嵌合載體的制作方法

專利名稱：：嵌合載體的制作方法嵌合載體相關(guān)申請信息本申請要求2004年12月15日提交的美國臨時專利申請序號60/636,126的優(yōu)先權(quán)，將其完整并入本文作為參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及新的嵌合病毒載體和其制備和施用方法。發(fā)明背景越來越清楚的是，基于腺伴隨病毒(AAV)的載體是某些基因療法應(yīng)用如肌肉遞送選擇的載體。此類方案中AAV載體的利用是基于AAV的有利的性質(zhì)。這些性質(zhì)包括缺少致病性和病理、容易制備和純化、在包括肌肉的許多組織中長期表達、和缺少有害的細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。AAV血清型2(AAV2)是研究最詳細的AAV分離物。在過去十年中，在評價備選AAV血清型的組織親嗜性中已經(jīng)進行了大量工作。這些研究表明不同的AAV血清型可以更好地適于具體應(yīng)用。在這方面，血清型1、6和7對于遞送到骨骼肌是最有希望的。如與AAV2相比，AAV1可以以較低劑量(例如，較少的顆粒)施用并且可以在較早的時間點和以更高的表達水平表達轉(zhuǎn)基因。AAV2的純化方案是充分確定的。改進較少的是一些其他AAV血清型的純化參數(shù)。將希望工程化AAV2的變體，其顯示出有利的性質(zhì)，如AAV1、6和7的增強的肌肉親嗜性但是仍然保持容易純化。增加可用的AAV載體的范圍將還解決與再次施用和免疫應(yīng)答有關(guān)的問題。因此，將希望可以利用更多種的AAV載體。發(fā)明概述本發(fā)明提供了嵌合病毒載體，其已經(jīng)設(shè)計成顯示出一種或多種目的性質(zhì)(例如，增強的組織親嗜性)，例如，發(fā)明人已經(jīng)鑒定了AAV1的負責(zé)增強的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵的氨基酸并且將該氨基酸選擇性工程化到AAV2以及AAV3b到骨架中。在具體實施方案中，本發(fā)明到嵌合病毒具有增強的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力(例如，骨骼肌、心肌、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、肝臟、視網(wǎng)膜和/或肺等等的轉(zhuǎn)導(dǎo))、增強的轉(zhuǎn)基因表達水平和/或較早的轉(zhuǎn)基因表達開始。該嵌合病毒還可以對于一種或多種細胞或組織(例如肝臟)具有減弱的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，其在載體靶定目的靶組織和減小施用的載體劑量方面是希望的。關(guān)于基于AAV2的嵌合病毒，這些嵌合體可以設(shè)計成保留該血清型的一種或多種所希望的性質(zhì)(例如，容易純化和已知的安全性)，而顯示出其他AAV如AAV1、AAV6和/或AAV7的一些有利的性質(zhì)(包括骨骼肌的增強的轉(zhuǎn)導(dǎo))，和/或在其他AAV中沒有看到或者在其他AAV中以較小程度存在的目的性質(zhì)。此外，在具體實施方案中，嵌合病毒具有與親本病毒之一或者兩者不同的免疫譜(即，與親本病毒相比，僅僅被中和性抗血清或者抗體弱識別或者根本不被識別)，從而，允許施用于具有針對親本病毒的抗體對受試者或施用另一種血清型后反復(fù)施用。因此，本發(fā)明的一方面提供了嵌合病毒載體，其包含(a)嵌合AAV殼體，其包含AAV2殼體亞基中氨基酸位置264后的選擇性氨基酸插入或者來自其他AAV的殼體亞基中的對應(yīng)改變；和(b)包含AAV末端重復(fù)序列和異源核酸序列的核酸；其中該核酸包裝在嵌合AAV殼體內(nèi)。作為另一方面，本發(fā)明還提供了嵌合病毒載體，其包含(a)嵌合AAV殼體，其包含(i)AAV2殼體亞基中氨基酸位置263上丙氨酸對谷氨酰胺的選擇性氨基酸替代；(ii)AAV2殼體亞基中氨基酸位置264后蘇氨酸的選擇性氨基酸插入(例如，緊接氨基酸位置264后)；(b)包含AAV末端重復(fù)序列和異源核酸序列的核酸；其中該核酸包裝在嵌合AAV殼體內(nèi)。本發(fā)明還提供了嵌合病毒載體，其包含(a)嵌合AAV殼體，其包含(i)AAV3b殼體亞基中氨基酸位置263上丙氨酸對谷氨酰胺的選擇性氨基酸替代；(ii)AAV3b殼體亞基中氨基酸位置264后蘇氨酸的選擇性氨基酸插入(例如，緊接氨基酸位置264后)；(b)包含AAV末端重復(fù)序列和異源核酸序列的核酸；其中該核酸包裝在嵌合AAV殼體內(nèi)。作為再一個方面，本發(fā)明還提供了嵌合病毒載體，其包含(a)嵌合AAV殼體，其包含AAV2殼體亞基中氨基酸位置450后的選擇性氨基酸替代或者來自其他AAV的殼體亞基中的對應(yīng)改變；和(b)包含AAV末端重復(fù)序列和異源核酸序列的核酸；其中該核酸包裝在嵌合AAV殼體內(nèi)。作為再一個方面，本發(fā)明還提供了嵌合病毒載體，其包含(a)嵌合AAV殼體，其包含AAV2殼體亞基中氨基酸位置457后的選擇性氨基酸替代或者來自其他AAV的殼體亞基中的對應(yīng)改變；和(b)包含AAV末端重復(fù)序列和異源核酸序列的核酸；其中該核酸包裝在嵌合AAV殼體內(nèi)。還提供了包含本發(fā)明的嵌合病毒載體的藥物制劑。本發(fā)明還提供了給細胞施用核酸的方法，其包括將細胞與本發(fā)明的嵌合病毒載體或者藥物制劑接觸。作為再一個方面，本發(fā)明提供了給受試者遞送核酸的方法，其包括給受試者施用本發(fā)明的病毒載體或藥物制劑。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的嵌合病毒載體在用于生產(chǎn)治療疾病的藥物中的用途。在下面本發(fā)明的描述中更詳細地給出本發(fā)明的這些和其他方面。附圖簡述圖1A-1B.分類方法的原理。使用VectorNTI軟件套裝中的Align程序，對四種AAV血清型(AAV1、AAV2、AAV7和AAV8)進行多重氨基酸比對。在AAV1(SEQIDNO:l)和AAV7(SEQIDNO:2)中相似并且在AAV2(SEQIDNO:3)和AAV8(SEQIDNO:4)中不同的氨基酸或者包含在四種血清型中不同的氨基酸的位置突出為潛在候選者。這導(dǎo)致36個潛在候選者工程化到AAV2。消除可以建模到晶體結(jié)構(gòu)的氨基酸和候選者在殼體表面的分子建模導(dǎo)致圖1C中所示的氨基酸的測試。圖1C.使用VectorNTI軟件包中的Align程序比對AAV1(SEQIDNO:l)和AAV2(SEQIDNO:3)。分類方法中測試的氨基酸以箭頭顯示。環(huán)繞的氨基酸對應(yīng)于以前Haucketal,(2003)丄77:2768-2774)中鑒定的那些氨基酸。圖2A.改變AAV2在324、328位的氨基酸不增強肌肉轉(zhuǎn)導(dǎo)。將AAV3的氨基酸位置324、328改變成AAV1的氨基酸。將1x101D個含有病毒基因組的顆粒注射到雄性Balb/c小鼠的每個腓腸肌中。在注射后7、14、28和42天對每只小鼠成像。使用氯化銫梯度純化該實驗中使用的病毒。圖2B.定量來自AAV2對比324，328變體的肌肉的光發(fā)射。使用CMIRjmage軟件計算從圖2A中描繪的實驗的光發(fā)射的量。定義來自每只腿的目的區(qū)(ROI)并用于計算發(fā)射的總的光子。數(shù)據(jù)表示為所有6只四肢的平均值。圖3A.改變AAV2的氨基酸產(chǎn)生2.5變體顯著增強了該變體的肌肉親嗜性。向雄性Balb/c小鼠的每個腓腸肌注射1x10"個含有病毒基因組的顆粒。每只小鼠在注射后7、14、28、42和95天成^f象。使用肝素HPLC純化該實驗中使用的病毒。使用CMIR—image軟件計算從每只動物發(fā)出的光的量。定義來自每只腿的目的區(qū)(ROI)并用于計算發(fā)射的總的光子。數(shù)據(jù)表示為所有6只四肢的平均值。圖3B.AAV2殼體單體上氨基酸位置的定位。描述了AAV2殼體單體的3D帶狀結(jié)構(gòu)。通過箭頭指出2.5變體中作出的改變的位置。頂部的箭頭指向263,265區(qū)，3個底部箭頭指向709,712,720氨基酸。圖3C.AAV2五聚體上2.5氨基酸的位置。通過圓圏指出2.5變體氨基酸的位置。盡管2個氨基酸位于單個亞基的一個部分并且3個其他氨基酸位于相同亞基的另一部分，但是當(dāng)2個亞基聚集在一起形成AAV殼體時，這5個氨基酸在2倍對稱軸上處于非常接近的位置。圖4.263，265氨基酸賦予增強的肌肉親嗜性。產(chǎn)生2.5變體的子集(263，265;709，712,720)。向雄性Balb/c小鼠的每個腓腸肌注射1x1010個含有病毒基因組的顆粒。每只小鼠在注射后7、14、28和42天成像。使用氯化銫梯度純化該實驗中使用的病毒。263，265變體顯示出與2.5變體相似的增強的肌肉親嗜性，而709，712，720變體顯示出與AAV2相似的肌肉親嗜性謙。圖5.在265位的蘇氨酸插入造成2.5的增強的肌肉親嗜性的主要部分。產(chǎn)生263，265變體的子集(263或者265)。向雄性Balb/c小鼠的每個腓腸肌注射lxlO^個含有病毒基因組的顆粒。每只小鼠在注射后7、14、28、42和100天成像。使用氯化銫梯度純化該實驗中使用的病毒。265變體顯示出與263,265變體相似的肌肉親嗜性，而263變體不顯示出增強的肌肉親嗜性。圖6.454,461變體在注射后較晚的時間點顯示出增強的肌肉親嗜性。向雄性Balb/c小鼠的每個腓腸肌注射1x101()個含有病毒基因組的AAV2或454，461顆粒。每只小鼠在注射后7、14、21、28和42天成像。使用氯化銫梯度純化該實驗中使用的病毒。454，461肌肉轉(zhuǎn)導(dǎo)在早期時間點(第7和14)天類似于AAV2，但是在較晚時間點的表達好于AAV2(第21-42天)。圖7.鑒定其他AAV血清型的263，265區(qū)為天然插入?yún)^(qū)。使用VectorNTI軟件包的Align程序?qū)AV血清型1(SEQIDNO:5)、2(SEQIDNO:6)、3a(SEQIDNO:7)、3b(SEQIDNO:7)、4(SEQIDNO:8)、5(SEQIDNO:9)、6(SEQIDNO:5)、7(SEQIDNO:IO)、8(SEQIDNO:ll)和9(SEQIDNO:12)的殼體序列進行多重序列比對。框中顯示的是其他血清型的對應(yīng)于AAV1中鑒定的負責(zé)增強的肌肉親嗜性的氨基酸的氨基酸。圖8.AAV變體的肝素結(jié)合圖。將每種AAV變體的等量顆粒應(yīng)用于1型肝素瓊脂糖并允許結(jié)合。用PBS洗滌柱子，并用氯化鈉洗脫。通過斑點印跡雜交確定穿過液、洗滌液和洗脫液中存在的顆粒數(shù)。數(shù)據(jù)描繪為未結(jié)合的顆粒(洗滌和穿過液)和結(jié)合的顆粒(洗脫液)的百分比。圖9AAV2背景中263，265突變體的殼體序列(SEQIDNO:13)與AAV2的殼體序列(SEQIDNO:3)的氨基酸比對。關(guān)于VPl序列編號氨基酸l。圖10AAV3b背景中263，265突變體的殼體序列(SEQIDNO:14)與AAV3b的殼體序列(SEQIDNO:15)的氨基酸比對。關(guān)于VPl序列編號氨基酸l。圖11AAV2背景中2.5突變體的殼體序列(SEQIDNO:16)與AAV2的殼體序列(SEQIDNO:3)的氨基酸比對。關(guān)于VPl序列編號氨基酸圖12.如通過體內(nèi)活動物成4象測定的，在注射AAV1、AAV2、AAV3b或SASTG的含有等量基因組的顆粒(1x101D)的小鼠中隨時間(第3、7、14和21天)的螢光素酶活性。圖13.在來自用攜帶hFIX轉(zhuǎn)基因的AAV2或者嵌合2.5載體處理的小鼠血清中，通過ELISA檢測的人因子IX(hFIX)水平。圖14.施用攜帶GFP轉(zhuǎn)基因的嵌合2.5載體后，在小鼠腦皮質(zhì)中的神經(jīng)元(左箭頭)和非神經(jīng)元(右箭頭)細胞中的綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因表達。發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于發(fā)現(xiàn)細小病毒(包括AAV)殼體可以工程化以摻入來自其他細小病毒的小的選擇性區(qū)域，其賦予希望的性質(zhì)。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一些情況中，來自第一種細小病毒(例如AAV)的小至單個氨基酸插入或替代到另一細小病毒(例如AAV)的殼體結(jié)構(gòu)中以產(chǎn)生嵌合的細小病毒，這足夠?qū)λ玫那逗霞毿〔《举x予第一種細小病毒的一種或多種希望的性質(zhì)和/或賦予在第一種細小病毒中不存在或者以較低程度展示的性質(zhì)。將參考附圖描述本發(fā)明，附圖中顯示了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。然而，本發(fā)明可以以不同的形式體現(xiàn)并且不應(yīng)該理解為局限于本文給出的實施方案。相反，提供這些實施方案使得該公開將是完全和完整的，并且將對本領(lǐng)域技術(shù)人員完全傳達本發(fā)明的范圍。除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同的含義。本文的發(fā)明描述中使用的術(shù)語僅僅用于描述具體實施方案并且不意在限定本發(fā)明。本文提到的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻都完整引入作為參考。本發(fā)明說明書和所附權(quán)利要求書中AAV殼體亞基的所有氨基酸位置的指定都是針對VP1殼體亞基編號。除了另外指出，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準方法可以用于構(gòu)建rAAV構(gòu)建體、修飾的殼體蛋白質(zhì)、表達細小病毒rep和/或cap序列的包裝載體，和瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的包裝細胞。此類技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。見例如，SAMBROOKe"/.，MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL2ndEd.(ColdSpringHarbor,NY，1989);F.M.AUSUBEL"fl/.CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(GreenPublishingAssociates,Inc.andJohnWiley&Sons,Inc.,NewYork)。定義下面的術(shù)語用于本文的說明書和所附權(quán)利要求書中。如本發(fā)明的說明書和所附權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式"一個"、"一種"或"該"意在包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文清楚地指出相反的意思。本文4吏用的術(shù)語"細小病毒"包括細小病毒科(尸"n^v/r/rfM)，包括自主復(fù)制的細小病毒和依賴病毒。自主細小病毒包括細小病毒屬(i^尸vov/尸ws)、紅細胞病毒屬(￡>j"roWn/s)、濃核病毒屬(DmsYv/ms)、/&/"flv//m、和CVw加v/n/s的成員。示例性自主細小病毒包括但不限于，小鼠的細小病毒、牛細小病毒、犬細小病毒、雞細小病毒、貓全白細l包缺乏癥病毒、貓細小病毒、鵝細小病毒、Hl細小病毒、美洲家鴨細小病毒和B19病毒。其他自主細小病毒是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。見例如，BERNARDN.FIELDSCfl/.，VIROLOGY,巻2,69章(第四版，Lippincott-RavenPublishers)。依賴病毒屬包括腺伴隨病毒(AAV)，包括但不限于l型AAV、2型AAV、3型AAV(包括3A和3B型)、4型AAV、5型AAV、6型AAV、7型AAV、8型AAV、9型AAV、10型AAV、11型AAV、鳥AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV和羊AAV或現(xiàn)在已知的或者以后發(fā)現(xiàn)的任何其他AAV。