒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種流感病毒疫苗。
本發(fā)明所提供的流感病毒疫苗，它的活性成分(抗原)為上述方法制備的重組A型流感減毒病毒和/或重組B型流感減毒病毒。
所述重組A型流感減毒病毒為A型H1N1亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組導(dǎo)入哺乳細(xì)胞中得到的重組流感病毒，和/或A型H3N2亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組導(dǎo)入哺乳細(xì)胞中得到的重組流感病毒；所述A型H1N1亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組由pADAPB2、pADAPA、pADANP、pADAAM、pADANS、pADAPB1、pADA1NA和pADA1HA組成，所述A型H3N2亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組由pADAPB2、pADAPA、pADANP、pADAAM、pADANS、pADAPB1、pADA3NA和pADA3HA組成；所述重組B型流感減毒病毒為B型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組導(dǎo)入哺乳細(xì)胞中，得到的重組流感病毒；所述B型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組由pADBPB2、pADBPA、pADBNP、pADBM、pADBNS、pADBPB1、pADBHA和pADBNA組成。
所述流感病毒疫苗可制成滴鼻劑或注射劑或透皮劑；所述重組A型流感減毒病毒和/或重組B型流感減毒病毒不加佐劑可直接制備成注射劑型；所述重組A型流感減毒病毒和/或重組B型流感減毒病毒加入保護(hù)劑(0.1-0.5％海藻糖或殼聚糖，0.1-0.3％明膠，0.2-0.8％蔗糖，0.1-0.3％乳膠蛋白和0.1-0.8％白蛋白)，可制成滴鼻劑；所述重組A型流感減毒病毒和/或重組B型流感減毒病毒加入10-20％CTB可制成透皮劑；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
可在MDCK細(xì)胞、Vero細(xì)胞、293T細(xì)胞、COS7細(xì)胞、WI-38、HL-8、Hela細(xì)胞或ChangC/I/L/K細(xì)胞等動物哺乳細(xì)胞中培養(yǎng)上述重組流感病毒。
本發(fā)明利用6+2質(zhì)粒拯救系統(tǒng)來重組流感病毒，該重組病毒可用細(xì)胞培養(yǎng)的方法來大量擴(kuò)增，該重組病毒不需任何處理可直接用于疫苗的制造。8質(zhì)粒系統(tǒng)中6個質(zhì)粒攜帶的病毒基因片段來源于流感冷適應(yīng)減毒株，但另兩個質(zhì)粒所攜帶的表面抗原HA、NA，則來源于當(dāng)年流行的流感病毒株(如當(dāng)年WHO確定流行的流感病毒株)。例如，HA、NA基因片段可來源于H1、H3或者是B型流感毒株，三者循序用于流感減毒三價疫苗的生產(chǎn)。同時HA、NA也可來源于當(dāng)時發(fā)病的其它亞型毒株，例如H2(H2N2)、H5(H5N1)、H7(H7N7)、H9(H9N3)等。運(yùn)用該種方法可以迅速針對季節(jié)性流感病毒的流行情況，重組出可用于疫苗制備的病毒參考株。本發(fā)明制備的流感減毒疫苗經(jīng)鼻免疫后取得了很好的免疫效果，同時用該種方法拯救的流感病毒具有時效性，能根據(jù)每年流感病毒的流行特點(diǎn)，針對性的制備有效的流感疫苗，制備快速，免疫原性、免疫保護(hù)效果顯著，并且很好的具有安全性。
本發(fā)明所提供的6+2質(zhì)粒系統(tǒng)拯救的流感病毒制備的流感減毒三價疫苗，人為的解決傳統(tǒng)方法制備流感減毒疫苗的安全性、穩(wěn)定性的問題，并且使流感疫苗保護(hù)譜更全面，同時重組的流感病毒可以在細(xì)胞中大量的擴(kuò)增。
本發(fā)明所采用的反向遺傳操作技術(shù)，應(yīng)用于流感病毒的拯救先進(jìn)而成熟，具有方便簡捷、定位可控等優(yōu)點(diǎn)。目前，人用流感滅活疫苗毒株要通過傳統(tǒng)的重排技術(shù)，而且，由于抗原的變異，每年都要對人用疫苗進(jìn)行評價，然后用經(jīng)評價確定使用的流行毒株與高度雞胚適應(yīng)株A/PR/8/34(PR8)同時感染雞胚，經(jīng)過傳代反復(fù)篩選，最終得到含有流行毒株HA和NA基因的重組病毒作為新疫苗株。這個過程費(fèi)時又費(fèi)力，但反向遺傳操作技術(shù)可以大大加速進(jìn)程，只需將用流行株的HA和NA基因與冷適應(yīng)株病毒的內(nèi)部基因構(gòu)建的質(zhì)粒組合共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，拯救的流感病毒就是所需要的疫苗株，Hoffmann等實(shí)驗證明這是一個容易而又直接的過程。
由于流感滅活疫苗注射免疫不能激活有效的粘膜免疫和細(xì)胞免疫，以減毒弱毒活疫苗是一個重要的研究方向，但流感病毒抗原易變的特點(diǎn)，難以預(yù)測其毒力變化的特性制約著這個方向的研究，且安全性上難以保證。冷適應(yīng)致弱活疫苗在臨床有過嘗試，它對小孩的保護(hù)力超過常規(guī)的滅活苗，其特性又不在體內(nèi)大量擴(kuò)增，對成人的保護(hù)效果也明顯優(yōu)于滅活疫苗。又由于自然減毒的流感病毒它只包含有限的少量氨基酸的替代變化，大量使用時可能會有毒力返強(qiáng)的潛在危險。本發(fā)明的重組病毒減毒疫苗保持了冷適應(yīng)株病毒的特點(diǎn)，同時又具備多種流感病毒HA/NA表面抗原的活性、及快速制備的優(yōu)勢。本發(fā)明制備的流感減毒疫苗更具備廣泛的適用性，并可激活有效的粘膜免疫和系統(tǒng)免疫，有效性、安全性更加確切。本發(fā)明用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)替代雞胚生產(chǎn)疫苗病毒抗原，可以解決由雞胚培養(yǎng)帶來的異源蛋白和標(biāo)準(zhǔn)化的等問題。
圖1為疫苗載體pAD3000的結(jié)構(gòu)示意2為雙表達(dá)盒的結(jié)構(gòu)示意3為反向遺傳操作系統(tǒng)建立的技術(shù)路線圖4為重組A型H1N1亞型流感病毒感染MDCK細(xì)胞后72小時后的顯微鏡照片圖5為8質(zhì)粒拯救系統(tǒng)模式6為重組A型H1N1、H3N2亞型流感病毒和重組B型流感病毒電鏡照片
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明有五個要點(diǎn)，每個要點(diǎn)包括以下步驟第一，疫苗載體pAD3000的構(gòu)建及鑒定運(yùn)用分子生物學(xué)的基本方法，在載體pHW2000的基礎(chǔ)上構(gòu)建pAD3000。即將pHW2000中的多聚A信號序列BGH(bovine growth hormone)改建成SV40(simian virus 40)，送公司測序及酶切鑒定其大小。
第二，構(gòu)建流感病毒的8質(zhì)粒拯救系統(tǒng)(1)分別選用A、B型流感病毒冷適應(yīng)株A/AnnArbor/6/60變異體、B/AnnArbor/1/66變異體(中國華蘭生物工程股份有限公司)為供體流感病毒提供PB1、PB2、NS、M、NP、PA的6個基因片段；當(dāng)年流行的甲乙流感病毒疫苗毒株提供的HA、NA基因片段。如本發(fā)明以當(dāng)年流行的A/New Caledonia/20/99(H1N1)、A/A/jiangxi/424/2004(H3N2)、B/Shanghai/361/2002(中國華蘭生物工程股份有限公司)為供體病毒提供重組病毒的HA、NA基因片段。
(2)提取病毒的總RNA。從供體A、B型流感病毒冷適應(yīng)株A/AnnArbor/6/60變異體、B/AnnArbor/1/66變異體病毒用PCR的方法擴(kuò)增PB1、PB2、NS、M、NP、PA的基因片段，測序后分別連接于構(gòu)建好的載體pAD3000上，構(gòu)建6質(zhì)粒系統(tǒng)。
