專利名稱：：革蘭氏陰性菌的lps的脫?；闹谱鞣椒?br>
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及革蘭氏陰性菌LPS的合成和修飾的生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明還涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及針對細菌性病原體的疫苗接種領(lǐng)域。本發(fā)明另外涉及革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陰性細菌脂多糖(LPS)以及包含LPS的組合物，這些可用于藥物和/或獸藥目的，特別是用于制備針對革蘭氏陰性菌例如百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)、畐寸百日咳博德特氏菌(Bordetellaparapertussis)和支氣管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)的疫苗。本發(fā)明另外提供含有脫酰基化LPS的疫苗，以及修飾的和脫毒的LPS在制備全細胞疫苗和無細胞疫苗中的用途。
背景技術(shù)：
：百日咳博德特氏菌感染是百日咳的病因，據(jù)估計全世界每年約有6千萬病例，并致死約355,000人(WHO)，特別是兒童和免疫損害的個體。盡管抗生素(紅霉素)治療是有效的，但到疾病被確診時，細菌毒素常常已經(jīng)造成嚴重的傷害。因此，疾病的預(yù)防是極為重要的。主要的控制措施仍然是進行接種疫苗。通常，針對百日咳感染的疫苗一直是基于百日咳博德特氏菌的全細胞。全細胞百日咳博德特氏菌疫苗(包含通過熱處理、甲醛或其它措施而滅活的全細菌)，一直是自從20世紀50年代早期以來的常規(guī)接種程序。通過全細胞百日咳疫苗的免疫盡管可有效預(yù)防嬰兒的百日咳，已經(jīng)涉及局部的、全身的和神經(jīng)學(xué)反應(yīng)，包括兒童的發(fā)燒、驚厥和腦病。在百日咳免疫后，LPS是造成兒童中不良反應(yīng)的主要原因。在動物的細菌性感染期間，LPS或其脂質(zhì)A部分通過Toll樣受體(主要是TLR-4)的相互作用，來激活先天免疫系統(tǒng)。宿主對脂質(zhì)A的應(yīng)答，包括產(chǎn)生陽離子抗微生物肽、細胞因子、趨化因子和其它免疫刺激分子。在受限制的感染中，對脂質(zhì)A的應(yīng)答有助于清除細菌，但在不可控制的敗血癥中，高水平的循環(huán)細胞因子和促凝物活性可損害微血管系統(tǒng)，并導(dǎo)致革蘭氏陰性感染性休克與彌漫性血管內(nèi)凝血綜合征。盡管在小鼠中的被動免疫實驗已經(jīng)證明針對LPS的抗體可提供一定水平的保護，但沒有關(guān)于LPS在百日咳疫苗中具有保護作用的確鑿證據(jù)。此外，更重要地是，存在于疫苗中的LPS，確實通過強化針對其它抗原的免疫應(yīng)答而提供佐劑活性(K.Mills:ImmunitytoBoWefe//aperftm/s.MicrobesandInfection3:655-677，2001)。安全方面的考慮已經(jīng)負面影響了疫苗的攝入，并促使通過來自百日咳博德特氏菌的高度純化的抗原而研制、制備無細胞的百日咳疫苗。近年來，除了所謂的"全細胞疫苗"或"wcv"之外，一些國家現(xiàn)在已經(jīng)引進了無細胞疫苗或"ACV"。無細胞疫苗通常由1至3種或更多的病原體抗原組成。至于通常使用的百日咳博德特氏菌抗原是；百日咳毒素(PT，通常對其處理來破壞其毒力，同時維持其免疫原性)、絲狀血凝素(FHA)、菌毛以及69kD蛋白質(zhì)或pertactin(Pm)。通常，無細胞疫苗的反應(yīng)原性比全細胞疫苗的反應(yīng)原性低得多。無細胞疫苗發(fā)生全身反應(yīng)(發(fā)燒、嘔吐、焦躁、厭食)和局部反應(yīng)(氣脹、發(fā)紅、熱度、觸痛、硬度、疼痛)的頻率明顯減少。然而，對于無細胞疫苗的保護性免疫是否匹敵全細胞疫苗的保護效應(yīng)，臨床的數(shù)據(jù)仍然是有爭議的。在許多研究中，全細胞疫苗的保護效應(yīng)是更好的，而爭論仍在繼續(xù)，即全細胞疫苗的保護效應(yīng)與其在嬰兒中引起雖然罕見但卻嚴重的副作用的風(fēng)險相比孰輕孰重。現(xiàn)在，正在測試各種免疫模式，其中最多給予六個劑量的無細胞疫苗。最初，全細胞疫苗給藥5次，摻入到常規(guī)疫苗計劃中進行，末次加強在4-6歲時給予。現(xiàn)在推薦無細胞百日咳疫苗給藥6次，其中包括在十幾歲時給予最后一劑(聯(lián)合了白喉-破傷風(fēng)疫苗)。無細胞疫苗看來比全細胞疫苗更安全，但兩者都不能用于以往對百日咳疫苗出現(xiàn)過過敏反應(yīng)的兒童。在本領(lǐng)域中，已經(jīng)充分地證明了百日咳全細胞疫苗的不良副作用(參見S,H.Yeh:Pertussis:persistentpathogen,imperfectvaccines.ExpertRev.Vaccines2:113-127，2003)。盡管現(xiàn)在使用的無細胞疫苗部分地克服了這些不良副作用，但在這些疫苗所提供的保護性免疫仍然是有爭論的，并且留下許多改進的余地。重要的是，在小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)了全細胞疫苗比無細胞疫苗具有更優(yōu)的長效保護(K.Mills:ImmunitytoMicrobesandInfection3:655-677(2001))。另外，無細胞疫苗成本更高，并難以生產(chǎn)、需要對各種抗原進行分離、徹底純化和質(zhì)量控制并以最適量/期望量對它們進行混合和配制。顯然，需要長期研制更好的百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌、支氣管炎博德特氏菌及其它的革蘭氏陰性菌疫苗。發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于制備改進的百日咳疫苗的方法和工具。本發(fā)明公開了新的博德特氏菌蛋白。根據(jù)本發(fā)明，使用這些新的百日咳博德特氏菌、副百日咳鮑特氏菌和支氣管炎博德特氏菌蛋白和編碼這些蛋白的DNA分子，以修飾脂質(zhì)A，從而提供包含至少部分3-0-脫?；暮兔摱镜腖PS的新的百日咳博德特氏菌、副百日咳鮑特氏菌和支氣管炎博德特氏菌菌株及其它革蘭氏陰性菌細胞。本發(fā)明還提供用于接種的改良組合物，其包含博德特氏菌細菌細胞，所述博德特氏菌細菌細胞包含部分3-0-脫?；腖PS,以及藥物組合物，所述藥物組合物包含分離的且至少部分3-(9-脫酰基化的LPS或體外3-0-脫酰基化的LPS。本發(fā)明另外提供了針對3-0-脫?；|(zhì)A和域LPS分子產(chǎn)生的且對其具有特異性的抗體。作為革蘭氏陰性菌外膜的主要組分，已知脂多糖(LPS)對于所述的膜發(fā)揮通透屏障的功能并抵抗補體介導(dǎo)的細胞溶解作用具有重要作用(綜述見1)。它由三個共價連接的結(jié)構(gòu)域組成脂質(zhì)A、核心以及O抗原。脂質(zhì)A形成疏水膜錨著點，并引起LPS的內(nèi)毒素活性。在大腸桿菌Escherichiacoli)中，它由1,4'-二磷酸化的e-l,6-連接的葡糖胺二糖組成，它通過酯或酰胺鍵在位點2、3、2'和3'具有R-3-羥基豆蔻酸殘基取代。二級月桂酰和豆蔻?；謩e在2'-和3'-位點取代R-3-羥基豆蔻酰的羥基(圖1A)。以前的研究表明磷酸基、葡糖胺二糖、以及適當數(shù)目和長度的?；湆τ谥|(zhì)A的生物學(xué)活性是很重要的(1，2，3)。盡管觀測到兩種磷酸酯和酰基鏈數(shù)目以及長度的取代作用模式中的輕微變化，但脂質(zhì)A的基本結(jié)構(gòu)在革蘭氏陰性菌中還是相當保守的(4,5)o在鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellaentericaserovartyphimurium,S.typhimurium)中，通過二元調(diào)控系統(tǒng)PhoP/PhoQ調(diào)控脂質(zhì)A的其它修飾(6，7)(圖1B)。應(yīng)答于低Mg2+水平，傳感激酶(Sensorkinase)PhoQ磷酸化并從而激活轉(zhuǎn)錄激活因子PhoP，這導(dǎo)致激活或抑制40種不同的基因(6，8)。參與脂質(zhì)A修飾的二級調(diào)控系統(tǒng)是PmrA/PmrB二元系統(tǒng)，其自身受到PhoP/PhoQ的調(diào)控(9,10)。具有PhoP/PhoQ系統(tǒng)中的變異的突變體，降低了毒力并增加了對抗微生物肽的敏感性(11,12)。己經(jīng)在其它革蘭氏陰性菌中鑒定了PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB系統(tǒng)的同系物，所述革蘭氏陰性菌包括大腸桿菌、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinapestis)以及銅綠假單胞菌(Pseudmonasaeruginosa)(13，14)。迄今為止，已經(jīng)鑒定了一些修飾脂質(zhì)A的酶。在鼠傷寒沙門氏菌CS.7)^H'wwn'Mw)中發(fā)現(xiàn)，以一或兩個4-氨基-4-脫氧-L-阿拉伯糖(L-Am4N)部分來取代1和4'磷酸基依賴于酶ArnT(15)。近來，PmrC蛋白被鑒定出在鼠傷寒沙門氏菌中介導(dǎo)磷酸乙醇胺(pEtN)加入脂質(zhì)A中(16)。另一種被稱為LpxO的酶，催化脂質(zhì)A的依賴02的羥基化反應(yīng)(17)，并在豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)中鑒定了脂質(zhì)Al-磷酸酶(18)。所有這些酶被認為是位于內(nèi)膜或周質(zhì)間隙中(15，16，17，18)。最近，發(fā)現(xiàn)了位于外膜的修飾脂質(zhì)A的新種類的酶。其中一個是棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶PagP(19)。脂質(zhì)A的棕櫚?；瘜?dǎo)致對陽離子的抗微生物肽的抗性的增加(7)。此外，棕櫚?；|(zhì)A拮抗了LPS誘導(dǎo)的人細胞的激活(20)。在下列菌種中發(fā)現(xiàn)了PagP的同系物鼠傷寒沙門氏菌、百日咳博德特氏菌、支氣管炎博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌、嗜肺軍團菌(￡eg/ow//a;wewmo;7/H7a)、大腸桿菌、以及鼠疫耶爾森氏菌(19,21)。