使用自我保護(hù)寡核苷酸調(diào)節(jié)基因表達(dá)的組合物和方法

專利名稱：使用自我保護(hù)寡核苷酸調(diào)節(jié)基因表達(dá)的組合物和方法
使用自我保護(hù)寡核苷酸調(diào)節(jié)基因表達(dá)的組合物和方法 發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般地涉及自我保護(hù)多核苷酸，和使用它們調(diào)節(jié)基因表達(dá) 和治療疾病的方法。相關(guān)技術(shù)的描述基因沉默或抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象蘊(yùn)含著治療和診斷目的，以及研 究基因功能本身的重大希望。這種現(xiàn)象的實(shí)例包括反義技術(shù)和轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)。近年來用于基因沉默的反義策略引起了極大關(guān)注。其基礎(chǔ)概念很 簡(jiǎn)單，原則上也很有效含靶RNA的反義核酸(M)堿基對(duì)導(dǎo)致失活。 反義RNA或DNA對(duì)耙RNA的識(shí)別可以認(rèn)為是一種雜交反應(yīng)。因?yàn)橥ㄟ^ 序列互補(bǔ)性結(jié)合該靶，這暗示反義M的適當(dāng)選擇應(yīng)確保高度特異性。 耙RNA的失活可以通過不同的途徑發(fā)生，這取決于反義NA Cf務(wù)飾或未 修飾的DNA或RNA)的性質(zhì)，和其中將要發(fā)生抑制的生物系統(tǒng)的性質(zhì)。然而，許多問題繼續(xù)存在于有效反義和PTGS技術(shù)的發(fā)展中。例如， DNA反義寡核苷酸僅顯示出短期有效性，并且所需劑量通常有毒性； 類似地，由于穩(wěn)定性問題，反義RNA的應(yīng)用也已證明是無效的。已經(jīng) 利用各種方法嘗試了通過降低核酸酶靈敏性來提高反義穩(wěn)定性。這些 方法包括修飾正常的磷酸二酯主鏈，例如使用硫代磷酸酯或甲基膦酸 酯；摻入2'-0Me-核苷酸，使用肽核酸(PM)和使用3'-末端帽，如3'-氨丙基修飾或3'-3'-末端鍵。然而，這些方法昂貴而且需要額外的步 驟。此外，非天然存在的核苷酸和修飾的使用妨礙了體內(nèi)表達(dá)反義序 列的能力，由此需要合成它們和之后給予。 因此，仍需要在體外和體內(nèi)靶向、定向抑制基因功能的有效和持 久的方法和組合物，尤其是在高等脊推動(dòng)物細(xì)胞中，包括穩(wěn)定性增加的改善的反義RNA。 發(fā)明概述本發(fā)明提供了新的組合物和方法，其包括對(duì)調(diào)節(jié)基因表達(dá)有用的 自我保護(hù)寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括分離的自我保護(hù)多核苷酸，包含 具有與靶mRNA序列互補(bǔ)的序列的區(qū)域和一個(gè)或多個(gè)自身互補(bǔ)區(qū)。在特定實(shí)施方案中，該寡核苷酸包含兩個(gè)或多個(gè)自身互補(bǔ)區(qū)。該自身互補(bǔ) 區(qū)可以位于多核苷酸的5'末端、3'末端或兩個(gè)末端。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸包括RNA、 DNA 或肽核酸。在另外的實(shí)施方案中，自我保護(hù)多核苷酸進(jìn)一步包含第二序列， 其與靶mRNA序列非互補(bǔ)或部分互補(bǔ)，和與自身互補(bǔ)區(qū)非互補(bǔ)，并且所 述第二序列位于自身互補(bǔ)區(qū)和與靼mRNA序列互補(bǔ)的序列之間。 在特定實(shí)施方案中，自身互補(bǔ)區(qū)包含莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。 在相關(guān)實(shí)施方案中，自身互補(bǔ)區(qū)不與和靶mRNA序列互補(bǔ)的序列互補(bǔ)。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，其中多核苷酸包含兩個(gè)自身互補(bǔ)區(qū)， 這兩個(gè)自身互補(bǔ)區(qū)彼此不互補(bǔ)。在特定實(shí)施方案中，與靶mRM序列互補(bǔ)的序列包含至少17個(gè)核 苷酸，或17至30個(gè)核苷酸。在其他實(shí)施方案中，自身互補(bǔ)區(qū)包含至少5個(gè)核苷酸、至少12 個(gè)核苷酸、至少24個(gè)核苷酸或12至48個(gè)核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)區(qū)包含至少1個(gè)核苷酸。在 其他實(shí)施方案中，該環(huán)區(qū)包含至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少 5個(gè)或至少6個(gè)核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括包含多重本發(fā)明的自我保護(hù)多 核苷酸的陣列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括能夠表達(dá)本發(fā)明的自我保護(hù)多 核苷酸的表達(dá)載體。