見例如，BERNARDN.FIELDSWa/.，VIROLOGY,巻2，69章(第四版，Lippincott-RavenPublishers)-最近，已經(jīng)鑒定了許多新的AAV血清型和進化枝(見例如，Gaoetal.，(2004)/W/Y/ogy78:6381-6388和表1)。AAV和自主細小病毒的多種血清型的基因組序列以及末端重復(fù)(TR)、Rep蛋白和殼體亞基的序列是本領(lǐng)域中已知的。此類序列可以在文獻或者公共數(shù)據(jù)庫如GenBank中找到。見例如，GenBank檢索號NC002077、NC001401、NC001729、NC001863、NC001829、NC001862、NC000883、NC001701、NC001510、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC001358、NC001540、AF513851、AF513852、AY530579、AY631965、AY631966;將它們的公開完整引入本文作為參考。還見例如，Srivistavaetal"(1983)/K//Y/ogy45:555;Chiorinietal"(1998)/F/ra/ogj;71:6823;ChioriniWfl/.，(1999)丄F/ra/ow73:1309;Bantel-Schaaletal"(1999)丄K/w/o^73:939;Xiaoetal"(1999)丄胸/柳73:3994;Muramatsuetal"(1996)K/n/ogj;221:208;Shadeetal"(1986)/F/n/.58:921;Gaoetal"(2002)A^.JcflJ.fASL499:11854;國家專利公布WO00/28061,WO99/61601,WO98/11244;美國專利號6，156，303;將它們的公開完整引入作為參考。還見表l。AAV1、AAV2和AAV3末端重復(fù)序列的早期描述由Xiao,X.，(1996),"CharacterizationofAdeno畫associatedvirus(AAV)DNAreplicationandintegration,，，Ph.D.Dissertation,UniversityofPittsburgh,Pittsburgh,PA(完整引入本文)提供。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>本文使用的術(shù)語"親嗜性"指病毒優(yōu)先進入某些細胞類型或組織類型，或優(yōu)先與促進進入某些細胞類型或組織類型的細胞表面相互作用，任選和優(yōu)選接著在細胞中表達(例如，轉(zhuǎn)錄和任選翻譯)病毒的基因組攜帶的序列，例如，對于重組病毒，表達異源核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，不存在例如誘導(dǎo)型啟動子或者其他方式調(diào)節(jié)的核酸序列的反式作用因子時，不能啟動異源核酸序列從病毒基因組的轉(zhuǎn)錄。對于rAAV基因組，從病毒基因組的基因表達可以從穩(wěn)定整合的原病毒、從非整合的附加體，以及其中病毒核酸可以被4聶取到細胞中的其他形式進行。如本文使用的，AAV或者嵌合病毒顆粒對細胞的"轉(zhuǎn)導(dǎo)"指通過核酸摻入到AAV或者嵌合病毒顆粒并隨后轉(zhuǎn)移到細胞中，將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞中。如本文所用的"受體"病毒或者病毒殼體是親本病毒或者病毒殼體，向其中引入修飾以產(chǎn)生嵌合體。如本文所用的"供體"病毒或病毒殼體是親本病毒或者病毒殼體，從其得到修飾并將修飾轉(zhuǎn)移到受體中以產(chǎn)生嵌合體。除非另外指出，本發(fā)明的嵌合病毒載體和殼體"增強的轉(zhuǎn)導(dǎo)"或者"增強的親嗜性"或類似術(shù)語指，與作為受體并且向其中引入修飾以產(chǎn)生嵌合體的親本病毒相比存在轉(zhuǎn)導(dǎo)或親嗜性的增加，或者與供體親本病毒相比顯示出增強的轉(zhuǎn)導(dǎo)"或者"增強的親嗜性"或類似術(shù)語的嵌合病毒載體和/或殼體，即，與作為供體并且從其得到修飾并引入受體中以產(chǎn)生嵌合體的親本病毒相比存在轉(zhuǎn)導(dǎo)或親嗜性的增加。在具體實施方案中，嵌合病毒或者殼體對于如下細胞具有增強的親嗜性或轉(zhuǎn)導(dǎo)肌細胞(包括骨骼肌、膈肌和/或心肌)、肝細胞、眼的細胞(包括視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜色素上皮和/或角膜)、腦細胞(包括神經(jīng)膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元和/或少突膠質(zhì)細胞)、肺、上皮細胞(包括胃腸和/或呼吸道上皮細胞)、樹突細胞、胰細胞(包括胰島細胞)、骨細Ji包(例如，骨髓干細胞)、造血干細胞、脾細J!包、角質(zhì)形成細胞、成纖維細l包、內(nèi)皮細胞、前列腺細l包、；〖且細胞或生殖細月包。類似地，除非另外指出，通過本發(fā)明的嵌合病毒載體和殼體"減弱的轉(zhuǎn)導(dǎo)"或者"減弱的親嗜性"或類似術(shù)語指，與作為受體并且向其中引入修飾以產(chǎn)生嵌合體親本病毒相比存在轉(zhuǎn)導(dǎo)或親嗜性的減弱，或者與供體親本病毒相比顯示出"減弱的轉(zhuǎn)導(dǎo)"或者"減弱的親嗜性"或類似術(shù)語的嵌合病毒載體和/或殼體，即，與作為供體并且從其得到修飾并引入受體中以產(chǎn)生嵌合體的親本病毒相比存在轉(zhuǎn)導(dǎo)或親嗜性的減弱。在具體實施方案中，嵌合病毒或者殼體對于如下細胞具有增強的親嗜性或轉(zhuǎn)導(dǎo)肌細胞(包括骨骼肌、膈肌和/或心肌)、肝細胞、眼的細胞(包括視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜色素上皮細胞和/或角膜)、腦細胞(包括神經(jīng)膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元和/或少突膠質(zhì)細胞)、肺、上皮細胞(包括內(nèi)臟和呼吸道上皮細胞)、樹突細胞、胰細胞(包括胰島細胞)、骨細胞(例如，骨髓干細胞)、造血干細胞、脾細胞、角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞包、內(nèi)皮細胞、前列腺細胞、祖細l包或生殖細胞。除非另外指出，本文使用的術(shù)語"多肽"包括肽和蛋白質(zhì)。"多核苷酸"是核苷酸堿基序列，并且可以是RNA、DNA或者DNA-RNA雜交序列(包括天然存在的和非天然存在的核苷酸)，但是優(yōu)選是單鏈或者雙鏈DNA序列。本文使用的"分離的，，多核苷酸(例如，"分離的DNA"或者"分離的RNA")指多核苷酸，其是分離的或者基本上無天然存在的生物或者病毒的至少一些其他組分，例如，細胞或者病毒結(jié)構(gòu)組分或者通常發(fā)現(xiàn)與該多核苷酸締合的其他多肽或者核酸。同樣，"分離的"多肽指多肽，其是分離的或者基本上無天然存在的生物或者病毒的至少一些其他組分，例如，細胞或者病毒結(jié)構(gòu)組分或者通常發(fā)現(xiàn)與該多肽締合的其他多肽或者核酸。"治療多肽"是多肽，其緩和或者減輕細胞或者受試者中蛋白質(zhì)的缺乏或者缺陷引起的癥狀。備選地，"治療多肽"是對受試者賦予益處，例如，抗癌作用或者移植物存活力的提高的多肽。術(shù)語"治療"(或者語法上等同的術(shù)語)指受試者的狀況的嚴重性減輕或至少部分改善或者減輕和/或?qū)崿F(xiàn)了至少一種臨床癥狀的一定的減輕、緩解或者減弱和/或防止或延遲疾病或病癥的發(fā)作。從而，術(shù)語"治療"(或者語法上等同的術(shù)語)指預(yù)防性和治療性方案。"異源核苷酸序列"或者"異源核酸"通常是不天然存在于病毒中的序列。通常，異源核酸或核苦酸序列包含編碼多肽或者非翻譯的RNA的可讀框。如本文使用的術(shù)語"載體"或者"遞送載體"可以指細小病毒(例如，AAV)顆粒，其作為核酸遞送載體，并且包含包裝在細小病毒(例如AAV)殼體內(nèi)的病毒DNA(例如，載體基因組)。備選地，在一些上下文中，術(shù)語"栽體"可以用于指不存在殼體時的載體基因組/vDNA。如本文使用的，"重組細小病毒載體基因組"是包含至少一個末端重復(fù)(例如，兩個末端重復(fù))和一個或多個異源核苷酸序列的細小病毒基因組(即，vDNA)。"重組細小病毒顆粒，，包含包裝在細小病毒殼體中的重組細小病毒載體基因組。"rAAV載體基因組"或者"rAAV基因組"是包含至少一個末端重復(fù)(例如，兩個末端重復(fù))和一個或多個異源核苷酸序列的AAV基因組(即，vDNA)。rAAV載體通常僅僅需要順式的145個堿基的末端重復(fù)(TR)以產(chǎn)生病毒。所有其他病毒序列是可有可無的并且可以以反式提供(Muzyczka，(1992)Cmt.rop/"Af/croWo/.J附附wwo/.158:97)。通常，rAAV載體基因組將僅保留最小的TR序列以使可以被載體有效包裝的轉(zhuǎn)基因的大小最大化。結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)編碼序列可以以反式提供(例如，來自載體，如質(zhì)粒，或者通過將序列穩(wěn)定整合到包裝細胞中)。rAAV載體基因組任選包含兩個AAVTR，其通常將在異源核苷酸序列的5，和3，末端，但不必與其相鄰。TR可以相互相同或者不同。"rAAV顆粒"包含包裝在AAV殼體中的rAAV栽體基因組。"細小病毒末端重復(fù)，，可以來自任何細小病毒，包括自主細小病毒和AAV(所有如上面定義)。"AAV末端重復(fù)，，可以來自任何AAV,例如，血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11。術(shù)語"末端重復(fù)"包括作為AAV倒置末端重復(fù)的合成的序列，如Samulski等人的美國專利號5,478,745中描述的"雙D序列"，將該專利的公開完整引入本文作為參考。AAV末端重復(fù)不必具有野生型末端重復(fù)序列(例如，野生型序列可以通過插入、缺失、截短或者錯義突變改變)，只要末端重復(fù)序列能夠介導(dǎo)所希望的功能，如復(fù)制、病毒包裝、整合、和/或原病毒復(fù)蘇等等。自主細小病毒和AAV的殼體結(jié)構(gòu)在BERNARDN.FIELDS"fl/.，VIROLOGY,巻2，69&70章(4thed.，Lippincott誦RavenPublishers)中更詳細地描述。本發(fā)明的嵌合病毒載體還可以是"定向，，病毒載體(例如，具有定向的親嗜性)和/或"雜交，，細小病毒(即，其中rAAV基因組和病毒殼體來自不同的細小病毒)，如國際專利公布WO00/28004和Chaoetal.,(2000)Mo/"w/flrT7^m;^2:619中描述。在具體實施方案中，rAAV基因組和病毒殼體來自不同的AAV。在具體實施方案中，病毒殼體的所有亞基都來自相同的AAV殼體蛋白質(zhì)主鏈。在其他實施方案中，病毒殼體包含來自不同AAV骨架的殼體蛋白質(zhì)。本發(fā)明的嵌合病毒還可以是如國際專利公布WO01/92551中描述的雙鏈體細小病毒顆粒。因此，如本文所用的術(shù)語"嵌合細小病毒"和"嵌合AAV"包括雜種、定向的和雙鏈體病毒顆粒，以及細小病毒和AAV的其他f參飾形式。嵌合病毒載體AAV殼體內(nèi)所選的區(qū)域可以對其他AAV賦予希望的性質(zhì)，所述性質(zhì)包括但不限于增強的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力(例如，增強的骨骼肌細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo))，通過重組基因組遞送的轉(zhuǎn)基因的更高表達水平和/或轉(zhuǎn)基因表達更早開始。這些所選的區(qū)域可以轉(zhuǎn)移或"工程化，，到其他AAV殼體中以對所得的嵌合顆粒賦予目的性質(zhì)。為了闡明，對于AAV2，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用來自AAV1的單個氨基酸插入，AAV2可以獲得AAV1的增強的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，而保留AAV2的容易純化(即，保留結(jié)合肝素的能力)和已知的安全性質(zhì)。此外，在具體實施方案中，所得嵌合病毒具有與親本病毒不同的免疫譜(例如，被親本病毒的中和性抗血清弱識別或者根本不識別)，從而允許重復(fù)施用于已經(jīng)產(chǎn)生了針對親本病毒的抗體的受試者。例如，本文描述的嵌合2.5載體僅被針對AAV2的中和性抗血清弱識別。在本研究中，發(fā)明人比較了具有高水平的骨骼肌轉(zhuǎn)導(dǎo)的兩種血清型(AAV1和AAV7)與轉(zhuǎn)導(dǎo)骨骼肌效率較低的兩種血清型(AAV2和AAV8)的線性氨基酸序列。盡管這四種血清型都顯示出高度的序列相似性，但是存在趨異的區(qū)域并且作為遞送載體的這四種血清型的特征不同。使用序列分析，鑒定了AAV1和/或AAV7中許多候選氨基酸以摻入到AAV2中來確定它們是否將對AAV2賦予AAV1/7的增強的骨骼肌轉(zhuǎn)導(dǎo)?；贏AV2的已知的晶體結(jié)構(gòu)分析用于例如鑒定位于可能影響該病毒的生物學(xué)的區(qū)域中的氨基酸位置，據(jù)此極大地縮小了該最初的候選位置庫。然后將該較小組的氨基酸單獨或者組合替代和/或插入到AAV2中，并且一些得到的突變體顯示出AAV1的增強的骨骼肌轉(zhuǎn)導(dǎo)。基于本公開，可以容易地將對應(yīng)的修飾引入其他AAV中。"對應(yīng)的"修飾可以是插入和/或替代和/或缺失。例如，作為AAV2中插入的修飾可以是另一AAV中的替代突變。此外，在另一AAV中，缺失突變可以將氨基酸帶入殼體亞基內(nèi)的希望的位置。其他AAV中"對應(yīng)的修飾"將是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。根據(jù)本發(fā)明，將"選擇性"氨基酸改變引入病毒殼體。該方法與以前所用AAV血清型之間的完整亞基或者大結(jié)構(gòu)域交換的工作相反(見例如，國際專利公布WO00/28004和Haucketal.，(2003)義F/w/ow77:2768-2774)。"選擇性"氨基酸改變導(dǎo)致插入和/或替代和/或缺失少于約20、18、15、12、10、9、8、7、6、5、4或3個連續(xù)氨基酸。在具體實施方案中，從殼體亞基插入和/或替代和/或缺失僅僅兩個連續(xù)氨基酸或甚至點突變(即一個氨基酸)?？梢栽跉んw亞基的不同位置引入一個或多個選擇性氨基酸改變。例如，在具體實施方案中，可以向AAV殼體亞基中引入2、3、4、5、6、7、8、9、IO或者更多選擇性氨基酸改變。將理解術(shù)語"嵌合病毒載體"或者"嵌合殼體"排除在它們的天然狀態(tài)在特定位置中具有所指出的氨基酸的那些病毒載體或者殼體(例如在受體病毒和/或野生型病毒中)。本發(fā)明預(yù)期通過修飾現(xiàn)在已知或者以后發(fā)現(xiàn)的任一AAV的殼體可以產(chǎn)生本發(fā)明的嵌合病毒。此外，將要修飾的受體親本AAV可以是表征的AAV之一，例如，AAV2、AAV3a或3b、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11(也見表1)。備選地，與天然存在的病毒(即來自野生型AAV，例如，AAV2、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和/或AAV11或者現(xiàn)在已知的或以后發(fā)現(xiàn)的任何其他AAV)相比，受體親本病毒可以已經(jīng)具有修飾/改變。此類病毒也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，受體病毒可以是來自AAV8的AAV,但是具有其中摻入的硫酸乙酰肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，來自AAV2殼體)或者可以是經(jīng)修飾而含有多聚-His序列以方便純化的AAV。