專利名稱：用于胚胎干細胞未分化增殖的包括大田軟海綿酸的組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于人類胚胎干細胞未分化增殖的包括大田軟海綿酸(okadai c acid)的培養基組合物，并涉及一種在該培養基組合物中誘導人類胚胎干細胞未分化增 殖的方法。
背景技術：
人類胚胎干細胞(hESCs)是來自胚胎的細胞，它們具有分化為構成人體所有器官 的細胞的潛力。自從Thomson小組(Thomson JA等，Science 1998， 282: 1145-1147 ) 和Reubinoff小組(Reubinoff B等，Nat Biotechnol 2000， 18: 399-404)建立了多 潛能干細胞hESCs以來，多潛能干細胞hESCs已經被用作有效治療被認為是不治之癥的 細胞來源。通常，它們的培養需要MEF (小鼠胚胎成纖維細胞)飼養細胞的支持。不幸 地是，當將hESCs與該小鼠細胞共同培養時，來自該異種飼養的病原具有交叉遷移的風 險，從而限制了它們的醫學應用。
為克服該缺點，致力于獲得人類細胞來源的飼養培養系統或者無飼養培養系統的廣 泛研究已經進行(Richards M等，Nat Biotechnol 2002, 20: 933-936; HovattaO等， Hum R印rod 2003， 18: 1404-1409; Amit M等，Biol R印rod 2003， 68: 2150-2156; Richards M等，干細胞2003, 21: 546-556; XuC等，Nat Biotechnol 2001, 19: 971-974; Rosier等,DevDyn2004， 229: 259-274; Carpenter等,DevDyn 2004， 229: 243-258; Amit等，Biol R印rod 2004, 70: 837-845; SatoN等,Nat Med2004， 10: 55-63; Xu R-H等，Nat Methods 2005, 2: 185-190; XuC等，干細胞2005, 23: 315-323 )。 Hovatta 小組(Hum R印rod 18: 1404, 2003 )報道了一種培養系統，在該培養系統中人包皮成 纖維細胞被用作飼養細胞，以刺激人類胚胎干細胞的產生。Amit (Biol R印rod68: 2150, 2003)和Richards (干細胞21: 546, 2003 )也提供了用于未分化hESCs的生長的人類 來源的飼養細胞系統。Xu小組(Nat Biotechnol 18: 399, 2000)使用MEF來源的CM (條件培養基)和例如昆布氨酸和基質膠的基質建立無飼養培養系統。通過采用由Xu 小組建立的該條件培養基，Rosier (Dev Dyn 229: 259, 2004 )成功地在無祠養條件下 供養hESCs—年或更長。然而，這種條件培養基遭受著將小鼠源的成分保留在培養基中 的缺點。Xu等在2005年發現保持在bFGF中的培養物，既可以單獨地也可以與其它因子
結合，顯示出與MEF-CM對照培養物相似的特性，從而得到即使在沒有條件培養基的情 況下，堿性成纖維細胞生長因子支持未分化人類胚胎干細胞生長的結論(干細胞23: 315, 2005)。同樣Sato等報道到在缺乏飼養細胞(Nat. Med 10: 55, 2004)時使用GSK-3-特異抑制劑BIO通過激活Wnt信號通路可使小鼠和人類胚胎干細胞保持未分化。Xu小組 同樣在補充了 bFGF和BMP拮抗劑Noggin基因(Nat Methods 2: 185， 2005 )的無飼養 培養基中成功供養hESCs。
本發明人在這種背景下在無飼養條件下對hESCs的增殖進行集中并透徹的研究，結 果發現大田軟海綿酸允許未分化的hESCs在缺乏飼養細胞時進行增殖并顯示包括正常干 細胞標記物和染色體組型穩定的特性，從而導致本發明。
發明內容
因此本發明的一個目的是提供用于誘導胚胎干細胞未分化增殖的包括大田軟海綿 酸的培養基組合物。
