一種耐高溫乳糖酶的制備方法

專利名稱：一種耐高溫乳糖酶的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種酶的制各方法，尤其涉及一種利用桿狀病毒表達系統生產耐高溫乳糖酶的方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
桿狀病毒表達系統這一生物反應器是八十年代建立起來的。自從1983年首次利用桿狀病毒表達系統高效表達了人的α-干擾素以來(Smith，Mol.CellBiol.，32156-2165，1983)，已有數十個外源基因得到了高效表達，僅我國就有α-干擾素(楊冠珍等，生物化學與生物物理學報，22355-361，1990)、慈菇蛋白酶抑制劑(季平等，蠶業科學，21223-227，1995)、馬立克氏病毒糖蛋白B(肖慶利等，蠶業科學，23104-108，1997)等多種。利用此系統來生產耐高溫乳糖酶的優點在于1.這一表達系統的表達效率極高，產量可達10毫克級/蟲的水平，亦即每頭蠶3000U以上。因而可大大降低耐高溫乳糖酶的生產成本并使耐高溫乳糖酶大規模生產成為可能；2.這一表達系統為真核表達系統，其表達的外源蛋白質可進行翻譯后修飾，使其在生化性質和生物活性等與天然產品相似，這為表達出的耐高溫乳糖酶具有正常的生物學活性提供了保證。3.用此系統生產的耐高溫乳糖酶只需高溫就可純化，降低了生產成本。目前，桿狀病毒表達系統，尤其是其中的家蠶(Bm)-家蠶桿狀病毒(BmNPV)表達系統是世界上最具有商業開發價值的真核生物個體表達系統之一。
從耐高溫古微生物中克隆的CelB基因曾在大腸桿菌表達系統(VoorhorstW.，et al，J.Bacteriol.，177，7105-7111，1995；Lebbink J.，et al，Methods Enzymol，330，364-379，2001)和畢赤酵母系統(Smith J.，et al.，Biotechnol.Bioeng.，79(7)713-723，2002)中進行了表達，但是表達量均很低，不足以大規模生產。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種高效、廉價、大規模的耐高溫乳糖酶的制備方法。
本發明所要解決的技術問題是通過以下技術途徑來實現的一種耐高溫乳糖酶的制備方法，包括以下步驟將耐高溫乳糖酶基因構建到桿狀病毒運載載體上，得到重組桿狀病毒運載載體；通過體內或體外重組，將耐高溫乳糖酶基因整合到桿狀病毒的基因組上，得到重組桿狀病毒；用所得到的重組桿狀病毒感染昆蟲宿主；培養被感染的昆蟲宿主使其進行耐高溫乳糖酶的表達；收集、純化所表達的重組耐高溫乳糖酶，即得。
上述制備方法中，所述的耐高溫乳糖酶基因可以為來源于各種高溫微生物、植物等的耐高溫乳糖酶基因，優選為來源于強烈熾熱古細菌(Pyrococcusfuriosus)菌株的CelB基因，該基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，該基因所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
所述的桿狀病毒運載載體可以選自AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUW1-lacZ，BacPAK6，Bac to Pac，Bacmid，BlueBacII(pETL)，p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360，pAc 373，pAcAB3，pAcAB 4，pAcAS3，pAcC129、C4、DZ1，pAcGP67，pAcIE1，pAcJP1，pAcMLF2，pAcMLF 7，pAcMLF 8，pAcMP1，pAcMP 2，pAcRP23，pAcRP 25，pAcRW4，pAcsMAG，pAcUW1，pAcUW 21，pAcUW 2A，pAcUW 2B，pAcUW 3，pAcUW 31，pAcUW 41，pAcUW 42，pAcUW 43，pAcUW 51，pAcVC2，pAcVC 3，pAcYM1，pAcJcC5，pBac 1，pBac 2，pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55，mXIV，pIEINeo，pJVETL，pJVNhe1，pJVP10，pJVrsMAG，pMBac，pP10，pPAK1，pPBac，pSHONEX1.1，pSYN XIV VI+，pSYNVI+wp，pSYNXIV VI-，pVL1391，pVL 1392，pVL1393，pVL941，pVL 945，pVL 985，pVL94，pVTBac，pBM030或pUAC-5，優選為pVL94。由于不同的轉運載體對表達效率的影響非常大，AcMNPV的專用載體pVL1393系列的構建業已證明是比較成功的。據分析，在桿狀病毒生物反應器中表達效率的關鍵在于啟動子的優劣及翻譯起始點附近的序列結構對外源基因的mRNA穩定性及翻譯效率的影響。據此，我們構建了新型的適于家蠶桿狀病毒BmNPV的專用表達載體pVL94(具體構建過程見實施例二)，該專用表達載體能夠在家蠶桿狀病毒中高效表達。