作為另一闡明性實例，AAV可以來自任一種已知的血清型或者進化枝，但是具有摻入其中的肽定向序列。作為另一可能性，AAV殼體可以包含來自不同血清型的殼體亞基。從而，在具體實施方案中，受體病毒包含來自AAV血清型或者進化枝的殼體，其已經(jīng)經(jīng)修飾而包含不來自該血清型或者進化枝的序列(例如，是野生型病毒外源的)。此外，將從中得到修飾并轉(zhuǎn)移到受體的供體親本AAV可以是表征的AAV之一，如但不限于，AAV2、AAV3a或3b、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9、AAVIO或AAVll。在代表性實施方案中，本發(fā)明提供了嵌合病毒載體，其包含(a)嵌合AAV殼體，其包含一個或多個AAV2殼體亞基中氨基酸位置260、261、262、263、264、265、266、267和/或268中的任一氨基酸位置(VP1編號)后(例如，氨基酸位置264后)的選擇性氨基酸插入或者來自其他AAV的一個或多個殼體亞基中對應(yīng)的改變；(b)包含AAV末端重復(fù)序列和異源核酸序列的核酸；其中所述核酸包裝在嵌合AAV殼體中。在具體實施方案中，與受體親本rAAV載體和/或供體親本rAAV載體相比，嵌合病毒具有增強的轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或親嗜性，和改變的免疫譜，增強的轉(zhuǎn)基因表達和/或轉(zhuǎn)基因表達的較早開始。"氨基酸位置X后"意指插入緊接所指出的氨基酸位置之后(例如，"氨基酸位置264后"指265位上的點插入或者更大的插入，例如，從265到268位，等等)或在所指出的氨基酸位置的兩個或三個氨基酸內(nèi)。本發(fā)明說明書和所附權(quán)利要求書中所有氨基酸位置的指定都是關(guān)于VP1編號。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本文描述的修飾將導(dǎo)致所有VP1、VP2和VP3殼體亞基中的修飾。在具體實施方案中，在AAV殼體的l、2、或3個亞基中發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的修飾。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白對于某種AAV，對應(yīng)的修飾將是插入和/或替代，取決于對應(yīng)的氨基酸位置是否部分或者完全存在于病毒中，或者備選地，完全缺失。同樣，當(dāng)修飾非AAV2的AAV時，特定氨基酸位置可以與AAV2中的位置不同。使用公知的序列比對技術(shù)(見例如，圖7)，對應(yīng)的氨基酸位置將是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。在具體實施方案中，可以將本文描述的修飾引入殼體亞基中對應(yīng)于AAV1、AAV6和/或AAV7殼體亞基或者得到{務(wù)飾的任何其他AAV中目的氨基酸的位置的位置?；诰w結(jié)構(gòu)分析，顯然在一些情況中，插入/替代可以在任一方向移動1、2、3、4或者5個或更多氨基酸并且仍然賦予所希望的特征。因為許多修飾在環(huán)結(jié)構(gòu)中進行，所以本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解通過物理展示在病毒體的表面可以比特定氨基酸位置更進一步驅(qū)動修飾的結(jié)果。將根據(jù)本發(fā)明替代和/或插入的氨基酸可以是任何天然存在的氨基酸，其修飾形式或者合成的氨基酸。在代表性實施方案中，殼體亞基中的插入和/或替代和/或缺失導(dǎo)致插入、替代和/或重新定位保持該區(qū)域中親水環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸和/或改變環(huán)結(jié)構(gòu)的構(gòu)型的氨基酸、帶電荷的氨基酸或者可以磷酸化或硫酸化或者通過翻譯后修飾(例如糖基化)獲得電荷的氨基酸，所述氨基酸在AAV2殼體亞基的任一氨基酸位置260、261、262、263、264、265、266、267和/或268之后(例如，264位后)或者另一AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變。在具體實施方案中，所述嵌合病毒載體與受體親本rAAV載體和/或供體親本rAAV載體相比對應(yīng)一種或多種細胞類型具有增強的轉(zhuǎn)導(dǎo)。合適的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺或者谷氨酰胺。在具體實施方案中，將蘇氨酸插入或者替代到殼體亞基中。根據(jù)本發(fā)明的該方面，在具體實施方案中，嵌合病毒載體包含嵌合AAV殼體，其包含AAV2、AAV3a或者AAV3b殼體亞基中氨基酸位置264后的氨基酸插入或者在已經(jīng)經(jīng)修飾而分別包含非AAV2、AAV3a或者AAV3b序列的AAV2、AAV3a或者AAV3b殼體中對應(yīng)位置中的氨基酸插入(即來自AAV2、AAV3a或者AAV3b)。對應(yīng)于AAV2(AAV3a或者AAV3b)殼體亞基的264位的氨基酸將容易在來自AAV2(AAV3a或者AAV3b)的起始病毒中鑒定，所述起始病毒可以進一步根據(jù)本發(fā)明修飾。在具體實施方案中，嵌合病毒載體可以包含嵌合AAV2、AAV3a或AAV3b殼體，其包含AAV2、AAV3a或AAV3b殼體亞基中氨基酸位置264后的氨基酸插入。合適的氨基酸插入在上面描述。其他AAV中對應(yīng)的突變的示例性實例在表2(位置2)中顯示。如上描述了氨基酸替代和插入。在具體實施方案中，插入或替代是蘇氨酸(除了在該位置具有蘇氨酸的AAV1、AAV6和其他AAV)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>其中，(x)」少突變成任一氨基酸(-)-〉插入任一氨基酸注釋位置2的插入通過插入位點指出本發(fā)明還提供了包含嵌合AAV殼體的嵌合病毒載體，所述殼體包含選自下組的一個或多個擇性氨基酸插入和/或替代(a)AAV2殼體亞基中氨基酸位置260、261、262、263、264、265、266、267和/或268中任一個位置后(如氫基酸位置264后)的選擇性氨基酸插入或者來自其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變；(b)AAV2殼體亞基中氨基酸位置260到266(例如位置263)上的選擇性氨基酸替代或者來自其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變；(c)AAV2殼體亞基中氨基酸位置705上的選擇性氨基酸替代或者來自其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變；U)AAV2殼體亞基中氨基酸位置708上的選擇性氨基酸替代或者來自其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變；(e)AAV2殼體亞基中氨基酸位置716上的選擇性氨基酸替代或者來自其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變；(f)AAV2殼體亞基中氨基酸位置447到453(例如，位置450)上的選擇性氨基酸替代或者來自其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變；和(g)AAV2殼體亞基中氨基酸位置454到460(例如，位置457)上的選擇性氨基酸替代或者來自其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變.一種以任一組合^f吏用。在具體實施方案中，嵌合病毒載體與受體親本rAAV載體和/或供體親本rAAV載體相比具有增強的轉(zhuǎn)導(dǎo)、增強的轉(zhuǎn)基因表達、更早的轉(zhuǎn)基因表達開始和/或改變的免疫譜。在代表性實施方案中，嵌合病毒載體包含嵌合AAV2殼體，該殼體包含AAV2殼體的氨基酸位置263位上的氨基酸替代或者已經(jīng)修飾而包含非AAV2序列的AAV2殼體中的對應(yīng)位置中的氨基酸替代。備選地，嵌合病毒載體可以包含嵌合AAV3b殼體，該殼體包含AAV3b殼體亞基的氨基酸位置263位上的氨基酸替代或者已經(jīng)修飾而包含非AAV3b序列的AAV3b殼體中的對應(yīng)位置中的氨基酸替代?？梢栽谄渌鸄AV中產(chǎn)生對應(yīng)的1務(wù)飾。例如，在其他實施方案中，替代在AAV1的氨基酸位置263、替代在AAV3a的氨基酸位置263或者在來自前面任一種血清型的經(jīng)修飾而包含外源序列的AAV殼體中對應(yīng)的位置。對應(yīng)的突變的非限制性實例在表2(位置1)中顯示。合適的氨基酸替代在下面描述。在具體實施方案中，將丙氨酸替代到殼體亞基中所指出的位置(除了在該位置具有丙氨酸的AAV1和AAV6和其他AAV夕卜)。合適的氨基酸替代包括但不限于小的非極性氨基酸如丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸或者異亮氨酸或者甚至脯氨酸、天冬酰胺、絲氨酸或者蘇氨酸替代到殼體亞基中(例如，這些氨基酸替代AAV2，AAV3a或AAV3b中的位置263存在的谷氨酰胺)。在具體實施方案中，丙氨酸替代到殼體亞基中。本發(fā)明的另一嵌合病毒載體包含嵌合的AAV2殼體，該殼體包含AAV2殼體亞基的氨基酸位置705上的氨基酸替代或者已經(jīng)修飾而包含非AAV2序列的AAV2殼體亞基中的對應(yīng)位置中的氨基酸替代。可以在其他AAV中產(chǎn)生對應(yīng)的改變。例如，在其他實施方案中，本發(fā)明提供了嵌合病毒載體，其具有AAV1殼體亞基的氨基酸位置706上的氨基酸替代、AAV3a殼體亞基的氨基酸位置706上的氨基酸替代、AAV3b殼體亞基的氨基酸位置706上的氨基酸替代、AAV7殼體亞基的氨基酸位置707上的氨基酸替代、AAV8殼體亞基的氨基酸位置708上的氨基酸替代、或AAV9殼體亞基的氨基酸位置706上的氨基酸替代；或者在來自前面任一種血清型的已經(jīng)經(jīng)修飾而包含外源序列的AVV殼體中的對應(yīng)位置上或者任一其他AAV的對應(yīng)位置上的氨基酸替代。在前面兩段中描述的本發(fā)明的代表性實施方案中，合適的氨基酸替代包括但不限于絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸或者異亮氨酸(例如，替代AAV2殼體亞基中該位置上的天冬酰胺)的替代。在具體實施方案中，丙氨酸替代到殼體亞基中。根據(jù)本發(fā)明的另一嵌合病毒載體包含嵌合AAV2殼體，該殼體包含AAV2殼體亞基的氨基酸位置708上的氨基酸替代或者已經(jīng)修飾而包含非AAV2序列的AAV2殼體亞基中的對應(yīng)位置中的氨基酸替代?？梢栽谄渌鸄AV中產(chǎn)生對應(yīng)的修飾。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了嵌合病毒載體，其具有AAV1殼體亞基的氨基酸位置709上的氨基酸替代、AAV3a殼體亞基的氨基酸位置709上的氨基酸替代、AAV3b殼體亞基的氨基酸位置709上的氨基酸替代、AAV7殼體亞基的氨基酸位置710上的氨基酸替代、AAV8殼體亞基的氨基酸位置711上的氨基酸替代、或AAV9殼體亞基的氨基酸位置709上的氨基酸替代；或者在來自前面AAV的任一種的已經(jīng)經(jīng)修飾而包含外源序列的AVV殼體亞基中的對應(yīng)位置上或者任一其他AAV的對應(yīng)位置上的氨基酸替代。在前面兩段中描述的本發(fā)明的代表性實施方案中，替代導(dǎo)致絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸或者異亮氨酸替代到殼體亞基中(例如，替代AAV2殼體亞基中該位置上的纈氨酸)。一個示例性替代是丙氨酸替代到殼體亞基中。本發(fā)明還提供了包含嵌合AAV2殼體的嵌合病毒載體，該殼體包含AAV2殼體亞基的氨基酸位置716上的氨基酸替代或者已經(jīng)修飾而包含非AAV2序列的AAV2殼體中的對應(yīng)位置中的氨基酸替代。可以在其他AAV中產(chǎn)生對應(yīng)的修飾。在具體實施方案中，本發(fā)明提供了嵌合病毒載體，其具有AAV1殼體亞基的氨基酸位置717上的氨基酸替代、AAV3a殼體亞基的氨基酸位置717上的氨基酸替代、AAV3b殼體亞基的氨基酸位置717上的氨基酸替代、AAV7殼體亞基的氨基酸位置718上的氨基酸替代、AAV8殼體亞基的氨基酸位置719上的氨基酸替代、或AAV9殼體亞基的氨基酸位置717上的氨基酸替代；或者在來自前面AAV的任一種的已經(jīng)經(jīng)修飾而包含外源序列的AVV殼體亞基中的對應(yīng)位置上或者任一其他AAV的對應(yīng)位置上的氨基酸替代。在前面兩段中描述的實施方案的具體方面，替代是不能被磷酸化的氨基酸替代可以被磷酸化的氨基酸(例如，絲氨酸)。備選地，替代可以是絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、天冬酰胺或者谷氨酰胺替代到殼體亞基中(例如，在AAV2中該位置上蘇氨酸的替代)。一種具體的嵌合病毒包含在該位置的天冬酰胺替代到殼體亞基中。根據(jù)本發(fā)明的另一嵌合病毒栽體是包含嵌合AAV2殼體的嵌合病毒載體，該殼體包含AAV2殼體亞基中氨基酸位置447、448、449、450、451、452和/或453中任一位置(斧/如450位)上的氨基酸替代或者已經(jīng)修飾而包含非AAV2序列的AAV2殼體亞基中的對應(yīng)位置上或者任一其他AAV的對應(yīng)位置上的氨基酸替代。在具體實施方案中，替代是不能被磷酸化的氨基酸替代可以被磷酸化的氨基酸(例如，蘇氨酸)。備選地，替代可以是絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、天冬酰胺或者谷氨酰胺替代到殼體亞基中(例如，在AAV2中該450位上蘇氨酸的替代)。一種具體的嵌合病毒包含在該位置的天冬酰胺替代到殼體亞基中。還提供了包含嵌合AAV2殼體的嵌合病毒載體，該殼體包含AAV2殼體亞基中氨基酸位置454、455、456、457、458、459和/或460中任一位置(辨如457位)上的氨基酸替代或者已經(jīng)修飾而包含非AAV2序列的AAV2殼體亞基中的對應(yīng)位置中或者任一其他AAV的對應(yīng)位置上的氨基酸替代。合適的氨基酸替代包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或者天冬酰胺替代到殼體亞基中。在代表性實施方案中，天冬酰胺替代到殼體亞基中(例如，天冬酰胺替代AAV2殼體亞基中457位上存在的谷氨酰胺)。本發(fā)明的嵌合病毒載體的一個非限制性實例包含(a)嵌合AAV殼體(例如，AAV2殼體)，其包含(i)AAV2殼體亞基的氨基酸位置264后的選擇性氨基酸插入或者其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變；和(ii)AAV2殼體亞基的氨基酸位置263上的選擇性氨基酸替代或者其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變；和(b)包含AAVTR序列和異源核酸序列的核酸；其中所述核酸包裝在嵌合AAV殼體中。在具體實施方案中，與受體親本rAAV載體和/或供體親本rAAV載體相比，嵌合病毒具有增強的轉(zhuǎn)導(dǎo)、增強的轉(zhuǎn)基因表達、更早的轉(zhuǎn)基因表達和/或改變的免疫譜。例如，嵌合病毒載體可以包含嵌合AAV2、AAV3a或者AAV3b殼體，其中蘇氨酸已經(jīng)插入AAV2或AAV3a殼體亞基中氨基酸位置264之后并且丙氨酸已經(jīng)替代了AAV2、AAV3a或者AAV3b殼體亞基中氨基酸位置263上的谷氨酰胺；或者這些改變可以在已經(jīng)#"飾而分別包含非AAV2、非AAV3a或者非AAV3b序列的AAV2、AAV3a或者AAV3b殼體中的對應(yīng)位置上進行。本文描述的263，265變體的序列在AAV2(圖9)和AAV3b(圖IO)中顯示并且與受體親本病毒的序列比較。