另一種位于外膜的脂質(zhì)A修飾酶是3-0-脫?；窹agL(22)。該酶在鼠傷寒沙門氏菌中被發(fā)現(xiàn)，并表現(xiàn)出水解脂質(zhì)A的3位的酯鍵，從而釋放一級3-羥基豆蔻酰部分(22)。迄今為止，除了在密切相關(guān)的傷寒沙門氏菌種和副傷寒沙門氏菌種中之外，在非重復(fù)或未完成的微生物數(shù)據(jù)庫中沒有發(fā)現(xiàn)pagL的明顯同系物。然而，其它的革蘭氏陰性菌，包括銅綠假單胞菌(尸.aeA"Mgz'"cwa)(14)、豇豆根瘤菌(/丄egM/m'"o^raw)(23)、幽門螺桿菌C^e/z'co6acfer_p_y/on')(24)、禾口戶o咖romo"asg/"gz'va/z's(25)，都含有3-0-脫酰基化脂質(zhì)A類型，這暗示著這些生物體含有與pagL相似活性的酶。本發(fā)明公開了各種革蘭氏陰性菌中的pagL同系物的鑒定法。各種蛋白質(zhì)中的有限序列相似性和發(fā)達的生物信息學(xué)工具被用于鑒定這些同系物和它們的活性位點的殘基。在本說明書中，我們描述了用于在各種革蘭氏陰性菌中異源表達的pagL同系物的存在和用途。盡管與來自沙門氏菌的已知pagL基因的總體序列相似性相當?shù)氐?，但在C末端區(qū)中可鑒定到保守的pagL區(qū)?，F(xiàn)有技術(shù)僅僅描述了來自沙門氏菌的PagL蛋白，并公開了PagL僅在大腸桿菌中異源表達(22)，得到脫?；疞PS。在本領(lǐng)域中，沒有關(guān)于pagL同系物在其它革蘭氏陰性菌中存在的已有數(shù)據(jù)。異源pagL在其它革蘭氏陰性菌中的表達，pagL在其它革蘭氏陰性菌中是否有功能，pagL對其它革蘭氏陰性菌中的脂質(zhì)A/LPS組成、細菌存活力、毒力以及免疫原性的作用，都是未知因素。僅僅已知大腸桿菌中異源沙門氏菌pagL表達的有限數(shù)據(jù)，其中在表達重組人TLR4的細胞中測量了TLR應(yīng)答，但這并不反映革蘭氏陰性菌感染的天然情況(Kawasaki等，JBiolChem,2004)。本發(fā)明的說明書公開了銅綠假單胞菌和支氣管炎博德特氏菌pagL同系物的活性，這點已經(jīng)通過在大腸桿菌和博德特氏菌(^^&&/&中的異源表達得到證實，其中所述的活性導(dǎo)致從脂質(zhì)A上除去了R-3-羥基豆蔻?；?。以人巨噬細胞分析了LPS的生物學(xué)活性的影響。在PagL脫?；饔煤螅竽c桿菌脂質(zhì)A(但非百曰咳博德特氏菌脂質(zhì)A)發(fā)生另一種修飾，這是內(nèi)源棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶PagP的活性的結(jié)果。此外，鑒定出保守組氨酸-絲氨酸對是活性位點殘基，這暗示著類似于絲氨酸水解酶的催化機理。最后，證明了PagL對LPS底物的體外活性。根據(jù)本發(fā)明，可應(yīng)用pagL的生物學(xué)功能，以修飾革蘭氏陰性菌致病力、毒力和免疫原性。這種修飾可發(fā)生在全菌細胞或其部分、組分或衍生的化合物上。本發(fā)明最后提供了針對革蘭氏陰性細菌感染的新疫苗，包含本發(fā)明的革蘭氏陰性細菌的全細胞，或從這些細菌所獲得和/或分離的修飾的脂質(zhì)A/LPS，或體外修飾的LPS/脂質(zhì)A分子。詳細說明定義.本文中"序列相同性"，定義是通過比較序列而測定的兩種或多種氨基酸(多肽或蛋白質(zhì))序列或兩種或多種核酸(多核苷酸)序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域中，"相同性"還意味著通過所述的序列串的匹配而測定的氨基酸或核酸序列之間的序列相關(guān)的程度。通過將一條多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代與第二條多肽序列進行比較，測定兩條氨基酸序列之間的"相似性"。通過包括但不限于下列文獻中描述的已知方法，可很容易地計算"相同性"和"相似性":(ComputationalMolecularBiology,Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversityPress,NewYork,1988;Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.，ed,，AcademicPress,NewYork,1993;ComputerAnalysisofSequenceData,PartI，Griffin，A.M,和Griffin，H.G-，eds.，HumanaPress,NewJersey,1994;SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeine,G.，AcademicPress，1987;以及SequenceAnalysisPrimer,Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.,MStocktonPress,NewYork,簡；以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAMJ.AppliedMath.，48:1073，1988)。測定相同性的優(yōu)選方法，目的在于得到待測序列中的最大匹配。測定相同性和相似性的方法被編輯成可公開獲得的計算機程序。測定兩條序列之間的相同性和相似性的優(yōu)選計算機程序方法，包括例如GCG程序包(Devereux，J等，NucleicAcidsResearch12(1):387(1984))、BestFit、BLASTP、BLASTN以及FASTA(Altschul，S.F.等，J.Mol.Biol.215:403-410，1990)。從NCBI和其它來源可公開獲得BLASTX程序(BLASTManual,Altschul，S.等，NCBINLMNIHBethesda，MD20894;Altschul，S.等，J.Mol.Biol.215:403-410，1990)。眾所周知的SmithWaterman算法也可用于測定相同性。用于多肽序列比較的優(yōu)選參數(shù)包括下列算法(Algorithm):Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:443-453，1970);比較矩陣(Comparisonmatrix):來自Hentikoff和Hentikoff的BLOSSUM62(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:10915-10919，1992);空位罰分(GapPenalty):12;和空位長度罰分(GapLengthPenalty):4。和這些參數(shù)一起使用的程序，是公眾可得到的，例如來自Madison,WI的GeneticsComputerGroup公司的"Ogap"程序。上述參數(shù)是氨基酸比較(沒有末端空位罰分的延續(xù))的缺省參數(shù)。用于核酸比較的優(yōu)選參數(shù)包括下列算法Needleman禾口Wunsch(J.Mol.BioI.48:443陽453，1970);Comparison矩陣匹配=+10，錯配=0;空位罰分50;空位長度罰分3?？墒褂脕碜訫adison(Wisconsin)的GeneticsComputerGroup公司的Gap禾呈序。以上列出都是用于核酸比較的缺省參數(shù)。任選地，在測定氨基酸相似性的程度中，技術(shù)人員也可考慮技術(shù)人員己知的所謂的"保守"氨基酸取代。保守氨基酸取代指具有相似側(cè)鏈的殘基的可互換性。例如，具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸組是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族羥基側(cè)鏈的氨基酸組是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側(cè)鏈的氨基酸組是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸組是苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的氨基酸組是賴氨酸、精氨酸以及組氨酸；具有酸性側(cè)鏈的氨基酸組是天冬氨酸和谷氨酸；以及具有含硫側(cè)鏈的氨基酸組是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。本文中公開的氨基酸序列的取代變體是在所公開的序列中已除去了至少一個殘基并在其位置插入了不同殘基的變體。優(yōu)選地，氨基酸變化是保守的。以下是適于各種天然存在的氨基酸的優(yōu)選的保守取代Ala至Ser;Arg至Lys;Asn至Gin或His;Asp至Glu;Cys至Ser或Ala;Gin至Asn;Glu至Asp;Gly至Pro;His至Asn或Gin;lie至Leu或Val;Leu至lie或Val;Lys至Arg;Gin或Glu;Met至Leu或lie;Phe至Met;Leu或Tyr;Ser至Thr;Thr至Ser;Trp至Tyr;Tyr至Trp或Phe;以及，Val至Ile或Leu。根據(jù)本發(fā)明，當一種DNA片段與另一種DNA片段一起被置于功能性相關(guān)的位置時，是"可操縱連接地"。例如，如果可促進序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動子或增強子是可操作地連接于編碼序列。如果信號序列的DNA表達為參與多肽分泌的前體蛋白，則其是可操作地連接于編碼所述多肽的DNA。通常，可操作地連接的DNA序列是相鄰的，且對于有信號序列的情況，它們既是相鄰的同時也在閱讀相(readingphase)中。然而，增強子不必與轉(zhuǎn)錄受到其控制的編碼序列相鄰。通過在方便的限制酶切位點或插入的連接體或接頭處進行連接，以實施連接。合適啟動子序列的選擇，通常取決于為表達DNA片段而選定的宿主細胞。合適啟動子序列的實例包括本領(lǐng)域中眾所周知的原核和真核啟動子(參見，例如Sambrook和Russell，2001，上文)。轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列通常包括可被宿主識別的異源增強子或啟動子。合適啟動子的選擇取決于宿主，但例如trp、lac的啟動子和噬菌體啟動子、tRNA啟動子和糖解酶啟動子是已知并可得到的(參見，例如Sambrook和Russell，2001，上文)。可使用的表達載體包含復(fù)制系統(tǒng)和轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，以及多肽編碼片段的插入位點。