在不同的實(shí)施方案中，該表達(dá)載體是組成型或誘 導(dǎo)型載體。本發(fā)明進(jìn)一步包括組合物，其包含生理學(xué)可接受的載體和本發(fā)明 的自我保護(hù)多核苷酸。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種降低基因表達(dá)的方法，包 括將本發(fā)明的自我保護(hù)寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞。在不同的實(shí)施方案中，該 細(xì)胞是植物、動(dòng)物、原生動(dòng)物、病毒、細(xì)菌或真菌的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí) 施方案中，該細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該多核苷酸被直接導(dǎo)入細(xì)胞，而在其他實(shí)施 方案中，該多核苷酸通過足以將分離的多核苷酸遞送入細(xì)胞的手段細(xì) 胞外導(dǎo)入細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種治療疾病的方法，包括將 本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞，其中靶基因的過量表達(dá)與該疾 病相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該疾病是癌癥。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種治療患者的感染的方法，包括將本發(fā)明 的自我保護(hù)多核苷酸導(dǎo)入患者，其中分離的多核苷酸介導(dǎo)感染物的進(jìn) 入、復(fù)制、整合、傳染或維持。在又一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種鑒定基因功能的方 法，包括將本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞，其中該多核苷酸抑 制該基因表達(dá)，和測(cè)定該多核苷酸的導(dǎo)入對(duì)細(xì)胞特征的影響，由此確 定靶基因的功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用高流通量篩選實(shí)施該方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種設(shè)計(jì)多核苷酸序列的方 法，所述序列包括一個(gè)或多個(gè)用于調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的自身互補(bǔ)區(qū)，所述方法包括(a)選擇長(zhǎng)度為17至30個(gè)核苷酸并且與靶基因互補(bǔ)的第 一序列；(b)選擇一個(gè)或多個(gè)長(zhǎng)度為12至48個(gè)核苷酸的附加序列，其 包含自身互補(bǔ)區(qū)且其與第一序列非互補(bǔ)；和(c)選擇一個(gè)或多個(gè)長(zhǎng)度為 2至12個(gè)核苷酸的另外的附加序列，其與靶基因非互補(bǔ)或自身互補(bǔ)，
且其與步驟(b)中選擇的附加序列非互補(bǔ)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸與缺乏所述一 個(gè)或多個(gè)自身互補(bǔ)區(qū)的相同多核苷酸相比，表現(xiàn)出體內(nèi)半衰期增加。在另一相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療疾病的方法(例如與突變mRNA或基因相關(guān)的疾病)，包括將自我保護(hù)多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞， 其中耙mRM與對(duì)應(yīng)的野生型mRNA相比包含一個(gè)或多個(gè)突變。在一個(gè) 具體實(shí)施方案中，該疾病是嚢性纖維化。類似地，在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種調(diào)節(jié)突變mRNA 在細(xì)胞中的表達(dá)的方法，包括將自我保護(hù)多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞，其中所 述粑RNA序列包含所述突變mRNA的區(qū)域。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該 突變mRNA與嚢性纖維化相關(guān)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該突變mRNA 是由編碼突變型嚢性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)(CFTR)多肽的基因表達(dá)的 mRNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該突變mRNA與肺瘤相關(guān)。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，該突變mRNA是由編碼突變型p53多肽的基因表達(dá)的mRNA。附圖簡(jiǎn)述