本發(fā)明的另一示例性嵌合病毒載體包含(a)嵌合AAV殼體(例如，AAV2殼體)，其包含(i)AAV2殼體亞基的氨基酸位置264后的選擇性氨基酸插入或者其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變；和(ii)AAV2殼體亞基的氨基酸位置263上的選擇性氨基酸替代或者其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變；(iii)在AAV2殼體亞基的氨基酸位置705上的選擇性氨基酸替代或者來自其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變；(iv)AAV2殼體亞基的氨基酸位置708上的選擇性氨基酸替代或者來自其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變；和(v)AAV2殼體亞基的氨基酸位置716上的選擇性氨基酸替代或者來自其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變；；和(b)包含AAVTR序列和異源核酸序列的核酸；其中所述核酸包裝在嵌合AAV殼體中。在具體實施方案中，與受體rAAV載體和/或供體親本rAAV栽體相比，嵌合病毒具有增強的轉(zhuǎn)導(dǎo)、增強的轉(zhuǎn)基因表達、更早的轉(zhuǎn)基因表達和/或改變的免疫譜。根據(jù)該實施方案，嵌合病毒栽體可以包含嵌合AAV殼體(例如，AAV2殼體)，其包含(a)AAV2殼體亞基中氨基酸位置264后的蘇氨酸插入；(b)丙氨酸替代AAV2殼體亞基中氨基酸位置263上的谷氨酰胺；(c)丙氨酸替代AAV2殼體亞基中氨基酸位置705上的天冬酰胺；(d)丙氨酸替代AAV2殼體亞基中氨基酸位置708上的纈氨酸；和(e)天冬酰胺替代AAV2殼體亞基中氨基酸位置716上的蘇氨酸；或者這些改變可以在已經(jīng)修飾而包含非AAV2序列的AAV2殼體中對應(yīng)的位置上或在其他AAV的對應(yīng)位置上進行。在具體實施方案中，嵌合病毒載體可以是本文公開的嵌合2.5變體。2.5突變體與AAV2比較的序列在圖11中顯示。本發(fā)明還提供了嵌合病毒栽體，其包含(a)嵌合AAV殼體(例如，AAV2殼體)，其包含(i)AAV2殼體亞基中氨基酸位置450上的選擇性氨基酸替代或者其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變；和(ii)AAV2殼體亞基中氨基酸位置457上的選擇性氨基酸替代或者其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變；(b)包含AAVTR序列和異源核酸序列的核酸；其中該核酸包裝在嵌合AAV殼體中。在具體實施方案中，與受體親本病毒載體和/或供體親本rAAV載體相比，嵌合病毒載體具有增強的轉(zhuǎn)導(dǎo)、增強的轉(zhuǎn)基因表達、更早的轉(zhuǎn)基因表達和/或改變的免疫譜。根據(jù)具體實施方案，該嵌合AAV2殼體包含(i)天冬酰胺替代AAV2殼體亞基中氨基酸位置450上的蘇氨酸；和(ii)天冬酰胺替代AAV2殼體亞基中氨基酸位置457上的谷氨酰胺；或者這些改變可以在已經(jīng)修飾而包含非AAV2序列的AAV2殼體亞基中對應(yīng)位置上進行或者在任一其他AAV的對應(yīng)位置上進行。本發(fā)明的另一示例性嵌合病毒載體包含(a)嵌合AAV殼體(例如，AAV2殼體)，其包含(i)AAV2殼體亞基中氨基酸位置264后的選擇性氨基酸插入或者其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變；和(ii)AAV2殼體亞基中氨基酸位置450上的選擇性氨基酸替代或者其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變(iii)AAV2殼體亞基中氨基酸位置457上的選擇性氨基酸替代或者其他AAV殼體中對應(yīng)的改變；(b)包含AAVTR序列和異源核酸序列的核酸；其中該核酸包裝在嵌合AAV殼體中。在具體實施方案中，與受體親本病毒載體和/或供體親本rAAV載體相比，嵌合病毒載體具有增強的轉(zhuǎn)導(dǎo)、增強的轉(zhuǎn)基因表達、更早的轉(zhuǎn)基因表達和/或改變的免疫譜。根據(jù)本發(fā)明的該實施方案的具體方面，該嵌合病毒載體包含嵌合AAV2殼體，其包含(a)AAV2殼體亞基中氨基酸位置264后的蘇氨酸插入；(b)天冬酰胺替代AAV2殼體亞基中氨基酸位置450上的蘇氨酸；和(c)天冬酰胺替代AAV2殼體亞基中氨基酸位置457上的谷氨酰胺；或者這些改變可以在已經(jīng)修飾而包含非AAV2序列的AAV2殼體亞基中對應(yīng)位置上進行或者在任一其他AAV的對應(yīng)位置上進行。本發(fā)明的嵌合病毒載體通常包含rAAV載體基因組，即，AAV載體基因組包含編碼多肽或者非翻譯的RNA的一種或多種異源核酸。在下文中詳細討論了異源核酸。嵌合殼體本發(fā)明還包含基本上如上述的嵌合病毒殼體，即，不存在rAAV載體基因組。嵌合病毒殼體可以用作"殼體載體"，如已經(jīng)在美國專利號5,863,541中描迷(將該專利的公開完整引入本文作為參考)?？梢员磺逗喜《練んw包裝并轉(zhuǎn)移到細胞中的分子包括異源DNA、RNA、多肽、小有機分子，或者它們的組合。將異源分子定義為在AAV感染中沒有天然存在的分子，即，不被野生型AAV基因組編碼的那些分子。此外，治療上有用的分子可以與嵌合病毒殼體的外部締合以將分子轉(zhuǎn)移到宿主耙細胞中。此類締合的分子可以包括DNA、RNA、小有機分子、糖類、脂類和/或多肽。在本發(fā)明的一個實施方案中，治療上有用的分子共價連接(即綴合或者化學(xué)偶聯(lián))到殼體蛋白質(zhì)。共價連接分子的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本發(fā)明的嵌合病毒可以也可以用于產(chǎn)生針對新的殼體結(jié)構(gòu)的抗體。作為另一備選方案，可以將外源氨基酸序列插入到細小病毒殼體用于抗原呈遞到細胞，例如，用于施用于受試者以產(chǎn)生針對該外源氨基酸序列的免疫應(yīng)答。根據(jù)一些實施方案，可以將嵌合病毒殼體與根據(jù)本發(fā)明的AAV載體或者嵌合病毒載體同時(例如，相互在幾分鐘或幾小時內(nèi))施用于受試者。此外，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的嵌合病毒殼體和AAV載體或者嵌合病毒載體的組合物和藥物制劑。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的嵌合病毒殼體和殼體亞基的核酸(任選地，分離的核酸)。還提供了包含所述核酸的載體，和包含本發(fā)明的核酸和/或栽體的細胞(體內(nèi)或者培養(yǎng)物中)。此類核酸、載體和細胞可以例如用作試劑(例如，輔助包裝構(gòu)建體或者包裝細胞)，用于產(chǎn)生如本文所述的嵌合病毒殼體或者載體。產(chǎn)生嵌合病毒載體的方法本發(fā)明還提供了產(chǎn)生本發(fā)明嵌合病毒載體的方法。在一個具體實施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生重組嵌合病毒載體的方法，其包括為細胞提供(a)rAAV模板，該模板包含(i)一種或多種異源核苷酸序列，和(ii)足夠AAV模板殼體化成嵌合病毒顆粒的包裝信號序列，和(b)足夠rAAV模板復(fù)制和殼體化成嵌合病毒顆粒的AAV序列(例如，AAVrep和嵌合cap序列，其中包含來自其他AAV的一個或多個選擇性插入、缺失和/或替代)。在使得在細胞中產(chǎn)生包含嵌合殼體內(nèi)包裝的rAAV模板的重組嵌合病毒顆粒的條件下提供rAAV模板和AAV復(fù)制和殼體序列。該方法還可包括從細胞收集病毒顆粒的步驟?？梢詮呐囵B(yǎng)基和/或通過裂解細胞收集病毒顆粒。細胞通常是允許AAV病毒復(fù)制的細胞。可以使用本領(lǐng)域中已知的任何合適的細胞。優(yōu)選哺乳動物細胞。還優(yōu)選提供從復(fù)制缺陷型輔助病毒缺失的功能的反式互補包裝細胞系，如293細胞或者其他Ela反式互補細月包。可以通過本領(lǐng)域中已知的任一種方法提供AAV復(fù)制和殼體序列。當(dāng)前的方案通常在單個質(zhì)粒上表達AAVrep/cap基因。AAV復(fù)制和包裝序列不必一起提供，盡管可以方便地這樣做?？梢酝ㄟ^任一種病毒或者非病毒載體提供AAVrep和/或cap序列。例如，可以通過雜種腺病毒或者皰瘆病毒載體提供rep/cap序列(例如，插入到缺失的腺病毒載體的Ela或者E3區(qū)中)。EBV載體也可以用于表達AAVcap和rep基因。該方法的一個優(yōu)點是EBV載體是附加型的，然而將通過連續(xù)細胞分裂保持高拷貝數(shù)(即，作為染色體外元件穩(wěn)定整合到細胞中，稱作"基于EBV的核附加體"，見Margolski,(1992)Curr.Top.Microbiol.Immun.158:67).作為另一備選方案，rep/cap序列可以穩(wěn)定攜帶在(附加或整合)細胞內(nèi)。通常，并且優(yōu)選地，AAVrep/cap序列的側(cè)翼將不為AAV包裝序列(例如，AAVITRs),以防止這些序列的拯救和/或包裝。可以使用本領(lǐng)域中已知的任一種方法為細胞提供rAAV模板。例如，可以通過非病毒(例如質(zhì)粒)或者病毒載體提供rAAV模板。在具體實施方案中，通過皰滲病毒或者腺病毒載體提供rAAV模板(例如，插入到缺失的腺病毒的Ela或E3區(qū)域中)。作為另一示例，Palomboetal,(1998)J.Virology72:5025，描述了攜帶側(cè)翼為AAVITR的報道基因的桿狀病毒載體。EBV載體還可以用于遞送rAAV模板，如上面關(guān)于rep/cap基因戶斤述。在另一代表性實施方案中，通過復(fù)制的rAAV病毒提供rAAV模板。在其他實施方案中，rAAV原病毒穩(wěn)定整合到細胞的染色體。為了得到最大病毒滴度，將通常為細胞提供生產(chǎn)性AAV感染必需的輔助病毒功能(例如，腺病毒或者皰瘆病毒)。AAV復(fù)制必需的輔助病毒序列是本領(lǐng)域中已知的。通常，這些序列將由輔助腺病毒或者皰滲病毒載體提供。備選地，腺病毒或者皰疹病毒序列可以通過另一非病毒或者病毒載體提供，例如，作為非感染性腺病毒小質(zhì)粒，其攜帶有效AAV產(chǎn)生所需的所有輔助基因，如Ferrarietal.，(1997)7V"m^3:1295,和美國專利號6，040，183和6,093,570所述。此外，可以通過包裝細胞提供輔助病毒功能，所述細胞具有整合在染色體中或者作為穩(wěn)定的染色體外元件保持的輔助基因。優(yōu)選這些輔助病毒序列不能包裝成AAV病毒體，例如，側(cè)翼不是AAVITR。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可以有利地在單個輔助構(gòu)建體上提供AAV復(fù)制和殼體序列和輔助病毒序列(例如，腺病毒序列)。該輔助構(gòu)建體可以是非病毒的或者病毒構(gòu)建體，但是優(yōu)選為包含AAVrep/cap基因的雜種腺病毒或者雜種皰滲病毒。在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，通過單個腺病毒輔助栽體提供AAVrep/cap序列和腺病毒輔助序列。該載體還含有rAAV模板。AAVrep/cap序列和/或rAAV模板可以插入到腺病毒的缺失的區(qū)域(例如，Ela或E3區(qū)域)中。在另一實施方案中，通過單個腺病毒輔助載體提供AAVr印/cap序列和腺病毒輔助序列序列。rAAV模板可以作為質(zhì)粒模板提供。在另一闡明性實施方案中，通過單個腺病毒輔助載體提供AAVrep/cap序列和腺病毒輔助序列，并且rAAV模板作為原病毒整合到細胞中。備選地，通過EBV載體提供rAAV模板，該載體在細胞內(nèi)作為染色體外元件保持(例如，作為基于EBV的核附加體)。在另一示例性實施方案中，通過單個腺病毒輔助病毒提供AAVrep/cap序列和腺病毒輔助序列。rAAV模板作為分離的復(fù)制病毒載體提供。例如，通過rAAV顆粒或者另一種重組腺病毒顆粒提供rAAV模板。根據(jù)前面的方法，雜種腺病毒栽體通常包含足夠腺病毒復(fù)制和包裝的腺病毒5'和3，順式序列(即，腺病毒末端重復(fù)和PAC序列)。AAVrep/cap序列和rAAV模板(如果存在)嵌入腺病毒骨架中并且側(cè)翼是5，和3，順式序列，從而這些序列可以包裝成腺病毒殼體。如上述，優(yōu)選腺病毒輔助序列和AAVrep/cap序列的側(cè)翼不是AAV包裝序列(例如，AAVITR)，從而這些序列不包裝成AAV病毒體。皰疹病毒也可以用作AAV包裝方法中的輔助病毒。編碼AAVRep蛋白的雜種皰疹病毒可以有利地方便一些大小更可變的AAV載體產(chǎn)生方案。已經(jīng)描述了表達AAV-2r印和cap基因的雜種I型單純皰滲病毒(HSV-l)載體Conwayetal"(1999)77^r"/7j6:986和WO00/17377，將其公開完整引入本文作為參考)。作為另一備選方案，可以使用桿狀病毒載體在昆蟲細胞中產(chǎn)生本發(fā)明的病毒載體以遞送M/7/cfl/基因和rAAV模板，如Urabeetal.，(2002)好wmflwG^weJ^era/^13:1935-43所述。產(chǎn)生AAV的其他方法使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的包裝細胞(見，例如美國專利號5,658,785)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中已知的任一種方法得到?jīng)]有污染性輔助病毒的AAV載體原種。例如，可以基于大小容易區(qū)別AAV和輔助病毒。還可以基于對肝素底物的親合力分離AAV與輔助病毒(Zolotukhinetal.(1999)Ge庇77^n^j;6:973)。優(yōu)選使用缺失的復(fù)制缺陷型輔助病毒，從而任何污染性輔助病毒都不能復(fù)制。作為另一備選方案，可以使用缺少晚期基因表達的腺病毒復(fù)制病毒，因為僅僅需要腺病毒早期基因表達來介導(dǎo)AAV病毒的包裝。晚期基因表達缺陷的腺病毒突變體是本領(lǐng)域中已知的(例如，tsl00K和tsl49腺病毒突變體)。本發(fā)明的包裝方法可以用于產(chǎn)生高滴度的嵌合病毒顆粒原種。優(yōu)選地，病毒原種具有至少約105轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(tu)/ml，更優(yōu)選至少約106tu/ml，更優(yōu)選至少約107tu/ml，更優(yōu)選至少約108tu/ml，更優(yōu)選至少約109tu/ml，還更優(yōu)選至少約101Gtu/ml的滴度。重組細小病毒載體本發(fā)明的細小病毒載體可以用于在體外、離體和體內(nèi)向細胞遞送核酸。具體地，細小病毒載體可以有利地用于向動物，更優(yōu)選哺乳動物的細胞遞送或轉(zhuǎn)移核酸?？梢杂帽景l(fā)明的嵌合病毒載體遞送任何異源核苷酸序列(如上文定義)。目的核酸包括編碼多肽，優(yōu)選地治療性(例如，用于醫(yī)學(xué)或者獸醫(yī)用途)或者免疫原性(例如，用于疫苗)多肽的核酸。治療性多肽包括但不限于嚢性纖維化跨膜調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)、肌養(yǎng)蛋白(包括肌養(yǎng)蛋白小基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，見例如，VincentCfl/.