(3)培養(yǎng)當(dāng)年流行的流感病毒株，從WHO確定的當(dāng)年疫苗流行株，比如供體A/NewCaledonia/20/99(H1N1)、A/A/jiangxi/424/2004(H3N2)、B/Shanghai/361/2002供體病毒用PCR的方法擴(kuò)增流HA、NA基因片段，構(gòu)建2質(zhì)粒系統(tǒng)。
第三，利用反向遺傳技術(shù)拯救流感病毒疫苗參考株(1)選取任一的共培養(yǎng)細(xì)胞系DMCK、293T、COS7、Vero細(xì)胞，通過脂質(zhì)體或電穿孔轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞系。
(2)將含有流感病毒PB1、PB2、PA、NP、M、NS、HA、NA基因片段的6+2質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞系。
(3)33℃培養(yǎng)后收集復(fù)活的重組H1、H3、乙型流感病毒，隨后進(jìn)入SPF雞胚或Vero、MDCK等細(xì)胞系適應(yīng)擴(kuò)大增殖，建立重組流感病毒減毒疫苗參考株原代種子庫、主種子庫、工作種子庫，放-80℃保存，并進(jìn)行全面的檢定。
(4)重組流感減毒疫苗參考株種子庫毒株采用紅細(xì)胞凝集試驗測定病毒的滴度、細(xì)胞病變法測定病毒的TCID50、雞胚感染力測定EID50、免疫擴(kuò)散法測定HA滴度；(5)重組流感減毒疫苗參考株種子庫毒株采用電鏡觀察病毒顆粒、SDS-PAGE測定病毒的主要蛋白抗原成分、間接免疫熒光測定病毒的特異性和血凝素型別；(6)重組流感減毒疫苗參考株種子庫毒株采用無菌試驗測定細(xì)菌、真菌、支原體，細(xì)胞培養(yǎng)測定外源因子；(7)重組流感減毒疫苗參考株種子庫毒株或傳代至15代的病毒株采用RT-PCR測定病毒HA、NA的穩(wěn)定性；
(8)重組流感減毒疫苗參考毒株在不同動物體內(nèi)進(jìn)行安全性、有效性、穩(wěn)定性的研究；第四，流感減毒三價活疫苗的生產(chǎn)(1)重組H1N1、H3N2、乙型流感減毒疫苗種子庫參考毒株，分別進(jìn)行哺乳細(xì)胞或雞胚培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)后收集流感病毒液；(2)收集的重組H1N1、H3N2、乙型流感減毒液超濾濃縮、柱層析純化，制備流感減毒三價活疫苗半成品。進(jìn)一步制備成噴鼻、注射、透皮流感減毒三價活疫苗成品劑型；(3)流感減毒三價活疫苗在不同動物體內(nèi)外觀察安全性、免疫原性、免疫保護(hù)性、穩(wěn)定性和長效性，并確定疫苗的劑型、免疫用量、途徑等免疫程序。
第五，建立哺乳細(xì)胞培養(yǎng)用于流感減毒三價活疫苗生產(chǎn)流感病毒的策略(1)重組H1N1、H3N2、乙型流感減毒疫苗種子庫參考毒株，采用微載體技術(shù)生產(chǎn)流感病毒。既是用哺乳細(xì)胞Vero、MDCK等細(xì)胞，所用的細(xì)胞培養(yǎng)基可以是各種無血清培養(yǎng)基，如Iscove’s培養(yǎng)基、ultraCHO培養(yǎng)基、EX-CELL等，也可以應(yīng)用常規(guī)的有血清培養(yǎng)基，MEM、DMEM等。培養(yǎng)器可用spinner培養(yǎng)瓶、滾動培養(yǎng)瓶、灌注型生物反應(yīng)器等；(2)培養(yǎng)基的pH值為6.8-7.3，PO2為35％-60％。細(xì)胞培養(yǎng)是懸浮培養(yǎng)，而非貼壁生長。培養(yǎng)20-30h，達(dá)到細(xì)胞濃度8-25×106個/ml。流感病毒在細(xì)胞中培養(yǎng)，其m.o.i(multiplicity of infection)為0.002-0.5；(3)植入病毒后不久便可加入蛋白酶，首選胰酶、或者是絲氨酸蛋白酶。蛋白酶首先切割流感病毒HA的先驅(qū)蛋白，才能使流感病毒吸附于細(xì)胞，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制。絲氨酸蛋白酶最開始的終濃度為5-30μg/ml，細(xì)胞感染后加入的蛋白酶終濃度可在1-80μg/ml。病毒是復(fù)制大約需要2-10天，收獲病毒液，用于流感減毒三價活疫苗的生產(chǎn)。
下述實(shí)施例中的實(shí)驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例1、重組A型H1N1、H3N2流感減毒病毒和重組B型流感減毒病毒的制備1、載體pAD3000的構(gòu)建運(yùn)用分子生物學(xué)的基本方法，在載體pHW2000的基礎(chǔ)上構(gòu)建pAD3000。即將pHW2000中的多聚A信號序列BGH(bovine growth hormone)改建成SV40(simian virus 40)。
設(shè)計SV40擴(kuò)增引物如下引物15’-AACAATTGAGATCTCGGTCACCTCAGACATGATAAGATACATTGATGAGT-3’引物25’-TATAACTGCAGACTAGTGATATCCTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTA-3’擴(kuò)增的模板為載體pcDNA3.1(Invitrogen公司)。PCR擴(kuò)增的程序為先94℃ 10min；然后94℃ 45s，55℃ 30s，72℃ 45s，共25個循環(huán)；最后72℃ 5min。擴(kuò)增得到的138bp片段用內(nèi)酶切EcoRV和BstEII進(jìn)行雙酶切后，與PvuII和BstEII雙酶切pHW2000(pHW2000的構(gòu)建參照Hoffmann E，Neumann G，Kawaoka Y，Hobom G，Webster RG.A DNA transfectionsystem for generation of influenza A virus from eight plasmids.Proc Natl Acad SciU S A.2000May 23；97(11)6108-13)得到的載體大片段連接構(gòu)建新的載體，送公司測序，測序結(jié)果表明pHW2000中的多聚A信號序列BGH被改建成SV40(simian virus 40)多聚A信號序列，將該重組疫苗載體命名為pAD3000(圖1，序列13)。
2、構(gòu)建流感病毒的8質(zhì)粒拯救系統(tǒng)為了克服流感病毒在細(xì)胞內(nèi)繁殖需要輔助病毒這一障礙，構(gòu)建了新的載體pAD3000。vRNA和mRNA合成的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)為pol I-pol II，雙表達(dá)盒如圖2所示。如圖5所示，流感病毒8個片段的cDNAs分別反向插入RNA聚合酶I啟動子(PIh)及其終止子(tI)之間構(gòu)成轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄單位之外相連的是聚合酶II啟動子(PIICMV)及其終止序列(aIISV40)，兩個啟動子方向相反。8個表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，由細(xì)胞提供pol I和pol II，從PIh啟動負(fù)義vRNA的合成，vRNA包含5′和3′端的非編碼區(qū)，從PIICMV啟動、pol II合成mRNA，mRNA帶5′帽子結(jié)構(gòu)和3′poly(A)尾，翻譯成病毒蛋白。病毒cDNA的ATG是pol II下游的第一個ATG，是pol II轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)。
①流感病毒的制備甲乙流感冷適應(yīng)株A/AnnArbor/6/60、B/AnnArbor/1/66和WHO當(dāng)年確定的流行毒株，如A/New Caledonia/20/99(H1N1)、A/jiangxi/424/2004(H3N2)、B/Shanghai/361/2002疫苗株分別接種于SPF雞胚，按常規(guī)培養(yǎng)流感病毒，收集尿囊液300ml，6000rpm(30#轉(zhuǎn)子)離心15min，取上清，18000rpm 4℃離心1.5h，用40ml STE(10mM pH8.0Tris-HCl，100mM NaCl，5mM pH8.0 EDTA)懸浮沉淀。用10％蔗糖墊底，小心加入懸浮液，18000rpm4℃離心1.5h去雜蛋白，去上清，沉淀用30ml STE懸浮，18000rpm 4℃離心1h去蔗糖，沉淀用7ml STE懸浮，分裝，每管450μl。
