利用重組酶/轉座酶的改進的dna免疫法的制作方法

專利名稱：：利用重組酶/轉座酶的改進的dna免疫法的制作方法
技術領域：
：本發明涉及DNA疫苗和佐劑領域。特別地，本發明涉及改進的利用包法，所述表達盒編碼一種或多種蛋白質/多肽抗原和/或佐劑以及介導DNA整合到動物的基因組里的重組酶。本發明還涉及包含新多肽一兔GMCSF的佐劑組合物，用于提高兔體內的抗體產量。
背景技術：
：利用疫苗免疫動物需要蛋白抗原的可重復生產，這是比較困難和昂貴的。免疫使用生物體、毒素或抗原的全部或者通常其部分來進行。為了在宿主體內維持一定水平的免疫性，需要施用高劑量的抗原，或者大多數情況下，需要施用重復劑量的抗原。另外，疫苗的開發嚴重受限于可在動物體內引發可用反應的有用抗原的可得性。利用佐劑來增強動物體內的免疫反應在本領域內是公知的。已有多種類型的佐劑得以應用，例如，礦物油或含油佐劑，如完全弗氏佐劑(FCA)、不完全弗氏佐劑、Ribi佐劑、Titermax等；來源于細菌的佐劑，如MDP(胞壁酰二肽)、脂質A、脂多糖(LPS)等；無機化合物，如磷酸鋁、氫氧化鋁和磷酸鈣等；脂質體，與膜蛋白抗原復合的皂苷(免疫刺激性復合物)等等。多數佐劑有毒或引起輕度至重度的副作用，但也有一些只在宿主體內引起很弱的免疫反應。因此，開發安全和有效的佐劑是一項持續的挑戰。佐劑開發中的一種較新的方法是利用生物免疫刺激性佐劑例如細胞因子作為佐劑。基因免疫或稱DNA免疫在本領域中是已知的，它利用編碼目的抗原蛋白的基因或者DNA,而不是以多肽本身作為免疫原的來源。它基于制造容易、成本便宜的原料，還可以重復性地生產。宿主細胞攝取引入的DNA，并且通過正常的細胞機制表達編碼的抗原。然后抗原與I類和II類MHC分子一起呈遞在細胞表面上，在那里與免疫活性細胞接觸，引起免疫反應。這樣，無需增加最初的疫苗中抗原的量，也不需要反復地施用疫苗，免疫性的持續時間就可以延長。Manickan等，JClinInvest100:2371-2375(1997)報道了用編碼一種單純皰瘆病毒(HSV)蛋白的棵露DNA免疫小鼠。Boyle等，ProcNatlAcadSciUSA94:14626-14631(1997)報道了DNA免疫可誘發快速CTL反應，并且可產生比傳統的蛋白免疫親和力更高的抗體。HIV/AIDS的DNA疫苗已經制成，并已在各種動物4莫型中，包括非人類靈長類中，以及人類臨床試驗中得到了檢驗。參見，例如，Robinson等，J朋iVF^c。dS".Xcm772:209-211(1995);Yasutomi等，/腸/70:678-681(1996);MacGregor等，J/"/e"Z)&178:92-100(1998)。除了傳染性疾病之外，人們還認為DNA免疫有可能作為癌癥免疫療法的手IS:(參見，例如，Srinivasan和Wolchok,>/7>ww/A/ed2:12(2004))。DNA疫苗還被推薦用于變態反應的治療(參見，例如，Hartl等，M"/w&32:328-39(2004))。有若干因素影響DNA疫苗接種的結果，包括免疫的方法和部位、免疫原的形式、免疫接種的給藥方案、有無佐劑或生物佐劑如細胞因子的共同施用、其它共刺激分子的共同施用，DNA內有無免疫刺激序列(ISS),等等。例如，人們觀察到來自細菌而不是脊推動物的DNA可以引起非特異性的免疫反應，這似乎是由于這兩種基因組中非曱基化的胞嘧啶-磷酸-鳥噪呤二核香酸(CpG)出現的頻率存在差異。另外，人們發現，使用包含CpG和ISS序列的質粒DNA進行DNA接種，可以比使用不含ISS序列的相同疫苗誘導出更強的抗體和CTL反應。影響針對DNA接種的免疫反應其它重要因素有所編碼的抗原的形式，特別是抗原是否表達為細胞質蛋白或分泌蛋白；以及所編碼的抗原和/或佐劑的表達水平。通常，表達的水平越高、越持久，免疫反應就越強。通過許多不同的途徑一包括靜脈內、肌肉內、脾內和肝內途徑一的DNA接種均已顯示了成功。就抗體反應的產生而言，已經有很多研究報道說基因槍免疫接種比針注射的效率高得多，只需用少100至5000倍的DNA就可引起類似水平的抗體反應。施用DNA疫苗的最佳的給藥方案(例如劑量、次數、和/或免疫接種頻率)還遠未確定，而且需要針對每種個別的抗原進行最優化。大多數的研究表明，為使免疫反應最大化，多次注射是必需的。在通過DNA接種調節免疫反應的不同方法中，最有前途的方法可能是與生物佐劑例如細胞因子共同施用。GM-CSF基因是研究得最多的基因佐劑之一，它被證明是一種DNA接種后有效的免疫刺激物。當GM-CSF與其它的佐劑如FMS樣酪氨酸激酶3配體(Flt3L)基因或IL-4基因組合使用時，觀察到了額外的增強作用。最近，GM-CSF和Flt3L的組合被證實可使130種試驗抗原的絕大多數(84%)在小鼠體內產生很高的抗體滴度；參見Chamber等，A^f.所o&c/z"o/.21(9):1088-92(2003)。即使如此，DNA免疫接種還需要能夠使所編碼抗原蛋白和/或佐劑更高、更持久表達的更有效的方法。發明概述本發明涉及一種DNA免疫或接種動物或刺激其免疫系統的方法，它利用重組酶/轉座酶介導的整合，將編碼一個或若干抗原和/或佐劑的表達盒整合到受接種動物體內經轉染細胞的基因組中；本發明還提供提高DNA免疫動物的抗體產量的佐劑組合物。一方面，本發明提供一種新的佐劑序列，即如SEQIDNO:l所示的兔GMCSF多肽。此外，本發明提供一種嵌合分子，其包含與異源氨基酸序列融合的SEQNO:l的兔GMCSF多肽。在一個實施方式中，該異源氨基酸序列是表位序列。在另一個實施方式中，該異源氨基酸序列是免疫球蛋白序列。在該實施方式的另一方面，該免疫球蛋白序列是免疫球蛋白的Fc區域。本發明還提供編碼如SEQIDNO:l所示的兔GMCSF多肽的核苷酸序列。此外，本發明提供載體或表達盒，其包含編碼如SEQIDNO:l所示的兔GMCSF多肽的核苷酸序列。本發明還提供一種分離的宿主細胞，其由編碼如SEQIDNO:l所示的兔GMCSF多肽的核酸序列所轉化。另一方面，本發明涉及一種免疫或接種動物的方法，所述方法包括(i)施用至少一種DNA構建體，其包含至少一種編碼抗原的表達盒和第一重組位點；(ii)通過對所述動物施用至少一種佐劑刺激所述動物的免疫系統；以及，(iii)施用重組酶，該重組酶介導所述表達盒整合到包含第二重組位點的所述動物的基因組中，所述抗原在其中表達。對于本發明的所有方面來說，佐劑可以是傳統上使用的佐劑，也可以作為多肽或作為編碼該佐劑的核酸而導入。當佐劑作為DNA導入時，本方法包括(i)將作為DNA構建體的佐劑施用到動物中，所述構建體包含編碼佐劑的表達盒和第一重組位點；和(ii)介導所述表達盒整合到包括第二重組位點的動物基因組內的重組酶，所述佐劑在所述動物中表達。在所有的情況下，優選的抗原包括但不限于病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原，以及與疾病如感染、炎癥、癌癥、哞喘/變態反應、自身免疫疾病、多發性硬化、膿毒癥/中毒性休克(sepsis/toxicshock)、類風濕關節炎、同種異體移植物排斥、銀屑病等等有關的抗原。