圖1提供了本發(fā)明示例性多核苷酸的圖。(A)表示包含與靶mRM 互補(bǔ)序列的區(qū)域；(B)表示自身互補(bǔ)區(qū)；(C)表示由自身互補(bǔ)區(qū)形成的 莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)區(qū)；和(D)表示包含與靶mRNA互補(bǔ)序列的區(qū)域和自身 互補(bǔ)區(qū)之間的缺口區(qū)。發(fā)明詳迷本發(fā)明提供了抑制靶基因在原核生物和真核生物體內(nèi)和體外表達(dá) 的新組合物和方法。本發(fā)明部分地基于令人驚奇的發(fā)現(xiàn)—進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)能夠 形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的自身互補(bǔ)區(qū)的反義寡核苷酸在抑制靶基因表達(dá)中更 穩(wěn)定和明顯更有效。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了有效抑制靶基 因體外或體內(nèi)表達(dá)的組合物。已知它們的有效性增加，本發(fā)明的組合 物可以以較低濃度遞送至細(xì)胞或受試者，伴隨著毒性降低。A.自我保護(hù)多核苷酸按照本發(fā)明，使用自我保護(hù)多核苷酸調(diào)節(jié)基因表達(dá)，其包含與由 靶基因表達(dá)的mRNA具有互補(bǔ)性的核苷酸序列，以及一個(gè)或多個(gè)自身互 補(bǔ)區(qū)。本文使用的自我保護(hù)多核苷酸是指分離的多核苷酸，其包含與 靼mRNA或基因序列區(qū)域互補(bǔ)的單鏈區(qū)，和一個(gè)或多個(gè)位于該多核苷酸 的5'或3'末端之一或兩個(gè)末端的自身互補(bǔ)區(qū)，該自身互補(bǔ)區(qū)能夠形成 雙鏈區(qū)，如莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。自我保護(hù)多核苷酸本文也稱為自我保護(hù)寡核苷 酸。本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸提供了令人驚奇的優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中的 多核苷酸抑制劑，包括反義RNA和RNA干擾分子的優(yōu)點(diǎn)，包括穩(wěn)定性 增加和有效性增加。在某些實(shí)施方案中，自我保護(hù)多核苷酸包含與靶基因互補(bǔ)的兩個(gè) 或多個(gè)序列區(qū)域。在特定實(shí)施方案中，這些區(qū)域與同一靶基因或mRM 互補(bǔ)，而在其他實(shí)施方案中，它們與兩個(gè)或多個(gè)不同的靶基因或mRNA 互補(bǔ)。因此，本發(fā)明包括自身互補(bǔ)多核苷酸，其包含與一個(gè)或多個(gè)靶 mRNA或基因互補(bǔ)的一系列序列。在特定實(shí)施方案中，這些序列被與靶在包含多重與靶基因或mRNA互補(bǔ)的序列的自我保護(hù)多核苷酸的其他 實(shí)施方案中，該自我保護(hù)多核苷酸在與靶基因互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)序列 區(qū)域的5'、 3'或兩個(gè)末端包含自身互補(bǔ)區(qū)。在一個(gè)特定實(shí)施方案中， 自我保護(hù)多核苷酸包含兩個(gè)或多個(gè)與一個(gè)或多個(gè)與靶基因互補(bǔ)的序列 區(qū)域，自身互補(bǔ)區(qū)位于與靶基因互補(bǔ)的每個(gè)區(qū)域的5'和3'末端。本文使用的術(shù)語"自身互補(bǔ)，，是指核苷酸序列，其中該核苷酸序 列的第一區(qū)域與它的第二區(qū)域結(jié)合形成A-T (U)和G-C雜交對(duì)。彼此 結(jié)合的核苷酸序列的這兩個(gè)區(qū)域可以相鄰或可以被其他核苷酸分隔 開。術(shù)語"非互補(bǔ)"表示在核苷酸的特定一段中，其內(nèi)部沒有核苷酸 與靶結(jié)合形成A-T (U)或G-C雜交。術(shù)語"部分互補(bǔ)"表示在一段核 苷酸中，有至少一個(gè)核苷酸對(duì)與靶結(jié)合形成A-T (U)或G-C雜交，但 是沒有足夠數(shù)量的互補(bǔ)核苷酸對(duì)在生理?xiàng)l件下維持這一段核苷酸內(nèi)的 結(jié)合。術(shù)語分離的是指一種物質(zhì)，其至少部分不含在該物質(zhì)的天然狀態(tài) 下正常伴隨該物質(zhì)的成分。分離意味著從原始來源或周圍環(huán)境中分離的程度。本文使用的分離的，例如與DNA相關(guān)的，是指基本上遠(yuǎn)離其 他編碼序列的多核苷酸，并且該DM分子不含大的無關(guān)編碼DNA部分， 如大的染色體片段或其他功能基因或多肽編碼區(qū)。當(dāng)然，這是指最初 分離的DNA分子，并且不排除隨后人工添加至該區(qū)段的基因或編碼區(qū)。