Sambrook和Russell(2001，上文)和Metzger等人(1988，Nature334:31-36)描述了細胞系和表達載體的可行組合的實例。例如，合適的表達載體可在下列宿主中表達酵母，如釀酒酵母(S.cerevisiae);昆蟲細胞，如Sf9細胞；哺乳動物細胞，如CHO細胞；以及細菌細胞，如大腸桿菌或博德特氏菌。在第一個實施方案中，本發(fā)明提供包含脂質(zhì)A3-0-脫酰基酶活性的新的多肽，其中該多肽顯示與SEQIDNo.l具有至少25、30、40、50、60、70、80、90、95、98或99%的氨基酸相同性，并且根據(jù)說明書中所述的分析法(如實施例3中舉例說明的體內(nèi)分析法或根據(jù)實施例9中的體外分析法)，該多肽表現(xiàn)出脂質(zhì)A3-0-脫?；傅幕钚?。具有脂質(zhì)A3-0-脫?；富钚缘亩嚯?，優(yōu)選是根據(jù)SEQIDNo.l的多肽，或是支氣管炎博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌的PagL蛋白或其部分、或其變體，或是包含了具有脂質(zhì)A3-(9-脫?；富钚缘腟EQIDNo.l的至少一部分的融合蛋白。在另一個實施方案中，本發(fā)明包含編碼所述多肽的核酸序列，其中該多肽顯示與SEQIDNo.l具有至少25、30、40、50、60、70、80、90、95、98或99%的氨基酸相同性。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的核酸序列，顯示與分別來自支氣管炎博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌的pagL基因的SEQIDNo.2或SEQIDNo.3的核酸序列具有至少50、60、70、80、90、95、98或99%的相同性。所述的核酸序列是全長編碼序列，或是自其衍生的編碼或非編碼(或互補)部分、片段或甚至是寡核苷酸。本發(fā)明還包括DNA載體，該載體包含本發(fā)明的核酸序列，和/或包含可編碼展現(xiàn)出與SEQIDNo.l具有至少25、30、40、50、60、70、80、90、95、98或99%的氨基酸相同性的肽的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的DNA載體，可以是本領(lǐng)域中已知的任何載體，例如但不限于質(zhì)粒、噬菌體、噬菌粒、粘粒、人工染色體、用于(同源)基因組整合的載體。載體可含有標記，例如提供抗生素抗性的選擇標記、熒光標記、分子標簽等等。用于克隆本發(fā)明的核酸并表達編碼蛋白的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是己知的，例如參考Sambrook等人(MolecularCloning,冷泉港出版社，NY1989)和AusubelF.等人(CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyInterscience，2004)。優(yōu)選本發(fā)明的載體是核酸序列被可操作地連接于調(diào)控序列(例如啟動子、增強子和終止子)的載體，以便所述基因表達并將信使翻譯為脂質(zhì)A3-0-脫?；傅鞍住Ｗ顑?yōu)選載體能在革蘭氏陰性菌宿主細胞中表達并賦予其脂質(zhì)A3-0-脫酰基酶活性，任選地以誘導(dǎo)方式，例如通過質(zhì)粒pMMB67上的誘導(dǎo)型tac啟動子。本發(fā)明還提供能結(jié)合SEQIDNo.l所示的多肽的抗體。如實施例所示，本發(fā)明的抗體可以是通過將本發(fā)明的多肽注入宿主中而激發(fā)的單克隆抗體或多克隆抗體?？贵w可用于診斷目的，例如分析革蘭氏陰性菌中的PagL蛋白或其同系物的表達?？贵w還可用于分離和/或純化表現(xiàn)出脂質(zhì)A3-0-脫?；富钚缘牡鞍?。在另一個方面中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的核酸分子和/或包含編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子的革蘭氏陰性菌。優(yōu)選核酸分子被包括在本發(fā)明的DNA載體中，所述的載體使得編碼的蛋白在革蘭氏陰性菌細胞中表達并將脂質(zhì)A3-0-脫?；富钚蕴峁┙o細胞。優(yōu)選所述的革蘭氏陰性菌是在其基因組中不包含可編碼表現(xiàn)出脂質(zhì)A3-0-脫?；富钚缘墓δ艿鞍椎幕虻募毦渲兴龅牡鞍桌缡桥c如SEQIDNo.l所示的PagL蛋白具有顯著(>40%)的相同性的蛋白。最優(yōu)選地，提供脂質(zhì)A3-(9-脫酰基酶活性的來源將改變革蘭氏陰性菌細胞的細胞壁外膜中的LPS的組分。具有脂質(zhì)A3-(9-脫?；富钚栽吹母锾m氏陰性菌，還可以是包含非功能基因的細菌(例如百日咳博德特氏菌)，其中例如通過突變、移碼或缺失，所述的非功能基因可與如SEQIDNo.2或3所示的核酸序列具有顯著的同源性。然而，即便是在其基因組中包含編碼具有脂質(zhì)A3-0-脫酰基酶活性的蛋白的(部分)功能基因的革蘭氏陰性菌，也可為其提供落入本發(fā)明范圍中的活性的額外來源。革蘭氏陰性菌具有一定水平的脂質(zhì)A3-0-脫?；富钚裕ㄟ^提供本發(fā)明的多肽的額外的和/或增強的表達，可提高所述的活性。優(yōu)選地，這導(dǎo)致細菌中的脂質(zhì)A3-0-脫?；富钚缘乃矔r或持續(xù)增加，直至與野生型細菌相比，細菌的脂質(zhì)A和/或LPS成分被瞬時或持續(xù)改變或修飾的程度。例如，所述的革蘭氏陰性菌是副百日咳博德特氏菌或支氣管炎博德特氏菌，但可選擇任何其它的革蘭氏陰性菌，優(yōu)選致病革蘭氏陰性菌，例如奈瑟氏球菌(iVe^en'a^p.)，腦膜炎奈瑟氏球菌(iV.wem'"g妝fo)、淋病奈瑟氏球菌(iV.go"oT/zoeae)、乳糖奈瑟氏根據(jù)本發(fā)明，包含脂質(zhì)A3-0-脫酰基酶活性或其水平提高的革蘭氏陰性菌，優(yōu)選在細菌細胞壁的外膜中至少部分包含3-0-脫?；闹|(zhì)A和/或LPS類型。或者，在脂質(zhì)A的3-0-脫酰作用之后，本發(fā)明的革蘭氏陰性菌包含具有二級修飾的LPS或脂質(zhì)A類型，例如在脂質(zhì)A的棕櫚酰化、去磷酸化或任何其它的3-0-脫酰化之后的二級修飾。本發(fā)明的細菌細胞的總LPS/脂質(zhì)A中至少10、20、30、40、50、60、70、80或90%為3-0-脫酰基化形式，或者其脂質(zhì)A/LPS中至少10、20、30、40、50、60、70、80或卯％為具有二級修飾的形式，例如但不限于，棕櫚?；蛉チ姿峄Ｔ诹硪粋€方面中，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)部分3-0-脫酰基化的LPS的方法。在第一個實施方案中，所述的方法包括在有助于去乙?；疞PS的合成的條件下培養(yǎng)革蘭氏陰性菌的步驟，和任選地，包括回收脫?；疞PS的步驟。用于培養(yǎng)各種革蘭氏陰性菌的方法是本領(lǐng)域中已知的，例如參見"MethodsforGeneralandMolecularBacteriology"(P.Gerhardt等，Eds,y4膨".c"w5"oc/砂々rM'm6/o/ogy，WashingtonDC，1994)。用于回收、分離和/或純化LPS的方法也是本領(lǐng)域中已知的(MeningococcalVaccines,MethodsandProtocols.A丄Pollard禾卩M.C.J.Maiden,Eds.Chapter12:ConstructionofLPSmutants,pp.155-165.HumanaPress,Totowa，NewJersey,2001)，例如可根據(jù)說明書中所提供的實例進行實施。或者，本發(fā)明提供用于體外生產(chǎn)至少部分3-0-脫?；腖PS或脂質(zhì)A的方法，該方法的步驟包括提供包含粗制或(部分)純化形式的LPS或脂質(zhì)A的組合物，并在有助于體外酶催化3-0-去乙?；臈l件下使該組合物接觸本發(fā)明的多肽或蛋白。所述的條件參見本說明書的實施例9和方法章節(jié)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供包含至少部分3-0-脫酰基化的LPS和/或脂質(zhì)A的組合物，優(yōu)選地總LPS或脂質(zhì)A占的至少10、20、30、40、50、60、70、80或90、95、98或99%是其3-<9-脫?；男问交蚴?-0-脫酰基化后的具有二級修飾的另一種形式，例如棕櫚?；问?。包含部分3-0-脫?；腖PS和/或脂質(zhì)A以及任選具有二級修飾本發(fā)明的組合物可用于制備藥物組合物，其中本發(fā)明的組合物或者包含于細菌細胞的細胞壁外膜中，或者是粗制或純化的形式。在特別優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的所述藥物組合物，是適于接種目的的組合物。所述的藥物組合物能在宿主生物體(優(yōu)選是哺乳動物，更優(yōu)選是人)中誘發(fā)針對革蘭氏陰性菌的免疫應(yīng)答。至少部分3-0-脫酰基化的LPS和/或脂質(zhì)A的存在，或者具有3-0-脫?；蟮亩壭揎椀拇嬖冢峁┝艘恍﹥?yōu)點，例如在受試者中，降低毒力、減少副作用的量及其嚴重度，以及在受治療或接種的受試者中提高組合物的耐受量。藥物組合物可含有1種或多種賦形劑和/或佐劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑和佐劑是本領(lǐng)域中己知的，并且技術(shù)人員可自由選擇，例如參見"CurrentprotocolsinImmunology，WileyInterscience2003orRemmington'sPharmaceuticalSciences,18thed.，MackPublishingCompany,1990，，。在第一個實施方案中，藥物組合物可以是包含活的或活的減毒細菌細胞或無活力細菌細胞的全細胞疫苗，它們可通過冷凍、熱處理、機械破壞、化學(xué)處理或制藥和接種領(lǐng)域中己知的其它方法進行失活(J丄.Pace,H.A.Rossi，V.M.Esposito，S.M.Frey，K,D.Tucker,R.I.Walker.Inactivatedwhole-cellbacterialvaccines:currentstatusandnovelstrategies.Vaccine16:1563-1574(1998))。