所述的重組桿狀病毒運載載體優選為pVL94-CelB。
所述的桿狀病毒選自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、S1MNPV、SeMNPV或TeNPV，優選為BmNPV。
所述的重組桿狀病毒優選為rBmNPVCelB，該重組桿狀病毒可通過以下方法制備得到將耐高溫乳糖酶基因CelB重組到家蠶桿狀病毒親本株BmNPV的基因組上，替代病毒基因組上的Polyhedrin基因，然后通過空斑篩選技術和PCR檢測技術，獲得攜帶CelB的重組家蠶桿狀病毒rBmNPVCelB。
所述的昆蟲宿主包括對桿狀病毒敏感的昆蟲，如家蠶(Bombyx mori)、野蠶(Bombyx mandarina)、蓖麻蠶(Philosamia cynthia ricim)、樟蠶(Dictyoploca japanica)、樗蠶(Philosamia cynthia pryeri)、柞蠶(Antheraeapernyi)、日本柞蠶(Antheraea yamamai)、野天蠶(Antheraea polyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropis obliqua)、甘蘭夜蛾(Mamestra brassicae)、斜紋夜蛾(Spodoptera littoralis)、秋粘蟲(Spodopterafrugiperda)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)、行軍蟲(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉鈴蟲(Heliothis armigera)、美國棉鈴蟲(Heliothis zea)、煙青蟲(Heliothisassulta)、煙草夜蛾(Heliothis virescens)、東方粘蟲(Pseudaletia separata)或舞毒蛾(Lymantria dispar)等，優選為家蠶(Bombyx mori)。
所述的感染是指將重組病毒通過口食或通過表皮的途徑來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹體，其中，所述的昆蟲幼蟲優選為4或5齡的昆蟲幼蟲，所述的蛹體優選為1-3天的早期嫩蛹。
所述的純化重組耐高溫乳糖酶的方法優選為收集含重組耐高溫乳糖酶的家蠶幼蟲或蛹的體液或整體勻漿，將收集到的體液或整體勻漿高溫處理后，再進行常溫離心，取上清，用105-130℃噴霧溫度進行噴霧干燥，即得純化后的耐高溫乳糖酶；其中所述的高溫通常指80-95℃，優選為90℃；所述的常溫通常指4-42℃，優選為30℃。
一般家蠶桿狀病毒生物反應器的基因工程表達產品的純化方法均在低溫下進行，并要經過一系列的蛋白質(硫酸銨)沉淀、濃縮、透析、柱層析等方法以分離純化所表達的表物。本發明根據表達產物的超耐高溫的酶學特性設計了一個集蛋白質純化和濃縮、干燥為一體的純化方法，具有步驟簡捷、廉價、快速、成本低、安全性高等優點。
本發明的一個最優選技術方案的整體描述將來源于高溫古生物的耐高溫乳糖酶基因CelB，插入到自行構建的病毒運載載體pVL94上，獲得重組病毒運載載體；再通過體內重組將CelB基因轉移到家蠶桿狀病毒親本株BmNPV的基因組上，替代基因組上的Polyhedrin基因，通過空斑篩選技術和PCR檢測技術，獲得攜帶CelB的重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(CelB)；將獲得的重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(CelB)感染家蠶細胞系或穿刺接種1-5齡的家蠶幼蟲或蛹，大量繁殖rBmNPV(CelB)。當rBmNPV(CelB)在蠶體內復制時，CelB在多角體蛋白基因(polh)啟動子控制下表達，產生耐高溫乳糖酶。在感染3-6天(最佳為4.5-5天)后收集含耐高溫乳糖酶的家蠶幼蟲或蛹的體液(或整體勻漿)，高溫處理后，進行常溫離心，去除蠶體蛋白，取上清，用105-130℃噴霧溫度進行噴霧干燥，即得耐高溫乳糖酶。
本發明通過桿狀病毒表達系統，應用昆蟲幼蟲及蛹作為生物反應器大規模生產耐高溫乳糖酶，能夠高效表達耐高溫乳糖酶。例如，每毫升蠶血淋巴可產生3毫克以上的CelB蛋白，活力高達10000U以上，一條蠶(或蛹)產生的酶活力約為2萬單位(或12000單位)以上，在pH 4.0-6.5，溫度80-130℃范圍內，所表達的酶均有很高的活力，有利于酶制劑加工。本發明生產的耐高溫乳糖酶經過純化后，能夠添加到食品、奶制品或飼料中，改進食品、奶制品或飼料中的營養成分，提高食品和飼料的營養價值。
本發明方法生產耐高溫乳糖酶的生產成本也明顯低于利用大腸桿菌表達系統或酵母系統生產耐高溫乳糖酶的成本。