在一個優選的實施例中，抗原是CD20。在所有的情況下，優選的佐劑包4舌、^S不限于GMCSF，Flt3L,白細胞介素如IL-la和卩、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5、IL-6、IL-IO，TNF-oc,TNF-(3，IFN-y等，以及共刺激分子如TCA3、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD40配體(CD154)、MCP-1、MIP-la、(3、RANTES、等等。在一個優選的實施方式中，佐劑是如SEQIDNO:l所示的兔GMCSF。在一個實施方式中，編碼抗原的表達盒和編碼佐劑的表達盒是一個DNA構建體的部分。在另一個實施方式中，編碼抗原的表達盒和編碼佐劑的表達盒在不同的DNA構建體上。在本發明的各種情況下，重組酶可以作為多肽施用，或者作為編碼重組酶的RNA分子施用，或者作為包含編碼重組酶的表達盒的DNA構建體施用。在一個實施方式中，重組酶可以是由噬菌體表達的位點特異性重組酶。在該實施方式的另一個方面中，噬菌體重組酶可以從由cJ)C31、噬菌體R4和TP卯1-1所組成的組中選擇。在另一個實施方式中，重組酶可以是選自Cre重組酶、Cre樣(Cre-like)重組酶、Flp重組酶和R重組酶的位點特異性重組酶。在另一個實施方式中，重組酶可以是轉座酶或逆轉錄轉座酶(retrorecombinase)。在另一個方面中，轉座酶選自AC7、Tn5、Tn916、Tn951、Tnl721、Tn2410、Tn薩、Tnl、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn9、TnlO、Tn30、Tnl01、Tn903、Tn501、Tn1000、Tnl681、tn2901、AC轉座子、Mp轉座子、Spm轉座子、En轉座子、Dotted轉座子、Mu轉座子、Ds轉座子、En轉座子和I轉座子。在另一個方面中，所述轉座酶是真核轉座酶。在一個實施方式中，第一和第二重組位點至少共有90。/。的序列同一性。在另一個實施方式中，第一和第二重組位點具有小于卯％的序列同一性。在另一個實施方式中，第一個重組位點包含細菌基因組重組位點，且第二重組位點包含噬菌體重組位點。在另一個實施方式中，細菌基因組重組位點是attB,且噬菌體重組位點是attP。在另一個實施方式中，第一重組位點包含attB位點，且第二重組位點包含擬attP(pseudo-attP)位點。在另一個實施方式中，第一重組位點包含擬attB(pseudo-attB)位點，且第二重組位點包含attP位點。在一個特定的實施方式中，重組酶介導的重組產生不再是重組酶底物的位點。在本發明的一個實施方式中，DNA構建體可以是環狀的。在另一個實施方式中，DNA構建體可以是線性的。在一個特定的方面，本發明提供一種在動物中生成抗體的方法，包括(i)施用至少一種編碼抗原的DNA表達盒、重組位點、以及介導該DNA表達盒整合入動物基因組內的重纟且酶(administeringatleastoneDNAexpressioncassetteencodinganantigen,arecombinationsite,andarecombinasethatmediatestheintegrationoftheDNAexpressioncassetteintothegenomeoftheanimal);(ii)可選地施用至少一種佐劑；(iii)數天后從動物體內收集血清樣品；(iv)從血清中鑒定并可選地純化針對所施用抗原的抗體。像前面所指出的那樣，佐劑可以是傳統上使用的佐劑，也可以作為多肽或作為編碼佐劑的核酸導入。在所有方面中，優選的動物包括人類和非人類動物，如兔、鳥類(例如雞、火雞、鴨、鵝，等等)、嚙齒動物、牛、豬、綿羊、山羊和馬。在一個優選的實施方式中，非人類動物是兔。一組優選的非人類動物包括攜帶外源免疫球蛋白轉座位(translocus)的非人類轉基因動物。在一個實施方式中，非人類轉基因動物是基因轉化(geneconverting)動物。在一個優選的實施方式中，外源免疫球蛋白轉座位是人源或人源化的免疫球蛋白重鏈和/或輕鏈序列。附圖簡述圖1顯示兔GMCSF的氨基酸序列(SEQIDNO:l)。圖2顯示編碼兔GMCSF多肽的核酸序列(SEQIDNO:2)。編碼序列突出顯示。圖3顯示兔GMCSF(SEQIDNO:l)與來源于多種動物的其它GMCSF分子(SEQIDNO:7-19)的序列比對。圖4顯示一種表達質粒，它有三個表達盒，編碼兔GM-CSF、兔FLT3-L和人CD20。該質粒還包含重組酶識別序列(RRS)，用于在重組酶介導下將表達盒整合入受轉染細胞的基因組內。發明詳述A.定義除非另有定義，本發明所使用的技術和科學術語具有與本發明所屬
技術領域：
的普通技術人員所通常理解的含義。Singleton等，Z)/c"'o"a^o/Mi'cro6z'o/ogy(3打c/A/o/ecw/ar5z'o/ogy,2nded,，J."^11ey&Sons(NewYork,NY1994);Lowrie和Whalen，DNAVaccines:MeAotisaw<iiVotoco&，HumanaPress(1999);ConstantinA.Bona和AdrianB'ot，Gewe"c7m,m,^/ow,KluwerAcademic/PlenumPublishers(NewYork,NY2000);Koprowski和Weiner，ZWJKjtcc/w加'o"/G^wWc^ccz,"加,ow，Springer(Berlin,NewYork,1998);"Mo/ecw/arC7om.w爿丄a6orato^yMawwa/"，2ndedition(Sambrook等,1989);"0//go"wc/eo"<afe(M丄Gait編，1984);"Gfewerrara^/^Actors/orCW/s，，(J.M.Miller&M.P.Calos編，1987);和"CWre"f/Votoco/s/"Mo/ecw/ar所o/ogv"(F.M.Ausubel等編，1987)為本領域技術人員提供了本申請中所用到的許多術語、方法和規程的一般指導。本領域技術人員會認識到許多類似或等同于本發明所描述的方法和材料，其也可應用于本發明的實踐中。當然，本發明決不僅限于所描述的方法和材料。對本發明來說，下列術語定義如下。術語"免疫"(immunization)使用其最廣泛的意義，指的是向體內導入抗原以刺激免疫性的產生。"DNA免疫"(DNAimmunization)或"基因免疫"(geneticimmunization)用編碼一種或多種抗原和/或佐劑的DNA，而不是這些蛋白/多肽本身來產生和/或提高免疫性。術語"接種，，(vaccination)通常指的是向體內導入滅活的或減毒的病原體以促進保護性免疫。