優(yōu)選細菌細胞是革蘭氏陰性致病菌細胞，更優(yōu)選細菌細胞來自博德特氏菌屬、沙門氏菌屬、志賀菌屬(Proteus)、奈瑟氏球菌屬(Pseudomonas)、克雷伯桿菌屬(Haemophilus)、假單胞菌屬(Haemophilus)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、埃希氏桿菌屬、變形菌屬(Proteus)，最優(yōu)選是百日咳博德特氏菌屬、副百日咳博德特氏菌屬或支氣管炎博德特氏菌屬。在第二個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以是無細胞疫苗，其包含革蘭氏陰性致病菌的1種、2種、3種或更多種免疫原性成分、并包含至少部分3-0-脫?；腖PS或脂質(zhì)A、或3-0-脫?；蟮木哂卸壭揎椀乃鯨PS。優(yōu)選部分3-0-脫?；闹|(zhì)A和/或LPS是來自于根據(jù)本發(fā)明的革蘭氏陰性致病菌細胞，其中優(yōu)選細菌細胞是博德特氏菌屬，最優(yōu)選是百日咳博德特氏菌屬、副百日咳博德特氏菌屬或支氣管炎博德特氏菌屬。至少部分3-0-脫?；闹|(zhì)A和/或LPS，其任選具有脫?；蟮亩壭揎?，可用于誘發(fā)針對細菌產(chǎn)物的保護性免疫應(yīng)答，或者也可與作為合適佐劑物質(zhì)的其它組合物一起使用或混合。LPS是本領(lǐng)域中用于接種目的、活化Toll樣受體以及刺激先天性免疫應(yīng)答的己知的合適佐劑。本發(fā)明的部分3-0-脫?；暮椭辽俨糠置摱镜腖PS和/或脂質(zhì)A，極大地保持了這種免疫刺激(佐劑)活性，并很少引起與毒性相關(guān)的不良副作用，例如局部腫脹、發(fā)紅、疼痛和發(fā)熱。根據(jù)本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的組合物和疫苗，可用于治療患有或處于患上致病性革蘭氏陰性菌感染的危險的受試者的方法，包括施用本發(fā)明的藥物組合物、全細胞或無細胞疫苗。技術(shù)人員已知或可確定具體佐劑的使用、組合物中的物質(zhì)的相對量和絕對量、以及給藥的劑量方案，并且根據(jù)情況(例如具體致病性感染或待治療的具體狀況)可進行調(diào)整。劑量方案包括單劑量，但也可包括多劑量，例如加強劑量，并可進行口服給藥、鼻內(nèi)給藥或胃腸外給藥。適于接種目的的各種劑量方案是本領(lǐng)域中己知的，并可被技術(shù)人員進行適當?shù)卣{(diào)整。圖1:脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)。大腸桿菌脂質(zhì)A由通過四個R-3-羥基豆蔻酰部分取代的二磷酸化葡糖胺二糖組成，其中分別用月桂酸酯和豆蔻酸酯來酯化2'和3'脂肪-?；?。B:沙門氏菌脂質(zhì)A的調(diào)控修飾。分別地，由AmT和PmrC介導(dǎo)用L-Ara4N或pEtN來取代磷酸酯部分，由LpxO介導(dǎo)2-羥基豆蔻酸修飾的脂質(zhì)A的形成，由PagP介導(dǎo)在2-位加入二級棕櫚酰鏈，以及由PagL介導(dǎo)在3-位除去3-羥基豆蔻酰部分。圖2:PagL蛋白的多重序列比對。使用ClustalW(http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html)來比對序列。連字符表明用于最適比對所引入的空位。用星號標記完全保守的殘基。冒號和圓點分別表示保守性強和保守性弱的殘基。百日咳博德特氏菌中的pagLORF因移碼而被破壞，為進行序列對比，通過在密碼子33處加入兩個核苷酸使其恢復(fù)。PagL同系物的GenBank蛋白登錄號是鼠傷寒沙門氏菌AAL21147、支氣管炎博德特氏菌NP_890306、副百日咳鮑特氏菌NP—885487、百日咳博德特氏菌BX470248§、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)NP—253350、熒光假單胞菌(P.fluorescens)NZ_AAAT03000006§、惡臭假單胞菌(P.putida)NC_002947§、丁香假單胞菌(P.syringae)ZP—00125465、B.fungorumNZ-AAAJ03000003§、鼻疽伯克氏菌(B.mallei)NC—002970§、類鼻疽伯克氏菌(B.pseudomallei)NC—002930§、R.metalliduransZP—00274744、茄科雷爾氏菌(R.solanacearum)NP—522762以及棕色固氮菌(A.vinelandii)ZP_00089534。符號§表示人工鑒定PagL同系物的全基因組(未完成)的GenBank登錄號。圖3:PagL在大腸桿菌BL21Star(DE3)中的表達和膜定位。從含有空的pET-lla或pPagL質(zhì)粒的大腸桿菌BL21Star(DE3)分離膜，并通過SDS-PAGE進行分析。用考馬斯亮藍染色蛋白。星號表示經(jīng)受微量測序并發(fā)現(xiàn)了相當于成熟PagL蛋白的條帶。用雙星號表示的條帶，相當于PagL(Bb)前體蛋白。左側(cè)是分子量標準蛋白。圖4:用TricineSDS-PAGE電泳分析LPS的體內(nèi)修飾。將指數(shù)生長的、含有pET-lla或pPagL構(gòu)建體的大腸桿菌BL21Star(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)所示的時間，之后收集1OD6Qo單位的培養(yǎng)物樣品并通過Tricine-SDS-PAGE電泳進行分析。圖5:野生型和PagL-修飾型大腸桿菌BL21Star(DE3)LPS的GC/MS分析。純化的大腸桿菌BL21Star(DE3)野生型LPS(WT)、PagL(st)修飾的LPS(L(St))、PagL(挑)修飾的LPS(L(Bb))、和PagL(pa)修飾的LPS(L(Pa))的GC/MS分析(t-誘導(dǎo)后的時間)。所示為標準化的C14/C14-30H比值，將野生型LPS設(shè)為100(短棒上方所示數(shù)值)。圖6:通過ESI-MS對野生型和PagL修飾型的大腸桿菌BL21Star(DE3)LPS進行結(jié)構(gòu)分析。通過ESI-MS，分析來自含有空的pET-lla(A)的野生型大腸桿菌BL21Star(DE3)的脂質(zhì)A類型，和由PagL(St)(B)、PagL(Pa)(C)以及PagL(Bb)(D)修飾的脂質(zhì)A類型。在m/z1797、1928、1622以及1490的主峰，分別被判讀為通常發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌中的特有的六?；姿狨ヮ愋?、具有L-Ara4N部分取代的六酰化二磷酸酯類型、用L-Ara4N部分取代的3-0-脫?；瘑瘟姿狨ヮ愋?，以及3-(9脫?；瘑瘟姿狨ヮ愋?。在m/z1716和1847處的主峰可能代表在m/z1797和1928處的類型的碎片離子。圖7:脫?；疞PS的體內(nèi)再修飾和內(nèi)源PagP的作用。A:將處于指數(shù)生長的、并含有空的pET-lla載體或pPagL(Bb)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21Star(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)所示的時限。收集相當于1OD柳單位的樣品，并通過TricineSDS-PAGE電泳進行分析。B和C:將在誘導(dǎo)的表達之后的所示時間中分離的純化大腸桿菌BL21Star(DE3)野生型LPS(WT)和PagL(Bb)修飾的LPS(L(Bb))的脂肪酸LPS含量，通過GC/MS進行分析。所示為標準化的C14/C14-30H禾BC16/C14(C)的比值，將野生型LPS設(shè)為100(短棒上方所示數(shù)值)。D:將指數(shù)生長的、含有pPagL(Pa)的野生型大腸桿菌BL21Star(DE3)或大腸桿菌BL21Star(DE3)及其戶ag戶突變體衍生物JG101,用IPTG誘導(dǎo)所示的時間，之后收集1OD6oo單位的培養(yǎng)樣品并通過Tricine-SDS-PAGE電泳進行分析。圖8:銅綠假單胞菌的PagL的拓撲模型。使用如(44)中所述的外膜蛋白結(jié)構(gòu)的一般規(guī)則，構(gòu)建PagL^)的拓撲模型。計劃的模型由具有四個延伸到外部環(huán)境的環(huán)(Ll-4)的八鏈3桶狀(P-barrel)組成。殘基在假定的P-鏈中顯示為菱形結(jié)構(gòu)，這可遮蔽暴露于脂雙分子層的殘基。His149和Ser^(顯示為紅色；指的是PagL^)前體中的位置)是完全保守的(圖2)，并被認為是絲氨酸水解酶的"標準"的催化三聯(lián)體的部分結(jié)構(gòu)。黃色表示催化三聯(lián)體的酸性殘基的可能選擇物。編號指前體序列中的殘基位點。圖9:通過氨基酸取代鑒定PagL(Pa)的活性位點的殘基。將指數(shù)生長的、含有空的pET-lla載體或pPagL(Pa)質(zhì)粒、或突變體pPagL(h)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21Star(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)75分鐘，之后收集1OD6QQ單位的培養(yǎng)樣品并通過SDS-PAGE電泳進行分析，隨后用針對PagL^)(A)的一級抗體進行免疫印跡，并通過Tricine-SDS-PAGE電泳來觀測LPS(B)。圖10:百日咳博德特氏菌LPS的體內(nèi)修飾。A:分離來自野生型百日咳博德特氏菌株Tohama的LPS，或分離含有pMMB67EH-PagL(Bb)質(zhì)粒的百日咳博德特氏菌株Tohama的LPS,并通過Tricine-SDS-PAGE電泳進行分析。B:通過GC/MS分析純化的百日咳博德特氏菌株Tohama的野生型LPS(WT)的脂肪酸含量，以及PagL(助)修飾的LPS(PagL)的脂肪酸含量。所示為標準化的C14-3OH/C10-3OH的比值，將野生型LPS設(shè)為IOO(短棒上方所示數(shù)值)。圖ll:分離的LPS的物活性。通過純化的LPS在MM6細胞中誘導(dǎo)IL-6(A)或IL-10(B)。橫軸給出LPS的濃度(mg/ml)，縱軸給出在450nm的ELISA讀數(shù)。圖12:通過半天然SDS-PAGE電泳，分析純化的、重折疊的PagL,(-)的熱修飾性?？捡R斯亮藍染色的半天然SDS-PAGE凝膠顯示純化的、重折疊的PagL(Pa)(-)的熱修飾性。電泳之前，室溫下(RT)在含有0.1%SDS的樣品緩沖液中，或在IO(TC下在含有2%SDS的樣品緩沖液中，處理樣品。左側(cè)是分子量標準蛋白。圖13:通過膜結(jié)合或體外重折疊的PagL，進行體外修飾LPS。顯示體外PagL活性的銀染Tricine-SDS-PAGE電泳膠。