總之，本發明提供了一種高效、廉價、大規模的生產耐高溫乳糖酶的方法，能夠廣泛的應用于食品及飼料生產領域。


圖1 CelB基因在宿主昆蟲體內的表達時相曲線。
圖2耐高溫乳糖酶進行純化和加工后的SDS-PAGE蛋白電泳圖譜。
1，410kDa標準蛋白分子量對照；2未處理的β-glucosidase；3初步純化的β-glucosidase；5野生型對照。
圖3耐高溫乳糖酶在不同pH值條件下的活性。
圖4耐高溫乳糖酶在不同溫度條件下的穩定性。
以下通過實施例來進一步描述本發明的有益效果，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發明的保護范圍。
具體實施例方式
實驗材料1.菌株、病毒株與載體大腸桿菌株E.coli TG1和DH5α購自Promega公司；pVL1393(購自Clontech公司)，家蠶細胞BmN、家蠶核型多角體病毒親本株BmNPV(BmNPV、家蠶細胞BmN也可從Clontech公司購買得到)由中國科學院上海生化所吳祥甫研究員惠贈；家蠶品種JY1由中國農業科學院蠶業研究所農業部家蠶生物技術重點開放實驗室保存；高溫古菌菌株購自Japan Collection of Microorganisms，RIKEN。
2.酶與試劑限制性內切酶、連接酶、RNA酶、Proteinase K為Promega公司產品。
3.生化試劑IPTG、X-Gal、SDS及pNPG為Sigma公司產品。過硫酸銨、TEMED、丙烯酰胺及甲叉雙丙烯酰胺為Promega公司產品。Lipofectin、低融點瓊脂糖LMP、PCR試劑盒、細胞培養基TC-100、胎牛血清及其他試劑購于GIBCO-BRL公司。
4.培養基大腸桿菌培養基為LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)；家蠶細胞培養基為TC-100(購自Gibco公司或Sigma公司)。
說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆試驗手冊》(Sambrook等編著，科學出版社，1992年版)一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。
實施例一、CelB基因的克隆和序列分析1、含CelB基因的耐高溫強烈熾熱古細菌(Pyrococcus furiosus)基因組DNA的制備(1)挑取單菌落，過夜培養。
(2)12,000rpm離心2min，去上清。
(3)沉淀中加入500μl含25％蔗糖的0.05M Tris-Cl(pH 8.0)緩沖液，混勻重懸，加入100μl5mg/ml溶菌酶，混勻，20℃溫育1hr。
(4)加入SET溶液(150mM NaCl，1Mm EDTA，20mM pH 8.0的Tris-Cl)，500μl5％SDS和100μl20mg/ml蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1hr。
(5)加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1)，混勻，11,000g離心5min，上清移入新管。
(6)加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，混勻，11,000g離心5min，上清移入新管。
(7)加入等體積氯仿，混勻，11,000g離心5min，上清移入新管。
(8)加入2倍體積無水乙醇，輕輕混勻至DNA沉淀，11,000g離心5min，去上清。
(9)沉淀中加入1ml 70％酒精。
(10)11,000g離心5min，去上清，抽干后加入50μl 0.1×TE溶解，于-20℃保存。
2、PCR擴增CelB基因產物化學合成CelB基因5’端和3’端引物5’-GAG GGA TCC AAT ATG AAGTTC CCA AAA AAC TTC ATG T-3’(Forward)和5’-AAA GAA TTC TGGCTA CTT TCT TGT AAC AAA TTT GAG-3’(Revise)。用步驟1中制備的基因組DNA作為模板進行PCR反應，擴增CelB基因。
PCR反應體系見表1，PCR反應過程94℃變性10分鐘；94℃1分鐘，53℃1分30秒，72℃3分鐘，共35個循環。最后72℃延伸反應10分鐘。
表1 PCR反應體系

3、PCR產物的純化將PCR擴增的CelB基因產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，發現擴增出約1.4kb的片段。在紫外燈下用滅菌手術刀切取含相應DNA片段的凝膠，然后用Geneclean試劑盒進行純化。方法如下切取凝膠片段并稱重，將其放入滅菌的1.5ml小離心管中，加入3倍(v/w)體積的6MNaI，37℃將凝膠溶解后，加入10μl玻璃奶(Glass milk)，混勻后室溫下放置5分鐘，使DNA充分吸附在玻璃奶上，12,000rpm離心5秒鐘，再用New Wash溶液重懸沉淀并離心，重復3次。將沉淀晾干后加入30μl 0.1×TE Buffer溶解DNA，離心后取上清作進一步分析。
