專利名稱：在酵母中重組生產(chǎn)二十二碳六烯酸(dha)的制作方法
在酵母中重組生產(chǎn)二十二碳六烯酸(DHA)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明介紹了酵母的工程設(shè)計途徑，所述途徑通過導(dǎo)入分離自合 適來源的5種去飽和酶和延長酶來將酵母中正常合成的油酸轉(zhuǎn)化成 DHA。這還包括將各基因克隆入合適的載體中并且將它們導(dǎo)入酵母中 用于在酵母中生產(chǎn)DHA。發(fā)明背景二十二碳六烯酸(DHA) (22:6)是cD-3-脂肪酸，這樣稱是因?yàn)樗谶h(yuǎn) 離分子的甲基端具有雙鍵3碳原子。在人膳食中所有必需的脂肪酸 都是co-3或①-6。盡管DHA可以由a-亞麻酸(在亞麻子油和紫蘇油 中發(fā)現(xiàn)的較簡單的CD-3)在體內(nèi)合成，但合成能力隨著年齡而減弱。脂 肪酸的 -3和co-6家族是必需的，因?yàn)樗鼈儾荒茉隗w內(nèi)合成，但必須 在膳食中獲得。脂肪酸包含在體內(nèi)每個細(xì)胞的膜中，但必需脂肪酸在 腦細(xì)胞、心細(xì)胞和免疫系統(tǒng)細(xì)胞的膜中特別集中。DHA是腦和視網(wǎng)膜的必需組分，并且涉及許多其它必需的機(jī)體功 能。它對于胎兒和新生兒腦的生長和發(fā)育尤其重要。在此期間DHA 水平的降低導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育、視覺靈敏度遲緩和兒童智力減退。DHA的 出生后缺陷還可以誘導(dǎo)成人退行性疾病的傾向，而膳食中DHA的補(bǔ) 充攝入已被證明對心臟具有積極作用-它降低LDL水平和甘油三酸酯-并且具有積極作用。它還用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療。DHA缺乏與胎兒乙醇綜合癥，注意缺陷活動過強(qiáng)障礙，嚢腫性纖 維化，苯丙酮酸尿癥，單才及性抑郁癥(unipolar depression ), aggressive hostility和腎上腺-腦百質(zhì)營養(yǎng)不良相關(guān)聯(lián)。腦中DHA的減少還與老 化過程中的認(rèn)知下降和突發(fā)性阿爾茨海默病的發(fā)病相關(guān)聯(lián)。西方國家死亡的主要原因是心血管疾病。流4亍病學(xué)研究顯示在魚 類消費(fèi)和緣于心肌梗死的突然死亡的減少之間有強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)。DHA是魚 類中的活性成分。盡管大多數(shù)魚油的EPA和DHA含量高，但有一些 魚油并非如此。比目魚、旗魚和鰈魚的EPA和DHA含量特別低。具 有最高水平EPA和DHA的魚油包括鯖、緋魚和鮭魚。 一些魚，如鱈魚和黑線鱈，在肝中儲存了它們大部分的脂肪，所以應(yīng)當(dāng)取這些魚的 肝油，而非來自魚片的油。魚油不4又減少血液中的甘油三酸酯和降低血4全癥，而且防止心律不齊。已經(jīng)顯示自魚油中純化的DHA降^氐血 壓并且減少血液粘性。有證據(jù)表明DHA提高紅血細(xì)胞膜流動性，由 此提高血細(xì)胞的可塑性，所以它們可以更加容易地穿過毛細(xì)血管并由 此降低血液粘性和血壓。DHA還可以通過降低氬化可的松來降低血 壓。DHA缺乏與抑郁癥的關(guān)聯(lián)是抑郁癥與心肌梗塞之間強(qiáng)陽性關(guān)聯(lián)的 原因。DHA還對諸如高血壓關(guān)節(jié)炎，動脈石更化癥，adult onset diabetes mellitus,血栓癥和某些癌癥的疾病具有積極效果。不過，魚油對于心 臟最顯著的效果是與心律不齊(不規(guī)則的心臟跳動)有關(guān)的。在美國， 作為心律不齊的結(jié)果，每年25萬人在一小時內(nèi)死于心臟病。腦發(fā)育 是復(fù)雜的交互式過程，其中早期的破壞性事件可以對于功能性適應(yīng)具 有長期持續(xù)影響。長鏈多不飽和脂肪酸(LCPUFA)，特別是花生四烯酸 和二十二碳六烯酸在發(fā)育過程中快速出現(xiàn)在腦的灰質(zhì)中，并且腦脂肪 酸(FA)組分反映了膳食的利用度。膳食n-3脂肪酸缺乏影響特定的 神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，特別是額皮層的多巴胺系統(tǒng)。腦的大部分干重是脂(脂 肪)，因?yàn)槟X活性在很大程度上依賴于由脂膜提供的功能。與其它身 體組織相比，腦的DHA和花生四烯酸非常高。DHA在具有功能活性 的膜，即突觸，和在視網(wǎng)膜中特別集中。對于膳食DHA的最大依賴 性發(fā)生在妊娠最后三周期間的胎兒中并且發(fā)生在出生后最初三個月期 間的嬰兒中(程度較小)。