在各種不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸包含RNA、 DNA或肽核酸，或這些類型分子的任何或全部的組合。此外，自我保 護(hù)多核苷酸可以包含修飾的核酸，或核酸的衍生物或類似物。核酸修飾的實(shí)例包括但不限于生物素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、將伯胺引 入多核苷酸的氨基修飾物、磷酸基、脫氧尿苷、離化核苷、硫代磷酸 酯、2'-0Me RNA類似物、嵌合RNA類似物、擺動(dòng)基團(tuán)和脫氧肌苷。本文使用的術(shù)語"類似物"是指保留與本文多核苷酸相同的結(jié)構(gòu) 和/或功能(例如與靶結(jié)合)的分子、化合物或組合物。類似物的實(shí)例包 括肽模擬物、肽核酸以及小的和大的有機(jī)或無機(jī)化合物。本文使用的術(shù)語"衍生物"或"變體"是指通過一個(gè)或多個(gè)核酸 缺失、添加、置換或側(cè)鏈修飾而不同于天然存在的多核苷酸(例如靶基 因序列)的多核普酸。在某些實(shí)施方案中，變體與靶基因序列的區(qū)域具 有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%序列同一性。 因此，例如，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的自我保護(hù)寡核苷酸包含與 靶基因序列的變體互補(bǔ)的區(qū)域。在所有情況下，本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸包含與靶基因或多核 苷酸序列(或其變體)的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域互補(bǔ)，并更優(yōu)選完全互補(bǔ)的序 列區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，與靶基因(或mRNA)互補(bǔ)的序列區(qū)域的選 擇基于對(duì)所選靶序列的分析和二級(jí)結(jié)構(gòu)的確定、Tra、結(jié)合能和相對(duì)穩(wěn) 定性。可以基于它們相對(duì)不能形成二聚體、發(fā)夾或其他二級(jí)結(jié)構(gòu)來選 擇這種序列，所述的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)降低或阻止與宿主細(xì)胞中乾mRNA的特 異性結(jié)合。非常優(yōu)選的mRNA靶區(qū)域包括在AUG翻譯起始密碼子處或其
附近的那些區(qū)域和基本上與該mRNA的5'區(qū)互補(bǔ)的那些序列。這些二 級(jí)結(jié)構(gòu)分析和耙位點(diǎn)選擇的考慮可以例如使用0LIG0引物分析軟件 v. 4和/或BLASTN 2. 0. 5算法軟件進(jìn)行(Altschul et al. ， Nucleic Acids Res. 1997， 25 (17): 3389-402)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過搜索靶mRNA轉(zhuǎn)錄序列中AA二核苷酸 序列的出現(xiàn)來選擇靶位點(diǎn)。每個(gè)AA二核苷酸序列與3'相鄰的大約19 個(gè)核苷酸相結(jié)合是潛在的siRNA耙位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，耙位點(diǎn) 優(yōu)先不位于5'和3'非翻譯區(qū)(UTR)內(nèi)或接近起始密碼子的區(qū)域內(nèi)(大 約75個(gè)堿基內(nèi))，因?yàn)榻Y(jié)合調(diào)節(jié)區(qū)的蛋白可能千擾多核苷酸的結(jié)合。 此外，潛在的耙位點(diǎn)可以與適當(dāng)?shù)幕蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)比較，如BLASTN 2. 0. 5,可從www. ncbi.nlm的NCBI服務(wù)器上獲得，和消除與其他編碼 序列具有顯著同源性的潛在靶序列。靼基因或mRNA可以是任何物種的，例如，包括植物、動(dòng)物(例如 哺乳動(dòng)物)、原生動(dòng)物、病毒、細(xì)菌或真菌的。如上指出，靶基因序列和自我保護(hù)多核苷酸的互補(bǔ)區(qū)可以彼此完 全互補(bǔ)，或它們可以未達(dá)完全互補(bǔ)，只要這些鏈可以在生理?xiàng)l件下彼 此雜交。本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸包含與靶mRNA或基因互補(bǔ)的區(qū)域，以及一個(gè)或多個(gè)自身互補(bǔ)區(qū)。此外，它們可以任選包含一個(gè)或多個(gè)位于 與靶mRM或基因互補(bǔ)的區(qū)域和自身互補(bǔ)區(qū)之間的缺口區(qū)。典型地，與靶mRNA或基因互補(bǔ)的區(qū)域的長(zhǎng)度為17至30個(gè)核苷酸， 包括這些范圍內(nèi)的整數(shù)值。