4、酶切與連接反應酶切反應純化后DNA用BamHI和EcoRI雙酶切分析，反應總體積為50μl，其中純化的PCR產物10μl，10×酶相應緩沖液5μl，兩種酶各為1μl，無菌水補足體積。37℃反應2小時以上。將轉移質粒pGEM-3Z作同樣酶切反應。反應結束后于65℃滅活10分鐘。
連接反應連接總體積15μl，PCR產物8μl，載體1μl，5×T4DNA連接緩沖液3μl，T4DNA連接酶1μl，無菌水補足體積，12～14℃連接過夜。
5、大腸桿菌的遺傳轉化用75mM CaCl2制備大腸桿菌TG1感受態細胞。取步驟4中制備的連接混合物5μl，加到200μl感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘，42℃熱激2分鐘，迅速置于冰上1～2分鐘，加入已溫育至37℃的LB培養基500μl，37℃培養1小時，取100～200μl涂布于含100μg/ml氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養基平板上，37℃倒置培養過夜。
6、質粒DNA的制備(1)從轉化的LB平板上挑取單個菌落，接種于3ml含100μg/ml Amp的LB培養基中，37℃培養過夜。
(2)取1.5ml菌液于小離心管中，3,500rpm離心4min，去上清。
(3)加入Solution I 150μl，混勻后置于冰上15min。
(4)加入Solution II 300μl，氯仿150μl，輕輕混勻后靜置5min。
(5)加入Solution III 450μl，混勻后置于冰上15min。
(6)11,000g離心10min，上清移入新管。
(7)加入異丙醇450μl，混勻后置于4℃15min。
(8)11,000g離心6min，去上清。
(9)加入TER 250μl，混勻后置于37℃20min。
(10)加入PPt Buffer 300～350μl，混勻后靜置15min。
(11)11,000g離心6min，去上清。
(12)加入75％乙醇400μl。
(13)11,000g離心3min，倒掉乙醇，抽干后加入0.1×TE Buffer 100μl溶解，于-20℃保存。
7、重組子的鑒定用BamHI和EcoRI雙酶切步驟6中制備的質粒DNA，電泳后出現約1.4kb的DNA條帶的質粒為重組運載質粒。將重組質粒pGEM-3Z(CelB)進行雙向測序，測序結果見SEQ ID NO1，所推導的氨基酸序列見SEQ ID NO2所示。
實施例二、重組轉移載體pVL94(CelB)的構建首先設計了一對突變引物，該引物序列如下Primer15’gggatcccgatggtgggggtgtatgaataattcggaatatttPrimer25’aaagcttaactttatcc aataatatat tatgtataPrimer1將多角體的起始密碼子ATG突變為ATT，同時在5′端引入了BamH I位點，保留了35bp的多角體基因序列以穩定外源基因的轉錄產物和提高翻譯效率；在反向引物Primer2中引入了HindIII位點以利于基因克隆。
以野生BmNPV的DNA為模板進行PCR擴增，將擴增片斷用BamH I、HindIII雙酶切后，克隆入pUC18(購自Gibco公司)的HindIII和BamH I位點，得載體pUC-BH，進一步用BamH I和Sal I酶切pVL1393載體(購自Clontech公司)得其3’端同源序列，將之克隆入已含有啟動子及5′端同源序列的BamH I和EcoR I雙酶切的載體pUC-BH中通過連接，Klenow補平，將連接產物轉化大腸桿菌TG1，篩選得到適于家蠶桿狀病毒高表達的轉移載體pVL94。
將實施例一中所制備的質粒pGEM-3Z(CelB)用BamHI和EcoRI雙酶切，按實施例一中步驟3的方法純化CelB基因片段，與經同樣酶切的桿狀病毒轉移載體pVL94連接后轉化大腸桿菌TG1，篩選得到重組轉移載體pVL94-CelB。
實施例三、家蠶核多角體病毒親本株BmNPV的繁殖及病毒DNA的制備按GIBCO公司產品說明配制1×TC-100培養基，用2N NaOH將pH調至6.22，過濾除菌后的培養基補加10％胎牛血清，27℃下培養家蠶細胞Bm-5。用家蠶核多角體病毒親本株BmNPV感染對數生長期的細胞約50ml，感染復數為1，3～4天后收集病毒感染液，離心(5,000rpm×10min)，除去沉淀，上清用25,000rpm離心1小時，除上清，用1ml病毒DNA抽提液(1,000ml中含Tris 12.1g，EDTA 33.6g，KCl 14.1g，pH7.5)懸浮病毒粒子沉淀，轉移至1.5ml離心管中，加入蛋白酶K至終濃度為50μg/ml，50℃保溫2小時，再加入35％的Sarkorsel至終濃度為1％，繼續于50℃保溫2小時，分別用等體積的苯酚、苯酚∶氯仿(1∶1)氯仿依次抽提，將上層水相轉移到一個新管中，加入1/10體積的3M NaCl，再加入2倍體積的無水乙醇，-20℃放置2小時以上沉淀病毒DNA，5,000rpm離心10分鐘，沉淀用75％乙醇洗一次，冷凍干燥。溶解在100μl TE Buffer中，放4℃保存備用。