正是在此期間腦突觸正在最快速地形成， 并且嬰兒對DHA的需求超出了酶合成它的能力。視網(wǎng)膜內(nèi)二十二碳六烯酸(DHA)的重要作用被它在這 一 組織中的 高水平和活性守恒所提示。喂祠n-3-缺陷型祠料的動物在視網(wǎng)膜DHA 水平上有很大減少，所述視網(wǎng)膜DHA水平與視網(wǎng)膜功能改變相關(guān)聯(lián)， 這種功能是由視網(wǎng)膜電流圖進(jìn)行評估了 。 DHA在視網(wǎng)膜功能中的作用 是顯著的，特別是在視桿細(xì)胞感光器外部節(jié)段內(nèi)，在這里發(fā)現(xiàn)DHA 的濃度最高。DHA的新生兒膳食供應(yīng)對于視網(wǎng)膜功能的發(fā)育是必需 的。動物實(shí)驗(yàn)和臨床干預(yù)研究表明 -3脂肪酸具有抗炎性特性并且， 因此，可以用于炎癥和自身免疫疾病的治療。冠心病，成人抑郁癥， 老化和癌癥的特征是高水平的白介素1 (IL-I),由co-6脂肪酸產(chǎn)生的原
炎性白三烯LTB-4。有許多臨床試驗(yàn)評估膳食添加魚油對于幾種人類 炎性和自身免疫疾病的益處，包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，克羅恩氏病，潰瘍 性結(jié)腸炎，牛皮癬，多發(fā)性硬化癥和偏頭痛。在油性魚和魚油中發(fā)現(xiàn)高含量的n-3多不飽和脂肪酸(PUFA) 二 十二碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。素食膳食的a-亞麻酸 (ALA)與亞油酸(LA)相比相對低，并且提供少量，如果有的話，二十 二碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸。因此，素食者需要作膳食改變 以優(yōu)化DHA的需求。魚油DHA含量的不一致和產(chǎn)品令人不快的魚腥味已經(jīng)剌激了對 于DHA替代來源的研究。 一組海洋原生生物，thraustochytrids,是co-3 脂肪酸包括DHA的天然生產(chǎn)者。最近已經(jīng)對這些生物進(jìn)行了培養(yǎng)并 用于DHA的生產(chǎn)。不過，要探索成本有效的替代品，以滿足不斷增 長的地球人口的需要。已經(jīng)考慮將各種微生物特別是單細(xì)胞藻類如海洋腰鞭毛蟲 Crypthecodinium cohni作為候選生物。但是這些藻類來源非常昂貴， 因?yàn)樗鼈兊漠a(chǎn)量低并且提取程序成本高。菜籽油、大豆、亞麻籽和某 些堅(jiān)果和種籽(胡桃，亞麻，芡歐鼠尾草，有時為南瓜籽)為富含a-亞 麻酸的來源，a-亞麻酸是DHA的前體。不地，a-亞麻酸需要轉(zhuǎn)變成DHA 并且因此作為DHA本身的補(bǔ)充物來說并不有效。由Thraustochytrids生產(chǎn)DHA非常專門化，與魚油相比，它們提 供簡單得多的生產(chǎn)方法，更少的魚腥味和高度純化的DHA。這些海洋 生物組是非光合的，異養(yǎng)的生物。但這些生產(chǎn)方法主要包括發(fā)酵和生 物加工技術(shù)。不過，必須探索成本有效的替代品，以滿足不斷增長的 地球人口的需要。本發(fā)明涉及通過重組方法導(dǎo)入基因來生產(chǎn)DHA,所述基因涉及 DHA的生物合成途徑。酵母已被認(rèn)識很久并且被用作宿主來進(jìn)行蛋白 質(zhì)表達(dá)，因?yàn)樗軌蛱峁┘庸は到y(tǒng)，以及微生物系統(tǒng)的方便應(yīng)用。作 為宿主，它具有許多優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗軌蛴糜诜置谛秃桶|(zhì)型蛋白質(zhì)的 生產(chǎn)，所述胞質(zhì)型可能需要翻譯后修飾，并且它的生物合成途徑在許 多方面類似于高等真核細(xì)胞。另外，與其它真核系統(tǒng)相比，對其遺傳 學(xué)有更加深入的了解，這樣易于操作，類似于大腸桿菌。表達(dá)水平還 可以達(dá)到幾毫克每升培養(yǎng)物。 現(xiàn)有技術(shù)專利號WO2005047485涉及絲狀真菌A12脂肪酸去飽和酶，其 能夠催化油酸轉(zhuǎn)變成亞麻酸(18:2)。描述了編碼所述去飽和酶的核酸 序列，與其雜交的核酸序列，包括所述去飽和酶基因的DNA構(gòu)建體， 和表達(dá)提高水平的去飽和酶的重組宿主微生物。更加具體的，分離并 克隆了來自真菌Fusarium moniliforme的A 12去飽和酶的編碼基因， 并且在油質(zhì)酵母中表達(dá)后證實(shí)了油酸向亞麻酸的有效轉(zhuǎn)化。