本發明的另 一個目的是提供誘導胚胎干細胞在所述培養基組合物中進行未分化增 殖的方法。
圖1顯示在無飼養條件下大田軟海綿酸對胚胎干細胞生長的影響。大田軟海綿酸在 (A, B)中添加lnM的量，在(C)中添加0. lnM的量，在(D)中未添加。
圖2顯示人類胚胎干細胞在飼養細胞層(A)和在缺乏飼養細胞(B-D)中的生長。 圖3顯示人類胚胎干細胞在無堿性成纖維生長因子(bFGF)培養系統(A)和在包括
InM大田軟海綿酸的無堿性成纖維生長因子(bFGF)培養系統(B)中的飼養細胞層中的生長。
圖4顯示在根據本發明的無飼養條件下人類胚胎干細胞的生長具有正常染色體組型。
圖5顯示在根據本發明的無飼養條件下生長的人類胚胎干細胞上有表達的未分化標 最佳實施方式
在研究干細胞和其使用中的一個十分重要的技術目標是在分化開始前的未分化狀
態下供養并增殖胚胎干細胞。
根據本發明中的一個實施例，本發明涉及包含能夠誘導胚胎干細胞進行未分化增殖 的大田軟海綿酸的培養基組合物。
在此使用的術語"胚胎干細胞"指來自胚胎的細胞，該細胞在維持其多能性的同時 具有增殖的潛力。
能夠用于本發明中的胚胎干細胞來源于包括人類，猴子，豬，馬，牛，羊，狗，貓， 小鼠，老鼠等的任意動物，并且優選使用哺乳動物的胚胎干細胞，更優選使用人類的胚 胎干細胞。
在此使用的術語"增殖"指細胞數量上的增加，與"生長"具有相同的意思。
在此使用的術語"未分化增殖"指胚胎干細胞增殖，但不增殖為特異性細胞而是增 殖為與該胚胎干細胞具有相同特性的細胞，既增殖為多能性細胞。對本領域的技術人員 顯而易見的是未分化細胞可以從已分化的細胞中容易地辨別出來。例如，未分化細胞的 特征是核子對細胞質的比例高并且核仁突出。
本發明人觀察到胚胎干細胞可以在大田軟海綿酸的存在下在無飼養細胞的培養基 中在未分化的狀態下增殖。
作為蛋白磷酸酯酶2A ( PP2A )的抑制劑，已知大田軟海綿酸抑制ciyc的降解并增 加c-myc的穩定性(Yeh E等，Nat Cell Bio12004， 6: 208-318)。然而，沒有發現關 于大田軟海綿酸在胚胎干細胞增殖中扮演角色的報道。在本發明的一個實施例中，通過 檢測所有未分化ES標記物nanog, oct-4， rexl和Tert,并觀察到正常染色體組型，證 實胚胎干細胞在包括大田軟海綿酸的培養基中甚至在15次繼代移植后保持未分化。因 此，即使在缺乏飼養細胞的情況下，大田軟海綿酸允許胚胎干細胞經歷穩定的未分化增 殖。
而且，大田軟海綿酸代替生長因子bFGF起作用，生長因子bFGF通常使用于胚胎千 細胞的增殖中。因此，大田軟海綿酸可以代替例如bFGF的典型的分化抑制物或與其結 合使用，用于傳統的胚胎干細胞培養使用的飼養細胞和基質中。
在此使用的術語"培養基"指確保干細胞在體外生長和存活的介質，并且它可以包 括通常使用在本領域中所有有關的培養基。該培養基和條件根據干細胞的種類決定。優 選細胞培養基礎培養基(CC麗)，其通常包括碳源，氮源和微量元素。CCMM的實施例包 括，但不限于，DMEM (達爾伯克改良伊格爾培養基)，MEM (最低必需培養基)，BME (基 本培養基)，RPMI1640, F-IO， F-12, aMEM ( a最低必需培養基),GMEM (格拉斯哥最低
基本培養基)，和伊斯科夫改良達爾伯克培養基。在該CCMM中，可以添加例如青霉素， 鏈霉素，慶大霉素等的抗生素。
為了實現本發明的目的，誘導胚胎干細胞的未分化增殖，將大田軟海綿酸添加到對 培養基種類或培養類型不受限制的胚胎干細胞培養基中。在這點上，大田軟海綿酸可以 單獨或與 一種或多種分化抑制劑結合使用。
該培養基必須包括大田軟海綿酸的有效濃度。該術語"有效濃度"指大田軟海綿酸 足以誘導胚胎干細胞的未分化增殖的量。由于低于該有效濃度的濃度不能顯示所需要的 效果并且高于該有效濃度的濃度顯示出細胞毒性，大田軟海綿酸應該在該有效濃度范圍 中使用。決定大田軟海綿酸有效濃度的因素包括胚胎干細胞的來源，培養基的種類，該 培養基的成分，在該培養基中共同使用的分化抑制劑等等。例如，當大田軟海綿酸作為 單一的分化抑制劑在人類胚胎干細胞的培養中使用時，它的有效濃度可以是0. 5至 1. 5nM的數量級。