實施例四、重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(CelB)的構建和獲得1.重組桿狀病毒rBmNPV(CelB)的構建接種大約1×106家蠶細胞于15cm2培養瓶中，細胞貼壁后，除去含胎牛血清(FBS)培養基，用不含FBS的培養基洗三次，加1.5ml無FBS培養基，備用。
向一滅菌管中依次加入1μg家蠶桿狀病毒親本株BmNPV DNA，2μg重組轉移質粒pVL94-CelB DNA和5μl脂質體，用無菌雙蒸水補足體積到60μl，輕輕混勻，靜置15分鐘后，逐滴加入到上述培養瓶中進行共轉染。27℃培養4小時后補加1.5ml無血清培養基和300μl FBS(購自Invitrogen公司)。27℃恒溫培養4～5天，收集上清液用于重組病毒的篩選。
2.重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(CelB)的篩選和純化接種適量家蠶細胞(約70～80％)于35mm小平皿中，細胞貼壁后，吸去培養基，將共轉染上清進行不同濃度稀釋，取1ml共轉染液加到貼壁細胞中，分布均勻。27℃感染1小時后，吸去感染液，將2％低融點瓊脂糖凝膠于60℃水浴中融化，冷至40℃與40℃預熱的2×TC-100培養基(含20％FBS)混合均勻，每平皿加4ml膠，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培養3～5天，顯微鏡觀察。將不含有多角體的空斑挑選出來，重復以上步驟，經過2～3輪的純化獲得純的重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(CelB)。
3.重組病毒rBmNPV(CelB)在家蠶細胞中的擴增將重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(CelB)感染正常生長的BmN細胞，培養3天后收集上清液，上清液中即含有大量的重組病毒rBmNPV(CelB)。
4.重組病毒的鑒定利用PCR方法分析外源基因整合。游離病毒基因組DNA的提取方法如下取病毒上清150μl，加入150μl(0.5mol/L)的NaOH后混勻，再加入20μl(8mol/L)的醋酸銨，混勻后用等體積的酚和氯仿分別抽提一次，酒精沉淀后用20μl的TE溶解DNA。寡核苷酸引物為5’-GAG GAT CCA CGA TGA AAG CGA TCT TAA TCC CAT-3’5’-TTG AAT TCA TTA CAA ACT GCA CGC CGG TAT-3’取上述病毒基因組DNA 1μl進行PCR擴增，反應條件為94℃變性5min、94℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 1min，30個循環，最后72℃延伸5min。電泳鑒定擴增產物。
實施例五、CelB基因在家蠶中的表達本實驗所用的家蠶高表達品種為JY1(由本發明人實驗室保存)。JY1品種家蠶飼養按呂鴻聲主編的《中國養蠶學》(上海科學技術出版社，1991)的常規方法進行。餉食后48h選擇平均體重相同的15頭家蠶為一組，每頭蠶接種約1.0×105rBmNPV(CelB)，即5μl接種液中含2.0×107pfu/ml的rBmNPV(CelB)，共12組，在病毒感染后分別按60h、72h、84h、96h、108h、120h的時間取血樣并測定CelB酶活力，重復三次。從感染病毒60h開始，CelB開始表達，隨著時間的增加，所表達的酶活也隨之增加，在病毒感染后120小時達最高，每ml蠶血淋巴CelB酶活力達10,199.5單位。表達時相曲線圖見圖1。
實施例六、CelB基因在家蠶蛹體中表達本實驗所用的家蠶蛹為高表達品種為JY1(由本實驗室保存)。JY1品種家蠶飼養按呂鴻聲主編的《中國養蠶學》(上海科學技術出版社，1991)的常規方法進行。結繭七天后選擇平均體重相同的15粒蠶蛹為一組，每頭蛹接種約1.0×105rBmNPV(CelB)，即5μl接種液中含2.0×107pfu/ml的rBmNPV(CelB)，共12組，在病毒感染后按60h、72h、84h、96h、108h、120h的時間取血樣并測定CelB酶活力，重復三次。從感染病毒60h開始，CelB開始表達，隨著時間的增加，所表達的酶活也隨之增加，在病毒感染后108至120小時達最高，每ml蠶血淋巴CelB酶活力大于10000單位，經酶活測定每條蠶和蛹的表達量高達20,000和12,000國際單位。
實施例七、耐高溫乳糖酶的純化含耐高溫乳糖酶的昆蟲蟲體用一定量的0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH5.0，90℃)或醋酸—醋酸鈉緩沖液稀釋，高速勻漿，90℃保溫15分鐘，使宿主昆蟲的蛋白和DNA充分變性，4℃，2000-10,000rpm×20min高速離心或過濾法去殘渣和變性物，保留上清，用105-130℃噴霧溫度進行噴霧干燥，獲得純化的高溫乳糖酶，純化產物的SDS-PAGE電泳圖見圖2。