另一個公開的專利WO2004104167涉及A12脂肪酸去飽和酶的 發(fā)明，其能夠催化來自Yarrowia lipolytica的油酸向亞麻酸轉(zhuǎn)化。2003-11-12由Yadav， Narendra.S.提交的WO2005047480,題為" 能夠催化亞麻酸a-亞油酸轉(zhuǎn)化的真菌A15脂肪酸去飽和酶的克隆和 測序。描述了與其雜交的核酸序列，包含所述去飽和酶基因的DNA構(gòu) 建體，表達(dá)提高水平的去飽和酶的重組宿主植物和微生物。更加具體 地，分離并克隆了來自真菌Fusarium moniliforme的A15去飽和酶的 編碼基因，并且在油質(zhì)酵母中表達(dá)后證實(shí)了 LA向ALA的有效轉(zhuǎn)化。專利號WO2000040705描述了涉及在碳5上多不飽和脂肪酸的去 飽和作用的基因的鑒定，及其應(yīng)用。還描述了編碼來自人單核細(xì)胞 cDNA文庫的人A5去飽和酶的cDNA，這是基于它與來自Mortierella alpina的去飽和酶的同源物而進(jìn)行的。1999-03-18由Napier, Johnathan A (The University of Bristol, UK) 提交的專利號WO2000055330，題為"Caenorhabditis elegans多不飽 和脂肪酸(PUFA)延長酶的蛋白質(zhì)和cDNA序列及其應(yīng)用"，涉及編 碼來自Caenorhabditis elegans的多不飽和脂肪酸延長酶的cDNA序 列，還涉及PUFA延長酶的應(yīng)用。還報道了由FUFA延長酶催化的由Y-亞麻酸合成二-高-Y-亞麻酸的方法，還報道了 C.elegans的重組PUFA延 長酶在酵母中的表達(dá)。專利號US 2003163845涉及幾種與多不飽和酸(即，延長酶)的延 長相關(guān)的基因的鑒定，及其應(yīng)用。它描述了通過利用源自酶保守性序 列并對M. alpina密碼子用法進(jìn)行調(diào)整的引物的PCR來克隆Mortierella alpina的延長酶基因的方法。延長酶基因組合以△ 5-去飽和酶基因在 啤酒酵母中的表達(dá)導(dǎo)致了花生四烯酸的出現(xiàn)。 US專利申請?zhí)朥S6432684涉及與在碳5上多不飽和脂肪酸的去 飽和作用相關(guān)的基因的鑒定，及其應(yīng)用。具體地，在二-高個亞油酸 (DGLA)向花生四烯酸的轉(zhuǎn)化中和在20:4n-3向二十碳五烯酸(EPA)的 轉(zhuǎn)化中利用了人A5?；谒c來自Mortierella alpina去飽和酶的去飽 和酶的同源物，從人單核細(xì)胞cDNA文庫中分離出編碼人A5去飽和 酶的cDNA,并且給出了表達(dá)序列標(biāo)簽的Incyte Life s叫數(shù)據(jù)庫的應(yīng) 用。一篇最近由Contreras, M.A和Rapoport發(fā)表的題為"Recent studies on interactions between n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids in brain and other tissues."的文獻(xiàn)，提出在某些酶學(xué)步驟上有n-3和n-6多不 飽和脂肪酸之間介導(dǎo)的竟?fàn)?，特別是那些涉及多不飽和脂肪酸延長和 去飽和的步驟。 一個關(guān)鍵的酶位點(diǎn)是A-6去飽和酶。在另一方面，一 種大鼠內(nèi)的體內(nèi)方法，應(yīng)用下列慢性n-3營養(yǎng)剝奪或長期施用鋰，表 明二十二碳六烯酸和花生四烯酸的去酯化作用/再酯化作用的循環(huán)，腦 磷脂獨(dú)立地彼此作用，因而調(diào)節(jié)這些循環(huán)的酶不太可能是n-3/n-6竟 爭的位點(diǎn)。專利申請DE 2003-10335992描述了來自多種分類單元的脂肪酸延 長酶和去飽和酶的基因，用于農(nóng)作物或生產(chǎn)者生物中多不飽和脂肪酸 的生物合成才莫式的調(diào)節(jié)。A-6去飽和酶，A-5去飽和酶，A-4去飽和酶， 和A-6延長酶的基因自下列生物中描述，包括Thalassiosira， Euglena， 和Ostreococcus。 還描述了來自 Pythiaceae和包括Prasinophyceae的 海藥的 誦3 去々包和酵。示"i正了表達(dá)來自 Euglena gracilis and Phaeodactylum tricornutum的基因的啤酒酵母宿主的構(gòu)建。所述生物 能夠由staeridonic acid或eicosapentaenoic acid合成二十二碳六火希酸。WO 2002081668涉及與在碳5，(即，"A-5-去飽和酶")和在碳6 (即，"A6去飽和酶")上多不飽和脂肪酸的去飽和作用相關(guān)的基因的 鑒定，及其應(yīng)用。