A:在含有去垢劑的緩沖液中，將純化的腦膜炎奈瑟氏球菌(iV.mem'"g/^fe)與或不與細胞被膜于37。C一起溫育18h，其中所述的細胞被膜來自含有空的pET-lla或pPagL質(zhì)粒的大腸桿菌BL21Star(DE3)。B:在含有去垢劑的緩沖液(缺少或存在5mMEDTA)中，將純化的腦膜炎奈瑟氏球菌L3-LPS與或不與4μg體外重折疊的PagL(pa)(沒有信號序列PagL,(-))于37℃—起溫育18h。在所有泳道中，上樣同樣量的分析混合液。圖14:通過Tricine-SDS-PAGE電泳分析體內(nèi)的LPS修飾。通過熱苯酚/水萃取，從野生型和表達PagP/PagL的百日咳博德特氏菌株Tohama分離LPS，并通過Tricine-SDS-PAGE電泳進行分析。圖15:通過ESI-MS對野生型和PagL/PagP修飾的百日咳博德特氏菌LPS進行結(jié)構(gòu)分析。通過ESI-MS，對來自野生型百日咳博德特氏菌株Tohama(A)的脂質(zhì)A、和被PagL,(B)、PagP,(C)以及PagP腳)(D)修飾的脂質(zhì)A進行分析。在/w/z1557、1477、1387、1307、1251以及1081的主峰，分別被判讀為通常發(fā)現(xiàn)于百日咳博德特氏菌中的特有的五?；姿狨ヮ愋汀⑾鄬?yīng)的五酰化一磷酸酯類型、m/z1557的失去3位的一級3-羥基癸酸殘基的分子離子的脫?；|(zhì)A類型、m/z1477的失去3位的一級3-羥基癸酸殘基的分子離子的脫?；|(zhì)A類型、m/z1477的失去一級3-羥基十四烷酸殘基(3-hydroxytetradecanoicacidresidue)的分子離子的脫酰基化脂質(zhì)A類型、m/z1477的失去3位的一級3-羥基癸酸殘基和一級3-羥基十四烷酸殘基的分子離子的脫?；|(zhì)A類型。在m/zl320、1490、1545、1625、1715以及1796處的峰，分別相當于分子離子在m/z1081、1251、1307、1387、1477以及1557處的PagP介導(dǎo)的棕櫚酰化。實施例實驗方法菌株和生長條件表I中描述了用于本研究的所有菌株。通常，將大腸桿菌和銅綠假單胞菌株在改良的Luria-Bertani肉汁瓊脂上(稱作LB瓊脂(26))于37℃中進行生長，或在LB肉湯中并以200rpm進行振蕩生長。對于大腸桿菌，培養(yǎng)基中補充0.2%葡萄糖。如果合適，在存在100μg/ml氨芐青霉素、50ug/ml卡那霉素、50ug/ml萘啶酮酸(naladixicacid)、或100ug/ml鏈霉素的情況下培養(yǎng)細菌，用于維持質(zhì)?；蚓赀x擇。在LB瓊脂平板上于37'C培養(yǎng)鼠傷寒沙門氏菌SR11。在補充了15%脫纖維羊血的Borduet-Gengou瓊脂(Difco)上，于35。C培養(yǎng)支氣管炎博德特氏菌和百日咳博德特氏菌株。為了誘導(dǎo)百日咳博德特氏菌中的pagL(Bb)基因的表達，將細菌在補充了lmM異丙基-l-硫代-e-D-卩比喃半乳糖苷(IPTG)(終濃度)的人造Thijs培養(yǎng)基(48)中于35'C振蕩(180rpm)生長。表I:舒本棘麟樣微控菌株或質(zhì)?；蛐突蛘f明來源或參考菌株支氣管炎博德特氏菌B505野生型菌株N.V.1百日咳博德特氏菌B509B134Toh咖aDutch疫苗株Dutch疫苗株野生型菌株NalRStrepRNalRStepR36銅綠假單胞菌PA025鼠傷寒沙門氏菌SR11PA01fewarg野生型菌株45大腸桿菌TOPIOF'46DH5aBUIStar,)SK2257JG101SM10cfeo7recj4/awD"9fbra./ew";^ga/t/g。//Tr/w丄e/wi4/朋pGInvitrogenp/io力,dtocZ/l膨47Skoznp!T/w必BffjB^ga/meWInvitrogenFcrcvl2FormpT...hasdsBfA>v46cgaldcmZJ20(reme131CGSCbBL21Star(DE3)crcv!2卵:.T"/0^本研究RP4-2-Tc::MuKmR50質(zhì)粒pCRII-TOPO大腸桿菌克隆載體AmpKKanRInvitrogenpET-Ua大腸桿菌高拷貝表達載體Amp11，T7啟動子NovagenpMMB67EH廣范圍的宿主表達載體,AmpR，tac啟動子51pMMB67EH廣范圍的宿主表達載體，AmpR，tac啟動子51pMMB67-PagL(Bb)含有支氣管炎博德特氏菌的pagL的pMMB67衍生物本研究pPagL(pa)含有銅綠假單胞菌的pagL的pET-lla衍生物本研究pPagL(Bb>含有支氣管炎博德特氏菌的pagL的pET-lla衍生物本研究pPagL(S0含有鼠傷寒沙門氏菌的pagL的pET-lla衍生物本研究pPagL(pa)(-)編碼銅綠假單胞菌的pagL的pET-11a衍生物，無信號序列本研究pPagL(Pa)(H81A)pPagL(pa>編碼PagL(pa)通過H81A取代本研究pPagL<Pa)(H81N)pPagL(pa)編碼PagL怖)通過H81N取代本研究pPagL(Pa)(S84A)pPagL(pa)編碼PagL(Ra)通過S84A取代本研究PPagL(Pa)(S84C)pPagL(I>a)編碼PagL(Pa>通過S84C取代本研究pPagL(Pa)(H149A)pPagL(pa)編碼PagL(w通過H149A取代本研究pPagL(p,)(H簡)pPagL(p,)編碼PagL(p,)通過H149N取代本研究pPagL(Pa)(S151A)pPagL(pa)編碼PagL(pa)通過S151A取代本研究pPagL(w(S151C)pPagL(pa>編碼PagL(w通過S151C取代本研究a荷蘭疫苗研究所，Bilthoven,荷蘭b大腸桿菌遺傳保藏中心，耶魯大學(xué)，NewHaven(CT)^pagp亦稱crcA重組DNA技術(shù)使用PromegaWizarcf的hisSVMinipreps系統(tǒng)，分離質(zhì)粒DNA。根據(jù)制造商(Fermentas)的說明書，使用小牛腸堿性磷酸酶和限制性核酸內(nèi)切酶。使用Qiagen快速凝膠提取試劑盒，從瓊脂糖凝膠分離DNA片段。使用快速DNA連接試劑盒(Roche)，進行連接反應(yīng)。將來自鼠傷寒沙門氏菌SRll(pagASt))、支氣管炎博德特氏菌B505(/7ag丄(Bb);)的基因，和來自銅綠假單胞菌PA025的戶g丄基因(有或者沒有其信號序列的編碼部分)(pagi:(Pa)、P"gZ(pa)(-))，克隆入pET-lla(Novagen)的T7啟動子之后。使用染色體DNA作為模板，通過PCR擴增基因。將約109細菌重懸浮于蒸餾水中，以制備模板DNA，之后將懸浮液置于95'C加熱15分鐘。然后，將懸浮液以16,100Xg離心l分鐘，之后上清液被用作模板DNA。包含AWe/位點(下劃線)的正向引物序列，其包含ATG起始密碼子，選自5,-AACATATGAAGAGAATATTTATATATC-3，(^g丄(st))、5，畫AACATATGAAGAAACTACTTCCGCTGG-3，(p"g丄(Pa))、5，-AACATATGGCGGACGTCTCGGCCGCCG-3，(/ag丄(pa)(-》和5，-AACATATGCAATTTCTCAAGAAAAACA-3'(p一斷)。包含^/m/Z/位點(下劃線)和終止密碼子的反向引物序列，選自5，畫AAGGATCCTCAGAAATTATAACTAATT-3，(pag丄湖)、5，-AAGGATCCCTAGATCGGGATCTTGTAG-3，(p。gZ(Pa),/"g丄(Pa)(-))和5，-AAGGATCCTCAGAACTGGTACGTATAG-3，(pagL(Bb))。在下列條件下實施PCR:50nl的反應(yīng)總體積、各個引物濃度為25pmo1、0.2mMdNTP、3pl模板DNA溶液、1.5%二甲亞砜、由制造商(Roche)提供的含緩沖液的1.75單位的延伸高保真酶(ExpandHighFidelityenzyme)混合物。如下所示溫度程序95'C-3分鐘，95'C-1分鐘、60'C-1分鐘以及72°C-1分30秒的循環(huán)重復(fù)30次，隨后72°C-10分鐘并隨后于4'C冷卻。從瓊脂糖凝膠純化PCR產(chǎn)物，隨后將其克隆入pCRII-TOPO。用Mfe/和^^///消化來自正確的克隆中的質(zhì)粒DNA，并將PagL編碼片段連接到7^^//5"附7//消化的pET-lla中。使用CaCl2方法(27)，將連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。通過Mfe/和^^/7/的酶切消化，檢査轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA是否存在正確的pagL編碼插入片段。顯示正確的酶切消化模式的質(zhì)粒被稱為pPagL(Pa)、pPagL,(-)、pPagL卿)以及pPagL瀏(表1)。通過雙向核苷酸測序，證實克隆/"g丄基因的正確編碼序列。為了將pagL(Bb)基因亞克隆到廣范圍的宿主中，用力fll和///"必//消化低拷貝的pMMB67EH載體、pPagL(ab)質(zhì)粒DNA，并將pagL(Bb)的編碼片段連接到消化的pMMB67EH中。連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。通過力^和州>^///的酶切消化，檢查轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA是否存在正確的pagL編碼插入片段。顯示正確的酶切消化模式的質(zhì)粒被稱作pMMB67EH-PagL(Bb)(表1)。將后一個質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌SMIO，通過在如Stibitz等人(52)所述的固體培養(yǎng)基上進行接合，所述的大腸桿菌SM10可允許隨后將pMMB67EH-PagL(Bb)轉(zhuǎn)移到百日咳博德特氏菌中。使用(^^0^1^6@位點-定向誘變試劑盒(51加3§6116)和表11中列出的引物，將突變引入pagL中。將質(zhì)粒pPagL(Pa)作為構(gòu)建突變的模板。通過雙向核苷酸測序，證實克隆正確突變的存在。