②流感病毒基因組RNA的提取取450μl的純化尿囊液，加入10％ SDS 50μl，顛倒混勻，置5min，中間輕輕振動數(shù)次。加入飽和酚500μl，混勻，5000×g離心15min，取上清，再加入飽和酚500μl，混勻，5000×g離心15min，取上清(約350μl)，加入DEPC處理的2M NaAc和4M LiCl各25μl，加入無水乙醇1000μl，顛倒混勻，-20℃過夜，12000×g離心15min，棄去上清，置超凈臺揮發(fā)干，用60μl DEPC-水懸浮沉淀，可立即使用或置-20℃?zhèn)溆谩?br>
③反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增各基因片段采用一步法RT-PCR試劑盒(Qiagen，Valencia，CaliF)說明進(jìn)行操作。已提取的流感病毒病毒RNA1μl，RT條件是50℃50min，PCR條件是先94℃ 15min；然后94℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 3min，25循環(huán)?；厥誔CR產(chǎn)物進(jìn)行酶切、測序，連于構(gòu)建好的pAD3000載體上。
流感病毒冷適應(yīng)株A/AnnArbor/6/60變異體、B/AnnArbor/1/66冷適應(yīng)株分別作為主要的供體病毒提供6個基因片段，引物見表1，2。A/New Caledonia/20/99(H1N1)、A/jiangxi/424/2004(H3N2))、B/Shanghai/361/2002作為流行毒株(既是WHO確定的當(dāng)年季節(jié)性流行株)來提供2個基因序列(NA、HA)，所用的引物為通用引物(表3)。
利用A/AnnArbor/6/60冷適應(yīng)株的基因組RNA、表1中的引物分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增得到A型H1N1亞型流感病毒的PB2、PA、NP、M、NS、PB1基因片段，將PB2基因片段反向插入pAD3000的AarI和AarI識別位點(diǎn)間，經(jīng)篩選、測序得到含有具有序列表中序列2的核苷酸序列的PB2基因的重組載體，將其命名為pADAPB2；將PA基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI識別位點(diǎn)間，經(jīng)篩選、測序得到含有具有序列表中序列5的核苷酸序列的PA基因的重組載體，將其命名為pADAPA；將NP基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI識別位點(diǎn)間，經(jīng)篩選、測序得到含有具有序列表中序列3的核苷酸序列的NP基因的重組載體，將其命名為pADANP；將M基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI識別位點(diǎn)間，經(jīng)篩選、測序得到含有具有序列表中序列6的核苷酸序列的M基因的重組載體，將其命名為pADAM；將NS基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI識別位點(diǎn)間，經(jīng)篩選、測序得到含有具有序列表中序列4的核苷酸序列的NS基因的重組載體，將其命名為pADANS；將PB1基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI識別位點(diǎn)間，經(jīng)篩選、測序得到含有具有序列表中序列1的核苷酸序列的PB1基因的重組載體，將其命名為pADAPB1。
利用B/AnnArbor/1/66冷適應(yīng)株的基因組RNA、表2中的引物分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增得到B型流感病毒的PB2、PA、NP、M、NS、PB1基因片段，將PB2基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI識別位點(diǎn)間，經(jīng)篩選、測序得到含有具有序列表中序列8的核苷酸序列的PB2基因的重組載體，將其命名為pADBPB2；將PA基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI識別位點(diǎn)間，經(jīng)篩選、測序得到含有具有序列表中序列11的核苷酸序列的PA基因的重組載體，將其命名為pADBPA；將NP基因片段反向插入pAD3000的BsaI和BsaI識別位點(diǎn)間，經(jīng)篩選、測序得到含有具有序列表中序列9的核苷酸序列的NP基因的重組載體，將其命名為pADBNP；將M基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI識別位點(diǎn)間，經(jīng)篩選、測序得到含有具有序列表中序列12的核苷酸序列的M基因的重組載體，將其命名為pADBM；將NS基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI識別位點(diǎn)間，經(jīng)篩選、測序得到含有具有序列表中序列10的核苷酸序列的NS基因的重組載體，將其命名為pADBNS；將PB1基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI識別位點(diǎn)間，經(jīng)篩選、測序得到含有具有序列表中序列7的核苷酸序列的PB1基因的重組載體，將其命名為pADBPB1。
利用A/New Caledonia/20/99(H1N1)或A/jiangxi/424/2004(H3N2)的基因組RNA，表3中的擴(kuò)增HA的引物AHA-1和AHA-2、擴(kuò)增NA的引物ANA-1和ANA-2分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增得到A型流感病毒A/New Caledonia/20/99(H1N1)或A/jiangxi/424/2004(H3N2)的HA、NA基因片段，將A/New Caledonia/20/99(H1N1)的NA基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI識別位點(diǎn)間，經(jīng)篩選、測序得到含有具有序列表中序列14的核苷酸序列的NA基因的重組載體，將其命名為pADA1NA；將A/New Caledonia/20/99(H1N1)的HA基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI識別位點(diǎn)間，經(jīng)篩選、測序得到含有具有序列表中序列15的核苷酸序列的HA基因的重組載體，將其命名為pADA1HA；將A/jiangxi/424/2004(H3N2)的NA基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI識別位點(diǎn)間，經(jīng)篩選、測序得到含有具有序列表中序列18的核苷酸序列的NA基因的重組載體，將其命名為pADA3NA；將A/jiangxi/424/2004(H3N2)的HA基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI識別位點(diǎn)間，經(jīng)篩選、測序得到含有具有序列表中序列19的核苷酸序列的HA基因的重組載體，將其命名為pADA3HA。
利用B/Shanghai/361/2002中的基因組RNA、表3中的引物BHA/NA-1和BHA/NA-2進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增得到B型流感病毒的1701bp的HA和1413bp的NA基因片段，將HA和NA基因片段分別反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI識別位點(diǎn)間，經(jīng)篩選、測序得到含有具有序列表中序列16的核苷酸序列的HA基因的重組載體，將其命名為pADBHA；得到含有具有序列表中序列17的核苷酸序列的NA基因的重組載體，將其命名為pADBNA。