在"DNA接種,，(DNAvaccination)(也稱作基因接種(geneticvaccination))中，向體內導入一種或多種不同病原體的一個或多個基因，而不是導入滅活或減毒的病原體。結果，可以同時針對同一病原體的多種變體，或者針對數種不同的病原體進行接種。本發明中使用的術語"DNA構建體"指的是一種多核苷酸分子，它包含一個或數個目的結構基因、重組序列及其它對于保持、復制和選擇該DNA構建體而言必需的DNA序列。DNA構建體可包含一個或多個下面所述的"表達盒"。DNA構建體可以是任何載體如質粒，任何病毒載體，包括但不限于逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體，黏端質粒，等等。術語"逆轉錄載體"也指逆轉錄病毒或逆轉錄病毒粒子，其能夠進入細胞并且將逆轉錄病毒基因組整合到宿主細胞基因組內。DNA構建體可以是線性的，或者優選為環狀的。術語"表達盒"指一種多核苷酸分子，它包含一個或幾個目的結構基因，這些結構基因可操作地連接于各自的調控序列，這些調控序列促進目的編碼基因的表達；它還可選地含有其它DNA序列，這些序列編碼多種功能所必需的區域，這些功能有例如適時表達、促進蛋白的適當折疊、抗原遞呈細胞攝取、B細胞活化、T輔助細胞識別等等。在本發明的范圍中，表達盒包括一個或多個抗原表達盒、佐劑表達盒、重組酶表達盒等等。本發明中所使用的術語"重組酶"指的是這樣的一組酶，它們可以促進兩個確定位點一稱作"重組位點，，一之間發生重組，優選位點特異性重組，其中兩個重組位點位于單個核酸分子內部且物理上分離，或者位于不同的核酸分子上。所述兩個確定的重組位點并不一定完全相同。本重組酶的組中有幾個亞家族，包括整合酶(例如，Cre、Cre樣、FLP和X整合酶)、解離酶/轉化酶(例如、小31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶)。術語"重組酶"還包括^f旦不限于原核或真核轉座酶、病毒或果蠅copia樣逆轉座子，或非病毒逆轉座子，包括哺乳動物逆轉座子。典型的原核生物的轉座酶包括可轉座元件Tnl,Tn2，Tn3，Tn4，Tn5，Tn6,Tn9，TnlO，Tn30,TnlOl，Tn501，Tn903,TnlOOO,Tnl681，Tn2901等中編碼的轉座酶。真核轉座酶包括果蟲是麵n'"er可轉座元件、睡美人(sleepingbeauty)轉座酶、果蠅P元件、玉米Ac和Ds元件等中編碼的轉座酶。逆轉錄轉座酶包括丄/、7b/2rc/、7W、ManVzer(7//m<ar1)、Mar/werOmw1)、M/"os等中編碼的轉座酶。轉座酶也可以選自Mp、Spm、En、dotted、Mu、和I轉座元件。本文中使用的術語"野生型重組位點"指的是重組酶例如整合酶通常使用的重組位點。"擬重組位點"(pseudo-recombinationsite)指的是這樣的位點，重組酶可以在該位點促進重組，即使該位點可能不具有與野生型重組位點序列完全一致的序列。在本發明的范圍內，術語"第一重組位點"或"第二重組位點"可以是任何野生型或擬重組位點，例如，attB、attP、擬attB、或擬attP4立點。術語"重組酶介導的表達盒的整合"用于指在編碼和表達的重組酶介導下進行的整合，該重組酶促進表達盒特異性地整合入細胞的基因組，而不是隨機地整合。"佐劑"是任何化合物或組合物，其目的是增強針對特定目的抗原的免疫反應。任何佐劑，不管它通過什么機制來增強免疫反應，都可用于本發明。"抗體"(Abs)和"免疫球蛋白"(Igs)是具有相同結構特征的糖蛋白。抗體表現出與特定抗原的結合特異性，而免疫球蛋白既包括抗體，也包括其它缺乏抗原特異性的抗體樣分子。后者的多肽被例如淋巴系統以低水平產生，被骨髓瘤以較高水平產生。本文中使用的術語"非人動物，，包括、但不限于哺乳動物，例如，非人類靈長類、嚙齒動物(例如小鼠和大鼠)、和非嚙齒類動物，如兔、豬、綿羊、山羊、牛、犬、馬和驢。還包括鳥(例如，雞、火雞、鴨、鵝等等)。本發明使用的術語"非靈長類動物"指除了靈長類之外的哺乳動物，包括但不限于上面特別提到的哺乳動物。術語"多核苷酸和""核酸"可互換使用，并且，當用于單數或復數時，泛指任何多聚核糖核苷酸或多聚脫氧核糖核苷酸，其可以是未經修飾的RNA或DNA，或經修飾的RNA或DNA。DNA可以來自基因組DNA、cDNA或通過基因合成來源。因此，舉例來說，如本文定義的多核苷酸包括但不限于單鏈和雙鏈DNA，包括單鏈和雙鏈區域的DNA、單鏈和雙鏈RNA、包括單鏈和雙鏈區域的rna、以及包含dna和rna的雜合分子，這些DNA和RNA可以是單鏈的，或者更典型地是雙鏈的，或者包括單鏈和雙鏈區域。另外，本文使用的術語"多核苦酸"是指包含RNA或DNA,或包含RNA和DNA二者的三鏈區域。這樣的區域中的鏈可以來自相同分子或來自不同分子。該區域可以包括這些分子中一個或多個的全部區域，但更典型地只包括這些分子中的一些的區域。三螺旋區域中的一個分子通常是寡核苷酸。術語"多核苷酸，，具體包括cDNA。該術語包括含有一個或多個修飾堿基的DNA(包括cDNA)和RNA。因此，為了穩定性或其它原因而進行了骨架^f奮飾的DNA或RNA是"多核苷酸"，如該術語在本文中所意指的那樣。另外，包含稀有堿基例如次黃噤呤核苷，或包含修飾堿基例如氚化堿基的DNA或RNA，均包括在本文所定義的術語"多核苷酸"的范圍內。一般地，術語"多核苷酸"包括所有未修飾多核苷酸的經過化學修飾、酶修飾和/或代謝修飾的形式，以及病毒和細胞(包括簡單細胞和復雜細胞)的特征性DNA和RNA的化學形式。B.發明詳述本發明涉及一種改進的對動物(例如哺乳動物，包括人類)進行DNA免疫或接種的方法。該方法使用編碼抗原(例如源自病原體或其部分的蛋白，腫瘤抗原等)的DNA表達盒，而不是抗原本身，以產生持久的免疫性。還可以使用該改進的方法，利用基因佐劑，即由DNA表達盒編碼的佐劑，來在動物中增強或刺激免疫性，以實現更持久的免疫性增強。本方法中，將編碼抗原或佐劑的DNA導入，然后該DNA借助重組酶，優選位點特異性重組酶整合到動物的基因組中，其中所述重組酶促進所述DNA整合到基因組中。本發明進一步提供兔GMCSF佐劑的新的核酸和多肽序列。因此，舉例來說，利用這種佐劑，可以在動物例如兔中產生抗體，包括人源化抗體。更具體地說，抗原和/或佐劑表達盒的位點特異性整合包括施用(i)一種或數種環狀DNA構建體，該構建體包含一種或數種編碼抗原和/或佐劑的表達盒，以及為位點特異性重組酶所識別的第一重組位點；和(ii)位點特異性重組酶。利用下述的任何方法將DNA構建體施用給動物，從而轉染細胞。經轉染細胞的基因組包括該基因組固有的第二重組位點，第一和第二重組位點在重組酶的促進下發生位點特異性重組，使得DNA表達盒以更高的頻率穩定地整合到動物的細胞基因組中。這樣，重組酶介導的DNA接種方法使得所編碼的抗原和/或佐劑蛋白表達水平更高，更持久。在本發明的另一方面，該方法包括編碼抗原的DNA。抗原DNA的來源包括但不限于基因組DNA、cDNA或通過基因合成獲得的序列。