表II:用于位點定向誘變的引物名稱a序列(5'-3')bH8lA_FWGAAGGCGCCGGCAAGSCSTCGCTGTCGTTCGCTH81A_REVAGCGAACGACAGCGACGCCTTGCCGGCGCCTTCH81N_FWGAAGGCGCCGGCAAGAACTCGCTGTCGTTCGCTH8lN_REVAGCGAACGACAGCGAGTTCTTGCCGGCGCCTTCS84A_FWGGCAAGCATTCGCTGfi￡STTCGCTCCGGTATTCS84A_REVGAATACCGGAGCGAACGCCAGCGAATGCTTGCCS84C_FWGGCAAGCATTCGCTGTGCTTCGCTCCGGTATTCS84C_REVGAATACCGGAGCGAAGCACAGCGAATGCTTGCCH149A_FWGGCGTTCGGGCGATCGCGTATTCCAACGCCGGCH149A_REVGCCGGCGTTGGAATA￡g￡GATCGCCCGAACGCCH149NLFWGGCGTTCGGGCGATCM￡TATTCCAACGCCGGCH149NLREVGCCGGCGTTGGAATAGTTGATCGCCCGAACGCCS151A_FWCGGGCGATCCACTATGCGAACGCCGGCCTGAAASl5lA_REVTTTCAGGCCGGCGTTCGCATAGTGGATCGCCCGS1S1C_FWCGGGCGATCCACTAT1S￡AACGCCGGCCTGAAAS151C_REVTTTCAGGCCGGCGTTGCAATAGTGGATCGCCCGa引物名稱顯示了氮基酸取代，如H81A_FWA_FW表示所示的寡核苷酸用作位點定向誘變方法中的正向引物，以用丙氨酸取代前體PagL(的位點81的組氨酸。b下劃線表示被引入的突變。使用0.2%SDS的電泳膠和Bio-RadMini-PROTEAN儀器，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(28)，分析蛋白質(zhì)。將樣品施加到具有4%積層膠的13%聚丙烯酰胺凝膠上，并進行150V的電泳。用考馬斯亮藍染色蛋白。將來自Bio-Rad的預(yù)染色或未染色的PrecisionPlusProteinStandard,用于測定相對分子量(Mr)。對于蛋白質(zhì)印跡，將來自SDS-PAGE膠的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。在磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.6)、0.5%脫脂奶粉、0.1%Tween-20中過夜封閉膜，并與直接針對PagL(pa)的一級抗體在封閉緩沖液中一起溫育，隨后與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的兔抗豚鼠IgG抗體(Sigma)在封閉緩沖液中一起溫育。使用SuperSignalWestPicoChemiluminescentSubstrate(Pierce),進行顯色印跡。使用0.2%SDS的電泳膠和Bio-RadMini-PROTEAN⑧儀器，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(28)分析蛋白質(zhì)。對于半天然的SDS-PAGE，流動膠和積層膠中不加入SDS，并在電泳之前不加熱樣品。將樣品施加到具有4。/。積層膠的13%聚丙烯酰胺凝膠上，并進行150V的電泳。對于半天然的SDS-PAGE，在冰上以恒流15mA進行電泳。用考馬斯亮藍染色蛋白。將來自Bio-Rad的預(yù)染色或未染色的PrecisionPlusProteinStandard,用于測定相對分子量(Mr)。Tricine-sds-page電泳對于含有LPS的樣品，將0.5mg/ml蛋白酶K(終濃度)加入樣品緩沖液(28)。將樣品在55i:中溫育60分鐘，隨后在95。C中溫育10分鐘，以滅活蛋白酶K。然后通過添加樣品緩沖液將樣品稀釋10倍，之后將2li1樣品施加到Tricine-SDS-PAGE電泳膠上(30)。使溴酚藍以35在分離膠上泳動，之后電壓增加到105V。在溴酚藍前端到達膠底部之后，將樣品繼續(xù)電泳另一個45分鐘。將凝膠在11:8:1的水/乙醇/乙酸(v/v/v)中過夜固定，并隨后按(31)所述用銀染色。多克隆抗體為了抗體的制備，將pPagL(Pa)(-)用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21Star(DE3)，以備表達截短的pagL基因之用。從SDS-PAGE預(yù)制膠上，分離(29)并純化包含體中聚積的PagL(pa)蛋白，并在Eurogentec中用于豚鼠的免疫。微量測量在192mM甘氨酸、25mMTris(pH8.3)、10。/。甲醇(v/v)中，使用Bio-RadMini-PROTEAN2印跡儀，將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE膠在ImmobilonTM-P聚二氟乙烯膜上以100V轉(zhuǎn)移lh。轉(zhuǎn)移后，用蒸餾水將膜洗滌3次，每次15分鐘。用考馬斯亮藍染色所轉(zhuǎn)移的蛋白。將膜風(fēng)干，切下假定的PagL帶，并在SequencingCenterFacility(UtrechtUniversity,荷蘭)上進行微量測序。通過氣相層析-質(zhì)譜分析(GC/MS)分離和分析LPS使用熱酚/水萃取方法(3)，分離LPS。簡而言之，在含有l(wèi)mMIPTG(終濃度)的3升Thijs培養(yǎng)基中，培養(yǎng)含有或沒有質(zhì)粒pMMB67EH-Pag"叫的百日咳博德特氏菌株Tohama。離心收集細胞，并重懸浮在含5mMEDTA的40mM磷酸鈉中緩沖液(pH7.0)中。用溶菌酶在4'C中過夜處理細胞，之后加入等體積酚。將懸浮液加熱到70°C，同時振蕩溫育30分鐘。懸浮液冷卻到10'C，之后離心分離相。收集上層相，并通過將等體積蒸餾水加到下層相，以重復(fù)萃取。隨后在7(TC溫育、冷卻和離心之后，混合兩種上層相，并對自來水進行透析，直至苯酚氣味消失。冷凍干燥透析的餾分后，將LPS以lmg/ml的濃度溶解在磷酸鹽緩沖液中。為了通過GC/MS分析脂肪酸，將5倍(v/v)過量的丙酮加入等分量的分離LPS中，之后在氮氣流中于6(TC干燥溶液。隨后，加入作為內(nèi)標物的10ug的C12:0(2OH)(在乙醇中為lmg/ml)以及100ul乙酰氯/乙醇l:9(v/v)，將樣品在90。C中進行衍化lh。冷卻后，通過加入200u1的1MK2HPO(pH8.0)，以終止反應(yīng)，隨后用200u1乙酸乙酯萃取?；?乙酯。通過在FinniganMATSSQ上，以電子碰撞模式分析1P1的上層相。LPS游生激學(xué)活絲通過人巨噬細胞細胞系MM6(49)，測試由野生型和PagL修飾的百日咳博德特氏菌Tohama的LPS誘導(dǎo)IL-6和IL-IO。將MM6細胞在補充了10。/。胎牛血清(GibcoBRL)的400u1IMDM(GibcoBRL)中接種在微孔板(2.105/孔)中，并用200lU連續(xù)稀釋的LPS液，在含5%<:02的潮濕空氣中，于37'C刺激16-18h。根據(jù)制造商的說明書(PdiPairTM試劑盒，SanquinReagents,Amsterdam荷蘭)，通過針對人IL-6或IL-10的ELISA，確定培養(yǎng)上清液中的IL-6和IL-10的水平量。細胞被膜地分離通過以1，500Xg離心IO分鐘，收集細胞并在50ml冰冷的0.9%氯化鈉溶液中洗滌一次。將細胞沉淀在-80'C中冰凍至少15分鐘，然后懸浮在含CompleteProtease抑制劑混合物(Roche)的20ml的3mMEDTA、10mM的Tris-HCl(pH8.0)中。通過超聲波來破碎細胞，之后通過以1，500Xg離心IO分鐘，來除去未破碎的細胞。通過以150，000Xg離心1.5h，從上清液沉淀細胞被膜，并重懸浮在2mMTris-HCl(pH7.4)中。將細胞被膜以等分量貯存在-80°C。包含體地分離為了分離包含體，在來自pPagL,(-)(表I)的大腸桿菌BL21Star(DE3)中表達PagL(Pa)(-)。在補充氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，于37。C培養(yǎng)兩升培養(yǎng)物，直至OD6o。介于0.4和0.6之間。然后，將lmMIPTG(終濃度)加入培養(yǎng)物中，以誘導(dǎo)重組基因的表達，之后將培養(yǎng)物于37。C進一步振蕩溫育。約4小時后，離心收集細胞(4,000rpm，15分鐘(4℃)。將收集的細胞在400ml的0.9%NaCl中洗滌一次，然后重懸浮在TE50:40(50mMTris-HCl(pH8.0)，40mMEDTA)中。加入蔗糖(0-25g/ml(終濃度))和溶菌酶(0.2mg/ml(終濃度))，之后將懸浮液在RT下振蕩溫育30分鐘。使用配備macrotip的Branson250Sonfier(輸出量9，工作周期50%)，將懸浮液冰上超聲處理三次(1.5分鐘，之間暫停2分鐘)。超聲波之后，加入0.13%(w/v)Brij-35P(Fluka)，并將懸浮液另外超聲處理2分鐘。通過以4,000rpm(4℃)離心2小時，收集稠密物質(zhì)(包含體)，之后在40mlTE50:40中洗滌一次，隨后使用40ml的10mMTris-HCl(pH8，3)進行另一次洗滌步驟。將獲得的包含體溶解在補充10mM甘氨酸(pH8,3)的8M尿素中，并用TCA進行沉淀。最后，將獲得的蛋白質(zhì)以10mg/ml的蛋白濃度溶解在補充了10mM甘氨酸(pH8.3)的8M尿素中。以13,000rpm將混合物離心2小時，以除去殘余的非溶解物質(zhì)和膜。PagL(pa)(-)的重折疊和純化在10%(w/v)十二垸基二甲基氧化胺(LDAO)中，通過兩倍稀釋的10mg/ml蛋白溶液(參見上文)進行體外重折疊PagL(Pa)(-)，隨后進行超聲波處理10分鐘。使用lml的MonoQ(AmershamBiosiences)離子交換柱，通過快速蛋白質(zhì)液相層析(FPLC)來純化重折疊的PagL(Pa)(-)。將蛋白溶液在緩沖液A(20mMTris-HCl(pH8.0)，0.08%(w/v)d。E5)中稀釋4次。將溶液裝在用緩沖液A預(yù)先平衡的柱上，并用緩沖液A洗滌一次，用緩沖液A的0-1MNaCl線性梯度來洗脫蛋白。通過SDS-PAGE，分析餾分的重折疊PagL(Pa)(-)蛋白的存在。集中含有蛋白的餾分，并用具有3kDa的分子量截留值的Centricon集中器(Amicon)，將其濃縮到10mg/ml的蛋白濃度。然后，使用具有3.5kDa的分子量截留值的膜，將蛋白溶液對10ml2mMTris-HCl(pH8.0)、0.06%(w/v)(:1(^5進行過夜透析三次，體外修飾分析將分離自含空的載體pET-lla或pPagL質(zhì)粒的大腸桿菌BL21Star(DE3)的重折疊PagL(pa)(-)(10mg/ml)或細胞被膜，在重蒸餾水中稀釋10倍。將4n1稀釋的重折疊蛋白或胞外被膜溶液，在50mMHepes(pH8.0)、0.1%TritonX-100、0.5MNaCl以及0.75nrno1腦膜炎奈瑟氏球菌L3-LPS的10lU終體積中，于37。C溫育16h。為了測試反應(yīng)是否依賴于二階陽離子，將5mMEDTA加入具有重折疊的PagL,(-)的反應(yīng)中。