實施例八、本發明所制備的耐高溫乳糖酶的特性分析供試酶實施例七所純化的耐高溫乳糖酶。
1.耐高溫乳糖酶的反應最適pH值分別用不同緩沖液配制底物，調節底物pH值，0.1mol/L Na2HPO4-NaAC(Ph 2.5-3.0)、0.1mol/L NaAc-Hac(pH 2.5-6.5)、0.1mol/L Na2HPO4-NaH2PO4(pH 6.0-8.0)，測定在90℃時不同pH條件下反應10分鐘的酶活力，CelB催化反應的最適pH為5.0，當pH值超過6.0時，酶活力急劇下降，在pH值超過8.0時，酶活力幾乎測不出(圖3)。
2.耐高溫乳糖酶的溫度穩定性含耐高溫乳糖酶的血樣用0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH5.0，90℃)稀釋后，分別在90-140℃下油浴15分鐘，迅速用冰浴降溫，10,000rpm×20min離心，取上清稀釋后測定酶活力，以稀釋后未經處理的樣品作對照，比較酶活力。耐高溫乳糖酶活力在溫度90-110℃之間隨溫度的上升酶活沒有改變，至120℃、130℃時則下降約20％，當溫度超過140℃后酶迅速失活(圖4)。
序列表.txtSEQUENCE LI STING<110> 中國農業科學院生物技術研究所中國農業科學院飼科研究所<120> 一種耐高溫乳糖酶的制備方法<130> P0089<160> 2<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 1419<212> DNA<213> 強烈熾熱古細菌(Pyrococcus furiosus)<400> 1atgaagttcc caaaaaactt catgtttgga tattcttggt ctggtttcca gtttgagatg60ggactgccag gaagtgaagt ggaaagcgac tggtgggtgt gggttcacga caaggagaac 120atagcatcag gtctagtaag tggagatcta ccagagaacg gcccagcata ttggcacctc 180tataagcaag atcatgacat tgcagaaaag ctaggaatgg attgtattag aggtggcatt 240gagtgggcaa gaatttttcc aaagccaaca tttgacgtta aagttgatgt ggaaaaggat 300gaagaaggca acataatttc cgtagacgtt ccagagagta caataaaaga gctagagaaa 360attgccaaca tggaggccct tgaacattat cgcaagattt actcagactg gaaggagagg 420ggcaaaacct tcatattaaa cctctaccac tggcctcttc cattatggat tcatgaccca 480attgcagtaa ggaaacttgg cccggatagg gctcctgcag gatggttaga tgagaagaca 540gtggtagagt ttgtgaagtt tgccgccttc gttgcttatc accttgatga cctcgttgac 600atgtggagca caatgaacga accaaacgta gtctacaatc aaggttacat taatctacgt 660tcaggatttc caccaggata tctaagcttt gaagcagcag aaaaggcaaa attcaactta 720attcaggctc acatcggagc atatgatgcc ataaaagagt attcagaaaa atccgtggga 780gtgatatacg cctttgcttg gcacgatcct ctagcggagg agtataagga tgaagtagag 840gaaatcagaa agaaagacta tgagtttgta acaattctac actcaaaagg aaagctagac 900tggatcggcg taaactacta ctccaggctg gtatatggag ccaaagatgg acacctagtt 960cctttacctg gatatggatt tatgagtgag agaggaggat ttgcaaagtc aggaagacct 1020gctagtgact ttggatggga aatgtaccca gagggccttg agaaccttct taagtattta 1080aacaatgcct acgagctacc aatgataatt acagagaacg gtatggccga tgcagcagat 1140agatacaggc cacactatct cgtaagccat ctaaaggcag tttacaatgc