抗原的鑒定可以通過利用本領域公知的策略在全基因組范圍搜索新的有用序列，或通過生物信息學篩選。抗原DNA(antigenicDNA)是指來自感染性病原體，包括但不限于細菌、病毒、原生動物、衣原體、利什曼原蟲(丄e"/7wam'a)、弓形體(7bxo//owma)、癡原蟲(尸/wmo&wm)、真菌(包括酵母)等等，或者其抗原的一部分的DNA序列。示例性的細菌抗原一在本發明中由它們的DNA所編碼一包括源自金黃色葡萄球菌(&a//^/ococcwm^e^)的抗原、毒力因子例如a毒素的重組形式、黏附素結合蛋白(adhesinbindingproteins)、膠原結合蛋白和纖連蛋白結合蛋白。示例性的細菌抗原還包括金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌aerwg/wasa)、腸球菌(enterococccus)、腸桿菌(enterobacter)和肺炎克雷伯氏菌(A7efezW/a/"e"wow'ae)、博德特氏菌屬(5onie&〃a)(cyaC和cyaA基因)的其它蛋白，等等。更多的示例性的細菌抗原包括但不限于莢膜抗原的編碼序列、外膜蛋白的重組形式、纖連蛋白結合蛋白、來自銅綠假單胞菌、腸球菌、腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌等等的抗原和毒素。用于產生針對真菌的抗體的示例性抗原包括真菌的外膜蛋白，例如，白色，支絲酵母(Ca"cfe/aa/6z'cfit"力、近平滑，I絲酵母(Ca"Wiiajoarapw7ow-力、熱帶有支絲酵母(C(3"dz'(^/rap/c""力和Ca"&(^"eo^brmam1等的夕卜膜蛋白。編碼序列可用于產生針對病毒的抗體的示例性抗原包括但不限于病毒的包膜蛋白和病毒的減毒型，所述病毒包括但不限于流行性感冒病毒、HIV-1/2(特別是gag，pol，rev,nef和包膜蛋白如gpl20、env等等)、狂犬病毒(rabies)、呼吸道合胞病毒(RSV)(特別是F蛋白)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、巨細胞病毒(CMV)、EBV、輪狀病毒、埃博拉病毒和HSV-1和2(單純皰瘆病毒)，等等。在本發明的另一個方面，抗原還可以指這樣的抗原，其引起抗體反應，其中所述抗體可用于治療疾病如癌癥。可用于制備治療性抗體的示例性癌癥相關抗原包括但不限于用于結腸癌的癌胚抗原(CEA)和17-1A;用于皮膚T細胞淋巴瘤的T細胞受體Vb;用于乳癌的Her-2-neu抗原；用于B細胞淋巴瘤的CD19、CD20、CD22和CD53抗原；用于前列腺癌的前列腺特異性膜抗原(PMSA);VEGF(通用)；用于卵巢癌的CA125;用于結腸直腸癌的EpCAM,等等。抗原還可以指這樣的抗原，其引起抗體反應，其中所述抗體可用于治療癌癥之外的其它疾病，這些疾病包括但不限于哞喘/變態反應，示例性抗原如CD23、IgE、IL-5、IL-4，等等；自身免疫疾病，示例性抗原如糖基CD3(對于I型糖尿病)、CD3、CD4、CD40L(對于全身性紅斑狼瘡或狼瘡)，等等；多發性硬化，示例性抗原如VLA-4、CD40L、CD11/18,等等；炎癥和/或膿毒癥/中毒性〈木克(inflammation/sepsis/toxicshock),示例性抗原如TNFa和(3、CD14,等等；類風濕性關節炎，示例性抗原如補體C5、TNFa和P、CD4等等；同種異體移植物排斥，示例性抗原如CD147、CD18、CD40L、P2整聯蛋白、CD3、CD4、CD25、等等；銀屑病，示例性抗原如IL-8、CDlla、E-選擇蛋白、ICAM-3、CD80、CD2、CD3;其中，如此導致的免疫反應可用于制備抵抗這些疾病的免疫疫苗。抗原還可以指這樣的抗原，其引起抗體反應，其中該抗體是對抗性(agonistic)或才莫擬性(mimetic)抗體，可用于治療疾病，例如血小^反減少。這里，模擬性抗體一anti-c-MPL設計為模擬負責血小板產生的TPO(促血小板生成素(thrombopoietin))的活性，因此可以作為治療抗體。在本發明的另一個方面，DNA接種方法使用佐劑。本發明的佐劑包括但不限于傳統上使用的佐劑，例如礦物油或含油佐劑，如完全弗氏佐劑(FCA)、不完全弗氏佐劑、Ribi佐劑、Titermax,等等；來源于細菌的佐劑，如MDP(胞壁酰二肽)、脂質A、脂多糖(LPS)等等；無機化合物如磷酸鋁、氫氧化鋁和磷酸鈣等等；脂質體、與膜蛋白復合的皂苷(免疫刺激復合物)、細胞因子、共刺激分子、細菌DNA、CpG等等。在一個實施方式中，本發明的佐劑是任何細胞因子，如GMCSF，IL-la和P，IL陽2，IL-12，IL-15，IL-18，IL誦4，IL國5，IL-6,IL-10,TNF-a,TNF-P，IFN-y等等。在另一個實施方式中，佐劑是共刺激分子，如TCA3,CD80(B7.1),CD86(B7.2),CD40配體(CD154),MCP-l,MIP-la、(3,RANTES,等等。在本發明的另一個實施方式中，細胞因子或共刺激佐劑可以作為多肽、mRNA、或作為編碼該佐劑或共刺激分子的DNA而施用。此外，也可以佳_用佐劑的組合或共同給予(co-delivery)多于一種佐劑。理想地，對于組合使用的佐劑，評價它們之間的協同作用以及它們引起體液免疫反應和細胞介導的免疫反應的聯合能力，即使它們通過不同的途徑給藥。在本發明的一個重要方面，該方法利用重組酶促進抗原和/或佐劑表達盒，乃至重組酶表達盒整合到動物的基因組中。位點特異的或隨機的重組均可促成表達盒的基因組整合。在一個優選的實施方式中，該方法需要位點特異性重組酶來促進所述表達盒中的任一個在特異性位點整合進入動物基因組中。位點特異性重組酶是具有酶活性的蛋白質，其催化兩個DNA片斷之間發生雙鏈DNA的相互交換。這樣的重組酶可識別發生交換的雙方DNA中的特異性序列，并且可以單獨作為蛋白起作用，也可以需要輔助因子的存在而起作用。盡管對于不同類型的位點特異性重組酶來說催化的機制可以是不同的，但不管其背后的機制如何，它們都包括在本發明中，并且適合于本發明的實踐。位點特異性重組酶典型地，但不是排他地，是原核生物的重組酶。位點特異性重組酶的兩個最大的家族是人整合酶樣酶和解離酶/轉化酶。這兩個家族的成員在它們的氨基酸序列以及催化機制上有顯著的差別。通過人整合酶家族的成員進行的重組包括Holliday交叉中間體的形成和解離，在此期間DNA通過磷酸酪氨酸鍵短暫地連接到酶上。解離酶/轉化酶家族的酶通過協同的、四鏈交錯的斷開和再接合(breakandrejoining)機制而發揮活性，在此期間在酶和DNA之間形成磷酸絲氨酸鍵。因此，舉例來說，已經知道，寬宿主范圍的鏈霉菌屬(Streptomyces)溫和噬菌體——OC31的基因組可以在解離酶/轉化酶位點特異性重組酶家族的一個成員酶的幫助下整合入宿主的染色體中。詳情可參見以下文獻，如，Thorpe和Smith,尸rac.扁.如d5*"..USA,95(10):5505國5510(1998)。