通過煮沸樣品緩沖液(28)終止反應(yīng)，之后用0.5mg/ml蛋白酶K于55'C處理樣品l小時，隨后于95溫育10分鐘。通過加入樣品緩沖液將樣品稀釋25倍，之后通過Tricine-SDS-PAGE電泳分析1樣品(參見上文)。分離LPS,并通過電噴霧電離-質(zhì)譜分析(ESI-MS)進行分析:使用稍加改動的熱酚/水萃取方法分離LPS(Westphal和Jann，MethodsCarbohydr.Chem.5;83-91，1965)。簡而言之，將細菌在具有l(wèi)mMIPTG(終濃度)的THIJS培養(yǎng)基中培養(yǎng)64h。離心收集細胞，并重懸浮在含5mMEDTA的40mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中。用溶菌酶在4°C中過夜處理細胞，之后加入等體積酚。將懸浮液加熱到70'C，同時振蕩溫育30分鐘，隨后冷卻到10'C，之后通過以8，000Xg離心IO分鐘，來分離相。收集上層相，并在將等體積蒸餾水加到下層相后，重復(fù)進行萃取?；旌蟽煞N上層相，并對自來水進行透析，直至苯酚氣味消失，冷凍干燥并隨后溶于蒸餾水。隨后以150,000Xg離心沉淀LPS,并溶于蒸餾水中，之后通過分析3-羥基十四烷酸含量，使用如Welch所述的6890Agilent氣相色譜儀(Clin.Microbiol.Rev.l991)來測定LPS濃度。對于ESI-MS，將200μl等分量的分離LPS(50nmol/ml)進行冷凍干燥，并溶于0.1ml的2%乙酸中。在95'C加熱混合物，以水解LPS并釋放脂質(zhì)A部分。隨后，混合物冷卻到室溫，并以16，100Xg離心1O分鐘。將沉淀在O.lml雙蒸水中洗滌兩次，溶于0.1ml雙蒸水，并加入0.3ml氯仿/甲醇(2:1，v/v)。劇烈渦旋振蕩后，以16，100Xg離心1O分鐘，進行分離相。然后，通過在FinniganLCQ上以陰離子模式(Wilm和Mann，Anal.Chem.1996)進行納電噴霧串式MS，將上層相用于純化脂質(zhì)A的結(jié)構(gòu)分析。實施例1各種革蘭氏陰性菌的Pagl同系物的鑒定通過檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)中的革蘭氏陰性菌的所有完成的和未完成的基因組，將鼠傷寒沙門氏菌PagL前體蛋白的187個氨基酸的序列，用于鑒定其它革蘭氏陰性菌中的推定的PagL同系物。BLAST檢索(34)顯示了博德特氏菌、百日咳博德特氏菌、支氣管炎博德特氏菌以及副百日咳鮑特氏菌中所存在的推定同系物(圖2)。如由signalP服務(wù)器(35)所預(yù)測的，支氣管炎博德特氏菌和副百日咳鮑特氏菌的PagL同系物是具有N末端25個氨基酸信號肽的兩種彼此相同178個氨基酸的多肽(圖2)。在百日咳博德特氏菌Tohamal菌株中還發(fā)現(xiàn)了PagL同系物的基因(36)，但是該開放讀碼框(ORF)由于移碼而被破壞(SEQIDNo.4)，這可被修復(fù)成如SEQIDNo.5所示的序列，并編碼如SEQIDNo.l所示的蛋白。對百日咳博德特氏菌株B509和B134的PagLORF進行的核苷酸測序，還顯示存在相同的移碼2，這表明PagLORF的破壞是百日咳博德特氏菌株的共同特征。通過使用新的支氣管炎博德特氏菌的相同PagL同系物來作為探針以用于進一步BLAST分析，可鑒定下列基因組中的額外推定的PagL同系物銅綠假單胞菌(SEQIDNo.6，30%相同性)、熒光假單胞菌(SEQIDNo.7，29%相同性)、丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)(SEQIDNo.8，31%相同性)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)，2x(SEQIDNo.9+10，32/33%)、Ralstoniametallidurans(SEQIDNo.15，28%)、茄科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)(SEQIDNo.16，29%)、鼻疽伯克氏菌(Burkholderiamallei)(SEQIDNo.12，28%)、類鼻疽伯克氏菌(Burkholderiapseudomallei)(SEQIDNo.13，28%)、Burkholderiafungorum(SEQIDNo.ll，29%)、以及棕色固氮菌(SEQIDNo.14，27%)。比對結(jié)果如圖2所示?？傊?，所有PagL同系物顯示了總體上彼此序列的低相同性，盡管高于鼠傷寒沙門氏菌的PagL同系物(24%相同性)，但它們在C末端附近具有明顯的同源區(qū)。我們對這種保守基序的發(fā)現(xiàn)，可鑒定其它(細菌)物種中的PagL同系物，并可將適當?shù)腜agL同系物用于進行3-0-脫?；娜魏渭毦闹骱?或任何LPS。實施例2:pagL的克隆及其在大腸桿菌中的異源表達為了驗證推定的脂質(zhì)A脫酰基酶活性，我們克隆了銅綠假單胞菌的pagL同系物(pagL(Pa))和支氣管炎博德特氏菌的pagL同系物(pagL9Bb))。我們將pagL(st)用作這些研究中的參照。通過PCR，從染色體擴增這些pagL基因，并最終克隆到pET-lla中，受T7啟動子的控制，得到質(zhì)粒pPagL(pa)、pPagL(Bb)和pPagL(St)。為了研究PagL在大腸桿菌中的表達和膜定位，將含有空的載體pET-lla或pPagL質(zhì)粒的大腸桿菌BL21Star(DE3)在LB中過夜生長，之后分離細胞被膜。SDS-PAGE分析，顯示了在表達PagL的細胞被膜中，具有15000-18000Mr的顯著的附加帶的存在(圖3)。這與成熟PagL蛋白的預(yù)期分子量一致，即Pagl(pa)16.1kDa、PagL,17.2kDa、和PagL(St)18.2kDa。為了鑒定附加的蛋白帶，將它們進行微量測序。PagL(Pa)、PagL,以及PagL則的前5個氨基酸殘基的序列分別是ADVSA、QPTQG以及NDNVF，它們分別指示前導(dǎo)肽酶對信號肽的裂解出現(xiàn)在氨基酸殘基23和24(AQA-ADV)、25和26(AQA-QPT)以及20和21(CSA-NDN)之間。特別是對于PagL(Bb)的表達，在膠上可看見具有更高Mr的附加帶(圖2)。這條帶的N末端序列，MQFLK，對應(yīng)于PagL(Bb)的前體的N末端序列。實施例3:PagL大腸桿菌LPS的體內(nèi)修飾為了研究克隆的PagL同系物是否對大腸桿菌LPS有活性，將IPTG加入含有空的載體pET-lla或pPagL質(zhì)粒的、指數(shù)生長的大腸桿菌BL21Star(DE3)細胞中，并在各種溫育期之后，收集相當于OD6Q0單位的樣品，并通過Tridne-SDS-PAGE電泳分析它們的LPS含量。根據(jù)預(yù)期水解脂質(zhì)A的3位的R-3-羥基豆蔻酸，三種PagL同系物的任何一種表達，可將LPS轉(zhuǎn)變成具有更高電泳遷移率的形式(圖4)。這種轉(zhuǎn)變在誘導(dǎo)PagL陶或PagL(Bb)之后的75分鐘內(nèi)幾乎是完全的，但是對于PagL(st)，需要花費更長的時間。PagL修飾的LPS的結(jié)構(gòu)分析為了測定其脂肪酸含量，自在存在10mMMgCl2以抑制PhoP/PhoQ調(diào)控的脂質(zhì)A修飾的情況下培養(yǎng)的細菌中分離LPS并通過GC/MS進行分析。與野生型LPS中的比值相比，PagL修飾的LPS樣品中的C14:/C14:0(3OH)比值增加(圖5)，這與預(yù)期的從脂質(zhì)A清除C14-30H相一致。為了證實這些數(shù)據(jù)，分離脂質(zhì)A部分，并通過ESI-MS以陽離子模式進行分析，這表明了在野生型LPS中存在四種主要的脂質(zhì)A類型(圖6A)。w/z1797的峰代表通常發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌中的特有的六?；姿狨ヮ愋?，而m/z1928的峰相當于用L-Ara4N部分取代的六酰化二磷酸酯類型。m/z1716和m/z1847兩個其余的峰，多半代表缺失磷酸基的上述兩種類型的碎片離子。PagL(st)(圖6B)、PagL陶(圖6C)或PagL,(圖6D)表達后，主要的脂質(zhì)A類型出現(xiàn)于w/z1622和m/z1490中，它們分別相當于自出現(xiàn)于空載體對照中的m/z1928和m/z1797的主要類型中缺失一個β-羥基豆蔻酸殘基和一個磷酸基。此外，磷酸基的缺失大概是電離方法的生物膺象。根據(jù)GC/MS和ESI-MS數(shù)據(jù)，可以推斷所鑒定的銅綠假單胞菌和支氣管炎博德特氏菌的PagL同系物，與鼠傷寒沙門氏菌的PagL同系物相似，是活性的脂質(zhì)A脫酰基酶。此外，數(shù)據(jù)暗示脫?；⒉灰蕾囉谑欠翊嬖贚-Ara4N部分，因為兩種類型都被有效地脫酰基化。實施例4:PagL脫?；腖PS的隨后體內(nèi)修飾在這些實驗過程中，觀察到在延長的PagL表達之后，在Tricine-SDS-PAGE電泳膠上不再檢測出PagL修飾的LPS,而且LPS再次遷移至野生型LPS的位置，正如表達PagL,的菌株所顯示的那樣(圖7A)。如SDS-PAGE膠上所示，在這個時點仍然存在豐富的PagL蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，GC/MS分析顯示在PagL(挑)誘導(dǎo)5小時之后，用于LPS分離的C14:0/C14:0(3OH)的比值不會再次降低(圖7B)。因此，在Tricine-SDS-PAGE電泳膠上觀測的二級修飾不是PagL修飾的復(fù)原結(jié)果，而是將電泳遷移率復(fù)原到野生型LPS的程度的額外修飾的結(jié)果。于是比較了其它的脂肪酸比值。在誘導(dǎo)產(chǎn)生PagL5h的細胞的LPS中發(fā)現(xiàn)，C16:0/C14:0比值顯著升高(圖7C)，暗示著PagL脫?；腖PS隨后被棕櫚?；⒆貦八岣砑拥街|(zhì)A的一種蛋白質(zhì)是外膜蛋白PagP(19)(圖1)。因此，我們猜測PagL修飾的LPS的二級修飾可能是內(nèi)源PagP活性的結(jié)果。為了研究這種可能性，我們用pPagL(Pa)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化野生型大腸桿菌BL21Star(DE3)及其/ag戶突變體衍生物JG101。在野生型菌株但非突變株的情況下，再次觀測到PagL修飾的LPS的二級修飾(圖7D)。該結(jié)果強烈地暗示PagL修飾的LPS的二級修飾的確是內(nèi)源PagP活性的結(jié)果(圖7A)。實施例5:PagL活性位點殘基的鑒定在所鑒定所PagL同系物之間的彼^:序列的相同性是極低的(圖2)。