它描述了 A-5去飽和酶的應(yīng)用，將di-homo-gamma-亞麻酸(DGLA)轉(zhuǎn)化為花生四烯酸(AA)，和將20:4n-3轉(zhuǎn)化為二十碳 五烯酸(EPA),以及A-6將亞油酸(LA)轉(zhuǎn)化為g-亞麻酸(GLA)的用途。 例證了這些序列鑒定其它真菌和哺乳動物的脂肪酸延長酶基因的用 途。題為 "Mammalian A6-desaturase genes and promoter regions andscreening for compounds modulating enzyme activity or levels" 的專利 WO 2001070993描述了控制去飽和酶基因的多核苷酸，和鑒定藥學(xué) 活性化合物的藥物篩選測試，所述活性化合物用于治療涉及異常脂類 代謝的疾病，包括其糖尿病性神經(jīng)病，這是通過利用脂肪酸去飽和酶 酶和編碼它們的基因作為本發(fā)明的靶標(biāo)而進(jìn)行的。例證了所述基因在 啤酒酵母中的表達(dá)。DHA在其它生物中的生產(chǎn)有各種限制，其包括蛋白質(zhì)以不可溶形 式生產(chǎn)以及高生產(chǎn)成本。當(dāng)與其它表達(dá)系統(tǒng)相比時，啤酒酵母提供了 良好的選擇，其包括遺傳修飾策略的廣泛工具箱，可靠功能產(chǎn)品的生 產(chǎn)，以及低培養(yǎng)成本。另外，通過發(fā)酵方法的大規(guī)模酵母生產(chǎn)和酵母的其它下游程序簡 單、安全并且得到充分表征。此外，酵母在遺傳上被認(rèn)為是安全的生 物并且由于它們的快速高細(xì)胞密度增長，二十二碳六烯酸的全球需求 可以得到輕易滿足。
圖1 :代表DHA生產(chǎn)的生物合成途徑。圖2:顯示來自黃芥子的A12去飽和酶的擴(kuò)增。圖3:顯示RL-99-27， SKM-9816和BPR-559與所述B.napus的△ 12去飽和酶的核苷酸序列的聚類。圖4:顯示△ 12去飽和酶的1.16 Kb序列中存在脂肪酸去飽和酶結(jié)構(gòu) 域。圖5: △ 12去飽和酶克隆入在pESC-His的GAL1啟動子下的MCS2位點(diǎn)。圖6:在它攜帶的A12-去飽和酶基因誘導(dǎo)下YPH501的脂肪酸曲線。圖7:顯示來自黃芥子(BPR559)的A15去飽和酶的擴(kuò)增。圖8:黃芥子BPR559的A15去飽和酶的1.2kb序列中的脂肪酸去飽和酶結(jié)構(gòu)域。圖9:在pESC-His載體中克隆A12和△ 15去飽和酶的步驟示意圖。 圖10: PEH-BJ-D 15-D 12-CO構(gòu)建體的圖譜。圖11:用半乳糖誘導(dǎo)后的克隆上的GC-MS。在重組酵母中生產(chǎn)18:2 和18:3脂肪酸的指征圖。圖12:顯示在SC1的A6去飽和酶中脂肪酸去飽和酶基序的存在。
圖13:攜帶GAL 1啟動子下的MCS II中的A6去飽和酶基因的 pESC-Trp。圖14:攜帶A-12, △ 15和A6去飽和酶基因的啤酒酵母YPH501。 圖15: SC1的延長酶中的基序。圖16:顯示分別克隆在MCSI和MSCII位點(diǎn)中的延長酶和A6去i包和 酶基因的pESC-TRP構(gòu)建體。圖17:攜帶A12. A15和A6去飽和酶基因的啤酒酵母YPH501。 圖18: pESC-URA中的A5構(gòu)建體的圖譜。圖19:攜帶A12, A15和A6去飽和酶基因的啤酒酵母YPH501。圖20:分別在pESC-URA的MCSI和MCS II下克隆的A5和A4去飽和酶的載體圖譜。圖21 :攜帶A12, △ 15， A6， A5, A4和延長酶去飽和酶基因的嘩酒 酵母YPH501。序列表介紹SEQ ID NO 1 :具有核苷酸取代的來自黃芥子BPR559的A12去飽和酶 的序列。SEQ ID NO 2:分離自黃芥子BPR 559的A-15去飽和酶ORF的核苷 酸序列。SEQ ID NO 3: A-15-去飽和酶的密碼子優(yōu)化序列，因此代表人工序列。 SEQIDN04:SC1的A-6去飽和酶的全長序列。SEQ ID NO 5: A-6去飽和酶密碼子的核苷酸序列，優(yōu)化用于導(dǎo)入酵母 中。SEQ ID NO 6:全長延長酶序列。SEQ ID NO 7:密碼子優(yōu)化后的延長酶核苷酸序列，用于導(dǎo)入酵母中。 SEQ ID NO 8: Phaeodactylum tricornatum的A-5去々包和酶的核苦酸序列。SEQ ID NO 9:擴(kuò)增自Thraustochytrium sp 21685的A-4去々包和酶的核 苷酸序列。發(fā)明詳述DHA是包含多不飽和脂肪酸的22碳，6雙鍵，其通過一系統(tǒng)由