噬菌體C31整合酶已經被證實可有效介導人細胞環境中染色體外載體的attB和attP噬菌體附著位點的整合。(j)C31和R4屬于位點特異性重組酶的整合酶家族，而TP901-1屬于擴展的(extended)解離酶家族。R4整合酶是來源于微小鏈霉菌(&rep/om少c^parvw/w力R4謹菌體基因組的位點特異性單向(unidirectional)重組酶。位點特異性整合酶TP901-1是乳酸乳球菌乳脂亞種(丄actococcws/actoswZw/.crewon'力i菌體TP901-1所編碼的。X是一種感染大腸桿菌(Eco//)的溫和噬菌體。該噬菌體具有一個供重組的附著位點(attP)，并且大腸桿菌細菌基因組也有一個供重組的附著位點(attB)。在本發明的范圍中，野生型重組位點可以從同源系統中得來并可與異源序列相聯系。因此，可以將attB位點置于其它系統中充當整合酶的底物。在一個實施方式中，重組酶可以催化細菌基因組重組位點(attB)和噬菌體基因組重組位點(attP)之間的重組，或者，第一位點可包含擬attB位點且/或第二位點可包含擬attP位點，反之亦然。在另一個實施方式中，重組酶介導產生不再是重組酶底物的重組位點(Groth等，尸rac.A^.5W.，2000，97:5995-6000;Olivares等，7Va/^e歷Wec/z"o/.2002，20(11):1124-8);(Thyagarajan等，M/."MCe〃.5w/.,2001,21:3926-3934);Hollis等，編.aW五wfocW"o/.,2003,1:79。因此，在本發明中，重組酶可以是噬菌體編碼的位點特異性重組酶，選自人整合酶、小C31、TP卯1-1和R4。其它已知和常用的位點特異性重組酶包括Cre和FLP等等(參見，如Bouhassira等，萬/ood88(Suppl.1),190a(1996);Bouhassira等,B/ood90:3332-3344(1997);Seibler&Bode,B/oc/z閨勿36:1740-1747(1997》Seibler等，所oc/z麵勿37:6229-6234(1998);Bethke&Sauer，iVwc/.^c/^ias.25:2828-2834(1997))。Cre重組酶的耙標是一個34bp序列的/ox尸位點，它由兩個顛倒的13bpCre結合位點組成，這兩個位點中間由8個石咸基的間隔序列分隔，重組發生在該間隔序列內部(Hoess&Abremski,尸rac.A^/.5W.USA81:1026-1029(1984))。基于Cre/loxP的克隆系統是可商購的，例如，可購自BDBiosciences-Clontech、PaloAlto、California(Creator)、或Invitrogen、Carlsbad、California(EchoTM)。Flp以fit位點為靶標。美國專利No.4,959,317中描述了利用Cre重組酶在真核細胞中進行DNA的位點特異性重組。美國專利No.6,632，672.中描述了利用位點特異性重組酶來轉染真核細胞。美國專利No.4，673，640中描述了通用的位點特異性重組。在另一個實施方式中，重組酶可以是轉座酶或逆轉錄轉座酶。轉座酶(transposons)或逆轉錄轉座酶是通過剪貼(cutandpaste)才幾制催化其轉座的酶，因此可用于轉移或插入任何表達盒。它們提供非病毒的和非同源的方法，來將任何DNA序列插入或轉移到多種物種的基因組中，包括脊推動物如人類、鳥、嚙齒動物等等。舉例來說，果蠅元件mariner就被證實可將其自身轉座到雞種系中，Sherman等，胸,腺ec/2"0/.，16:1050-1053(1998)。Yant等，淑,G認^，25:35-41(2000);Dupuy等，尸亂淑Jed5W.，99:4495陽4499(2002)和Geurts等，Mo/.77zera;_y，8:108-117(2003)已經證實，利用睡美人轉座酶系統，轉座子DNA在哺乳動物系統例如小鼠和人類基因組中實現了長期轉基因表達或高效插入。其它轉座酶如ZJ、7b/27W、7W、Man."er(///w<ar1)、M3n'"er(/ww1)、M/ww已經凈皮證實在脊推動物物種中具有活性，因此可用于基因轉移或作為插入"i秀變載體，Largaespada,DavidA.，歷o/.a"d五"docW"o/.,1:80(2003)。示例性的轉座酶包括但不限于原核或真核轉座酶，病毒、果蠅copia樣或非病毒逆轉錄轉座酶，包括哺乳動物逆轉錄轉座酶，等等。原核轉座酶包括可轉位元件Tnl,Tn2，Tn3，Tn4,Tn5,Tn6,Tn9，TnlO,Tn30，TnlOl，Tn501，Tn卯3，TnlOOO,Tnl681，Tn2901等中編碼的轉座酶。真核轉座酶包括果蠅man'"w、睡美人轉座酶、果蠅P元件、玉米Ac和Ds元件等中編碼的轉座酶。逆轉錄轉座酶包括因子ZJ、7^/27^7、rc3、iWiar/wer(///war/)、Afan'"e/"(附os/)、Mifwos等元4牛中編碼的。轉座酶也可以選自Mp、Spm、En、dotted、Mu和I轉座元件。在一個特定實施方式中，轉座酶可以是選自AC7、Tn5、Tn916、Tn951、Tnl721、Tn2楊、Tnl681、Tnl、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn9、TnlO、Tn30、TnlOl、Tn903、Tn501、TnlOOO、Tnl681、tn2901、AC轉座子、Mp轉座子、Spm轉座子、En轉座子、Dotted轉座子、Mu轉座子、Ds轉座子、En轉座子、I轉座子等的轉座酶。或者，也可以使用目標位點改變的轉座酶或真核轉座酶，如果蠅P元件、果蠅man'ww元件，或睡美人轉座酶等等。在另一個實施方式中，可以通過一種"滾動復制"(rollingreplication)轉座將編碼抗原和/或佐劑的表達盒的多個拷貝插入到真核細胞基因組中。Tnl，Tn2,Tn3，Tn4,Tn5,Tn9,Tn21,Tn501,Tn551,Tn951,Tnl721,Tn2410和Tn2603是滾動復制類型的轉座子的例子。重組酶可以作為具有酶活性的蛋白質，或者以編碼重組酶的重組表達質粒的形式施用。或者，重組酶的表達可以通過導入編碼重組酶的信使RNA而實現。因此，本發明涉及DNA接種方法，包括在轉座酶介導下將編碼一種或數種抗原和/或佐劑的表達盒整合到受接種動物的經轉染細胞的基因組中。才艮據本發明，編碼抗原的核酸、重組酶和佐劑可以同時加入，或者以任何順序加入。例如，編碼抗原的DNA和佐劑可以在加入重組酶之前加入。或者，可以將重組酶在導入下述各項之前或同時導入受體細胞包含所需一種或多種抗原的編碼序列的表達盒，和/或所需佐劑的編碼序列，以及重組酶特異性識別序列。或者，可以首先加入編碼抗原、重組酶和重組酶特異性識別序列的核酸，然后加入佐劑或編碼佐劑的DNA。在一個實施方式中，重組酶作為mRNA導入細胞，例如，借助于顯孩i操作器注射到雄性原核中。