tatgaaagaa 1200ggtgctgatg ttagagggta tctccactgg tctctaacag acaactacga atgggcccaa 1260gggttcagga tgagatttgg attggtttac gtggatttcg agacaaagaa gagatattta 1320aggccaagcg ccctggtatt cagagaaata gccactcaaa aagaaattcc agaagaatta 1380gctcacctcg cagacctcaa atttgttaca agaaagtag 1419<210> 2<211> 472<212> PRT<213> 強烈熾熱古細菌(Pyrococcus furiosus)<400> 2Met Lys Phe Pro Lys Asn Phe Met Phe Gly Tyr Ser Trp Ser Gly Phe1 5 10 15
序列表.txtGln Phe Glu Met Gly Leu Pro Gly Ser Glu Val Glu Ser Asp Trp Trp20 25 30Val Trp Val His Asp Lys Glu Asn Ile Ala Ser Gly Leu Val Ser Gly35 40 45Asp Leu Pro Glu Asn Gly Pro Ala Tyr Trp His Leu Tyr Lys Gln Asp50 55 60His Asp Ile Ala Glu Lys Leu Gly Met Asp Cys Ile Arg Gly Gly Ile65 70 75 80Glu Trp Ala Arg Ile Phe Pro Lys Pro Thr Phe Asp Val Lys Val Asp85 90 95Val Glu Lys Asp Glu Glu Gly Asn Ile Ile Ser Val Asp Val Pro Glu100 105 110Ser Thr Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ile Ala Asn Met Glu Ala Leu Glu115 120 125His Tyr Arg Lys Ile Tyr Ser Asp Trp Lys Glu Arg Gly Lys Thr Phe130 135 140Ile Leu Asn Leu Tyr His Trp Pro Leu Pro Leu Trp Ile His Asp Pro145 150 155 160Ile Ala Val Arg Lys Leu Gly Pro Asp Arg Ala Pro Ala Gly Trp Leu165 170 175Asp Glu Lys Thr Val Val Glu Phe Val Lys Phe Ala Ala Phe Val Ala180 185 190Tyr His Leu Asp Asp Leu Val Asp Met Trp Ser Thr Met Asn Glu Pro195 200 205Asn Val Val Tyr Asn Gln Gly Tyr Ile Asn Leu Arg Ser Gly Phe Pro210 215 220Pro Gly Tyr Leu Ser Phe Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Phe Asn Leu225 230 235 240Ile Gln Ala His Ile Gly Ala Tyr Asp Ala Ile Lys Glu Tyr Ser Glu245 250 255Lys Ser Val Gly Val Ile Tyr Ala Phe Ala Trp His Asp Pro Leu Ala260 265 270Glu Glu Tyr Lys Asp Glu Val Glu Glu Ile Arg Lys Lys Asp Tyr Glu275 280 285Phe Val Thr Ile Leu His Ser Lys Gly Lys Leu Asp Trp Ile Gly Val290 295 300Asn Tyr Tyr Ser Arg Leu Val Tyr Gly Ala Lys Asp Gly His Leu Val