去飽和酶和延長酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化由油酸合成。本發(fā)明描述了通過導(dǎo)入分 離自合適來源的五種去飽和酶和延長酸進(jìn)行酵母工程化改造的途徑，用于將一般在酵母中合成的油酸轉(zhuǎn)化成DHA。油酸向DHA轉(zhuǎn)化的步 驟在圖1中給出。本發(fā)明的目標(biāo)是由合適的來源分離5種涉及由油酸合成DHA的 去飽和酶和延長酶，將所述基因克隆入合適的栽體中并將它們導(dǎo)入酵 母中用于在酵母中生產(chǎn)DHA。在酵母中生產(chǎn)亞油酸導(dǎo)入A12去飽和酶由A12去飽和作用帶來的油酸向亞油酸的轉(zhuǎn)化是由油酸生產(chǎn)DHA 的第 一步。亞油酸進(jìn)行進(jìn)一步的去飽和作用和延長作用以生成高度不 飽和二十二碳六烯酸。已經(jīng)從三個變種的黃芥子中分離出A-12去飽 和酶，即該步^^所需要的酶。分離三個變種黃芥子-RL-99-27， Skm-9816和BPR-559的基因組 DNA，并以設(shè)計來擴(kuò)增該基因的引物進(jìn)行擴(kuò)增。圖2描述了由黃芥子 擴(kuò)增A-12去飽和酶。以設(shè)計來擴(kuò)增A-12去飽和酶的引物擴(kuò)增100ng的 RL-99-27， Skm-9816和BPR-559變種的基因組DNA。 M-標(biāo)記、1 Kb 梯度和下列泳道顯示由各變種擴(kuò)增A-12去飽和酶的產(chǎn)物，如圖2所 示。擴(kuò)增片段的預(yù)期大小為1.2kb。由黃芥子的所有三種變種擴(kuò)增預(yù)期大小為1.2 kb的片段。將這些 片段克隆入pGEM(T)Easy載體(Prco)中。全部三種獲得的序列都與 B.napus,黃芥子和B.rapa的A-12去飽和酶同源。盡管黃芥子(所有三種變種)的A-12去飽和酶顯示與各物種的12 去飽和酶具有同源性，但它與B.napus的同源性比與其它物種的同源 性更高。分離自三個變種的A-12去飽和酶與B.napus的同源性顯示 于圖3中。所有變種的cDNA序列翻i斧成384aa的蛋白質(zhì)?；?f企索確證了 分離的序列具有圖4中所示的脂肪酸去飽和酶結(jié)構(gòu)域。上面的序列是 對酵母優(yōu)化的密碼子并且用B.napus的A-12去飽和酶氨基酸替換了 幾個非保守性氨基酸(與B.napus的序列相比)。對于黃芥子A-12去飽 和酶序列作了總共23處改變。A-12去飽和酶序列的修飾序列顯示于 Seq ID 1中。
由此，已經(jīng)將具有23個所需核苷酸取代的A-12去飽和酶直接克 隆入pEsc His的BamHI和Sail位點(diǎn)中，得到的克隆命名為PEH-BJ-D12-CO。將構(gòu)建體從大腸桿菌穿梭到啤酒酵母YPH501中。將A-12 去飽和酶克隆入pESC-His的GAL1啟動子下的MCS位點(diǎn)中，如圖 5中所示。功能檢驗(yàn)利用PEH-BJ-D 12-CO在酵母菌林YPH501中進(jìn)行了所有的功能實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)。下面給出實(shí)驗(yàn)所遵循的方案。_攜帶目標(biāo)質(zhì)粒/基因的酵母細(xì)胞過夜(10%)培養(yǎng)物接種入100ml SDTrp-(0.67。/。無氨基酸的酵母氮基，2%葡萄糖，0.13%的去除色氨酸 的氨基酸dr叩out粉)培養(yǎng)基并于30。C過夜培養(yǎng)。丄將上述接種體的10%接種物接種到200ml SDTrp-肉湯中。將培養(yǎng)物于3(TC過夜培養(yǎng)。 丄將細(xì)胞沉淀并重懸于等體積的SGTrp-肉湯中(0.67%無氨基酸的酵 母氮基，2%半乳糖，0.13%的去除色氨酸的氨基酸dropout粉)來導(dǎo)入 目標(biāo)基因。將培養(yǎng)物于3(TC培養(yǎng)3天。丄三天后將溫度變成15。C并將細(xì)胞再孵育三天。丄將培養(yǎng)物沉淀下來并用2%的葡萄糖溶液洗滌并將收集的細(xì)胞干 燥并用于脂肪酸提取和分析。將攜帶PEH-BJ-D12-CO的YPH501細(xì)胞在SD培養(yǎng)基中于30°C 過夜培養(yǎng)；將細(xì)胞沉淀并于第二天重懸于SG培養(yǎng)基中。將這些細(xì)胞 于3(TC培養(yǎng)3天，隨后于1VC再孵育三天(顯示對于去飽和酶作用 優(yōu)化的條件)(Knutxon等，1998)。將誘導(dǎo)的細(xì)胞沉淀并進(jìn)行脂肪酸 分析。脂肪酸分析的結(jié)果在圖6中給出。在不同的條件下將實(shí)驗(yàn)重復(fù)幾次并且我們已觀察到在攜帶A-12 去飽和酶基因的YPH501細(xì)胞中出現(xiàn)了亞油酸。因而導(dǎo)入酵母中的