或者，可以通過編碼重組酶的重組表達盒(例如質粒)將重組酶導入受體細胞。這樣的質粒在本領域中是公知的，并且可以商購或者容易地制備，包括可商購的表達質粒pcDNA3和它的變體。Cre表達質粒也是可商購的，并且包括例如pBSl85(CMV-CRE)(Clontech)。在另一個實施方式中，重組酶作為具有酶活性的蛋白質導入受體動物。在本發明中，DNA構建體可以是任何載體，如質粒，任何病毒載體，包括但不限于逆轉錄病毒、腺病毒、慢病毒、黏端質粒、噬菌體等等。此外，DNA構建體可以是線性的，或者優選地是環狀的。本發明的DNA構建體可以在一個構建體、兩個或更多構建體，或在多個不同的個別構建體上編碼抗原DNA、佐劑DNA和/或重組酶DNA。可以將每種DNA構建體同時施用給動物，或者，優選地，在導入并且表達抗原DNA表達盒后再施用佐劑構建體。本發明的DNA構建體可以進一步包括必要的DNA序列，例如，對于它的維持、復制、抗生素選擇等而言必需的DNA序列。此外，DNA構建體可以編碼多種功能性DNA序列，例如可引發更強烈的免疫反應的免疫刺激(ISS)序列，如CpG基序等等。本發明的DNA構建體的施用途徑包括注射、口服或鼻內送遞等等，或通過本領域公知的任何其它途徑，或通過例如以下文獻所描述的途徑美國專利No.5,543,158、美國專利No.5,641,515、以及美國專利No.5,399,363,以上文獻均并入作為參考，并且不管其通過何種機制引發免疫反應。注射可以是皮下注射、皮內注射、肌肉內注射、腹膜內注射、脾內注射、透皮注射等等。注射本發明的DNA構建體的一種優選方法是借助基因槍。可以將DNA作為棵露DNA施用給動物、也可以與脂質體轉染(lipofection)試劑一起、與載體(carrier)—起，或者與任何已知的可增強細胞攝取DNA的組合物一起施用給動物，像例如美國專利Nos.4,608,251;4,601,903;4,599,231;4，599，230;4，596，792;以及4,578,770所描述的那樣，以上文獻均并入作為參考。載體包括疫苗組合物起作用所必需的任何其它活性成分、任何溶劑、分散介質、賦形劑(vehicle)、包衣(coating)、稀釋劑、抗細菌或抗真菌劑、緩沖劑、等滲溶液、吸收延遲劑(absorptiondelayingagent)、膠體、懸浮介質，等等。待注射的DNA構建體的有效量隨著例如以下因素而變化抗原種類以及它的表達水平(需對于每種抗原標準化)、施用途徑、大小(宿主的體重)、編碼的抗原的形式，即抗原是細胞質蛋白、膜結合蛋白或是分泌蛋白，等等。要注射到動物中的DNA構建體的有效量或劑量，是指對于任何施用的抗原來說，有效地達到最佳免疫效果或免疫治療效果的DNA量。例如，對于本發明某些抗原來說，每只動物每個Helios基因槍子彈約1嗎DNA的注射劑量是最佳的，但也可以使用其它適當的劑量。DNA接種可以根據適當的計劃表重復進行，這:f又決于所治療的疾病類型、為維持保護性免疫水平所需要的劑量等等，這些可以由本領域技術人員常規確定。除了編碼目的結構DNA序列以外，表達盒還可以包含編碼以下序列的序列保證所編碼的抗原的分泌的分泌前導序列；改善蛋白質可溶性和/或蛋白質折疊以增強抗原遞呈細胞對該抗原的攝取的域(例如46殘基的COMP域)、用于T輔助細胞依賴性B細胞活化的表位，等等。本發明還進一步提供編碼兔GMCSF蛋白質、多肽或多肽序列的核酸序列，它們可用作佐劑。GMCSF的表達可受到組成型活性啟動子、組織特異性啟動子或可誘導啟動子的控制。本文還認為給定的兔GMCSF核酸序列可表現為核酸序列具有輕微差別，但仍編碼相同蛋白質的天然變體。此外，本發明所使用的術語"功能等價密碼子"指的是編碼相同氨基酸的密碼子，例如編碼精氨酸或絲氨酸的6個密碼子(表1),也可指編碼生物學上等價的氨基酸的密碼子，如本文中討論的。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>谷胺酰胺GinQCAACAG精氨酸ArgRAGAAGGCGACGCCGGCGU絲氨酸SerSAGCAGUUCAUCCUCGUCU蘇氨酸ThrTACAACCACGACU纈氨酸ValVGUAGUCGUGGUU色氨酸TrpWUGG酪氨酸TyrYUACUAU本發明中所用到的DNA片斷包括生物學上功能等價的修飾多肽以及肽。這樣的序列的產生可能是已知在核酸序列中及由此編碼的蛋白質中天然存在的密碼子冗余以及功能等價性的結果。或者，功能等價蛋白質或肽可以通過應用DNA重組技術而產生，在DNA重組4支術中，基于交換的氨基酸的性質，可以對蛋白質結構的變化進行設計改造(engineer)。可以使用定點誘變技術引入人為設計的變化，來例如改進蛋白質的抗原性、減少蛋白質對接受該蛋白質的受試者的體內毒性作用、或者提高涉及該蛋白的任何治療的效力。考慮到遺傳密碼的簡并性(表1),本發明涵蓋這樣的序列其有至少大約50%,通常至少大約60%,更通常大約70%,最通常大約80%，優選至少大約卯％，最優選大約95%的核苷酸與SEQIDNO:2的核苷酸一致。術語"生物學上功能等價"是本領域普遍理解的，并在本文中得到了進一步詳細的定義。由此，那些有大約70%至大約80%;或更優選地，大約81%至大約90%;更優選地，大約91%至大約99。/。的氨基酸與兔GMCSF多肽的氨基酸一致或功能等價的序列，只要保持了該蛋白質的生物活性。本文中使用的術語"功能等價密碼子"指的是編碼相同氨基酸的密碼子，例如編碼精氨酸或絲氨酸的六個密碼子，也指編碼生物學上等價的氨基酸的密碼子(表l)。以下基于改變氨基酸而產生等價的、乃至改進的二代分子進行討論。例如，蛋白質結構中的某些氨基酸可以為其它的氨基酸所取代，而不會顯著損失與例如抗體的抗原結合區或底物分子上的結合位點等結構的相互作用結合能力。由于蛋白質的生物學功能活性是由蛋白質的相互作用能力以及蛋白質的性質所限定的，因此可在蛋白質序列中，以及作為其基礎的DNA編碼序列中進行某些氨基酸取代，而仍然生成與其性質類似的蛋白質。因此發明人認為在基因的DNA序列中可進行各種變化而不會對其生物學效用或活性造成明顯損失，如下所述。表1顯示了編碼特定氨基酸的密碼子。在進行這樣的變化時，可考慮氨基酸的親水指數(hydropathicindex)。親水氨基酸指數對于賦予蛋白質相互作用的生物功能的重要性是本領域普遍理解的(Kyte&Doolittle，1982)。人們公認，氨基酸的相對親水特性有助于形成蛋白質的二級結構，二級結構進而會決定蛋白質與其他分子，例如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等等的相互作用。本領域還知曉，根據親水性可有效地進行類似氨基酸的取代。美國專利No.4,554，101(在此并入本文作為參考)稱，蛋白質的最大局部平均親水性由它鄰近的氨基酸的親水性所決定，與該蛋白質的生物學性質之間相互關聯。如美國專利No.4,554,101中詳述的，已經給氨基酸殘基確定了以下親水值精氨酸(+3.0);賴氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0.