這個(gè)區(qū)域的長(zhǎng)度可以為至少16個(gè)核苷酸、 長(zhǎng)度為至少17個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度為至少20個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度為至少24 個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度為16至24個(gè)核苷酸，或長(zhǎng)度為17至24個(gè)核苷酸， 包括這些范圍內(nèi)的任何整數(shù)值。典型地，自身互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度為14至30個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度為至少14 個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度為至少16個(gè)核苷酸或長(zhǎng)度為至少20個(gè)核苷酸，包括 這些范圍內(nèi)的任何整數(shù)值。在某些實(shí)施方案中，自身互補(bǔ)區(qū)位于該多 核苷酸的5'或3'末端。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)多核苷酸包含兩個(gè)自身 互補(bǔ)區(qū)時(shí)， 一個(gè)位于5'末端， 一個(gè)位于3'末端。在優(yōu)選實(shí)施方案中，自身互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度足以形成雙鏈結(jié)構(gòu)。在一 個(gè)實(shí)施方案中，自身互補(bǔ)區(qū)形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含自身互補(bǔ)序列 的雙鏈區(qū)和單鏈序列的環(huán)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，自身互補(bǔ)區(qū)的 一級(jí)序列包含被非互補(bǔ)或部分互補(bǔ)的附加序列分隔開的彼此互補(bǔ)的兩 個(gè)序列段。盡管不太理想，但在某些實(shí)施方案中附加序列可以互補(bǔ)。 附加序列形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)，并因此，必須足夠長(zhǎng)以促進(jìn)允許兩個(gè)互 補(bǔ)段彼此結(jié)合所需的折疊。在特定實(shí)施方案中，環(huán)序列包含至少3個(gè)、 至少4個(gè)、至少5個(gè)或至少6個(gè)堿基。在一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)序列包 含4個(gè)堿基。彼此互補(bǔ)的兩個(gè)序列段(在自身互補(bǔ)區(qū)內(nèi)；即莖區(qū))具有 足以在生理?xiàng)l件下彼此特異性雜交的長(zhǎng)度。在某些實(shí)施方案中，每一 段包含4至12個(gè)核苷酸；在其他實(shí)施方案中，每一段包含至少4個(gè)、 至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少8個(gè)或至少IO個(gè)核苷酸，或這些范圍內(nèi)的 任何整數(shù)值。在特定實(shí)施方案中，自身互補(bǔ)區(qū)包含至少4個(gè)互補(bǔ)核苷 酸的兩段，這兩段被至少4個(gè)核苷酸的環(huán)序列分隔開。此外，在優(yōu)選 實(shí)施方案中，當(dāng)自我保護(hù)多核苷酸包含兩個(gè)或多個(gè)自身互補(bǔ)區(qū)時(shí)，這 兩個(gè)區(qū)域彼此不互補(bǔ)。另外，在優(yōu)選實(shí)施方案中，自身互補(bǔ)區(qū)不和與 耙mRNA或基因互補(bǔ)的自我保護(hù)多核苷酸區(qū)域互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，任選的缺口區(qū)包含長(zhǎng)度至少為1個(gè)、至少為 2個(gè)、至少為3個(gè)或至少為4個(gè)的核苷酸，或長(zhǎng)度為1至6個(gè)的核苷 酸，包括落在這些范圍內(nèi)的任何整數(shù)值。在各種不同的實(shí)施方案中， 缺口區(qū)不與乾mRNA或基因互補(bǔ)，或它與耙mRNA或基因部分互補(bǔ)。在 一個(gè)實(shí)施方案中，缺口區(qū)不與自身互補(bǔ)區(qū)的莖區(qū)互補(bǔ)。在特定實(shí)施方案中，自身互補(bǔ)區(qū)具有適于自身互補(bǔ)區(qū)結(jié)合，例如 形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)參數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)由RM的自由能分析來動(dòng)態(tài)計(jì)算自身互補(bǔ) 區(qū)，然后與剩余"非自身互補(bǔ)區(qū)"或環(huán)區(qū)內(nèi)所含的能量相比，以確保 該能量組成足夠形成期望結(jié)構(gòu)，例如莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。通常，在確定莖-環(huán) 結(jié)構(gòu)的組成中，考慮mRNA靶向區(qū)的不同核苷酸序列，以確保形成該結(jié)