△ -12去飽和酶引起亞油酸在酵母中的有效生產(chǎn)。事實(shí)上，生產(chǎn)的亞油 酸的量大于酵母細(xì)胞中油酸的量。油酸向亞油酸的高效轉(zhuǎn)變可能導(dǎo)致油酸的生產(chǎn)提高，由此導(dǎo)致生產(chǎn)出更多的亞油酸。因而用于生產(chǎn)DHA 的酵母工程設(shè)計途徑的第 一 步已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)。在酵母中生產(chǎn)a亞麻酸亞油酸向a亞麻酸的轉(zhuǎn)化是由15去飽和酶催化的油酸向DHA 轉(zhuǎn)化中的下一步驟。這還是w-3途徑的第一步。A-15去飽和酶在產(chǎn) 生亞麻酸的生物中表達(dá)。在才直物中該酶在兩種不同的組織中表達(dá)-內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)和葉綠體。來自B. napus的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的A-15去飽和酶是1154bp的轉(zhuǎn) 錄本。該基因長3.1kb并包含8個外顯子；設(shè)計引物來從表達(dá)該基因 的組織中的RNA來擴(kuò)增A-15去飽和酶的ORP。用10 脫落酸將黃 芥子種籽(BPR559)處理2天。從發(fā)芽的秧苗中分離總RNA并從其 中制備mRNA。利用寡聚dT引物對mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用100ng cDNA以特異性引物擴(kuò)增導(dǎo)致擴(kuò)增出預(yù)期大小(1.2kb)的擴(kuò)增片段，顯 示于圖7中。將所述1.2kb片段克隆于pGEMm-easy克隆載體并進(jìn)行測序。 序列顯示于S叫ID2中。用該序列進(jìn)行的基序檢索確證了在擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)脂肪酸去飽和酶結(jié) 構(gòu)域的存在。它顯示在圖8中。已經(jīng)對黃芥子序列進(jìn)行優(yōu)化以便在酵母中表。還對一些氨基酸進(jìn) 行了取代以便提高基因的效率。得到的序列顯示在SeqlD3中。在單一構(gòu)建體中克隆A-12和A-15去飽和酶.已經(jīng)克隆了 A-12和A-15去飽和酶并證實(shí)其發(fā)揮功能，所述二酶 構(gòu)成了油酸向ALA轉(zhuǎn)化的最初兩步。已將密碼子優(yōu)化的A-12去飽和 酶和A-15去飽和酶在單一構(gòu)建本中組合在一起。將A-12去飽和酶 克隆入pESC-His的Gal I啟動子之下的MCSII的BamHI和Sail位 點(diǎn)中，同時將A-15去飽和酶克隆在同一構(gòu)建體的Gal 10啟動子之下 的MCSI的EcoRI和CIaI位點(diǎn)之間。逐步的克隆過程顯示在圖9中。新構(gòu)建體命名為PEH-BJ-D15-D12-CO,轉(zhuǎn)化入酵母中。PEH-BJ-D15-D12-CO構(gòu)建體的圖譜顯示在圖10中。
功能檢驗(yàn)已將攜帶兩種密碼子優(yōu)化去飽和酶的YPH501進(jìn)行與A-12去飽 和酶一樣的功能實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)。在重組酵母中生產(chǎn)18:2和18:3脂肪酸的 證據(jù)顯示在圖11中。由此，我們已經(jīng)能夠通過將A-12和A-15去飽和酶導(dǎo)入啤酒酵母 中來在酵母中生產(chǎn)ALA。將A-6去飽和酶導(dǎo)入酵母中SC-I的EST文庫的測序鑒定了 A-6去飽和酶，所述SC-I是一種 產(chǎn)生大量DHA的thraustochytrid。用以上篩選SC-I BAC文庫，隨后 對鑒定的BAC克隆進(jìn)行測序，鑒定出全長A-6去飽和酶。A6去飽和 酶的全長序列在SeqlD4中給出。對A-6去飽和酶序列進(jìn)行基序檢索來確證去飽和酶結(jié)構(gòu)域的存。 來自SC-I的A-6去飽和酶的基序檢索結(jié)果在圖12中給出。已對上面的序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化來在酵母中表達(dá)。密碼子取代 后的序列顯示在S叫IDNo5中。已經(jīng)將優(yōu)化的A-6去飽和酶克隆入pESC-Trp的BamHI和Sail 位點(diǎn)之間的Gall啟動子之下的MCSII位點(diǎn)中(PET-SC1-D6)。它已 在圖13中表示。已將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入攜帶A-12和A-15去飽和酶的重組酵母中。攜 帶A-12， A-15和A-6去飽和酶基因的啤酒酵母YPH501顯示在圖14 中。