+-.l);谷氨酸(+3.0.+-.1);絲氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);蘇氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5.+-.1);丙氨酸(-0.5);組氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);曱硫氨酸(-1.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。應當理解，一個氨基酸可以被另一具有類似親水值的氨基酸取代，且仍然生成生物學上等價的以及免疫學上等價的蛋白質。在這樣的改變中，所取代的氨基酸的親7K值在十-.2以內是優選的，在+-.1以內是特別優選的，更加優選的是在十-.0.5以內。如本文所概括的，氨基酸取代通常根據氨基酸側鏈取代基的相對類似性，例如，它們的疏水性、親水性、電荷、大小，等等。考慮了前述各種的特性的典型取代對于本領域技術人員而言是熟知的，包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。制備本發明的多肽的另一種實施方式是肽模擬物(mimetics)的利用。模擬物是模擬蛋白質二級結構元件的含肽分子(Johnson1993)。利用肽模擬物的理論基礎是蛋白質肽骨架的存在，主要是為了確定氨基酸側鏈的方向以促進分子間相互作用，如抗體和抗原之間的作用。可以預料，肽模擬物也與天然分子類似地容許分子相互作用。這些原則可以與上面概括的那些原則結合起來，用來設計改造具有佐劑的許多天然性質并且具有變化和改進的特性的第二代分子。因此，編碼兔GMCSF和兔GMCSF功能等價多肽的變體核酸序列在本發明中可用作佐劑。在本發明的另一個方面，可以施用本發明的DNA構建體的動物包括、但不限于哺乳動物(例如人類、非人類靈長類、嚙齒動物(例如小鼠和大鼠)、非嚙齒動物(例如兔、豬、綿羊、山羊、牛、豬、馬和驢)、以及鳥類(例如，雞、火雞、鴨、鵝等等)。可施用本發明的DNA構建體的動物包括"基因轉化動物"，也就是那些通過基因轉化和/或體細胞突變大量產生抗體多樣性的動物(如兔、鳥、牛、豬，等等)，以及那些在生命早期，典型地，在生命的第一個月之內，抗體重排停止的動物(如兔、鳥、綿羊、山羊、牛、豬、馬，等等)。此外，可施用本發明的DNA構建體的動物還包括任何如上所述的非人類動物，其另外攜帶編碼外源免疫球蛋白轉座位的轉基因，所述免疫球蛋白轉座位優選是人源或人源化免疫球蛋白重鏈和/或免疫球蛋白輕鏈序列或其部分。轉基因位點可以是種系構型或者是重排的形式。由于轉基因編碼人源或人源化免疫球蛋白或其片段，它產生人源化的抗體。因此，舉例來說，利用如上所述的重組酶介導DNA接種方法，可以利用本發明中描述的兔GMCSF佐劑在非人類動物對象中產生抗體，包括人源化抗體。通過下面的實施例中援引的某些實施方式進一步說明本發明，但本發明決不僅限于這些實施方式。本領域技術人員可以理解，可以對本發明作各種修改而不對本發明實施的方式產生實質性變化。所有這樣的修改都明確地包括在本發明的權利要求的范圍之內。實施例1兔GMCSF的克隆用30-60mlPBS/2%FCS(Gibco;PET10270098)灌洗ZIKA兔的腹膜腔，采集腹膜的巨噬細胞，并且洗滌兩次。對細胞計數，把細胞鋪在24孔板的一個孔中的DMEM/10%FCS中，密度是1-3x105細胞/孔，并用1jig/mlLPS大腸桿菌0111:B4(Sigma;L2630)在5%(:02保溫箱中于37。C刺激5小時。收集細胞，用QIA細pRNA-Mini-Mini-Kit(Qiagen)按照廠商說明書分離總RNA。利用BDSMARTRACEcDNAAmlificationKit(BDBiosciences),才安照廠商的規程，用3'-RACECDS引物A(5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30VN-3')(SEQIDNO:3)對3-6fil總RNA進4亍逆專爭錄。以引物對GAfGSFw;3(5'畫aaggctaaggtcctgaggagg國3')(SEQIDNO:4)和10x通用引物A混合物(5'CTAA丁ACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'(SEQIDNO:5)和5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'(SEQIDNO:6)的混合物)為引物，利用EppendorfTripleMaster聚合酶與高保真緩沖液從第一鏈cDNA擴增兔GMCSF。.PCR條件是94。C變性50s，60。C退火50s以及在72。C延伸50s，35個循環。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物。切下特異性帶，用GeneCleanTurbo凝膠提取試劑盒(Biol01)抽提，克隆進TOPOTA克隆載體(Invitrogen)并測序(Agowa)。實施例2通過基因接種在兔中產生抗CD20抗體分離來自LPS刺激的兔腹膜巨噬細胞和淋巴細胞的信使RNA(mRNA)，并進行逆轉錄。利用PCR擴增兔GMCSF和Flt3LcDNAs。接著，把cDNAs克隆進表達質粒。合成編碼人CD20可溶部分的cDNA,并將其克隆進同一表達質粒中。最終的構建體如圖l所示。純化質粒DNA并將其與等量的編碼C31整合酶的質粒混合。按照廠家說明將質粒DNA涂覆于Helios基因槍子彈上(約lpg/子彈)。將兔適度地麻醉，于第0天和第14天射擊每只耳朵。收集血液并使其凝結。通過離心收集血清。通過流式細胞術利用人外周血單核細胞檢測抗CD20抗體。將進行兔GMCSF免疫和沒有進行兔GMCSF免疫的動物進行對比，結果顯示，用兔GMCSF免疫顯著地提高了免疫反應。權利要求1.如SEQIDNO:l所示的兔GMCSF多肽。.2.—種嵌合分子，其包含與異源氨基酸序列融合的權利要求1的多肽。3.權利要求2的嵌合分子，其中所述異源氨基酸序列是表位序列。4.權利要求2的嵌合分子，其中所述異源氨基酸序列是免疫球蛋白序列。5.權利要求4的嵌合分子，其中所述的免疫球蛋白序列是免疫球蛋白的Fc區i或。6.—種核苷酸序列，其包含編碼權利要求1的兔GMCSF多肽的核苷酸序列。7.—種載體或表達盒，其包含權利要求6的核苷酸序列。8.—種分離的宿主細胞，其由權利要求6的核酸轉化。9.一種免疫或接種動物的方法，所述方法包括(i)施用至少一種DNA構建體，其包含至少一種編碼抗原的表達盒和第一重組位點；(ii)通過向所述動物施用至少一種佐劑刺激所述動物的免疫系統；以及,(iii)施用重組酶，所述重組酶介導所述表達盒整合到包含第二重組位點的所述動物的基因組中，所述抗原在其中表達。10.