構(gòu)?？梢栽俅胃淖冏杂赡芙馕鍪剑越忉尯塑账岬念愋突蚴褂盟沫h(huán)境的pH。本領(lǐng)域可以獲得許多不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)程序，根據(jù)本發(fā)明 每一種都可以使用。RNA和DNA堿基的熱力學(xué)參數(shù)也可以公開獲得， 與耙序列選擇算法相結(jié)合，其中幾個(gè)是本領(lǐng)域可獲得的。在一個(gè)實(shí)施方案中，自我保護(hù)多核苷酸包含以下或由以下組成(a) 包含長(zhǎng)度為17至30個(gè)核苷酸(包括中間的任何整數(shù)值)的序列，其 與mRNA分子的至少一部分互補(bǔ)且在生理?xiàng)l件下能夠與其雜交；側(cè)翼是(b) 包含長(zhǎng)度為1至4個(gè)核苷酸的兩個(gè)缺口區(qū)，和(c)包含長(zhǎng)度為16 至24個(gè)核普酸(包括中間的任何整數(shù)值)的兩個(gè)自身互補(bǔ)序列。在一個(gè) 實(shí)施方案中，每個(gè)自身互補(bǔ)序列能夠形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，其中一個(gè)位于自 我保護(hù)多核苷酸的5'末端， 一個(gè)位于其3'末端。在某些實(shí)施方案中，自身互補(bǔ)區(qū)發(fā)揮作用抑制或降低自我保護(hù)寡 核苷酸在生理?xiàng)l件，如細(xì)胞內(nèi)的條件下降解。不希望受特定學(xué)說的束 縛，據(jù)信自身互補(bǔ)區(qū)采用的結(jié)構(gòu)使得多核苷酸比缺乏自身互補(bǔ)區(qū)的多 核普酸更耐核酸酶的降解。此外，自身互補(bǔ)區(qū)采用的結(jié)構(gòu)的存在被認(rèn) 為促進(jìn)細(xì)胞攝取和降低不良的副作用。因此，在各種不同的實(shí)施方案 中，如本文所述，自我保護(hù)多核苦酸與缺乏自身互補(bǔ)區(qū)的相同多核苷 酸相比，體內(nèi)半衰期增加。在各種不同的實(shí)施方案中，半衰期可以增 加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸與靶mRNA結(jié)合并 降低其表達(dá)。靶基因可以是已知的基因靶，或作為選擇，靶基因可以 是未知的，即，可以使用隨機(jī)序列。在某些實(shí)施方案中，靶mRNA水平 降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60°乂、 至少70%、至少75%、至少80%、至少90%或至少95°/4。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，靶基因表達(dá)(即mRNA表達(dá))的抑制水 平是至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或幾乎100%，由此細(xì)胞 或生物實(shí)際上將具有相當(dāng)于所謂的基因"敲除"的表型。然而，在一 些實(shí)施方案中，可能優(yōu)選僅達(dá)到部分抑制，使得表型相當(dāng)于所謂的基 因"敲減"。這種敲減基因表達(dá)的方法可以用于治療或用于研究(例如
產(chǎn)生疾病狀態(tài)模型、檢驗(yàn)基因功能、估計(jì)一種物質(zhì)是否作用于基因、 證實(shí)用于發(fā)現(xiàn)藥物的靶)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸的陣列，包括微 陣列。微陣列是用測(cè)微計(jì)測(cè)定其大小典型地在亳米范圍的微型裝置，用于實(shí)施化學(xué)和生物化學(xué)反應(yīng)，并且尤其適用于本發(fā)明的實(shí)施方案。 陣列可以通過微電子學(xué)和/或微組裝來構(gòu)建，使用半導(dǎo)體工業(yè)和/或生 物化學(xué)工業(yè)中基本上任何已知的和可利用的技術(shù)，只要這類技術(shù)適合 于多核苷酸序列的淀積和/或篩選且與之不矛盾。
本發(fā)明的微陣列尤其合乎高流通量分析多重自我保護(hù)多核苷酸的 需要。微陣列典型地被構(gòu)建具有包含本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸的離 散區(qū)域或斑點(diǎn)，每個(gè)斑點(diǎn)包含一個(gè)或多個(gè)自我保護(hù)多核苷酸，優(yōu)選在 陣列表面上可定位地點(diǎn)。本發(fā)明的陣列可以用本領(lǐng)域可利用的任何方法來制備。例如，可以使用Affymetrix開發(fā)的光定向化學(xué)合成方法 (參見美國(guó)專利5， 445， 934和5, 856, 174)，通過將固相光化學(xué)合成與 光刻制造技術(shù)相結(jié)合在芯片表面上合成生物分子。lncyte Pharmaceutical開發(fā)的化學(xué)淀積方法4吏用了用于定向淀積在芯片表 面上的預(yù)先合成的cDNA探針(參見例如美國(guó)專利5, 874, 554)。