，(1993)7V"mfeGew"/a5:130;美國專利^S布號2003017131,將其/>開完整引入本文作為參考)、utrophin(TinsleyWfl/"(1996)7Va,M,e384:349)、凝血因子(辨余，因子VIII、因子IX、因子X等等)、紅細胞生成素、制管張素、內(nèi)皮抑制素、過氧化氫酶、酪氨酸羥化酶、超氧化物歧化酶、瘦蛋白、LDL受體、中性溶酶、脂蛋白脂肪酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨曱酰酶、P-珠蛋白、a-珠蛋白、血影蛋白、a廣抗胰蛋白酶、腺苷脫氨酶、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、P-葡糖腦苷脂酶、鞘磷脂酶、溶酶體氨基己糖苷酶A、支鏈酮酸脫氫酶、RP65蛋白、細胞因子(例如，a-干擾素、P-干擾素、Y干擾素、白介素1-14、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、淋巴細胞毒素等等)、肽生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子和激素(例如，生長激素、胰島素、胰島素樣生長因子，包括IGF-1和IGF-2、血小板衍生的生長因子、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、神經(jīng)生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3和-4、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)膠質(zhì)衍生的生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-a和-(3等等)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(包括RANKL和VEGF)、、溶酶體蛋白、抗細胞凋亡基因產(chǎn)物、谷氨酸受體、淋巴因子、可溶性CD4、Fc受體、T細胞受體、ApoE、ApoC、蛋白質(zhì)磷酸酶抑制劑1(1-1)、受磷蛋白、serca2a、溶酶體酸性oc-葡糖苷酶、oc-半乳糖苷酶A、barkct、02-腎上腺素能受體、P2-腎上腺素能受體激酶(BARK)、磷酸肌醇-3激酶(PI3激酶)、calsarcin、sarcoglycan(例如，ot、P、y)、受體(例如，腫瘤壞死生長因子a可溶性受體)、抗炎因子，如IRAP、單克隆抗體(包括單鏈單克隆抗體；示例性Mab是herc印tinMab)。其他示例性異源核苷酸序列編碼自殺基因產(chǎn)物(例如，胸苷激酶、胞嘧啶脫氨酶、白喉毒素、和肺瘤壞死因子如TNF-oc)、賦予對用于癌癥治療中的藥物的抗性的蛋白質(zhì)、腫瘤抑制基因產(chǎn)物(例如，p53、Rb、Wt-1)、TRAIL、FAS-配體和在需要其的受試者中具有治療作用的任何其他多肽。編碼多肽的異源核香酸序列包括編碼l艮道多肽(例如，酶)的那些。報道多肽是本領(lǐng)域中已知的并且包括，但不限于，綠色熒光蛋白、P-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、螢光素酶和氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因。備選地，異源核酸可以編碼反義核酸、核酶(如美國專利號5，877，022中所述)、實現(xiàn)剪接體介導(dǎo)的反式剪接的RNA(見，Puttaraju調(diào)節(jié)透鏡管的軸位置。專利申請WO2004/047192涉及一種電活性(electro-active)致動器，該致動器包括電活性材料層和用于激活電活性材料的電極層。電活性致動器是彎帶并且具有用于為電極提供接觸端子的至少一個平坦部分。專利申請WO2004/095596涉及一種包括具有如下布置的多個電活性彎曲物的設(shè)備，在該布置中，單獨彎曲物在激活時的移位對于在設(shè)備的近端與遠端之間的總體相對移位起作用。專利申請WO03/061276涉及一種具有可調(diào)聚焦的相機。該相機包括固定透鏡、傳感器和定位于傳感器之下用于使傳感器移位的壓電元件。在上述系統(tǒng)中，特別是對于通常在它們寬度的約百分之三的范圍中移動的壓電材料而言，移動可能受到限制。因此對于薄的材料塊來說，該移動可能不夠。另外，解決方案可能為了在諸如便攜設(shè)備之類的小型設(shè)備中實施而需要太多空間。或者解決方案可能需要復(fù)雜的手工組裝。因此，可能需要可調(diào)透鏡元件的替代解決方案?？赡芟Ｍ峁┚哂行⌒屯哥R元件而仍然具有足夠移動范圍和分辨率的相機裝置。這樣的透鏡元件可以在電子設(shè)備中、特別是在便攜或者移動電子設(shè)備中使用。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種包括至少兩個致動器臂的致動器元件。至少兩個致動器臂的每一個在該致動器臂的第一端固定于第一底座部分而在該致動器臂的第二端固定于第二底座部分。至少兩個致動器臂被配置用以通過向至少兩個致動器臂施加電場來引起第一底座部分和第二底座部分相對于4皮此的移動。在一個實施例中，至少兩個致動器臂由壓電材料制成。在一個實施例中，至少兩個致動器臂的第一部分可以被配置用苗病毒，如痘苗病毒L1或者L8基因)、黃病毒免疫原(例如，黃熱病毒免疫原或者日本腦炎病毒免疫原)、線狀病毒免疫原(例如，埃博拉病毒免疫原或者馬爾堡病毒免疫原，如NP和GP基因)、布尼病毒免疫原(例如，RVFV、CCHF和SFS病毒)，或者冠狀病毒免疫原(例如，傳染性人冠狀病毒免疫原，如人冠狀病毒包膜糖蛋白基因，或者豬傳染性胃腸炎病毒免疫原，或者鳥傳染性支氣管炎病毒)。免疫原還可以是脊髓灰質(zhì)炎免疫原、皰滲免疫原(例如，CMV、EBV、HSV免疫原)、腮腺炎免疫原、麻疹免疫原、風(fēng)滲免疫原、白喉毒素或者其他白喉免疫原、百日咳抗原、肝炎(例如，甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎)免疫原，或者本領(lǐng)域中已知的任何其他疫苗免疫原。備選地，免疫原可以是任一腫瘤或者癌細胞抗原。優(yōu)選:l也，腫瘤或者癌抗原在癌細胞的表面表達。示例性癌和腫瘤細胞抗原在S.A.Rosenberg,(1999)/附附""/印10:281)中描述。其他示例性癌癥和腫瘤抗原包括但不限于BRCA1基因產(chǎn)物、BRCA2基因產(chǎn)物、gp100、酪氨酸酶、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、NY-ESO畫l、CDK-4、(3-連環(huán)蛋白、MUM-1、胱天蛋白酶-8、KIAA0205、HPVE、SART畫1、PRAME、p15、黑素瘤腫瘤抗原(Kawakamietal"(1994)iVfl".爿cflrf.5W.f/5L491:3515;Kawakamietal"(1994)/￡"xp.180:347;Kawakamietal"(1994)54:3124)，包括MART-1(Coulieetal.，(1991)丄Merf.180:35)，gplOO(Wicketal"(1988)丄PflA0/.4:201)和MAGE抗原、MAGE-1、MAGE-2和MAGE-3(VanderBruggenetal"(1991)5Wewce，254:1643);CEA、TRP-l、TRP-2、P曙15和酪氨酸酶(Brichardetal"(1993)/Af^/.178:489);HER-2/neu基因產(chǎn)物(美國專利號4,968,603)，CA125,LK26,FB5(內(nèi)皮唾酸蛋白)、TAG72、AFP、CA19-9、NSE、DU-PAN-2、CA50、SPan畫l、CA72-4、HCG、STN(唾液腺Tn抗原)、c-erbB-2蛋白、PSA、L-CanAg、雌激素受體、乳脂球蛋白、p53腫瘤抑制蛋白(Levine，(1993)及ev.Bi》c/ie附.62:623);粘蛋白抗原(國際專利公布WO90/05142);端粒酶；核基質(zhì)蛋白；前列腺酸性磷酸酶；乳頭瘤病毒抗原；和與下面的癌相關(guān)的抗原黑素瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宮癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌、胰腺癌和其他癌(見例如Rosenberg,(1996)Wev.Me丄47:481-91)。備選地，異源核苷酸序列可以編碼希望在體外、離體或者體內(nèi)在細胞中產(chǎn)生的任一多肽。例如，可以將細小病毒載體導(dǎo)入培養(yǎng)的細胞中并從其分離表達的基因產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解目的異源核苦酸序列可以可操作性地締合合適的控制序列。例如，異源核酸可以可操作性地締合表達控制元件，如轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號、復(fù)制原點、多聚腺苷酸化信號、內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)、啟動子、增強子等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白取決于希望的水平和組織特異性表達，可以使用多種啟動子/增強子元件。啟動子/增強子可以是組成型或者誘導(dǎo)型的，這取決于希望的表達模式。啟動子/增強子可以是天然的或者外源的并且可以是天然或者合成的序列。外源的意指轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域在導(dǎo)入該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域的野生型宿主中沒有發(fā)現(xiàn)。最優(yōu)選靶細胞天然的或者受到處理的啟動子/增強子元件。還優(yōu)選異源核酸序列天然的啟動子/增強子元件。選擇啟動子/增強子元件使得它將在目的靶細胞中發(fā)揮功能。還優(yōu)選哺乳動物啟動子/增強子元件。啟動子/增強子元件可以是組成型或者誘導(dǎo)型的。在希望對異源核酸序列的表達提供調(diào)節(jié)的那些應(yīng)用中優(yōu)選誘導(dǎo)型表達控制元件?；蜻f送的誘導(dǎo)型啟動子/增強子元件優(yōu)選為組織特異性啟動子/增強子元件，并且包括肌肉特異性(包括心肌、骨骼肌和/或平滑肌)、神經(jīng)組織特異性(包括腦特異性)、目艮(包括視網(wǎng)膜特異性和角膜特異性)、肝臟特異性、骨髓特異性、胰腺特異性、脾臟特異性、和肺特異性啟動子/增強子元件。其他誘導(dǎo)型啟動子/增強子元件包括激素誘導(dǎo)型和金屬誘導(dǎo)型元件。示例性誘導(dǎo)型啟動子/增強子元件包括，但不限于，Tet開/關(guān)元件、RU486誘導(dǎo)型啟動子、蛻皮激素誘導(dǎo)型啟動子、雷帕霉素誘導(dǎo)型啟動子，和金屬硫蛋白啟動子。在異源核酸序列將轉(zhuǎn)錄然后在靶細胞中翻譯的實施方案中，特定起始信號通常是插入的蛋白質(zhì)編碼序列的有效翻譯所需的?？梢园ˋTG起始密碼子和相鄰序列的這些外源翻譯控制序列可以是多種來源的，包括天然和合成的來源?；蜣D(zhuǎn)移技術(shù)根據(jù)本發(fā)明的細小病毒載體還提供了將異源核苷酸序列遞送到多種細胞，包括分裂和非分裂細胞的手段。細小病毒載體可以用于在體外向細胞中遞送目的核苷酸序列，例如，以在體外產(chǎn)生多肽或者用于離體基因治療。載體額外可以用于向需要其的受試者遞送核苷酸序列，例如以表達免疫原性或者治療性多肽的方法。以這種方式，多肽可以在受試者中體內(nèi)產(chǎn)生。受試者可以需要多肽，因為受試者具有多肽缺陷，或者因為受試者中多肽的產(chǎn)生可以賦予一些治療效果，作為治療方法或者如下文中解釋。一般地，本發(fā)明的細小病毒載體可以用于遞送具有生物學(xué)效應(yīng)的任一外源核酸以治療或者減輕與基因表達有關(guān)的任何病癥的癥狀。備選地，本發(fā)明可以用于治療任一疾病狀態(tài)，遞送治療多肽對于所述疾病狀態(tài)是有益的。示例性疾病狀態(tài)包括，但不限于嚢性纖維化(嚢性纖維化跨膜調(diào)節(jié)蛋白)和肺的其他疾病、血友病A(因子VIII)、血友病B(因子IX)、地中海貧血(P-珠蛋白)、貧血(紅細胞生成素)和其他血液疾病、阿爾茨海默氏病(GDF;中性溶酶)、多發(fā)性硬化(P-干擾素)、帕金森病(神經(jīng)膠質(zhì)細胞系衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子[GDNF)、亨廷頓病(RNAi以除去重復(fù))、肌萎縮性側(cè)索硬化、癲癇(甘丙肽，神經(jīng)營養(yǎng)因子)和其他神經(jīng)病、癌癥(內(nèi)皮抑制素、制管張素、TRAIL、FAS-配體、細胞因子，包括干擾素；RNAi,包括針對VEGF或者多藥物抗性基因產(chǎn)物的RNAi)、糖尿病(胰島素)、肌營養(yǎng)不良，包括杜興肌營養(yǎng)不良(肌養(yǎng)蛋白、小肌養(yǎng)蛋白、胰島素樣生長因子I，sarcoglycan例如，a、p、y，針對myostatin的RNAi)和貝克爾、戈謝病(葡糖腦苷脂酶)、胡爾勒病(ct-L-艾杜糖苷酸酶)、腺苷脫氨酶缺陷(腺苷脫氨酶)、糖原沉積病(例如，法布里病[a-半乳糖普酶]和蓬佩病溶酶體酸性ct-糖苷酶)和其他代謝缺陷、先天性肺氣肺(al抗胰蛋白酶)、Lesch-Nyhan綜合征(次黃噤呤鳥噤呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶)、Memann-Pick病(鞘磷脂酶)、泰-薩克斯病(溶酶體氨基己糖苷酶A)、楓糖尿病(支鏈酮酸脫氫酶)、視網(wǎng)膜變性疾病(和眼和-魄網(wǎng)膜的其他疾病；例如，黃斑變性的PDGF)、實體器官病(例如，腦，包括帕金森病[GDNF、星形細胞瘤[內(nèi)皮抑制素、制管張素和/或針對VEGF的RNAi)、成膠質(zhì)細胞瘤[內(nèi)皮抑制素、制管張素和/或針對VEGF的RNAi)、肝、腎、心臟，包括充血性心力衰竭或外周動脈病(PAD)[例如，通過遞送蛋白質(zhì)磷酸酶抑制劑1(1-1)、受磷蛋白、sircaserca2a、調(diào)節(jié)受磷蛋白基因的鋅指蛋白、barkct、P2-腎上腺素能受體、P2-腎上腺素能受體激酶(BARK)、磷酸肌醇-3激酶(PI3激酶)、calsarcin等等，關(guān)節(jié)炎(胰島素樣生長因子)、關(guān)節(jié)病(胰島素樣生長因子)、內(nèi)膜增生(例如，通過遞送enos，inos)，提高心臟移植物的存活(超氧化物歧化酶)、艾滋病(可溶性CD4)、肌肉萎縮(胰島素樣生長因子I)、腎功能不足(紅細胞生成素)、貧血(紅細胞生成素)、關(guān)節(jié)炎(抗炎因子，如IRAP和TNFct可溶性受體)、肝炎(a干擾素)、LDL受體缺陷(LDL受體)、高氨血癥(鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶)、克拉伯病(半乳糖腦苷脂酶)、巴騰病、脊髓大腦性共濟失調(diào)，包括SCA1、SCA2和SCA3、苯丙酮尿癥(苯丙氨酸羥化酶)、自身免疫病等等。本發(fā)明還可以在器官移植后用于增加移植物的成功和/或減少器官移植或者輔助治療(例如，通過使用免疫抑制劑或者抑制性核酸以阻斷細胞因子產(chǎn)生)的不利副作用。作為另一實例，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(包括RANKL和/或VEGF)可以與骨allograph—起施用，例如在骨折或癌癥患者后手術(shù)去除后)。備選地，可以施用編碼任一其他治療性多肽的基因轉(zhuǎn)移載體。在具體實施方案中，包含根據(jù)本發(fā)明的263和/或265突變的AAV2來源的和/或AAV3b來源的載體用于遞送如本文描述的目的核酸到腫瘤或者骨格肌、心肌、星形膠質(zhì)細胞和/或神經(jīng)膠質(zhì)細胞，例如，以治療與這些細胞或組織的任一種有關(guān)的病癥，如帕金森病、星形細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、肌營養(yǎng)不良、心臟病(包括PAD和充血性心力衰竭)，等等?；蜣D(zhuǎn)移在了解和提供疾病狀態(tài)的治療中具有;(艮大的潛在用途。有多種遺傳病中，已經(jīng)知道和克隆了缺陷基因。通常，上面的疾病狀態(tài)落入兩類缺陷狀態(tài)，通常是酶的缺陷狀態(tài)，其通常以隱性方式遺傳，和不平衡狀態(tài)，其可以涉及調(diào)節(jié)或者結(jié)構(gòu)蛋白，并且通常以顯性方式遺傳。對于缺陷狀態(tài)疾病，基因轉(zhuǎn)移可以用于將正?；驇牖疾〗M織中用于替代療法，以及使用反義突變產(chǎn)生疾病的動物模型。