通過半乳糖誘導(dǎo)包含A-12, A-15和A-6去飽和酶的重組酵母。 在這些細(xì)胞中觀察SDA的生產(chǎn)。將延長酶導(dǎo)入酵母中已經(jīng)從Thraustochytrid SC—1的cDNA文庫中分離出延長酶。該 序列具有U19bp的ORF, 29堿基的5'UTR和234石咸基的3'UTR。 延長酶的序列在Seq ID 6中給出。該序列顯示與多種延長酶的同源性。使用結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示存在 KOG3072結(jié)構(gòu)域，它是存在于延長酶家族大多數(shù)成員中的基序。基
序檢索結(jié)果顯在圖15中。進(jìn)行延長酶的功能檢驗(yàn)，其中在用IPTG誘導(dǎo)之前和之后在DH10B 中由延長酶克隆提取脂肪酸。將提取的脂肪酸進(jìn)行酯化并將脂肪酸甲 基酯進(jìn)行GC-MS。結(jié)果顯示延長酶向脂肪酸中添加了 2C。序列已經(jīng)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化用于在酵母中進(jìn)行表達(dá)并在S叫ID 7 中表示。延長酶和A-6去飽和酶克隆在pESC-Trp中將徹底密碼子優(yōu)化的延長酶和A-6去飽和酶分別克隆在pESC-TRP載體的MCSI和MCSII位點(diǎn)中。顯示pESC載體中二基因的載 體圖譜在圖16中表示。已經(jīng)將該構(gòu)建體導(dǎo)入攜帶構(gòu)建體ESH-BJ-D15-D12-CO的酵母細(xì) 胞中。該構(gòu)建體在圖17中表示。已經(jīng)用半乳糖誘導(dǎo)稱作PEHT-12-15-6-El0的克隆。觀察到該克隆 產(chǎn)生Eicosatetraenoic acid。DPA的生產(chǎn):A-5去飽和酶導(dǎo)入酵母中△-3途徑的下一步驟是ETA轉(zhuǎn)化成EPA,由A-5去飽和酶催化。 已經(jīng)克隆并測序了來自P. tricornatum的A-5去飽和酶。去飽和酶的序 列在S叫ID 8中給出。已經(jīng)擴(kuò)增了這些去飽和酶的ORF并直接克隆入pEsc-Ura的EcoRI 和ClaI之間的MCSI位點(diǎn)中。構(gòu)建體的圖譜在圖18中表示。已經(jīng)將后者從攜帶A-12， A-15， A-6去飽和酶和延長酶的重組酵 母中穿梭出來。用半乳糖誘導(dǎo)攜帶所有這五種基因的酵母細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞產(chǎn)生 DPA。在圖19中表示。在酵母中生產(chǎn)DHA:已經(jīng)分離并克隆了來自Thraustochytrium sps 21685的A-4去々包和 酶。該基因的序列在SeqlD9中給出。在單一構(gòu)建體中克隆D4和D5去飽和酶
已經(jīng)將A-4去飽和酶克隆入Sal I和Bam HI之間的pESC-URA 的MCS II位點(diǎn)，所述pESC-URA在EcoRI和Cla I之間的MCSI位點(diǎn)中攜帶A-5去飽和酶。載體圖譜示意圖在圖20中給出。攜帶A-12, A-15, A-6, A-5〉 A-4和延長酶去飽和酶基因的啤酒 酵母YPH501在圖21中表示。用半乳糖誘導(dǎo)包含該途徑所有六種基因的重組酵母。在攜帶所有 6種基因的酵母中觀察到DHA的生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1. 通過轉(zhuǎn)化包含所有涉及脂肪酸生產(chǎn)的生物合成途徑的基因的質(zhì)粒而由重組酵母制備多不飽和脂肪酸，即二十二碳六烯酸(DHA)和 其它PUFA的方法。
2. 權(quán)利要求1的生產(chǎn)DHA的宿主細(xì)胞，其選自啤酒酵母或其 它油質(zhì)物種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的PUFA的生產(chǎn)方法，其中，編碼A-12去飽 和酶的核酸序列在SEQID 1中表示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)方法，其中，將權(quán)利要求3的核酸序 列導(dǎo)入酵母載體中并用于轉(zhuǎn)化入權(quán)利要求2的宿主細(xì)胞中。
5. 表達(dá)亞油酸的纟又利要求4的重組宿主細(xì)月包。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1的PUFA的生產(chǎn)方法，其中編碼A-15去飽和 酶的核酸序列在SEQ ID 3中表示。