在某些實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域廣泛利用的技術(shù)合成本發(fā)明的自 我保護(hù)多核苷酸。在其他實(shí)施方案中，使用適當(dāng)?shù)暮推毡橐阎募夹g(shù) 在體外或體內(nèi)表達(dá)它。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括包含本 發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸序列的體外和體內(nèi)表達(dá)載體。可以使用本領(lǐng) 域技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建含有編碼自我保護(hù)多核苷酸的序列，以及 適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外DNA重組 技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)基因重組。已經(jīng)描述了這類技術(shù)，例如Sambrook， J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview， N. Y. ， and Ausubel， F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wi ley & Sons, New York, N. Y中。
表達(dá)栽體典型地包括調(diào)節(jié)序列，其調(diào)節(jié)自我保護(hù)多核苷酸的表達(dá)。 表達(dá)載體中存在的調(diào)節(jié)序列包括載體的那些非翻譯區(qū)，例如，增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、5'和3'非翻譯區(qū)，它們與宿主細(xì)胞蛋白相互作用進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和 翻譯。這類元件在它們的強(qiáng)度和特異性方面可以有變化。根據(jù)使用的 載體系統(tǒng)和細(xì)胞，可以使用許多適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括組成型 和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。此外，也可以使用組織特異性或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。 對(duì)于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，通常優(yōu)選來自哺乳動(dòng)物基因或來自 哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子。此外，通常可利用許多基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。 例如，在使用腺病毒作為表達(dá)載體的情況下，編碼感興趣多肽的序列 可以連接入由晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)前導(dǎo)序列組成的腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯復(fù) 合物。插入病毒基因組的非必需El或E3區(qū)中可以用于獲得能夠在感 染宿主細(xì)胞中表達(dá)多肽的活病毒(Logan， J. and Shenk， T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81 : 3655-3659)。此外，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，如 魯斯氏肉瘤病毒(RSV)增強(qiáng)子，可以用來增加在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的 表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了自我保護(hù)多核苷酸的條件性表 達(dá)。本領(lǐng)域已知和可利用用于細(xì)胞和動(dòng)物的各種條件性表達(dá)系統(tǒng)，并 且本發(fā)明包括任何這類條件性表達(dá)系統(tǒng)調(diào)節(jié)自我保護(hù)多核苷酸的表達(dá) 或活性的用途。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，例如，使用REV-TET系 統(tǒng)實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)型表達(dá)。這個(gè)系統(tǒng)的成分和使用該系統(tǒng)控制基因表達(dá)的方 法已經(jīng)在文獻(xiàn)中詳細(xì)記載，并且表達(dá)四環(huán)素控制的反式激活蛋白(tTA) 或反向tTA (rtTA)的載體是市場(chǎng)上可買到的(例如pTet-0ff、 pTet-0n 和ptTA-2/3/4載體，Clontech， Palo Alto， CA)。