對于不平衡的疾病狀態(tài)，可以用基因轉(zhuǎn)移在模型系統(tǒng)中產(chǎn)生疾病狀態(tài)，其然后可以用于抵消該疾病狀態(tài)。從而，根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的細小病毒載體允i午治療遺傳疾病。如本文^f吏用的，通過部分或完全彌補引起該疾病的缺陷或者不平衡或者使得它更嚴重來治療疾病狀態(tài)。使用核酸序列的位點特異性重組來導(dǎo)致突變或者校正缺陷也是可能的。根據(jù)本發(fā)明的細小病毒載體還可以用于在體外或者體內(nèi)為細胞提供反義核酸或者RNAi。反義核酸或者RNAi在耙細胞中的表達減小了細胞對特定蛋白質(zhì)的表達。因此，可以施用反義核酸或者RNAi以減小需要其的受試者中特定蛋白質(zhì)的表達。還可以在體外對細胞施用反義核酸或者RNAi以調(diào)節(jié)細胞生理，例如，優(yōu)化細胞或者組織培養(yǎng)系統(tǒng)。此外，根據(jù)本發(fā)明的細小病毒載體還用于診斷和篩選方法，其中目的基因在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，或者備選地在轉(zhuǎn)基因動物模型中瞬時或者穩(wěn)定表達。還實踐本發(fā)明來遞送核酸用于蛋白質(zhì)產(chǎn)生，例如，用于實驗室、工業(yè)或者商業(yè)目的。免疫原性多肽的遞送另一方面，本發(fā)明的細小病毒栽體可以用于在受試者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答。根據(jù)該實施方案，包含編碼免疫原的核苷酸序列的細小病毒載體可以施用于受試者，并且受試者產(chǎn)生針對該免疫原的免疫應(yīng)答。免疫原如上文所述。優(yōu)選地，引起保護性免疫應(yīng)答。備選地，可以將細小病毒載體離體施用于細胞并將改變的細胞施用于受試者。將異源核苷酸序列導(dǎo)入細胞，并將細胞施用于受試者，其中編碼免疫原的異源核苷酸序列優(yōu)選表達并在受試者中誘導(dǎo)針對該免疫原的免疫應(yīng)答。在具體實施方案中，細胞是抗原呈遞細胞(例如，樹突細胞)。"主動免疫應(yīng)答"或者"主動免疫"的特征是"遇到免疫原后宿主組織和細胞的參與。它涉及淋巴網(wǎng)狀組織中免疫活性細月包的分化和增殖，其導(dǎo)致合成抗體或者產(chǎn)生細胞介導(dǎo)的反應(yīng)性，或者兩者"。HerbertB.Herscowitz，7m附MW。//i戸》/ogy..CW/Fmw"/owflwrfCW/w/ar/"&ra"/ows/Jw"7)o辦T^簡fl"》rt，/wIMMUNOLOGY:BASICPROCESSES117(JosephA.Bellantied.，1985)。換句話說，通過感染或者接種暴露于免疫原后，宿主引起主動免疫應(yīng)答。主動免疫與被動免疫相對，被動免疫"從主動免疫的宿主轉(zhuǎn)移預(yù)先形成的物質(zhì)(抗體、轉(zhuǎn)移因子、胸腺移植物、白介素2)到非免疫宿主獲得"，同前。如本文使用的"保護性"免疫應(yīng)答或者"保護性"免疫表示免疫應(yīng)答賦予受試者一定的益處，因為它防止或者減少了疾病的發(fā)生。備選地，保護性免疫應(yīng)答或者保護性免疫可以用于治療疾病，尤其癌癥或者肺瘤(例如，通過引起癌癥或者肺瘤的消退和/或通過防止肺瘤轉(zhuǎn)移和/或通過防止轉(zhuǎn)移的結(jié)節(jié)的生長)。保護作用可以是完全的或部分的，只要治療的益處超過了其任一缺點。根據(jù)前面的在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，優(yōu)選以免疫學(xué)有效量施用攜帶異源核苷酸的細小病毒載體，如下述。通過施用表達癌細胞抗原(或者免疫學(xué)上相似的分子)或者產(chǎn)生針對癌細胞的免疫應(yīng)答的任何其他免疫原，也可以施用本發(fā)明的細小病毒載體用于癌癥免疫療法。為了闡明，例如通過施用包含編碼癌細胞抗原的異源核苷酸序列的細小病毒載體，可以在受試者中產(chǎn)生針對癌細胞抗原的免疫應(yīng)答，以治療癌癥患者。通過^f吏用如本文描述的離體方法可以對受試者體內(nèi)施用細小病毒載體。如本文使用的術(shù)語"癌癥"包括形成腫瘤的癌癥。同樣，術(shù)語"癌組織"包括肺瘤。"癌細胞抗原"包括腫瘤抗原。術(shù)語"癌癥"在本領(lǐng)域中了解為指例如，組織的不受控制的生長，其具有擴散到身體的遠處的潛力(即，轉(zhuǎn)移)。示例性癌癥包括，但不限于，白血病、淋巴瘤、結(jié)腸癌、腎癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、黑素瘤等等。優(yōu)選治療和預(yù)防形成腫瘤的癌癥的方法。術(shù)語"腫瘤"在本領(lǐng)域理解為例如，多細胞生物內(nèi)未分化的細胞的異常團塊。肺瘤可以是惡性的或良性的。優(yōu)選地，本文公開的方法用于預(yù)防和治療惡性腫瘤。上文已經(jīng)描述了根據(jù)本發(fā)明的癌細胞抗原。術(shù)語"治療癌癥"或者"癌癥的治療"意指癌癥的嚴重性減輕或者預(yù)防或者至少部分消除癌癥。優(yōu)選地，這些術(shù)語表明預(yù)防或者減少或者至少部分消除癌癥的轉(zhuǎn)移。還優(yōu)選這些術(shù)語指出預(yù)防或減少或者至少部分消除轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)(例如，手術(shù)除去原發(fā)腫瘤后)。術(shù)語"癌癥的預(yù)防"或者"預(yù)防癌癥"意指至少部分消除或者減少癌癥的發(fā)生或者發(fā)作的方法?；蛘哒f，受試者中癌癥的發(fā)作可能減慢、控制、減輕或者延遲。在具體實施方案中，可以從癌癥受試者除去細胞并將其接觸根據(jù)本發(fā)明的細小病毒顆粒。然后將經(jīng)修飾的細胞施用于受試者，從而引起針對癌細胞抗原的免疫應(yīng)答。該方法尤其有利地用于不能在體內(nèi)產(chǎn)生足夠免疫應(yīng)答(即，不能以足夠量產(chǎn)生增強抗體)的免疫受損的受試者。本領(lǐng)域中已知通過免疫調(diào)節(jié)性細胞因子(例如，cx-干擾素，(3-干擾素，Y-干擾素，co-干擾素，T-干擾素，白介素-la，白介素-ip，白介素-2，白介素-3，白介素-4，白介素5，白介素-6，白介素-7，白介素-8，白介素-9，白介素-10，白介素-11,白介素12，白介素-13，白介素-14，白介素-18,B細胞生長因子、CD40配體、肺瘤壞死因子-a、腫瘤i不死因子-P、單核細胞化學(xué)引誘蛋白-1、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和淋巴細胞毒素)可以增強免疫應(yīng)答。因此，免疫調(diào)節(jié)性細胞因子(優(yōu)選地，CTL誘導(dǎo)性細胞因子)可以與細小病毒載體一起施用于受試者?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中已知的任一種方法可以施用細胞因子?？梢詫⑼庠醇毎蜃邮┯糜谑茉囌?，或者備選地，使用合適的載體，可以將編碼細胞因子的核普酸序列遞送到受試者，并在體內(nèi)產(chǎn)生細胞因子。受試者、藥物制劑和施用方式根據(jù)本發(fā)明的細小病毒栽體可以用于獸醫(yī)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用。合適的受試者包括鳥類和哺乳動物。本文使用的術(shù)語"鳥類"包括但不限于，雞、鴨、鵝、鵪鶉、火雞、野雞、鷚鷸、長尾鷚鷸。本文使用的術(shù)語"哺乳動物"包括但不限于，人類、非人靈長類、牛、綿羊、山羊、馬、貓、狗、兔等等。人類受試者包括新生兒、嬰兒、青少年和成年人。在具體實施方案中，受試者具有針對一種或多種AAV(例如，AAV血清型，如AAV1和/或AAV2)的抗體。在其他實施方案中，受試者以前已經(jīng)施用不同的AAV載體(例如，免疫學(xué)上不同的AAV)。任選地，受試者需要本發(fā)明的方法，例如，因為該受試者患有包括本文描迷的那些病癥或者認為處于患所述病癥的危險中或者將從包4舌本文描述的核酸的遞送中受益。在具體實施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含可藥用載體中的本發(fā)明的病毒顆?；虿《練んw和任選地，其他醫(yī)學(xué)試劑、藥劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、載體、佐劑、稀釋劑等等。對于注射，載體將通常為液體。對于其他施用方法，載體可以為固體或者液體。對于吸入施用，載體將為可呼吸的，并且將優(yōu)選為固體或者液體顆粒形式。"可藥用的"指無毒或者無其他方面不良的物質(zhì)，即，該物質(zhì)可以施用于受試者而不引起任何不希望的生物學(xué)作用。本發(fā)明的一方面是在體外將核苷酸序列轉(zhuǎn)移到細胞的方法。根據(jù)適于具體靶細胞的標準轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，可以將病毒顆粒以合適的感染復(fù)數(shù)導(dǎo)入細胞。將施用的病毒的滴度可以改變，其取決于靶細胞類型和數(shù)目，和具體的病毒載體，并且可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員不用過度的實驗來確定。優(yōu)選地，向細胞中導(dǎo)入至少約103感染單位，更優(yōu)選地至少約105感染單位。導(dǎo)入細小病毒載體的細胞可以是任何類型，包括但不限于，神經(jīng)細胞(包括外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞，尤其腦細胞，如神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞)、肺細胞、眼的細胞(包括視網(wǎng)膜細胞、視網(wǎng)膜色素上皮細胞，和角膜細胞)、上皮細胞(例如，胃腸和呼吸道上皮細胞)、肌細胞、樹突細包、胰細胞(包括胰島細胞)、肝細胞、心肌細胞、骨細胞(例如，骨髓干細Ji包)、造血干細胞、脾細胞、角質(zhì)形成細J!包、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、前列腺細胞、生殖細胞、等等。備選地，細胞可以是任何祖細胞。作為另一備選，細胞可以是干細胞(例如，神經(jīng)干細胞、肝干細胞)。作為另一備選，細胞可以是癌細J!包或者腫瘤細胞。此外，細胞可以來自如上列出的任一物種?？梢栽隗w外將細小病毒載體導(dǎo)入細胞，用于將經(jīng)修飾的細胞施用于受試者。在具體實施方案中，已經(jīng)從受試者除去細胞，向細胞中導(dǎo)入細小病毒載體，然后再將細胞返回到受試者中。從受試者除去細胞用于離體治療，然后返回到受試者的方法是本領(lǐng)域中已知的(見，例如，美國專利號5,399,346;將其公開完整引入本文作為參考)。備選地，可以將重組的細小病毒載體導(dǎo)入來自另一受試者的細胞、導(dǎo)入培養(yǎng)的細胞或者導(dǎo)入來自任何其他合適的來源的細胞，并且將細胞施用于需要其的受試者。用于離體基因治療的合適的細胞在上文描述。施用于受試者的細胞的劑量將隨著受試者的年齡、狀況和物種、細胞的類型、細胞表達的核酸、施用方式等等而變。通常，將在可藥用載體中施用每劑至少約102到約108或約103到約106個細胞。在具體實施方案中，將用細小病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞以治療有效量與藥物載體組合施用于受試者。本文使用的"治療有效"量是足以為受試者提供某種改善或者益處的量?；蛘哒f，"治療有效"量是將提供受試者中至少一種臨床癥狀的減輕、緩解或者減退的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解治療效果不必是完全的或治愈性的，只要對受試者提供了一定的益處。在一些實施方案中，可以施用已經(jīng)用細小病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞以引起針對遞送的多肽(例如，表達為轉(zhuǎn)基因或者在殼體中)的免疫原應(yīng)答。通常，施用與可藥用載體組合的表達免疫原有效量的多肽的細胞的量。"免疫原有效量"是足以在施用該藥物制劑的受試者中引起主動免疫應(yīng)答的量。優(yōu)選地，劑量足以產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答(如上文定義)。賦予的保護的程度不必是完全的或者永久的，只要施用免疫原性多肽的益處超過其任一缺點。本發(fā)明的另一方面是對受試者施用本發(fā)明的細小病毒顆?；驓んw的方法。可以通過本領(lǐng)域中用于施用病毒載體的任一種方法對需要其的人類受試者或者動物施用根據(jù)本發(fā)明的細小病毒顆?；驓んw。優(yōu)選地，在可藥用載體中以治療有效劑量遞送細小病毒載體。還可以施用本發(fā)明的細小病毒載體以引起免疫原性應(yīng)答(例如，作為疫苗)。通常，本發(fā)明的疫苗包含與可藥用載體組合的免疫原性有效量的病毒。優(yōu)選地，該劑量足夠產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答(如上文定義)。賦予的保護的程度不必是完全或者永久的，只要施用該免疫原性多肽的益處超過其任一缺點。受試者和免疫原如上述。將施用于受試者的細小病毒顆粒的劑量將取決于施用方式、待治療的疾病或者狀況、個體受試者的狀況、具體的病毒載體，和將遞送的核酸，并且可以以常規(guī)方式確定。實現(xiàn)治療效果的示例性劑量為至少約105、106、107、108、109、1010、IO11、1012、103、10"、1015轉(zhuǎn)導(dǎo)單位或者以上，優(yōu)選約108-1013轉(zhuǎn)導(dǎo)單位，更優(yōu)選1012轉(zhuǎn)導(dǎo)單位的病毒滴度。在具體實施方案中，可以用一次以上的施用(例如，2、3、4或者多次施用)以不同時間間隔，例如每天、每周、每月、每年等等，實現(xiàn)所希望的基因表達水平。示例性施用途徑包括口服、直腸、經(jīng)粘膜、局部、鼻內(nèi)、吸入(例如，通過氣溶膠)、經(jīng)頰(例如，舌下)，陰道、鞘內(nèi)、眼內(nèi)、經(jīng)皮、子宮內(nèi)(或者卵內(nèi))、腸胃夕卜(例如，靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)(包括施用于骨骼肌、膈肌和/或心肌)、皮內(nèi)、胸膜內(nèi)、腦內(nèi)和關(guān)節(jié)內(nèi))、局部(例如，施用于皮膚和粘膜表面，包括呼吸道表面，和經(jīng)皮)施用，等等，以及直接組織或者器官注射(例如，注射到肝臟、骨骼肌、心肌、膈肌或腦)。還可以施用到肺瘤(例如，腫瘤中或附近或、淋巴結(jié)中)。在任何給定情況下，最合適的途徑將取決于所治療的狀況的性質(zhì)和嚴重性和使用的具體載體的性質(zhì)。在具體實施方案中，將包含AAV2或AAV3b骨架中的如本文描述的263和/或265突變的本發(fā)明的嵌合載體施用于骨骼肌、心肌和/或腦(例如，以治療肌營養(yǎng)不良、心臟病(例如，PAD或充血性心力衰竭)、帕金森病、星形細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤)或施用于肺瘤。注射劑可以以常規(guī)性質(zhì)制備，作為液體溶液劑或者混懸劑、適于在注射前溶解或者混懸在液體中的固體形式，或者作為乳劑。備選地，可以以局部而不是全身方式施用病毒，例如，以貯庫制劑或者緩釋制劑的方式。此外，病毒顆粒可以干燥遞送到可手術(shù)植入的基質(zhì)上如骨移植物代用品、縫線、支架等等(例如，如美國專利公布號US-2004-0013645-A1中描述)。泉適于口服施用的藥物組合物可以以離散單位存在，如膠嚢劑、扁嚢劑、錠劑或者片劑，每種含有預(yù)定量的本發(fā)明的組合物；作為粉劑或者粒劑；作為水性或非水性液體中的溶液劑或混懸劑；或作為水包油或者油包水乳劑。通過將本發(fā)明的組合物與能夠抵抗動物的內(nèi)臟中的消化酶的降解的載體復(fù)合，進行口服遞送。此類載體的實例包括塑料膠嚢或者片劑，如本領(lǐng)域中已知。