表1 擴(kuò)增A型H1N1亞型流感病毒A/AnnArbor/6/60 6個基因片段的引物
注1代表正向引物，2代表反向引物表2 擴(kuò)增B/AnnArbor/1/66型流感病毒6個基因片段的引物
注1代表正向引物，2代表反向引物表3 擴(kuò)增A和B型流感病毒HA和NA基因的引物序列
注1代表正向引物，2代表反向引物3、重組流感病毒的復(fù)活及培養(yǎng)①質(zhì)粒提取用Premega公司生產(chǎn)的小提質(zhì)粒試劑盒，按說明操作提取質(zhì)粒。最后用滅菌T1(2mM Tris.HCl)無菌操作洗脫質(zhì)粒。用Eppendorf Biophotometer RS232C(德國Hamburg)測定質(zhì)粒的含量和純度，含量在100μg/ml以上、OD260/OD280為1.70-2.00的質(zhì)粒備轉(zhuǎn)染用。
②反向遺傳操作技術(shù)制備重組流感病毒如圖3所示，把已構(gòu)建的8個質(zhì)粒及陰性對照的質(zhì)粒按設(shè)計的基因重排組合，等量混勻，共轉(zhuǎn)染MDCK或Vero或293T或COS7共培養(yǎng)的細(xì)胞系，收集轉(zhuǎn)染上清和細(xì)胞，用10日齡SPF雞胚增殖，72h后收集尿囊液，HA試驗檢測血凝價，HA陽性的進(jìn)一步驗證重組病毒子是否為預(yù)先設(shè)計的病毒；HA陰性的再用SPF雞胚傳一代，HA陽性者驗證重組病毒，HA仍為陰性則棄去。
共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒分為以下四組A型H1N1亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組pADAPB2、pADAPA、pADANP、pADAM、pADANS、pADAPB1、pADA1NA和pADA1HA；A型H1N1亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒陰性對照組pADAPA、pADANP、pADAM、pADANS、pADAPB1、pADA1NA和pADA1HA；A型H3N2亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組pADAPB2、pADAPA、pADANP、pADAM、pADANS、pADAPB1、pADA3NA和pADA3HA；A型H3N2亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒陰性對照組pADAPA、pADANP、pADAM、pADANS、pADAPB1、pADA3NA和pADA3HA；B型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組pADBPB2、pADBPA、pADBNP、pADBM、pADBNS、pADBPB1、pADBHA和pADBNA；B型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的陰性對照組pADBPA、pADBNP、pADBM、pADBNS、pADBPB1、pADBHA和pADBNA。
將293T細(xì)胞用OptiMEMI-AB+5％FBS培養(yǎng)基(購自美國Sigma公司)培養(yǎng)；COS7細(xì)胞用DMEMI-AB+10％FBS培養(yǎng)基(購自美國Sigma公司)；MDCK細(xì)胞用1×MEM+10％FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)。收集293T細(xì)胞、COS7細(xì)胞和MDCK細(xì)胞，用5mLPBS或者含有10％FBS的培養(yǎng)基洗細(xì)胞。將10mLtrypsin-EDTA加入75cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，分別將MDCK細(xì)胞、293T、COS7或Vero細(xì)胞加入進(jìn)行孵育，MDCK細(xì)胞孵育20-45min，293T、COS7和Vero細(xì)胞孵育1min。細(xì)胞離心后重懸于OptiMEM-AB中。每毫升的細(xì)胞懸液用18mLOptiMEM-AB稀釋并混勻。將稀釋好的細(xì)胞加入6孔板中，6-24h后，以上四個共轉(zhuǎn)染組中的每種質(zhì)粒1μg混勻(xμg質(zhì)粒+xμLOptiMEM-AB+TransI1-LT1＝200μL(OptiMEM-AB和TransI1-LT1購自Mirus公司)，加入800μLOptiMEM-AB室溫孵育45min。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞更換培養(yǎng)基，移入33℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6-15h，輕輕移去培養(yǎng)基，再加入1mL的OptiMEM-AB培養(yǎng)基，繼續(xù)在33℃條件下培養(yǎng)24h。
轉(zhuǎn)染后48h，將1mL含有終濃度為1μg/μL的TPCK-trypsin的OptiMEM-AB加入細(xì)胞內(nèi)，96h后再加入1mL含有終濃度為1μg/μL的TPCK-trypsin的OptiMEM-AB。
A型H1N1亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組，A型H3N2亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組和B型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染后的MDCK細(xì)胞、293T、COS7和Vero細(xì)胞在5-7天有CPE，說明病毒已被拯救復(fù)活，分別得到重組A型H1N1亞型流感病毒(重組H1N1流感減毒病毒)(圖6中A)、重組A型H3N2亞型流感病毒(重組H3N2流感減毒病毒)(圖6中B)和重組B型(乙型)流感病毒(重組乙型流感減毒病毒)(圖6中C)。A型H1N1亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒陰性對照組、A型H3N2亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒陰性對照組和B型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒陰性對照組轉(zhuǎn)染后的MDCK細(xì)胞、293T、COS7和Vero細(xì)胞沒有CPE。為了證明這個拯救系統(tǒng)的效應(yīng)，轉(zhuǎn)染后7天，收集細(xì)胞上清，1mL上清，5000rpm離心5min，再取離心后的上清，倍比稀釋每孔500mL加入MDCK細(xì)胞中。上清與細(xì)胞共培養(yǎng)1h后去掉上清，代之以終濃度為1μg/μL的TPCK-trypsin的1×MEM，然后做HA實(shí)驗和空斑實(shí)驗。證明所有的陽性組(A型H1N1亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組，A型H3N2亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組和B型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組)該兩項實(shí)驗結(jié)果均陽性，而陰性對照組(A型H1N1亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒陰性對照組，A型H3N2亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒陰性對照組和B型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒陰性對照組)結(jié)果均陰性。該實(shí)驗粗步篩選出陽性者進(jìn)行重組的H1N1、H3N2、乙型流感減毒病毒的驗證。