根據另一個實施例，本發明涉及誘導胚胎干細胞未分化增殖的方法，該方法包括在 包含大田軟海綿酸的培養基中培養它們。
根據本發明，在包括大田軟海綿酸的培養基中，胚胎干細胞可以在非自發分化下增 殖并將未分化保持到所需要的時間點。
胚胎干細胞可以使用傳統方法獲得。例如，人類胚胎千細胞的制備可以根據Thomson 的方法實現(U. S.專利號5843780; Science282; 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133ff. , 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA92: 7844， 1995 )。才艮據本發明包括大田軟海 綿酸的培養基確保胚胎干細胞在不被來自異種飼養例如那些來自病毒和動物的病菌污 染的情況下下完成未分化增殖。
本發明的更好的理解可以通過下面的實施例給出，這些實施例出于說明的目的，而 不是對本發明的限制。
實施例1: hESCs的培養
13.5天的CF1小鼠胎(ORIENT)作為飼養細胞培養hESC系HSF-6 (加利福尼亞大 學，舊金山)。該飼養細胞在DMEM(高糖，Invitrogen)中培養，并補充10%的FBS (HyClone), 0. ImM的0-巰基乙醇，和0. ImM的非必需氨基酸，并隨后用lOug/ml的 絲裂霉素C (sigma)處理1.5小時以結束它們的有絲分裂。隨后，用絲裂霉素C處理過 的飼養細胞以每孔6. 1 x 104細胞密度接種在0. 1%凝膠涂覆的四孔培養皿中。在接種了 該飼養細胞后的當天，接種hESC,并在5-7天時間間隔以機械方式繼代培養。
該hESC在達爾伯克改良伊格爾培養基/F12 (面EM/F12,無丙酮酸鹽)中培養，補 充20%的無(knockout)血清替代品(SR) (Gibco/BRL, Invitrogen, Carlsbad， CA)， 0. 1 mM的e -巰基乙醇，1%的非必需氨基酸(Gibco/BRL ), 100U/ml青霉素G, 100g/ml 鏈霉素，和4ng/ml的hr-bFGF (人類重組堿性成纖維細胞生長因子，Invitrogen)。在 圖2A中，顯示CF1小鼠飼養細胞層上的hESC。
實施例2:大田軟海綿酸對人類胚胎干細胞的影響
大田軟海綿酸對在飼養細胞層上生長的hESCs的影響用大田軟海綿酸在人類胚胎干 細胞培養基中的各種濃度(0.01， 0.1， 1, 10， 100nM)進行評估。在添加10或100nM 的大田軟海綿酸后的第二天(24小時)，由于大田軟海綿酸的細胞毒性，該胚胎干細胞和 該飼養細胞都在該培養基中裂解。相反，在包括lnM或更少的大田軟海綿酸的培養基中， 該胚胎干細胞增殖，顯示與在沒有大田軟海綿酸的培養基中培養的對照組相似的形態， 沒有觀察到大田軟海綿酸的毒性。
實施例3:大田軟海綿酸在無飼養條件下對人類胚胎干細胞的影響。 在沒有飼養細胞下評估大田軟海綿酸對hESCs的影響。0. OlnM, 0. lnM,和lnM的 大田軟海綿酸添加到使用培養系統中，該培養系統沒有條件培養基。在沒有使用例如昆 布氨酸和基質膠的基質的情況下，與前面使用這些基質的培養系統對照，四孔培養皿在 室溫下用0. 1%的凝膠涂覆30分鐘后，該胚胎干細胞機械地分裂。隨后，該胚胎干細胞 在包括O. OlnM, 0. lnM,和lnM的大田軟海綿酸的培養基中接種。
結果，在0. OlnM和O. lnM大田軟海綿酸(圖1C)中的該人類胚胎干細胞以與在沒 有大田軟海綿酸(圖1D)的對照組中相似方式增殖，并且在三次繼代移植后由于所有細 胞都經歷了分化因此沒有觀察到未分化的干細胞。相反，在lnM大田軟海綿酸培養基中 的該人類胚胎干細胞甚至在三次繼代移植后(圖2B-D)仍保持未分化，沒有分化的跡象。 同時觀察到在該祠養細胞層上的該胚胎干細胞中核子對細胞質的比例高(圖2D)。