通過藥劑學(xué)的任一合適的方法制備此類制劑，所述方法包括將組合物與合適的載體(其可以含有一種或多種如上面提到的輔助成分)締合。通常，通過將組合物與液體或者細分的固態(tài)載體或者兩者均勻和密切混合，然后如果必要，將所得混合物成型，制備根據(jù)本發(fā)明的實施方案的藥物組合物。例如，通過壓縮或者模壓含有組合物的粉劑或者粒劑(其中任選含有一種或多種輔助成分)可以制備片劑。通過在合適的機器中，將自由流動形式的組合物，如任選與黏合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑和/或表面活性/分散劑混合的粉劑或者粒劑壓片來制備壓制的片劑。通過在合適的機器中，模壓用惰性液體黏合劑濕潤的粉狀化合物來制備模壓片。適于經(jīng)頰(舌下)施用的藥物組合物包括錠劑，其在調(diào)味基質(zhì)，通常蔗糖和阿拉伯樹膠或者西黃蓍膠中包含本發(fā)明的組合物；和軟錠劑，其在惰性基質(zhì)如明膠和甘油或者蔗糖和阿拉伯樹膠中包含該組合物。適于腸胃外施用的本發(fā)明的藥物組合物可以包含本發(fā)明的組合物的水性和非水性注射液，該制劑優(yōu)選與預(yù)期的受者的血液等滲。這些制劑可以含有抗氧化劑、緩沖劑、制菌劑和溶質(zhì)，其使得該組合物與預(yù)期的受者的血液等滲。水性和非水性無菌混懸劑、溶液劑和乳劑可以包括懸浮劑和增稠劑。非水性溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油，如橄欖油，和可注射的有機酯，如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水性溶液、乳液或者混懸液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外載體包括氯化鈉溶液、林格葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉、乳酸化的林格葡萄糖注射液，或者不揮發(fā)油。靜脈內(nèi)載體包括液體和營養(yǎng)補充劑、電解質(zhì)補充劑(如基于林格葡萄糖注射液的那些)，等等。還可以存在防腐劑和其他添加劑，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等等。組合物可以存在于單位劑量或者多劑量容器中，例如，存在于密封的安瓿和管形瓶中，并且可以在凍干(冷凍干燥)條件下保存，使用前僅僅需要加入無菌液態(tài)載體，如鹽水或者注射用水?？梢詮那懊婷枋鲱愋偷臒o菌粉劑、粒劑和片劑制備臨時注射的溶液和混懸液。例如，可以以單位劑型在密封容器中提供本發(fā)明的可注射的穩(wěn)定的無菌組合物。該組合物可以以凍干物形式提供，其可以用合適的可藥用載體重構(gòu)以形成適于注射到受試者中的液體組合物。單位劑型可以為約1ng到約10g本發(fā)明的組合物。當(dāng)組合物基本上是水不溶的時候，可以以有效量包括生理學(xué)上可接受的有效量的乳化劑以在水性載體中乳化該組合物。一種此類有用的乳化劑是磷酯酰膽堿。適于直腸施用的藥物組合物優(yōu)選作為單位劑量栓劑存在。通過將組合物與一種或多種常規(guī)的固態(tài)載體，如可可脂混合，然后成型所得的混合物，可以制備這些栓劑。適于局部應(yīng)用于皮膚的本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選采用軟膏劑、霜劑、洗劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或者油的形式?？梢允褂玫妮d體包括，但不限于，石油膏、羊毛脂、聚乙二醇、醇、經(jīng)皮增強劑，和它們的兩種或多種的組合。在一些實施方案中，例如，可以通過混合本發(fā)明的藥物組合物與能夠穿過皮膚的親脂試劑(例如DMSO)，進4亍局部遞送。適于經(jīng)皮施用的藥物組合物可以為離散貼劑的形式，其適于與受試者的表皮在長時間內(nèi)保持密切接觸。適于經(jīng)皮施用的組合物還可以通過離子電滲療法(見例如，PharmaceuticalResearch3:318(1986))遞送并且通常采取本發(fā)明組合物的任選緩沖的水溶液的形式。合適的制劑可以包含檸檬酸鹽或者bis/trisi爰沖液(pH6)或乙醇/水并且含有0.1到0.2M活性成分。本文公開的細小病毒載體可以通過任何合適的方法施用于受試者的肺，但是優(yōu)選通過施用受試者吸入的包含細小病毒載體的可吸入的顆粒的氣溶膠混懸液進4亍施用。可吸入的顆?？梢允且后w或者固體。包含細小病毒載體的液體顆粒的氣溶膠可以以任何合適的方式產(chǎn)生，如用壓力驅(qū)動的氣溶膠噴霧器或者超聲噴霧器，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。見，例如美國專利號4,501,729。包含細小病毒載體的固體顆粒的氣溶膠同樣可以用任何固體顆粒藥物氣溶膠發(fā)生器，通過藥學(xué)領(lǐng)域中已知的技術(shù)產(chǎn)生。已經(jīng)描述了本發(fā)明，將在下面的實施例中更詳細地解釋本發(fā)明，這些實施例包括在本文中僅用于闡明的目的，并且它們不意在限定本發(fā)明。實施例1分類方法材料和方法質(zhì)粒和DNAi秀變這些實驗的起始質(zhì)粒是pxrl、pxr2、prx3(Rabinowitzetal，(2001)/F/ra/ogy76:781-801)。<吏用QuikChangeMultiSiteMutagenesis或QuikChangeSiteDirectedMutagenesis試劑盒(都來自Stratagene)進行所有質(zhì)粒誘變。通過DNA序列分析驗證核苷酸改變的準確性，然后將DNA亞克隆以消除誘變方法產(chǎn)生的任何不想要的人為產(chǎn)物。在一些實例中，使用新產(chǎn)生的突變體進行亞克隆以產(chǎn)生另一突變體。重組病毒產(chǎn)生使用標準三重轉(zhuǎn)染方法(Habermanetal.1999.Productionofrecombinantadeno-associatedviralvectorsanduseininvitroandinvivoadministration,p.4.17.1-4.17.25.J.Crawley,etal.(eds.)，Currentprotocolsinneuroscience,vol.1.JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,NY)產(chǎn)生所有重組的AAV(rAAV)病毒。在該研究中，使用標準氯化銫梯度或者使用肝素柱層析(同上)純化rAAV。用于病毒純化的方法在對應(yīng)的附圖中指出。使用斑點印跡雜交評估不同的病毒制備物的物理滴度。在一個實驗中比較的制備物在相同的斑點印跡雜交上評估以控制不同的斑點印跡之間的差異。動物成《象將1x101()個含病毒基因組的顆粒(vg)注射到6周齡雄性BALB/c小鼠的腓腸肌中。使用25Ml病毒，對每種病毒類型注射共6個四肢。在注射后不同的天數(shù)使用RoperScientificImaging(PrincetonInstruments)對動物成像。簡言之，將動物麻醉并腹膜內(nèi)注射熒光素底物。注射后10分鐘，將動物放置在室中并確定光發(fā)射。使用CMIR一Image軟件(CenterforMolecularImagingResearch,Mass.General)確定每個目的區(qū)域的總像素的平均數(shù)并隨時間作圖。肝素結(jié)合實驗如以前的描述(Rabinowitz,(2004)F/,o/ogj;78:4421陽4432)進行rAAV對肝素瓊脂糖的分批結(jié)合。簡言之，對lxPBS中的1型肝素瓊脂糖(H-6508，Sigma,St.Louis,MO)應(yīng)用等量的rAAV病毒體顆粒，允許在室溫結(jié)合1小時，以低速離心2分鐘，并除去上清液(流出)。進行PBS1mMMgCl2的5倍柱床體積的6次洗滌，然后進行5倍柱床體積的含有0.5MNaCl(步驟1)、1.0MNaCl(步驟2)、或1.5MNaCl(步驟3)的PBS1mMMgCl2的三步洗脫。通過斑點印跡雜交確定洗滌和三步洗脫中存在的rAAV顆粒數(shù)。結(jié)果分類方法的原理文獻中很清楚，AAV的不同血清型顯示出不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)不同組織的能力。一個詳細記載的實例是AAV1能夠優(yōu)先轉(zhuǎn)導(dǎo)骨骼肌。AAV1和AAV2的氨基酸序列83%同一。一個以前的研究將AAV2殼體的大部分區(qū)域用AAV1的對應(yīng)的氨基酸交換并檢查所得載體轉(zhuǎn)導(dǎo)骨骼肌的能力(Haucketal"(2003)丄K/ra/ogy77:2768-2774)。他們鑒定似乎由AAV2賦予但AAV1不賦予的增強的骨骼肌轉(zhuǎn)導(dǎo)的兩個氨基酸。本研究以更詳細的方式檢查該現(xiàn)象。使用生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)-功能分析，鑒定了造成增強的AAV1轉(zhuǎn)導(dǎo)的AAV殼體蛋白質(zhì)中關(guān)鍵氨基酸殘基，以在主要AAV2殼體的背景中測試。該方法避免對2種血清型之間做出氨基酸的所有不同的改變和所有不同的排列的需要。此外，該方法利用了AAV2的晶體結(jié)構(gòu)、氨基酸序列比對和多種AAV血清型的已知的性質(zhì)。從不同血清型的這些非常相似的殼體蛋白質(zhì)產(chǎn)生比對。鑒定了AAV1和AAV7殼體蛋白之間相同和在AAV2和AAV8殼體蛋白之間不同的氨基酸。通過該分類方法鑒定了36個候選氨基酸(圖1A)。基于晶體結(jié)構(gòu)的建模，選擇了12個最佳的候選者來測試增強的肌肉轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖1B)。一些AAV變體與AAV2之間不顯示出差異而其他的好于AAV2。將1x10"個含有基因組的病毒顆粒注射到BALB/c小鼠的腓腸肌后，對不同的AAV變體評估它們轉(zhuǎn)導(dǎo)骨骼肌的能力。一些病毒變體在轉(zhuǎn)導(dǎo)骨骼肌的能力方面不顯示出任何差異(圖2a和b)。盡管324,328位于預(yù)測處于殼體表面的環(huán)上，但是這些氨基酸改變成AAV1中的對應(yīng)氨基酸并不提高該病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)骨骼肌的能力(圖2A和2B)。一種變體(2.5)顯示出比AAV2高得多的肌肉轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖3A)。該變體具有5個氨基酸改變，它們位于2倍對稱軸中(圖3B)。盡管似乎這5個氨基酸組位于相同亞基的不同部分(2個在一側(cè)，3個在另一側(cè))，但是當(dāng)2個亞基聚集到一起時，這些氨基酸非常接近(圖3C)。為了研究所有5個氨基酸是否都是該增強的肌肉親嗜性必需的，我們制備了263,265變體和709,712,720變體。將這些變體在相似的成像實驗中測試(圖4)。709,712,720變體顯示出與AAV2相似的肌肉轉(zhuǎn)導(dǎo)，而263,265變體顯示出增強的肌肉轉(zhuǎn)導(dǎo)，與用含有所有5個氨基酸改變的2.5變體，見察到的相似。構(gòu)建了263和單獨的265變體并在相似的實驗中測試(圖5)。這些實驗揭示主要造成增強的AAV1轉(zhuǎn)導(dǎo)的氨基酸位于265位。這基本上是在AAV2殼體序列中插入蘇氨酸。在AAV3b骨架的263和265位進行了相同的插入(圖10)。有趣的是，263，265區(qū)域在血清中是趨異的(圖7中加框的區(qū)域)。與AAV2相比，在該區(qū)域中存在額外的氨基酸插入。比AAV2顯示出更高的肌肉轉(zhuǎn)導(dǎo)的另一變體是454，461變體(圖6)。評估265與454，461改變的不同組合以確定通過組合這些變體是否可以》見察到進一步增強。最后，我們檢查了不同變體被肝素純化的能力(圖8)。測試的所有變體都顯示出與AAV2相似的肝素結(jié)合謙。實施例2免疫譜類似于其他非包膜病毒，高劑量的AAV產(chǎn)生了中和性抗體，其阻止了重復(fù)給藥。隨著新血清型的來臨，反復(fù)施用是可能的。為了研究避免對AAV2的預(yù)先存在的免疫應(yīng)答，測試了暴露于來自以前接觸不同AAV血清型(分別l、2和2.5)的動物的血清后，嵌合2.5載體的體外轉(zhuǎn)基因表達。為了產(chǎn)生對AAV病毒體外殼具有強烈免疫應(yīng)答的動物，在C57blk6小鼠中獨立地肌內(nèi)注射AAV血清型1、2和2.5載體的4xl010個顆粒。注射后4周，分離血液并收集血清。來自這些動物的血清然后用于中和抗體測定，該測定4吏用293細胞和表達GFP的AAV特異性血清型栽體作為報道基因。在該測定中，將血清連續(xù)稀釋，然后與已知量的血清型特異性載體(釷108個顆粒)在4匸混合2小時。然后感染復(fù)數(shù)為S的腺病毒輔助病毒存在下，向24孔板中的293個細胞加入血清和載體的該混合物。在這些條件下，綠色熒光蛋白(GFP)表達是對在中和性抗體存在下，血清特異性載體感染細胞的能力的度量。然后將中和抗體的滴度計算為GFP表達為對照載體(不與血清型特異性血清預(yù)混合)的50%或者以下時的最高稀釋度。如表3所示，預(yù)先接觸AAV1的動物可以以高達1:1000的稀釋度中和AAV1GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而，該血清型1特異性中和抗體需要更多小鼠血清來中和AAV嵌合2.5(1:100稀釋度)。更重要地，對于從預(yù)先接觸AAV2血清型2病毒體外殼的動物得到的小鼠血清，該觀察是真實的。在該測定中，僅將血清以1:10,000稀釋后，當(dāng)與AAV2對照比較時，我們觀察到50%GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)。但是對于嵌合的2.5,僅用該小鼠血清的1:100稀釋度觀察到50%GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)。因為僅0.6%的氨基酸改變與該嵌合載體中AAV2不同，所以這些改變對于預(yù)先存在的AAV2中和抗體識別AAV2.5殼體外殼具有深遠影響。將動物預(yù)先接觸2.5然后測定對AAV1、2和2.5的中和活性產(chǎn)生了預(yù)期的結(jié)果(見表3)，對于2.5載體需要最高的稀釋度(1:8000)，接著分別是AAV21:1000和AAV血清型11:100。從這些研究得到的結(jié)論是嵌合2.5中的5個氨基酸改變盡管數(shù)目很小(總氨基酸的0.6%)，但是當(dāng)用AAV2特異性中和抗體攻擊時，足以顯著影響該病毒體的免疫語?；谶@些研究，當(dāng)轉(zhuǎn)導(dǎo)預(yù)先接觸AAV1、AAV2或者兩者的個體時，2.5載體將是合適的，從而在可利用的載體中提供了更大的多樣性。例如，該嵌合載體將允許在預(yù)先接觸AAV2的動物和患者中再次施用。此外，該嵌合載體闡明所選的氨基酸可以在AAV2氨基酸殼體序列中改變，其顯著改變免疫應(yīng)答。基于這些結(jié)果，在其他AAV血清型的類似的殼體編碼區(qū)中的相似改變將也導(dǎo)致獨特的免疫譜，允許容易地產(chǎn)生更大數(shù)目的備選AAV變體，其用于重復(fù)施用而不用每次改變?yōu)樾碌难逍蜌んw。表3AAV2.5病毒的中和抗體測定<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>實施例3AAV3b骨架中的263，265突變(SASTG)賦予增強的骨骼肌轉(zhuǎn)導(dǎo)來自AAV1的這些氨基酸(263,265)也工程化到AAV3b殼體的對應(yīng)的位置以產(chǎn)生稱作SASTG的載體，AAV3b是與AAV2密切相關(guān)的一種血清型并且也不轉(zhuǎn)導(dǎo)骨骼肌。用含有AAV1、AAV2、AAV3b或SASTG的等量基因組的顆粒(lxio1())注射小鼠，并使用體內(nèi)活的動物成像隨時間評估焚光素酶活性(第3、7、14和21天)(圖12)。如預(yù)期的，AAV2和AAV3沒有AAV1那樣有效轉(zhuǎn)導(dǎo)骨駱肌。