4、重組H1N1、H3N2、乙型流感減毒病毒的驗證①雞胚傳代流感減毒病毒的感染性HA實(shí)驗和空斑實(shí)驗陽性的轉(zhuǎn)染上清-20℃和20℃凍融2次，經(jīng)尿囊腔接種于10日齡SPF雞胚，每胚0.2ml，每個樣品接種2個胚，置35℃培養(yǎng)至72h，收集尿囊液，參考OIE推薦的標(biāo)準(zhǔn)、用0.8％雞紅細(xì)胞進(jìn)行血凝(HA)試驗，HA陽性者用H1、H3、B亞型陽性血清(購于中國CDC國家流感中心)進(jìn)行血凝抑制試驗(HI)。
陽性的HI效價均在1∶28以上，而對照組HI實(shí)驗均陰性。檢測的陽性尿囊液代次及其HA效價見表4，陽性組合上清接種雞胚在第一代(F1)尿囊液檢測為陽性，檢測陽性時的雞胚平均HA效價范圍為1∶27～1∶211，表明經(jīng)上述傳代后重組H1N1、H3N2、乙型流感病毒HA效價沒有改變，證明重組H1N1、H3N2、乙型流感減毒病毒具有很高的滴度，表明重組H1N1、H3N2、乙型流感減毒病毒具有很好的穩(wěn)定性。
表4.HA/HI實(shí)驗檢測雞胚傳代、血凝滴度及病毒亞型
#F1/F2雞胚代次；AH1表示重組A型H1N1亞型流感病毒，AH3表示重組A型H3N2亞型流感病毒，B表示重組B型流感病毒，NC代表A/New Caledonia/20/99②重組流感減毒病毒全基因序列分析陽性尿囊液，用雞胚傳代的第2代尿囊液分別提取重組H1N1、H3N2、乙型流感病毒RNA、用通用引物(表1、表2和表3)、RT-PCR擴(kuò)增8基因片段進(jìn)行測序，未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的RNA、用通用引物(表1、表2和表3)做PCR對照，以排除尿囊液中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA的存在。結(jié)果表明A型H1N1亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組、A型H3N2亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組和B型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染的293T、COS7、Vero細(xì)胞和MDCK細(xì)胞培養(yǎng)上清得到的尿囊液，RT-PCR均能擴(kuò)增出PB1、PB2、NS、M、NP、PA、HA、NA的8基因片段，經(jīng)測序與設(shè)計的相符，而未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的RNA均不能擴(kuò)增出8個基因片段，說明尿囊液中無質(zhì)粒DNA的存在；A型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒陰性對照組和B型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒陰性對照組轉(zhuǎn)染的293T、COS7、Vero細(xì)胞和MDCK細(xì)胞培養(yǎng)上清得到的尿囊液，RT-PCR不能擴(kuò)增出8基因片段，未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的RNA也不能擴(kuò)增出8基因片段；說明尿囊液中無拯救病毒的存在。
③重組流感減毒病毒感染MDCK細(xì)胞的穩(wěn)定性第2代陽性尿囊液在不加胰酶的情況下感染MDCK細(xì)胞，觀察96h內(nèi)的病變。結(jié)果表明重組A型H1N1亞型流感病毒、重組A型H3N2亞型流感病毒和重組B型(乙型)流感病毒感染72h后均使MDCK產(chǎn)生變圓、死亡、小塊脫落并以絲相連等特征性病變。其中，重組A型H1N1亞型流感病毒感染MDCK細(xì)胞的照片如圖4中B所示。圖4中A為未經(jīng)感染的MDCK細(xì)胞)。
進(jìn)一步用SPF雞胚(或細(xì)胞)傳代20代，A/New Caledonia/20/99毒株做對照。HA試驗檢測每批次雞胚(或細(xì)胞)的血凝價，對每代次取平均值。此結(jié)果表明重組病毒對雞胚(或細(xì)胞)有很好的感染性。
表5.重組減毒病毒和A/New Caledonia/20/99用雞胚傳平均HA效價
F1-代表第2代、F2-代表第6代、F3-代表第12代、F4-代表第20代，AH1-表示重組A型H1N1亞型流感病毒，AH3-表示重組A型H3N2亞型流感病毒，B-表示重組B型流感病毒，NC代表A/New Caledonia/20/99。
同時對重組的流感減毒病毒EID50、序列分析，傳20代后重組A型H1N1亞型流感病毒、重組A型H3N2亞型流感病毒和重組B型(乙型)流感病毒的EID50分別為10-11/0.2ml、10-8/0.2ml和10-9.25/0.2ml。序列分析結(jié)果顯示無基因突變。所有的實(shí)驗結(jié)果均表明，重組病毒具有很好的穩(wěn)定性。
④雞胚半數(shù)感染劑量(EID50)的測定按參考文獻(xiàn)的方法。將共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的重組A型H1N1亞型流感病毒，重組A型H3N2亞型流感病毒，重組B型流感病毒和野生型病毒A/New Caledonia/20/99第1代尿囊液作10倍遞進(jìn)稀釋，經(jīng)尿囊腔接種于10日齡非免疫雞胚，每個稀釋度接種4個胚，每胚0.2ml，35℃培養(yǎng)，取出24h后的死胚和培養(yǎng)至84h的胚，血凝價在1∶16以上的判定為雞胚感染陽性，用Reed-Muench法計算EID50(表3)。共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的重組A型H1N1亞型流感病毒，重組A型H3N2亞型流感病毒，重組B型流感病毒的EID50分別為10-7/0.2ml、10-6.75/0.2ml和10-10.75/0.2ml。雞胚感染和死亡情況見表6。
表6.EID50測定中雞胚感染和死亡數(shù)(n/4)
AH1表示重組A型H1N1亞型流感病毒，AH3表示重組A型H3N2亞型流感病毒，B表示重組B型流感病毒，NC代表A/New Caledonia/20/99。
⑤電鏡觀察重組流感減毒病毒的超微結(jié)構(gòu)共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的重組A型H1N1、H3N2亞型流感病毒和重組B型流感病毒感染MDCK細(xì)胞后72小時后分別用負(fù)染法處理，透射電鏡下觀察。結(jié)果表明所重組的H1N1、H3N2、B型流感病毒的電鏡形態(tài)與野生型病毒無任何差異。
⑥重組流感減毒病毒的安全性按照2005年版《中國生物制品規(guī)程》要求，對不同代次重組A型H1N1、H3N2亞型流感病毒和重組B型流感病毒進(jìn)行無菌實(shí)驗、毒力實(shí)驗、外源致熱原等安全性實(shí)驗，結(jié)果均陰性，表明重組的重組A型H1N1、H3N2亞型流感病毒和重組B型流感病毒作為疫苗株具有很好的安全性。
⑦重組流感減毒病毒的敏感及冷適應(yīng)性在不同的溫度培養(yǎng)條件下測定TCID50滴度。在不同的溫度條件下，在96孔板內(nèi)用病毒感染細(xì)胞的CPE來決定TCID50滴度，這個實(shí)驗決定于溫度和病毒株的不同，即病毒的復(fù)制能力。PCK(primary chicken kidney)細(xì)胞用含有5％的FCS的MEM懸浮，并種植于96孔板，48h后單克隆細(xì)胞數(shù)需達(dá)到90％以上，用含有1mM L-谷氨酰胺的非必需氨基酸的無血清的MEM來洗細(xì)胞1h。后種植96孔板，稀釋10倍的病毒樣品來感染細(xì)胞，設(shè)6個孔。未加病毒的細(xì)胞做陰性對照，也設(shè)6個孔。陽性對照為冷適應(yīng)病毒及溫度敏感毒株A/AnnArbor/6/60、B/AnnArbor/1/66變異體。為了決定重組病毒的溫度敏感性，加入病毒的板子分別在33℃、37℃的溫度條件的CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)6天，測定其冷適應(yīng)性需要在25℃培養(yǎng)10天。病毒滴度用Karber方法計算，用log10平均值(n＝4)TCID50Titer/ml±SD來表示。此值在33℃-37℃之間的不同代表溫度敏感現(xiàn)象，在25℃-33℃之間的差異代表冷適應(yīng)性。