7. 權(quán)利要求6的核酸序列，克隆入權(quán)利要求4的構(gòu)建體中，以 形成攜帶A-15和A-12去飽和酶的單一構(gòu)建體。
8. 生產(chǎn)a-亞麻酸的方法，其包括如下步驟a. 分離并優(yōu)化包含或與選自SEQ ID Nol和SEQ ID No3的核苷 酸序列的至少50%互補(bǔ)的核酸序列，b. 構(gòu)建包含步驟(a)的所述分離核苷酸序列的載體，c. 將步驟(b)的所述載體導(dǎo)入權(quán)利要求2的宿主細(xì)胞中，在一定 條件下持續(xù)一定時間，所述時間和條件足以表達(dá)由步驟(a)的所述核苷 酸序列編碼的a-亞麻酸。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1的PUFA的生產(chǎn)方法，其中，編碼A-6去飽 和酶的核酸序列在SEQ ID-5中表示。
10. 將根據(jù)權(quán)利要求9的核酸序列導(dǎo)入酵母載體中并用于轉(zhuǎn)化入 4又利要求2的宿主細(xì)胞中來表達(dá)steridonic acid。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1的PUFA的生產(chǎn)方法，其中編碼延長酶的核 酸序列在SEQ ID-7中表示。
12. 將根據(jù)權(quán)利要求11核酸序列，導(dǎo)入根據(jù)權(quán)利要求9的酵母載 體中以形成攜帶核酸序列SEQ ID-5和SEQ ID-7的單一構(gòu)建體。
13. 生產(chǎn)eicosatetranoic acid的方法，其包4舌^口下步驟a.分離并優(yōu)化包含或與選自SEQ ID 5和SEQ ID 7的核苷酸序列 的至少50%互補(bǔ)的核酸序列，b. 構(gòu)建包含步驟(a)的所述分離核苷酸序列的載體，c. 將權(quán)利要求10和13的步驟(b)的所述載體導(dǎo)入權(quán)利要求2的 宿主細(xì)胞中，在一定條件下持續(xù)一定時間，所述時間和條件足以生產(chǎn) 由步驟(a)的所述核脊酸序列編碼的eicosatetranoic acid。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1的PUFA的生產(chǎn)方法，其中，編碼A-4去飽 和酶的核酸序列由SEQ ID-8表示。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1的PUFA的生產(chǎn)方法，其中，將權(quán)利要求14 的核酸序列導(dǎo)入酵母載體中。
16. 將SEQ ID 9中表示的核酸序列導(dǎo)入根據(jù)權(quán)利要求15的載體中。
17. 生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法，其包括如下步驟a. 分離并優(yōu)化包含或與選自SEQ ID 8和SEQ ID 9的核普酸序列 的至少50%互補(bǔ)的核酸序列，b. 構(gòu)建包含步驟(a)的所述分離核苷酸序列的載體，c. 將權(quán)利要求10、 13和17的步驟(b)的所述載體導(dǎo)入權(quán)利要求 2的宿主細(xì)胞中，在一定條件下持續(xù)一定時間，所述時間和條件足以 生產(chǎn)由步驟(a)的所述核苷酸序列編碼的二十二碳六烯酸。
18. 包含權(quán)利要求9, 15和20的所述載體的權(quán)利要求2的宿主細(xì) 胞編碼生產(chǎn)功能活性DHA所需的全部酶。
19. 權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞，其中所述載體的核苷酸序列的表達(dá) 導(dǎo)致所述宿主細(xì)胞生產(chǎn)多不飽和脂肪酸，二十二碳六烯酸和其它 PUFA，而這些在所述宿主細(xì)胞的野生型中并不生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種特別新的通過潛在安全的重組生物釀酒酵母生產(chǎn)ω-3脂肪酸，二十二碳六烯酸的重組方法。本發(fā)明描述了通過一系列酶學(xué)轉(zhuǎn)化而進(jìn)行的油酸生物轉(zhuǎn)化成二十二碳六烯酸的過程，所述酶學(xué)轉(zhuǎn)化是通過將各種基因克隆入合適的載體和最終在宿主細(xì)胞酵母中表達(dá)而促進(jìn)的。
文檔編號C12P7/64GK101124330SQ200580048321
公開日2008年2月13日 申請日期2005年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月14日
發(fā)明者K·R·拉亞施里, M·V·帕特爾 申請人:阿維斯塔金格蘭技術(shù)有限公司