在第3天不能從AAV2和AAV3注射的小鼠檢測到表達；而在第3天可以檢測到從AAV1并且重要地，從SASTG的表達。SASTG的表達圖式與AAV1而不是它的AAV3b親本在注射后所有時間點平4亍。實施例4腦和肝臟的轉(zhuǎn)導(dǎo)6到8周齡雄性C57bl/6小鼠用于確定肝臟中AAV2和2.5載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率。用300"12.5%阿佛丁麻醉小鼠，將攜帶人因子IX(hFIX)轉(zhuǎn)基因病毒的AAV2和2.5載體的1x1011個顆粒溶解在250m1PBS中并通過門靜脈緩慢注射。載體為如國際專利公布WO01/92551中描述的雙鏈體化的病毒顆粒。l和6周后，使用肝素包被的毛細玻璃管從每只小鼠的尾部靜脈收集100p1血液。通過在4X:以8000rpm離心血樣20分鐘收集血清。將血清在-80"C保存直到測試。通過標準ELISA方法測試血清中hFIX的表達。用5mg/mL的hFIX水平對正常人血清的連續(xù)稀釋液用作標準。使用該測定法，發(fā)現(xiàn)2.5栽體轉(zhuǎn)導(dǎo)肝臟的能力與親本AAV2病毒相比降低(圖13)。該實驗表明除了獲得肌肉親嗜性外，2.5還失去了AAV2特有的肝臟特異性親嗜性。在另一實施方案中，使用綠色熒光蛋白(GFP)報道物轉(zhuǎn)基因盒和以前為AAV2建立的條件，將雙鏈體化的2.5載體注射到小鼠腦的皮質(zhì)區(qū)(圖14)，并測定神經(jīng)元特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)。充分確定AAV1和AAV2對于神經(jīng)元轉(zhuǎn)導(dǎo)是特異的。如圖14中所示，2.5載體轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)元(左邊的箭頭)以及非神經(jīng)元細胞(右邊的箭頭)。基于形態(tài)學(xué)，這些細胞似乎是星形膠質(zhì)細胞。當(dāng)能夠測試2.5載體的體內(nèi)組織特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)時，這些實驗一起表明除了獲得組織特異性親嗜性(例如，來自AAV血清型1親本的骨骼肌或心肌親嗜性)外，還失去了細胞類型特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如，受體AAV2的肝臟-肝細胞-特異性轉(zhuǎn)導(dǎo))，這些載體已經(jīng)獲得了新的親嗜性(非神經(jīng)元/星形膠質(zhì)細胞)，其不存在于供體親本(AAV1)或受體親本殼體(AAV2)中并且總體上是嵌合的2.5載體特有的。前文用于闡明本發(fā)明，并且不理解為對本文的限制。本發(fā)明通過下面的權(quán)利要求書限定，其中包括權(quán)利要求的等同方案。權(quán)利要求1.嵌合病毒載體，其包含(a)嵌合腺伴隨病毒(AAV)殼體，其包含AAV2殼體亞基中氨基酸位置264后的選擇性氨基酸插入或者來自其他AAV的殼體亞基中的對應(yīng)改變；和(b)包含AAV末端重復(fù)序列和異源核酸序列的核酸；其中該核酸包裝在嵌合AAV殼體內(nèi)。2.權(quán)利要求1的嵌合病毒載體，其中所述嵌合病毒載體與受體親本AAV載體相比具有增強的靶細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。3.權(quán)利要求2的嵌合病毒載體，其中所述嵌合病毒載體具有增強的骨骼肌轉(zhuǎn)導(dǎo)。4.權(quán)利要求2的嵌合病毒載體，其中所述嵌合病毒載體具有增強的心肌轉(zhuǎn)導(dǎo)。5.權(quán)利要求2的嵌合病毒載體，其中所述嵌合病毒載體具有增強的星形膠質(zhì)細胞和/或神經(jīng)膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。6.權(quán)利要求1的嵌合病毒載體，其中所述插入是蘇氨酸插入到殼體亞基中。7.權(quán)利要求1的嵌合病毒載體，其中所述嵌合病毒載體包含嵌合AAV2殼體，該殼體包含AAV2殼體亞基中氨基酸位置264后的氨基酸插入。8.權(quán)利要求7的嵌合病毒載體，其中所述插入是蘇氨酸的插入。9.權(quán)利要求1的嵌合病毒載體，其中所述嵌合病毒載體包含嵌合AAV3b殼體，該殼體包含AAV3b殼體亞基中氨基酸位置264后的氨基酸插入。10.權(quán)利要求9的嵌合病毒載體，其中所述插入是蘇氨酸的插入。11.權(quán)利要求l的嵌合病毒載體，其中所述嵌合病毒載體還包含選擇性氨基酸替代，所述替代選自(a)AAV2殼體亞基中氨基酸位置263上的氨基酸替代或來自其他AAV的殼體亞基中的對應(yīng)改變；(b)AAV2殼體亞基中氨基酸位置450上的氨基酸替代或來自其他AAV的殼體亞基中的對應(yīng)改變；(c)AAV2殼體亞基中氨基酸位置457上的氨基酸替代或來自其他AAV的殼體亞基中的對應(yīng)改變；和U)上面(a)到(c)的任意組合。12.權(quán)利要求11的嵌合病毒載體，其中所述嵌合病毒載體包含嵌合AAV2殼體，該殼體包含AAV2殼體亞基中氨基酸位置263上的氨基酸替代。13.權(quán)利要求12的嵌合病毒載體，其中所述替代是丙氨酸替代谷氨酰胺。14.權(quán)利要求11的嵌合病毒載體，其中所述嵌合病毒載體包含嵌合AAV3b殼體，該殼體包含AAV3b殼體亞基中氨基酸位置263上的氨基酸替代。15.權(quán)利要求14的嵌合病毒載體，其中所述替代是丙氨酸替代谷氨酰胺。16.權(quán)利要求11的嵌合病毒載體，其中所述嵌合病毒載體包含嵌合AAV2殼體，該殼體包含AAV2殼體亞基中氨基酸位置450上的氨基酸替代。17.權(quán)利要求16的嵌合病毒載體，其中所述替代是天冬酰胺替代蘇氨酸。18.權(quán)利要求11的嵌合病毒載體，其中所述嵌合病毒載體包含嵌合AAV2殼體，該殼體包含AAV2殼體亞基中氨基酸位置457上的氨基酸替代。19.權(quán)利要求18的嵌合病毒載體，其中所述替代是天冬酰胺替代谷氨酰胺。20.嵌合病毒載體，其包含(a)嵌合腺伴隨病毒(AAV)殼體，其包含(i)AAV2殼體亞基中氨基酸位置263上丙氨酸對谷氨酰胺的選擇性氨基酸替代；(ii)AAV2殼體亞基中氨基酸位置264后蘇氨酸的選擇性氨基酸插入；(b)包含AAV末端重復(fù)序列和異源核酸序列的核酸；其中該核酸包裝在嵌合AAV殼體內(nèi)。21.嵌合病毒載體，其包含(a)嵌合腺伴隨病毒(AAV)殼體，其包含(i)AAV3b殼體亞基中氨基酸位置263上丙氨酸對谷氨酰胺的選擇性氨基酸替代；(ii)AAV3b殼體亞基中氨基酸位置264后蘇氨酸的選擇性氨基酸插入；(b)包含AAV末端重復(fù)序列和異源核酸序列的核酸；其中該核酸包裝在嵌合AAV殼體內(nèi)。22.嵌合病毒載體，其包含(a)嵌合腺伴隨病毒(AAV)殼體，其包含AAV2殼體亞基中氨基酸位置450上的選擇性氨基酸替代或者來自其他AAV的殼體亞基中的對應(yīng)支變；(b)包含AAV末端重復(fù)序列和異源核酸序列的核酸；其中該核酸包裝在嵌合AAV殼體內(nèi)。23.權(quán)利要求22的嵌合病毒載體，其中所述替代是天冬酰胺替代蘇氨酸。24.嵌合病毒載體，其包含(a)嵌合腺伴隨病毒(AAV)殼體，其包含AAV2殼體亞基中氨基酸位置457上的選擇性氨基酸替代或者來自其他AAV的殼體亞基中的對應(yīng)改變；(b)包含AAV末端重復(fù)序列和異源核酸序列的核酸；其中該核酸包裝在嵌合AAV殼體內(nèi)。25.權(quán)利要求24的嵌合病毒載體，其中所述替代是天冬酰胺替代谷氨酰胺。26.權(quán)利要求24的嵌合病毒載體，其中所述嵌合病毒載體還包含AAV2殼體亞基中氨基酸位置450上的選擇性氨基酸替代或者來自其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變。27.嵌合病毒載體，其包含(a)嵌合腺伴隨病毒(AAV)殼體，其包含(i)AAV2殼體亞基中氨基酸位置264后的選擇性氨基酸插入或者來自其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變；(ii)AAV2殼體亞基中氨基酸位置263上的選擇性氨基酸替代或者來自其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變；(iii)AAV2殼體亞基中氨基酸位置705上的選擇性氨基酸替代或者來自其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變；(iv)AAV2殼體亞基中氨基酸位置708上的選擇性氨基酸替代或者來自其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變；和(v)AAV2殼體亞基中氨基酸位置716上的選擇性氨基酸替代或者來自其他AAV的殼體亞基中對應(yīng)的改變；和(b)包含AAV末端重復(fù)序列和異源核酸序列的核酸；其中該核酸包裝在嵌合AAV殼體內(nèi)。28.權(quán)利要求27的嵌合病毒載體，其中所述嵌合AAV殼體包含(a)AAV2殼體亞基中氨基酸位置2M后蘇氨酸的插入；(b)AAV2殼體亞基中氨基酸位置263上丙氨酸對谷氨酰胺的替代；(c)AAV2殼體亞基中氨基酸位置705上丙氨酸對天冬酰胺的替代；(d)AAV2殼體亞基中氨基酸位置708上丙氨酸對纈氨酸胺的替代；(e)AAV2殼體亞基中氨基酸位置716上天冬酰胺對蘇氨酸的替代。29.權(quán)利要求1-28任一項的嵌合病毒載體，其中氨基酸位置264后的插入或者對應(yīng)的改變存在于AAV殼體的所有亞基中。30.權(quán)利要求l-29任一項的嵌合病毒載體，其中所述異源核酸序列編碼多肽。31.權(quán)利要求30的嵌合病毒載體，其中所述多肽是治療多肽。32.權(quán)利要求31的嵌合病毒載體，其中所述治療多肽選自肌養(yǎng)蛋白、小肌養(yǎng)蛋白、utrophin、凝血因子，包括因子VIII或因子IX、生長因子，包括胰島素樣生長因子I、胰島素樣生長因子II、血小板衍生的生長因子、表皮衍生的生長因子、成纖維細胞衍生的生長因子、神經(jīng)衍生的生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)細胞衍生的生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-ot或轉(zhuǎn)化生長因子-p、神經(jīng)營養(yǎng)因子、抗炎因子，包括轉(zhuǎn)化生長因子-oc可溶性受體或IRAP、otl-抗胰蛋白酶、溶酶體酸性ct-葡糖苷酶、P-葡糖腦普脂酶、a-半乳糖苷酶A、細胞因子、干擾素，包括P-干擾素、TRAIL、FAS-配體、內(nèi)皮抑制素、制管張素、嚢性纖維化跨膜調(diào)節(jié)蛋白、紅細胞生成素、LDL受體、脂蛋白脂肪酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨曱酰酶、P-珠蛋白、a-珠蛋白、血影蛋白、腺苷脫氨酶、次黃噤呤鳥噤呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、鞘磷脂酶、溶酶體氨基己糖苷酶、支鏈酮酸脫氫酶、骨形態(tài)發(fā)生蛋白，包括VEGF和RANKL、蛋白質(zhì)磷酸酶抑制劑I、受磷蛋白、serca2a、過氧化氫酶、酪氨酸羥化酶、超氧化物歧化酶、瘦蛋白、RP65蛋白、甘丙肽、a-L-艾杜糖苷酸酶、激素，包括胰島素或者生長激素、半乳糖腦苷脂酶、苯丙氨酸羥化酶、LDL受體、可溶性CD4、抗凋亡基因產(chǎn)物、谷氨酸受體、、淋巴因子、barkct、02-腎上腺素能受體、calsarcin、enos、inos、sarcoglycan、Fc受體、T細胞受體、ApoE、ApoC、自殺基因產(chǎn)物、肺瘤抑制基因產(chǎn)物，及其任意組合。33.權(quán)利要求1-29任一項的嵌合病毒載體，其中所述異源核酸序列編碼非翻譯的RNA。34.權(quán)利要求33的嵌合病毒載體，其中所述非翻譯的RNA為反義RNA或者干擾RNA(R薩)。35.權(quán)利要求33或權(quán)利要求34的嵌合病毒載體，其中所述非翻譯的RNA針對VEGF、多藥抗性基因產(chǎn)物、myostatin或者亨廷頓病基因產(chǎn)物中的重復(fù)序列。36.藥物制劑，其包含可藥用載體中的根據(jù)權(quán)利要求l-35任一項的嵌合病毒載體。37.給細胞施用核酸的方法，其包括使細胞與權(quán)利要求l-35任一項的嵌合病毒載體或者權(quán)利要求36的藥物制劑接觸。38.給受試者遞送核酸的方法，其包括給受試者施用權(quán)利要求1-35任一項的嵌合病毒載體或者權(quán)利要求36的藥物制劑。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述受試者是人類受試者。40.權(quán)利要求38的方法，其中所述受試者具有選自肌營養(yǎng)不良，包括杜興肌營養(yǎng)不良或貝克爾肌營養(yǎng)不良、血友病A、血友病B、多發(fā)性硬化、糖尿病、戈謝病、法布里病、蓬佩病、癌癥、關(guān)節(jié)炎、肌肉萎縮、心臟病，包括充血性心力衰竭或者外周動脈病、內(nèi)膜增生、神經(jīng)障礙，包括癲癇、亨廷頓病、帕金森病或阿爾茨海默氏病、自身免疫性疾病、嚢性纖維化、地中海貧血、胡爾勒病、克拉伯病、苯丙酮尿癥、巴騰病、脊髓大腦性共濟失調(diào)、LDL受體缺陷、高氨血癥、貧血、關(guān)節(jié)炎、視網(wǎng)膜變性疾病，包括黃斑變性、腺苷脫氨酶缺陷，和癌，包括形成腫瘤的癌的病癥或者處于患所述病癥的危險中。41.權(quán)利要求38的方法，其中將所述嵌合病毒載體或者藥物制劑施用于骨骼肌。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述受試者患有肌營養(yǎng)不良或者處于患肌營養(yǎng)不良的危險中。43.權(quán)利要求41或權(quán)利要求42的方法，其中所述嵌合病毒載體包含嵌合AAV殼體，該殼體包含AAV2殼體亞基中氨基酸位置264后的選擇性氨基酸插入。44.權(quán)利要求41或權(quán)利要求42的方法，其中所述嵌合病毒載體包含嵌合AAV殼體，該殼體包含AAV3b殼體亞基中氨基酸位置264后的選擇性氨基酸插入。45.權(quán)利要求38的方法，其中將所述嵌合病毒載體或者藥物制劑施用于心肌。46.權(quán)利要求45的方法，其中所述受試者患有心臟病或者處于患心臟病的危險中。47.權(quán)利要求46的方法，其中所述受試者患有充血性心力衰竭或者外周動脈病或處于患所述疾病的危險中。48.權(quán)利要求46或權(quán)利要求47的方法，其中所述嵌合病毒載體包含嵌合AAV殼體，該殼體包含AAV3b殼體亞基中氨基酸位置264后的選擇性氨基酸插入。49.權(quán)利要求38的方法，其中將所述嵌合病毒載體或者藥物制劑施用于神經(jīng)膠質(zhì)細胞和/或星形膠質(zhì)細胞。50.權(quán)利要求49的方法，其中所述受試者患有帕金森病、星形細胞瘤或成膠質(zhì)細胞瘤或處于患所述疾病的危險中。51.權(quán)利要求49或權(quán)利要求50的方法，其中所述嵌合病毒載體包含嵌合AAV殼體，該殼體包含AAV2殼體亞基中氨基酸位置264后的選擇性氨基酸插入。全文摘要本發(fā)明部分基于發(fā)現(xiàn)細小病毒(包括AAV)殼體可以工程化以摻入來自其他細小病毒的小的選擇性區(qū)域，其賦予希望的性質(zhì)。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一些情況中，來自第一種細小病毒(例如AAV)的小至單個氨基酸插入或替代到另一細小病毒(例如AAV)的殼體結(jié)構(gòu)中以產(chǎn)生嵌合的細小病毒，這足夠?qū)λ玫那逗霞毿〔《举x予第一種細小病毒的一種或多種希望的性質(zhì)和/或賦予第一種細小病毒不顯示或者以較低程度展示的性質(zhì)。文檔編號C12N15/35GK101124328SQ200580048323公開日2008年2月13日申請日期2005年12月15日優(yōu)先權(quán)日2004年12月15日發(fā)明者C·李,D·E·鮑爾斯,J·E·拉比諾維茨,J·格里格爾,M·阿班杰-麥肯納,R·J·薩穆爾斯基申請人:北卡羅來納查佩爾山大學(xué);佛羅里達大學(xué)研究基金會有限公司