權利要求9的方法，其中所述佐劑作為多肽導入。11.權利要求9的方法，其中所述佐劑的施用包括向所述動物中導入(i)作為DNA構建體的所述佐劑，該DNA構建體包含編碼所述佐劑的表達盒以及第一重組位點；以及，(ii)重組酶，其介導所述表達盒整合到包含第二重組位點的所述動物的基因組中，所述抗原在其中表達。12.權利要求9的方法，其中所述抗原選自病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原以及與疾病如感染、炎癥、癌癥、哮喘/變態反應、自身免疫疾病、多發性硬化、膿毒癥/中毒性休克、類風濕關節炎、同種異體移植物排斥、銀屑病等相關的抗原。13.權利要求9的方法，其中所述抗原是CD20。14.權利要求11的方法，其中所述佐劑選自GMCSF、Flt3L、白細胞介素如IL-la和p,IL陽2，IL-12,IL-15,IL-18,IL-4,IL-5,IL隱6，IL畫IO，TNF-q，TNF-B,IFN-y等以及共刺激分子如TCA3、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD40配體(CD154)、MCP-1、MIP畫la,(3、RANTES等。15.權利要求11的方法，其中所述佐劑是SEQIDNO:l的兔GMCSF。16.權利要求11的方法，其中所述編碼抗原的表達盒和所述編碼佐劑的表達盒是一個DNA構建體的部分。17.權利要求11的方法，其中所述編碼抗原的表達盒和所述編碼佐劑的表達盒在不同的DNA構建體上。18.權利要求9或11的方法，其中所述重組酶作為多肽施用。19.權利要求9或11的方法，其中所述重組酶作為編碼所述重組酶的信使RNA分子施用。20.權利要求9或11的方法，其中所述重組酶作為包含編碼所述重組酶的表達盒的DNA構建體施用。21.權利要求9或11的方法，其中所述重組酶是由喧菌體表達的位點特異性重組酶。22.權利要求21的方法，其中所述重組酶選自(j)C31、噬菌體R4和TP卯1畫1。23.權利要求21的方法，其中所述位點特異性重組酶選自Cre重組酶、Cre樣重組酶、Flp重組酶和R重組酶。24.權利要求9或11的方法，其中所述重組酶是轉座酶或逆轉錄轉座酶。25.權利要求24的方法，其中所述轉座酶選自AC7、Tn5、Tn916、Tn951、Tnl721、Tn2410、Tnl681、Tnl、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn9、TnlO、Tn30、TnlOl、Tn903、Tn501、TnlOOO、Tnl681、tn2901、AC轉座子、Mp轉座子、Spm轉座子、En轉座子、Dotted轉座子、Mu轉座子、Ds轉座子、En轉座子和I轉座子。26.權利要求24的方法，其中所述轉座酶是真核轉座酶。27.權利要求9或11的方法，其中所述第一和第二重組位點至少有卯％的序列同一性。28.權利要求9或11的方法，其中所述第一和第二重組位點的序列同一性小于卯％。29.權利要求9或11的方法，其中所述第一重組位點包含細菌基因組重組位點，且所述第二重組位點包含噬菌體重組位點。30.權利要求29的方法，其中所述細菌基因組重組位點是attB，且所述噬菌體重組位點是attP。31.權利要求29的方法，其中所述第一重組位點包含attB位點，且所述第二重組位點包含擬attP位點。32.權利要求29的方法，其中所述第一重組位點包含擬attB位點，且所述第二重組位點包含attP位點。33.權利要求9或11的方法，其中所述重組酶介導的重組產生對于重組酶而言不再是底物的位點。34.權利要求9或11的方法，其中所述DNA構建體是環狀的。35.權利要求9或11的方法，其中所述DNA構建體是線性的。36.權利要求9的方法，其中所述動物是非人哺乳動物。37.權利要求36的方法，其中所述非人哺乳動物是兔。38.權利要求9的方法，其中所述動物是人。39.—種在動物中生成抗體的方法，包括(i)施用至少一種編碼抗原的DNA表達盒、重組位點和介導所述DNA表達盒整合到所述動物的基因組中的重組酶；(ii)可選地施用至少一種佐劑；(iii)數天后從所述動物中采集血清樣品；(iv)從所述血清樣品中鑒定并可選地純化針對所施用抗原的抗體。40.權利要求39的方法，其中所述佐劑作為多肽施用。41.權利要求39的方法，其中所述佐劑作為核酸施用，所述核酸包含編碼所述佐劑的表達盒、重組位點和介導所述編碼佐劑的DNA表達盒整合到所述動物的基因組中的重組酶。42.權利要求39的方法，其中所述動物是人。43.權利要求39的方法，其中所述動物是非人哺乳動物。44.權利要求39的方法，其中所述動物是攜帶外源免疫球蛋白轉座位的非人轉基因動物。45.權利要求44的方法，其中所述外源的免疫球蛋白轉座位是人源或人源化免疫球蛋白重鏈和/或輕鏈序列。46.權利要求44的方法，其中所述非人轉基因動物是基因轉化動物。47.權利要求44的方法，其中所述非人轉基因動物選自嚙齒動物、兔、鳥，包括雞、火雞、鴨和鵝。48.權利要求43的方法，其中所述非人哺乳動物是兔。49.權利要求39的方法，其中所述抗原選自病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原和與疾病如癌癥、哮喘/變態反應、自身免疫疾病、多發性硬化、炎癥/膿毒癥/中毒性休克、類風濕關節炎、同種異體移植物排斥、銀屑病等相關抗原。50.權利要求49的方法，其中所述抗原是CD20。51.權利要求39的方法，其中所述佐劑選自GMCSF、Flt3L、白細胞介素如IL-la和(3,IL-2，IL-12,IL-15,IL-18,IL-4,IL-5,IL-6，IL畫IO,TNF畫aTNF-R，IFN-y等以及共刺激分子如TCA3、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD40配體(CD154)、MCP-1、MIP-la、卩、RANTES等。52.權利要求39的方法，其中所述佐劑是如SEQIDN0:1的所示的兔GMCSF。全文摘要本發明涉及利用載體免疫/接種包括人的動物或刺激其免疫系統的改進的方法，該方法利用包含編碼的表達盒的載體，所述載體編碼一種或多種蛋白質/多肽抗原和/或佐劑，特別是細胞因子如GMCSF、Flt3L、白細胞介素等等，所述佐劑也可被DNA所編碼，另外還利用重組酶介導的整合。已知佐劑可增強DNA疫苗接種后的免疫反應。另外，載體包含一個或多個受重組酶/轉座酶識別的位點，重組酶/轉座酶催化載體插入到轉染細胞的基因組中。質粒穩定地整合到轉染細胞的基因組中導致編碼蛋白的更高水平和更持久的表達，并且增強受接種動物體內的免疫反應。本發明還涉及包含新多肽—兔GMCSF的佐劑組合物，用于提高兔體內的抗體產量。文檔編號C12N15/90GK101123981SQ200580048364公開日2008年2月13日申請日期2005年12月12日優先權日2004年12月14日發明者約瑟夫·普拉策,羅蘭·比洛申請人:人類多細胞治療股份有限公司