實施例4:在沒有bFGF下大田軟海綿酸對在飼養細胞層上生長的胚胎干細胞的影響 在胚胎干細胞的未分化增殖中bFGF通常的使用濃度是4ng/ml。分析胚胎干細胞在 沒有bFGF的包括lnM的大田軟海綿酸的培養基中的增殖和分化。在既不包括大田軟海 綿酸也不包括bFGF的培養基中，觀察到生長在飼養細胞層上的所有胚胎干細胞在兩次 或多次繼代移植后分化(圖3A)。在兩次繼代移植后，觀察到在包括lnM大田軟海綿酸 而沒有bFGF的培養基中(圖3B)的人類胚胎千細胞保持未分化。由此證實大田軟海綿 酸代替bFGF起作用。
實施例5:在無飼養條件下ES標記物在hESCs上的表達和hESCs的染色體組型 為檢測hESCs在沒有飼養細胞下是否表達正常ES標記物，使用RT-PCR。使用Trizol 試劑(Invitrogen)分離總RNA。使用500ng的總RNA，低聚(dT ) 12-18mer引物 (Invitrogen ),和AMV反轉錄酶(Roche Molesular Biochemical)進行反轉錄(RT )以 產生cDNA。對于RT-PCR,使用lul的cDNA,每個引物lOpmol,和PCR預混劑(1U Tag DNA聚合酶，250uM dNTPs， lOnMTris-HCL, 40nMKCL和1. 5mM MgCL2 Bioneer, Korea )。 在ES中表達的特異性的對未分化的ES基因標記物nanog ( SEQ ID NOS. : 1和2 )， oct-4 (SEQ ID NOS. : 3和4 ), rexl (SEQ ID NOS. : 5和6)和hTert (SEQ ID NOS.: 7和8)的寡核苷酸在RT-PCR中作為引物使用。)3-肌動蛋白引物(SEQ ID NOS. : 9和 10 )作為陰性對照。就cDNA來說，它來自生長在沒有飼養細胞的5, 10和15次繼代移 植的hESCs中，而生長在飼養細胞層上hESCs作為陽性對照。圖5中的RT-PCR數據顯 示所有ES標記物nanog， oct-4， rexl和該ES表達蛋白hTert在沒有飼養細胞下生長 的hESCs中的表達，作為陽性對照。委托Samkwang Medical Laboratories染色體組型 分析證實在沒有飼養細胞的15次繼代移植后得到的細胞顯示正常染色體組型。因此， 大田軟海綿酸允許在其存在下在無詞養培養系統中hESCs生長，與在飼養細胞層(圖4) 生長的那些hESCs具有相同的基因表達特性和染色體組型。
工業實用性
在此所述,根據本發明的包括大田軟海綿酸的培養基組合物允許hESCs的未分化增 殖，而沒有從來自例如那些病毒和其它動物的異種飼養的病菌交叉遷移的風險。
權利要求
1.一種用于誘導人類胚胎干細胞未分化增殖的培養基組合物，包括大田軟海綿酸。
2. 根據權利要求1所述的培養基組合物，其特征在于，所述胚胎干細胞來源于人類。
3. 根據權利要求2所述的培養基組合物，其特征在于，所述組合物包括0. 5至1. 5nM 的大田軟海綿酸。
4. 一種用于誘導胚胎千細胞未分化增殖的方法，包括在權利要求1所述的培養基組 合物中培養所述的胚胎干細胞。
5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的胚胎干細胞來源于人類。
6. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的培養基組合物包括0.5至 1. 5nM的大田軟海綿酸。
全文摘要
本發明公開了一種用于人類胚胎干細胞未分化增殖的培養基組合物，所述的培養基組合物中含有大田軟海綿酸，和一種在該培養基中誘導人類胚胎干細胞未分化增殖的方法。
文檔編號C12N5/0735GK101180388SQ200580049660
公開日2008年5月14日 申請日期2005年11月18日 優先權日2005年11月18日
發明者全恩暻, 劉承權, 尹炳善, 文哉喜, 樸才汝, 柳炅秀, 鄭惠年, 金埔那, 金明珍, 金淇東 申請人:銀怎株式會社