結(jié)果如表7，這一結(jié)果表明重組A型H1N1、H3N2亞型流感減毒病毒和重組B型流感減毒病毒既有溫度敏感現(xiàn)象，也有冷適應(yīng)性。25℃-33℃之間病毒滴度的差異在0.3-0.4log10，說明了其具有冷適應(yīng)性。37℃病毒生長滴度小于33℃病毒滴度2log10，33℃-37℃之間病毒滴度的差異在原病毒和重組病毒之間的差異是3.4-3.7log10。說明重組A型H1N1亞型流感病毒，重組A型H3N2亞型流感病毒和重組B型流感病毒在人體溫下不會大量繁殖，可以直接用于流感減毒疫苗的生產(chǎn)。
表7.重組流感減毒病毒株穩(wěn)定敏感及冷適應(yīng)型結(jié)果
Ca-ts代表冷適應(yīng)性和溫度敏感性，NC代表A/New Caledonia/20/99實(shí)施例2.重組流感三價減毒活疫苗病毒的制備1、鑒定好的重組A型H1N1、H3N2亞型流感病毒和重組B型流感病毒按WO96/15231的方法感染雞胚。
2、在接種雞胚的當(dāng)天，用PBS稀釋病毒接種液，保存在2-8℃。
3、接種雞胚，9-11日齡雞胚被用于病毒復(fù)制。蛋殼除菌，每個雞胚接種0.2ml的病毒接種液，接種好病毒的雞胚在33℃下孵育48-96小時，在結(jié)束時，把雞胚放在2-8℃冰箱12-60小時使雞胚凍死。
4、流感病毒的收獲，從凍死的雞胚中收獲尿囊液，通常一個雞胚可以收獲8-10ml。收獲的雞胚尿囊液4000-14000g離心。
5、將尿囊液離心后用超濾包(MW為20KD)濃縮全病毒液，蔗糖梯度超速離心或柱層析進(jìn)行重組A型H1N1、H3N2亞型流感病毒和重組B型流感病毒的純化；6、對純化的病毒進(jìn)行病毒滴度、HA含量、外源因子、純度等理化性質(zhì)檢測，檢測合格用于流感三價減毒活疫苗的制備。
實(shí)施例3.細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)流感三價減毒活疫苗病毒1、電轉(zhuǎn)Vero細(xì)胞復(fù)制重組流感病毒以往用脂質(zhì)體進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，只能獲得單株高復(fù)制的病毒，且只限于實(shí)驗室階段的應(yīng)用，在疫苗的生產(chǎn)中受到了很大的限制。本發(fā)明提供了一種新的病毒拯救方法，即用電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，此方法適用于A、B型流感病毒的復(fù)活。用這種方法復(fù)活的溫度敏感、冷適應(yīng)性、減毒流感病毒可用于減毒疫苗的生產(chǎn)，沒用更多的化學(xué)物質(zhì)的摻入。8質(zhì)粒系統(tǒng)拯救流感病毒的過程中，電轉(zhuǎn)的方法明顯優(yōu)于其它方法，且Vero細(xì)胞最適合。具體方法是；(1)將Vero細(xì)胞種植于T225細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，所種植的細(xì)胞濃度為9×106個/瓶，所用的細(xì)胞培養(yǎng)基為含有L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、10％FBS的MEM。
(2)培養(yǎng)的第二天，收集細(xì)胞重懸于50mlPBS，再重懸于0.5mLoptiMEM(購于美國Sigma公司)。
(3)FCM 1∶40計數(shù)細(xì)胞，每5×106個細(xì)胞中加入0.4cm電穿孔杯(electroporationcuvette)和400μL optiMEMI(購于美國Sigma公司)。
(4)等比例混合實(shí)施例1中的A型H1N1亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組、A型H3N2亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組和B型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組中的8種質(zhì)粒共20μg，控制在總體積為25μL，加入cuvette。輕混勻，300v電轉(zhuǎn)28-33msec。
(5)電轉(zhuǎn)后1-2min后，輕拍cuvette，加入0.7mL含有10％FBS的MEM，輕拍，使細(xì)胞懸浮，分成兩份，加入已有2mL10％FBS MEM的六孔板。繼續(xù)用1mL10％FBS MEM洗cuvette，仍分成兩份加入六孔板，使得終體積為3.5mL。
(6)將六孔板放在適合病毒生存條件(33℃，5％CO2孵箱)下培養(yǎng)細(xì)胞。
(7)電轉(zhuǎn)后19h移去培養(yǎng)基，用3mL OptiMEM沖洗細(xì)胞，每毫升OptiMEM含有低濃度的青/鏈霉素，收集上清-80℃保存。病毒生長的高峰在電轉(zhuǎn)后2-3天即可以達(dá)到。
同時，用電轉(zhuǎn)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和陽離子轉(zhuǎn)染將重組病毒在表8中的細(xì)胞系上進(jìn)行實(shí)驗，實(shí)驗結(jié)果如表8所示，用脂質(zhì)體和陽離子轉(zhuǎn)染COS-7或MDCK可以有陽性結(jié)果，但拯救的效率較低，實(shí)驗具有不可重復(fù)型，而Vero細(xì)胞電轉(zhuǎn)的方法，其病毒拯救的效率可達(dá)到100％。因此最適合流感病毒的大規(guī)模培養(yǎng)，電轉(zhuǎn)的方法效率也是最高的。
表8.不同的細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染方法在病毒拯救上運(yùn)用的比較
注Lipo代表脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，CaPO4代表陽離子轉(zhuǎn)染，Electroporation代表電轉(zhuǎn)。(1)(2)(3)方法參考盧圣棟《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗技術(shù)》。
2、流感減毒活病毒的純化從細(xì)胞培養(yǎng)的流感病毒用超濾包、蔗糖梯度超速離心或柱層析，進(jìn)行重組A型H1N1、H3N2亞型流感病毒和重組B型流感病毒的濃縮和純化，以用于疫苗流感病毒的制備。
實(shí)施例4.疫苗的制備與效果評價1、疫苗的制備將收獲并純化好的重組H1N1、H3N2和B型流感病毒以HA含量1∶1∶1的質(zhì)量比混合，并加入保護(hù)劑(0.1-0.5％海藻糖或殼聚糖，0.1-0.3％明膠，0.2-0.8％蔗糖，0.1-0.3％乳膠蛋白和0.1-0.8％白蛋白)，制備重組流感三價減毒活疫苗的滴鼻劑，或不加佐劑制備成注射劑型，或加入10-20％CTB制備成透皮劑型。重組A型H1N1、H3N2亞型流感病毒或重組B型流感病毒分別制成重組A型H1N1亞型流感減毒活疫苗(重組H1N1流感病毒減毒活疫苗)、重組A型H3N2亞型流感減毒活疫苗(重組H3N2流感病毒減毒活疫苗)或重組B型流感病毒活疫苗的滴鼻劑、注射劑或透皮劑。
2、疫苗的免疫原性評價將制備的重組流感三價減毒活疫苗(重組A型H1N1亞型流感減毒活疫苗、重組A型H3N2亞型流感減毒活疫苗和重組B型流感病毒活疫苗以HA含量1∶1∶1的質(zhì)量比混合得到的疫苗)、重組A型H1N1亞型流感減毒活疫苗、重組A型H3N2亞型流感減毒活疫苗和重組B型流感病毒活疫苗分別進(jìn)行噴鼻粘膜免疫，同時以A/AnnArbor/6/60作為重組A型H1N1亞型流感病毒減毒活疫苗和重組A型H3N2亞型流感病毒減毒活疫苗的陽性對照，B/AnnArbor/1/66作為重組B型流感病毒減毒活疫苗的陽性對照，以未接種病毒的雞胚尿囊液為陰性對照，流感三價滅活疫苗(購自中國天壇藥業(yè))作為陽性對照。免疫方案如表9。