其中，少數(shù)完全保守的殘基是組氨酸和絲氨酸，我們猜測它們是絲氨酸水解酶的"標準"的Asp/Glu-His-Ser的催化三聯(lián)體。這些推定的活性位點殘基位于我們預(yù)計的拓撲模型中的P-鏈頂部接近的脂質(zhì)暴露側(cè)面(圖8)。有趣的是，在外膜磷脂酶A中，活性位點His禾nSer位于相似的位點(37)。為了分別測試這些位于PagL(Pa)前體蛋白的位點149和151的殘基是否的確是對催化活性很重要，分別用丙氨酸或天冬酰胺、和丙氨酸或半胱氨酸進行取代它們。作為對照，分別對位于PagL(Pa)前體的位點81和84的非保守組氨酸和絲氨酸殘基進行相同的取代。通過免疫印跡(圖9A)和Tricine-SDS-PAGE電泳(圖9B)，分別對具有相關(guān)質(zhì)粒并被IPTG誘導(dǎo)75分鐘的大腸桿菌BL21Star(DE3)細胞的蛋白和LPS性質(zhì)進行分析。盡管取代非保守的His81和Ser84不會影響LPS的脫?；?，但是當取代保守的Hisl49和Serl51時(圖9B)，即使未影響到這些突變體蛋白的表達(圖9A)，也不再觀測到LPS的脫?；＿@些結(jié)果有利地支持了我們的假設(shè)，即前體PagL(M蛋白的位點149的保守組氨酸和位點151的保守絲氨酸是活性位點殘基，并且PagL發(fā)揮絲氨酸水解酶的機制作用。實施例6:pagl(bb)的克隆及其在百日咳博得特氏菌中的異源表達為了體內(nèi)修飾百日咳博德特氏菌LPS，我們克隆了支氣管炎博德特氏菌的pagL基因(pagL(Bb))。通過PCR，從染色體擴增pagL基因，并最終克隆到受Tac啟動子控制下的pMMB67EH中，得到質(zhì)粒pMMB67EH-pagL(Bb)，這可通過接合反應(yīng)轉(zhuǎn)入百日咳博德特氏菌株Tohama中。為了定位百日咳博德特氏菌LPS的體內(nèi)修飾，將野生型百日咳博德特氏菌株Tohama、或含pMMB67EH-PagL,質(zhì)粒的百日咳博德特氏菌株Tohama，培養(yǎng)在補充了lmMIPTG(終濃度)的Thijs培養(yǎng)基中。通過熱苯酚/水萃取分離LPS,并通過Tricine-SDS-PAGE電泳(圖IOA)和GC-MS(圖IOB)進行分析。Tricine-SDS-PAGE電泳膠的分析顯示從PagL(Bb)表達菌株分離的LPS，遷移略微快于野生型百日咳博德特氏菌LPS。令人驚訝的是，從PagL(Bb)表達菌株分離的LPS顯出兩種不同的LPS群體。一個群體沿著野生型TohamaLPS的高低遷移，一個群體遷移更快。在野生型LPS的制備中，還可觀測到后一個LPS群體，然而它的豐度非常低。為了驗證來自PagL表達菌株的LPS的確在其3位被脫?；ㄟ^GC-MS對其分析。與野生型LPS中的比值(圖IOB)相比，PagL修飾的LPS樣品中的C14:0(3OH)/C10:0(3OH)比值增加，這與預(yù)期的從百日咳博德特氏菌脂質(zhì)A的3位去除C10-3OH相一致。實施例7:PagL修飾地LPS的生物學(xué)活性為了評定PagL修飾的LPS和野生型百日咳博德特氏菌的LPS的內(nèi)毒素活性，測量它們在人巨噬細胞系MM6中刺激IL-6和IL-10產(chǎn)生的能力。如圖2所示，與用等量的pagL修飾的LPS刺激細胞的情況相比，對于野生型LPS,通過MM6細胞所產(chǎn)生的IL-6(圖IIA)和IL-10(圖IIB)更多。因此，可以斷定由PagL在體內(nèi)對百日咳博德特氏菌LPS進行脫酰基化，導(dǎo)致LPS的內(nèi)毒素活性的降低。實施例8:PagL(Pa)克隆、表達、純化界重折疊將來自銅綠假單胞菌PA025并且沒有其信號序列編碼部分的pagL基因，克隆到pET-lla中，得到質(zhì)粒pPagL(Pa)(-)。為了獲得包含體，在大腸桿菌BL21Star(DE3)中表達缺少其信號序列的PagL。分離包含體并溶解在尿素中，之后通過在兩倍10%十二垸基二甲基氧化胺(LDAO)中稀釋，以重折疊蛋白，并通過快速蛋白質(zhì)液相層析(FPLC)進一步純化。通過SDS-PAGE(圖12)證實正確的重折疊，并測量圓二色性(CD)(數(shù)據(jù)未顯示)。在SDS-PAGE膠上，重折疊蛋白的電泳遷移率低于變性形式的電泳遷移率，然而CD測量顯示重折疊蛋白主要具有e-折疊結(jié)構(gòu)。實施例9:通過膜定位和重折疊的PagL體外修飾LPS為了測試膜定位或體外重折疊的PagL是否能體外修飾所加入的LPS，我們將重折疊的PagL(Pa)(-)、或來自含有空的載體pET-lla或pPagL質(zhì)粒的大腸桿菌BL21Star(DE3)的分離細胞被膜，與腦膜炎奈瑟氏球菌的純化LPS—起進行溫育。通過Tricine-SDS-PAGE電泳(圖13)，評價LPS的修飾。與預(yù)期水解脂質(zhì)A的3位的R－3-羥基豆蔻酸相一致，當存在膜定位的PagL(圖13A)或重折疊PagL(Pa)(-)(圖13B)時，LPS被轉(zhuǎn)變成具有更高電泳遷移率的形式。與重折疊PagL(pa)(-)的反應(yīng)不依賴于二階陽離子的存在，因為在5mMEDTA(圖13B)的存在下，仍然觀測到LPS的脫?；?。實施例10:PagP和PagL在百日咳博德特氏菌中表達之后德脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)德改變?yōu)榱嗽诎偃湛炔┑绿厥暇闠ohama中表達PagP和PagL，在表達載體pMMB67EH的低拷貝數(shù)的廣范圍宿主中表達支氣管炎博德特氏菌的基因(pagL(Bb))和百日咳博德特氏菌的基因(PagP(Bp))。作為對照，還構(gòu)建了表達大腸桿菌pagP基因(pagP(Ec))的菌株。從野生型百日咳博德特氏菌株Tohama和表達PagP或表達PagL百日咳博德特氏菌株Tohama中分離LPS，并通過Tricine-SDS-PAGE電泳進行分析。分離自PagL(Bb)表達菌株的LPS，在膠上顯得未受到影響，然而分離自PagP表達菌株的LPS顯得受到可能的修飾，因為檢測出比野生型百曰咳博德特氏菌LPS更低電泳遷移率的帶。此外，與PagP聊)表達菌株相比，在PagP(關(guān)表達菌株中出現(xiàn)更高的修飾效率(圖14)。為了進一步詳細地評價可能的LPS修飾，通過ESI-MS以陰離子模式分析菌株本脂質(zhì)A部分。這種分析表明在野生型LPS中存在四種主要的脂質(zhì)A類型(圖15A)。m/z1557的峰代表通常發(fā)現(xiàn)于百日咳博德特氏菌中的特有的五?；姿狨ヮ愋?Caroff等，Microbes.Infect.，1994)，而m/z1477的峰相當于五?；涣姿狨ヮ愋?。m/z1307和1251的兩種其它峰代表分子離子在m/21477的脫?；|(zhì)A類型，它們分別缺失了3位的一級3-羥基癸酸殘基或一級3-羥基十四烷酸殘基(在2或3'位點)。這些結(jié)果表明在野生型百日咳博德特氏菌的脂質(zhì)A類型之間的高不均一性，即在凝膠分析中表現(xiàn)出的不溶解性(圖14)。有趣的是，計算來自相應(yīng)峰高的各個脂質(zhì)A類型的相對量，揭示了在野生型百日咳博德特氏菌LPS中，大量的脂質(zhì)A類型(50。/。)由四?；问浇M成。此外，大多數(shù)的脂質(zhì)A類型是一磷酸酯形式(80%)。為了排除高豐度的低酰基化的和低磷酸化的脂質(zhì)A類型是由用于分離脂質(zhì)A的水解方法引起的人工假象這種可能性，我們測試更短或更長的水解周期(介于1至4小時之間)是否影響脂質(zhì)A類型的相對豐度，然而情況并非如此(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，測定已知濃度的野生型百日咳博德特氏菌的純化LPS的溶液的總磷酸酯含量(totalphospahecontent)。與由ESI-MS檢測出的最為普遍的一磷酸脂質(zhì)A類型一致，當LPS已經(jīng)完全被磷酸化時，檢測到的磷酸酯含量僅僅比預(yù)期的磷酸酯含量的一半稍多(數(shù)據(jù)未顯示)。根據(jù)PagL(Bb)的表達(圖15B)，在m/z1081、1307和1387分別存在三種脂質(zhì)A類型。在m/z1307的主峰相當于缺失3位的3-羥基癸酸殘基的脫?；囊涣姿狨バ问?，而在附/z1387的峰相當于m/z1307的二磷酸化形式的分子離子。在m/z1081的峰相當于缺失3-羥基葵酸殘基和3-羥基十四烷酸殘基的一磷酸酯形式。缺失其3位的3-羥基癸酸殘基的脂質(zhì)A類型的相對含量，從野生型百日咳博德特氏菌LPS中的約37%提高到表達PagL,的菌株中的92°/。以上。因此，即使LPS的電泳遷移率不受到影響(圖14，泳道2)，編碼脂質(zhì)A3-0-脫?；傅?^g々腳在百曰咳博德特氏菌中仍具有活性。PagP(EC)(圖15C)和PagP(Bp)(圖15D)表達后，檢測出一些新的脂質(zhì)A類型(表III)。在m/zl320、14卯、1545、1625、1715以及1796的峰，分別相當于分子離子在m/z1081、1251、1307、1387、1477以及1557時的期望PagP介導(dǎo)的棕櫚?；?。通過Tricine-SDS-PAGE電泳后(圖14)可以觀測的在大腸桿菌PagP和百日咳博德特氏菌PagP中的修飾效率的差異，也可在質(zhì)譜分析中得到展現(xiàn)。在表達大腸桿菌PagP的菌株中，47%的總脂質(zhì)A群體被棕櫚?；c之相反的是，在表達PagP聊)的菌株中，只有9%。有趣的是，與在表達PagP(Ec)的菌株中相反，在表達PagP(Bp)的菌株中，發(fā)現(xiàn)缺失3-羥基十四烷酸殘基的脂質(zhì)A類型沒有被棕櫚酰化。對于這種差異的可能解釋是這是兩種PagP酶的特異性中的差異。盡管大腸桿菌PagP在脂質(zhì)A的2位點添加了酰基鏈，但百日咳博德特氏菌PagP在3'位點添加了棕櫚酸根(Bishop等，EMBOJ.，2000;Preston等，Mol.Microbiol.,2003)。因此，完全沒有被棕櫚?；闹|(zhì)A類型(缺失了百日咳博德特氏菌PagP的表達菌株的一個3-羥基十四烷酸殘基)，暗示著缺失3-羥基十四烷酸殘基的脂質(zhì)A分子，是在其3'位點的特異缺失了該殘基。由于大腸桿菌PagP的底物庫大于百日咳博德特氏菌PagP的底物庫，于是這可部分解釋在兩種PagP酶中所觀測到的修飾效率的差異。此外，這種假說與存在體內(nèi)低酰基化的脂質(zhì)A類型相一致。表III:根據(jù)ESI-MS所測定脂質(zhì)A分子離子的相對豐度<table>complextableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>參考文獻1.Raetz，C.R.H.，andWhitfield,C,(2002)爿"m/.Tev.所oc/^m.71，635-7002.Lop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