序列表.txt305 310 315 320Pro Leu Pro Gly Tyr Gly Phe Met Ser Glu Arg Gly Gly Phe Ala Lys325 330 335Ser Gly Arg Pro Ala Ser Asp Phe Gly Trp Glu Met Tyr Pro Glu Gly340 345 350Leu Glu Asn Leu Leu Lys Tyr Leu Asn Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Met355 360 365Ile Ile Thr Glu Asn Gly Met Ala Asp Ala Ala Asp Arg Tyr Arg Pro370 375 380His Tyr Leu Val Ser His Leu Lys Ala Val Tyr Asn Ala Met Lys Glu385 390 395 400Gly Ala Asp Val Arg Gly Tyr Leu His Trp Ser Leu Thr Asp Asn Tyr405 410 415Glu Trp Ala Gln Gly Phe Arg Met Arg Phe Gly Leu Val Tyr Val Asp420 425 430Phe Glu Thr Lys Lys Arg Tyr Leu Arg Pro Ser Ala Leu Val Phe Arg435 440 445Glu Ile Ala Thr Gln Lys Glu Ile Pro Glu Glu Leu Ala His Leu Ala450 455 460Asp Leu Lys Phe Val Thr Arg Lys465 470
權利要求
1.一種耐高溫乳糖酶的制備方法，包括以下步驟將耐高溫乳糖酶基因構建到桿狀病毒運載載體上，得到重組桿狀病毒運載載體；通過體內或體外重組，將耐高溫乳糖酶基因整合到桿狀病毒的基因組上，得到重組桿狀病毒；用所得到的重組桿狀病毒感染昆蟲宿主；培養被感染的昆蟲宿主使其進行耐高溫乳糖酶的表達；純化所表達的重組耐高溫乳糖酶，即得。
2.按照權利要求1的制備方法，其特征是所述的耐高溫乳糖酶基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.按照權利要求1的制備方法，其特征是所述的桿狀病毒運載載體選自AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUW1-lacZ，BacPAK6，Bac to Pac，Bacmid，BlueBacII(pETL)，p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360，pAc 373，pAcAB3，pAcAB 4，pAcAS3，pAcC129、C4、DZ1，pAcGP67，pAcIE1，pAcJP1，pAcMLF2，pAcMLF7，pAcMLF8，pAcMP1，pAcMP2，pAcRP23，pAcRP25，pAcRW4，pAcsMAG，pAcUW1、pAcUW21，pAcUW2A，pAcUW2B，pAcUW3，pAcUW31，pAcUW41，pAcUW42，pAcUW43，pAcUW51，pAcVC2，pAcVC3，pAcYM1，pAcJcC5，pBac1，pBac2，pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55、mXIV，pIEINeo，pJVETL，pJVNhe1，pJVP10，pJVrsMAG，pMBac，pP10，pPAK1，pPBac，pSHONEX1.1，pSYN XIV VI+，pSYNVI+wp，pSYNXIV VI-，pVL1391、pVL1392、pVL1393，pVL941，pVL945，pVL985，pVL94，pVTBac，pBM030或pUAC-5。
4.按照權利要求3的制備方法，其特征是所述的桿狀病毒運載載體為pVL94。
5.按照權利要求1的制備方法，其特征是所述的重組桿狀病毒運載載體為pVL94-CelB。
6.按照權利要求1的制備方法，其特征是所述的桿狀病毒選自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV或TeNPV，
7.按照權利要求6的制備方法，其特征是所述的桿狀病毒為BmNPV。
8.按照權利要求1的制備方法，其特征是所述的重組桿狀病毒是rBmNPVCelB。
9.按照權利要求1的制備方法，其特征是所述的昆蟲宿主是家蠶(Bombyx mori)。
10.按照權利要求1的制備方法，其特征是所述的純化為收集含耐高溫乳糖酶的家蠶幼蟲或蛹的體液或整體勻漿，將收集到的體液或整體勻漿高溫處理后，再進行常溫離心，取上清，用105-130℃噴霧溫度進行噴霧干燥，即得純化后的產物。
全文摘要
本發明公開了一種新的耐高溫乳糖酶的制備方法，屬于生物技術領域。本發明方法包括以下步驟將耐高溫乳糖酶基因構建到桿狀病毒運載載體上，得到重組桿狀病毒運載載體；通過體內或體外重組，將耐高溫乳糖酶基因整合到桿狀病毒的基因組上，得到重組桿狀病毒；用所得到的重組桿狀病毒感染昆蟲宿主；培養被感染的昆蟲宿主使其進行耐高溫乳糖酶的表達；收集、純化所表達的產物即得。本發明方法可以高效、廉價、大規模的生產耐高溫乳糖酶，所獲得的耐高溫乳糖酶能夠廣泛的應用于食品及飼料生產領域。
文檔編號C12N15/56GK1807609SQ20061000178
公開日2006年7月26日 申請日期2006年1月25日 優先權日2006年1月25日
發明者張志芳, 林旭璦, 姚斌, 陳寅, 張偉, 范云六, 沈桂芳 申請人:中國農業科學院生物技術研究所, 中國農業科學院飼料研究所