表9.小鼠免疫方案
注5×106EID50相當(dāng)于50ug HA。
分別于0d、14d、21d噴鼻免疫Balb/c小鼠三次，于第28天取動物的唾液、肺臟及血清標(biāo)本，測定每份標(biāo)本的抗體效價，用0.5mlPBS注入小鼠口腔，收集唾液測定其IgA含量，肺組織裂解標(biāo)本的制備處死小鼠，打開喉部，取出肺臟并用PBS清洗，研磨肺組織并離心勻漿去處細(xì)胞組織，收集上清液并儲存于-20℃，用于IgA效價測定。IgG和IgA效價測定使用商品化甲型或乙型流感病毒ELISA檢測試劑盒(Genzyme Virotech)。37℃孵育2小時后加入羊抗鼠IgG或IgA抗體(Pharmigen)及底物液和顯色液檢測特異性IgG和IgA抗體效價。HAI效價測定取小鼠血液，按照Palmer et al指定方法測定甲型和乙型流感病毒HAI(紅細(xì)胞凝集抑制實(shí)驗)效價。唾液、血清及肺組織裂解物中IgA抗體效價和血清中IgG與HAI效價測定結(jié)果如表10所示，表明重組流感三價減毒活疫苗免疫原性好于重組A型H1N1、H3N2和重組B型流感病毒減毒活疫苗的效果，且重組流感三價減毒活疫苗、重組A型H1N1、H3N2和重組B型流感病毒減毒活疫苗都好于流感三價滅活疫苗的效果，與陽性對照組差別不明顯。其中滴鼻免疫IgA的含量高于肌肉注射，但I(xiàn)gG含量差別并不明顯。
表10.鼻粘膜免疫后抗體滴度的檢測
3、疫苗免疫保護(hù)效果評價重組流感三價減毒活疫苗、重組A型H1N1流感病毒減毒活疫苗、重組A型H3N2流感病毒減毒活疫苗和重組B型流感病毒減毒活疫苗分別噴鼻免疫動物三次后7d，用50LD50甲、乙型流感病毒野生株A/AnnArbor/6/60、B/AnnArbor/1/66(購于中國CDC國家流感中心)氣溶膠攻擊，其免疫保護(hù)效果是重組流感三價減毒疫苗好于重組A型H1N1、H3N2和重組B型流感病毒減毒活疫苗的免疫保護(hù)效果，且重組流感三價減毒活疫苗、重組A型H1N1、H3N2和重組B型流感病毒減毒活疫苗都好于流感三價滅活疫苗(購自中國天壇藥業(yè))的免疫保護(hù)效果(表11)。
表11.重組流感三價減毒活疫苗、重組A型H1N1、H3N2和重組B型流感病毒減毒活疫苗和流感三價滅活疫苗的免疫保護(hù)效果
4、疫苗的穩(wěn)定性評價重組流感三價減毒活疫苗、重組A型H1N1、H3N2和重組B型流感病毒減毒活疫苗在不同溫度下穩(wěn)定性觀察，通過電鏡觀察病毒形態(tài)、HA特異性含量與最初的量、病毒滴度可知，放-70℃可保存二年，-20℃可保存一年，4℃可保存三個月，表明重組流感三價減毒活疫苗、重組A型H1N1、H3N2和重組B型流感病毒減毒活疫苗具有很好的穩(wěn)定性。
5、疫苗的安全性評價重組流感三價減毒活疫苗、重組A型H1N1、H3N2和重組B型流感病毒減毒活疫苗通過噴鼻或腹腔免疫Balb/c小鼠、SD大鼠、豚鼠、雪貂動物，免疫劑量是0.5-1.0ml，共三次，沒有出現(xiàn)異常毒性和過敏反應(yīng)，表明重組流感三價減毒活疫苗、重組A型H1N1、H3N2和重組B型流感病毒減毒活疫苗具有很好的安全性。
序列表<160>19<210>1<211>2341<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1agcgaaagca ggcaaaccat ttgaatggat gtcaatccga ccttactttt cttgaaagtt 60ccagcgcaaa atgccataag tactacattc ccttatactg gagatcctcc atacagccat 120gggacaggaa caggatacac catggacaca gtcaacagaa cacatcaata ttcagaaaag 180gggaagtgga caacaaacac ggaaactgga gcgcaccaac ttaacccaat tgatggacca 240ctacctgagg acaatgaacc aagtggatat gcacaaacag actgcgtcct ggaagcaatg 300gctttccttg aagaatccca cccaggaatc tttgaaaact cgtgtcttga aacgatggaa 360gttattcaac aaacaagagt ggacaaactg acccaaggtc gtcagaccta tgattggaca 420ttgaacagaa atcagccggc tgcaactgcg ctagccaaca ctatagaggt cttcagatcg 480aatggcctga cagctaatga atcgggaagg ctaatagatt tcctcaagga tgtgatagaa 540tcaatggata aagaggagat ggaaatcaca acacacttcc aaagaaaaag aagagtaaga 600gacaacatga ccaagaaaat ggtcacacaa cgaacaatag gaaagaagaa gcaaagattg 660aacaagagaa gctatctaat aagagcactg acattgaaca caatgactaa agatgcagag 720agaggtaaat taaagagaag agcaattgca acacccggta tgcagatcag agggttcgtg 780tactttgtcg aaacactagc gagaagtatt tgtgagaagc ttgaacagtc tgggcttccg 840gttggaggta atgaaaagaa ggctaaactg gcaaatgttg tgcgaaaaat gatgactaat 900tcacaagaca cagagctctc tttcacaatt actggagaca ataccaaatg gaatgagaat 960caaaatcctc ggatgttcct ggcgatgata acatacatca caagaaatca acctgaatgg1020tttagaaacg tcctgagcat cgcacctata atgttctcaa ataaaatggc aagactaggg1080aaaggataca tgttcaaaag caagagcatg aagctccgaa cacaaatacc agcagaaatg1140ctagcaagta ttgacctgaa atactttaat gaatcaacaa gaaagaaaat cgagtaaata1200aggcctctcc taatagatgg cacagtctca ttgagtcctg gaatgatgat gggcatgttc1260aacatgctaa gtacagtctt aggagtctca atcctgaatc ttggacaaaa gaagtacacc1320aaaacaacat actggtggga cggactccaa tcctctgatg acttcgccct catagtgaat1380gcaccaaatc atgatggaat acaagcaggg gtggatagat tctacagaac ctgcaagcta1440gtcggaatca atatgagcaa aaagaagtcc tacataaata ggacagggac atttgaattc1500acaagctttt tctatcgcta tggatttgta gccaatttta gcatggagct gcccagcttt1560ggagtgtctg gaattaatga atcggctgat atgagcattg gggtaacagt gataaagaac1620aacatgataa acaatgacct tgggccagca acagcccaac tggctcttca actattcatc1680aaagactaca gatatacgta ccggtgccac agaggagaca cacaaattca gacaaggaga1740
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<223>
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1.一種制備重組流感病毒的方法，由以下步驟組成1)將來自于A型或B型流感病毒冷適應(yīng)株的PB2編碼基因、PB1編碼基因、PA編碼基因、M編碼基因、NS編碼基因和NP編碼基因，以及來自于當(dāng)年流行的A或B型流感病毒毒株的HA編碼基因和NA編碼基因分別插入真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒中得到8個重組表達(dá)質(zhì)粒；所述8個重組表達(dá)質(zhì)粒為含有PB2編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒、含有PB1編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒、含有PA編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒、含有M編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒、含有NS編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒、含有NP編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒、含有HA編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒和含有NA編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒；2)將所述8個重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳細(xì)胞中，培養(yǎng)所述哺乳細(xì)胞，得到重組A型流感減毒病毒或重組B型流感減毒病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述A型流感病毒的冷適應(yīng)株為A/AnnArbor/6/60變異體；所述B型流感病毒的冷適應(yīng)株為B/AnnArbor/1/66變異體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒為如圖1所示的pAD3000。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述8個重組表達(dá)質(zhì)粒選自下述三個共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組中的任意一組1)A型H1N1亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組pADAPB2、pADAPA、pADANP、pADAAM、pADANS、pADAPB1、pADA1NA和pADA1HA；2)A型H3N2亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組pADAPB2、pADAPA、pADANP、pADAAM、pADANS、pADAPB1、pADA3NA和pADA3HA。3)B型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組pADBPB2、pADBPA、pADBNP、pADBM、pADBNS、pADBPB1、pADBHA和pADBNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述哺乳細(xì)胞為293T細(xì)胞、COS7細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、VERO細(xì)胞、WI-38、HL-8、Hela細(xì)胞或Chang C/I/L/K。
6.由權(quán)利要求1至5中任一所述的方法制備的重組流感病毒。
7.一種流感病毒疫苗，它的活性成分為由權(quán)利要求1至5中任一所述的方法制備的重組A型流感減毒病毒和/或重組B型流感減毒病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的疫苗，其特征在于所述重組A型流感減毒病毒為A型H1N1亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組導(dǎo)入哺乳細(xì)胞中得到的重組流感減毒病毒，和/或A型H3N2亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組導(dǎo)入哺乳細(xì)胞中得到的重組流感減毒病毒；所述A型H1N1亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組由pADAPB2、pADAPA、pADANP、pADAAM、pADANS、pADAPB1、pADA1NA和pADA1HA組成，所述A型H3N2亞型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組由pADAPB2、pADAPA、pADANP、pADAAM、pADANS、pADAPB1、pADA3NA和pADA3HA組成；所述重組B型流感減毒病毒為B型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組導(dǎo)入哺乳細(xì)胞中，得到的重組流感減毒病毒；所述B型流感病毒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組由pADBPB2、pADBPA、pADBNP、pADBM、pADBNS、pADBPB1、pADBHA和pADBNA組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的疫苗，其特征在于所述流感病毒疫苗為滴鼻劑或注射劑或透皮劑；所述重組A型流感減毒病毒和/或重組B型流感減毒病毒不加佐劑直接制備成注射劑型；所述重組A型流感病毒和/或重組B型流感病毒加入保護(hù)劑制成滴鼻劑；所述重組A型流感減毒病毒和/或重組B型流感減毒病毒加入10-20％CTB制成透皮劑；所述保護(hù)劑由0.1-0.5％海藻糖或殼聚糖，0.1-0.3％明膠，0.2-0.8％蔗糖，0.1-0.3％乳膠蛋白和0.1-0.8％白蛋白組成；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
10.一種培養(yǎng)流感病毒的方法，是在293T細(xì)胞、COS7細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、VERO細(xì)胞、WI-38、HL-8、Hela細(xì)胞或Chang C/I/L/K細(xì)胞中培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的重組流感病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組流感病毒及其制備方法與應(yīng)用。該重組流感病毒按照以下方法制備1)將來自于A型或B型流感病毒的冷適應(yīng)株的PB2編碼基因、PB1編碼基因、PA編碼基因、M編碼基因、NS編碼基因和NP編碼基因，以及來自于當(dāng)年流行的致病流感病毒株的HA編碼基因和NA編碼基因分別插入真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒中得到8個重組表達(dá)質(zhì)粒；2)將所述8個重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳細(xì)胞中，培養(yǎng)所述哺乳細(xì)胞，得到重組A型流感病毒或重組B型流感病毒。用本發(fā)明的重組流感病毒作為減毒活疫苗具備廣泛的適用性，并可激活有效的粘膜免疫和系統(tǒng)免疫。本發(fā)明用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)替代雞胚生產(chǎn)疫苗病毒抗原，可以解決由雞胚培養(yǎng)帶來的異源蛋白和標(biāo)準(zhǔn)化的等問題。
文檔編號C12N15/40GK1810961SQ200610007909
公開日2006年8月2日 申請日期2006年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月22日
發(fā)明者王希良, 羅德炎, 楊鵬輝, 王棟 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所