已經(jīng)描述了這類 系統(tǒng)，例如美國(guó)專利5650298、 6271348、 5922927和相關(guān)專利，將 它們的全部?jī)?nèi)容引入作為參考。在一個(gè)特殊實(shí)施方案中，使用包含pSUPER栽體主鏈和相當(dāng)于待表 達(dá)的自我保護(hù)多核苷酸的附加序列的載體系統(tǒng)表達(dá)自我保護(hù)多核苷 ^。已經(jīng)表明pSUPER栽體系統(tǒng)對(duì)表達(dá)siRM反應(yīng)物和下調(diào)基因表達(dá)有 用(Br翻elkamp， TT. et al, ， Science 296: 550 (2002) and Br畫elkamp， T. R. et al.， Cancer Cell, 2002年8月22曰在線公
開發(fā)表)。PSUPER載體可從OligoEngine， Seattle, WA買到。 B.調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸可以用于各種目的，通常都與它們抑 制或降低靶基因表達(dá)的能力相關(guān)。因此，本發(fā)明提供了降低一個(gè)或多 個(gè)靶基因表達(dá)的方法，包括將本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸導(dǎo)入含有靶 基因或其同源物、變體或其直向同源物的細(xì)胞。此外，自我保護(hù)多核 苷酸可以用于間接降低表達(dá)。例如，自我保護(hù)多核苷酸可以用于降低 驅(qū)動(dòng)第二個(gè)基因表達(dá)的反式激活物的表達(dá)，由此降低笫二個(gè)基因的表 達(dá)。類似地，自我保護(hù)多核苷酸可以用于間接增加表達(dá)。例如，自我 保護(hù)多核苷酸可以用于降低抑制第二個(gè)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄阻遏物的表 達(dá)，由此增加第二個(gè)基因的表達(dá)。在各種不同的實(shí)施方案中，靶基因是來源于自我保護(hù)多核苷酸將 被導(dǎo)入的細(xì)胞的基因、內(nèi)源基因、外源基因、轉(zhuǎn)基因或病原體基因， 其存在于轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中。根據(jù)特定靶基因和遞送入細(xì)胞的自我保護(hù) 多核苷酸的量，本發(fā)明的方法可以引起靶基因表達(dá)的部分或完全抑制。 含有靶基因的細(xì)胞可以來源于或包含在任何生物(例如植物、動(dòng)物、原生動(dòng)物、病毒、細(xì)菌或真菌)中。靶基因表達(dá)的抑制可以通過以下手段來證實(shí)，包括但不限于使用 本發(fā)明領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的技術(shù)觀察或檢測(cè)耙基因所編碼的蛋白 質(zhì)，和/或來自靶基因的mRNA產(chǎn)物，和/或與基因表達(dá)有關(guān)的表型的水 平缺乏或可觀察到的降低?？杀粰z驗(yàn)以確定導(dǎo)入本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸所引起的作用的 細(xì)胞特征的實(shí)例包括細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、細(xì)胞周期特征、細(xì)胞分化和形 態(tài)。自我保護(hù)多核苷酸可以直接導(dǎo)入細(xì)胞(即細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入)，或細(xì)胞外 導(dǎo)入空腔、胞間隙、導(dǎo)入生物的循環(huán)系統(tǒng)、經(jīng)口導(dǎo)入，通過在含有自 我保護(hù)多核苷酸的溶液中浸浴生物，或通過足以將自我保護(hù)多核苷酸 遞送入細(xì)胞的一些其他手段。
此外，經(jīng)改造以表達(dá)自我保護(hù)多核苷酸的載體可以被導(dǎo)入細(xì)胞， 其中該載體表達(dá)自我保護(hù)多核苷酸，由此將它導(dǎo)入細(xì)胞。將表達(dá)載體 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域熟知的和可以利用的，包括例如轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、劃痕荷載(scrape-loading)、電穿孔、顯微注射、感染、基 因槍和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座。通常，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于載體類型和細(xì)胞類型， 和本領(lǐng)域可廣泛利用的教導(dǎo)容易確定將載體導(dǎo)入細(xì)胞的適宜方法?？?以通過本領(lǐng)域容易利用的各種方法，包括例如鼻吸入導(dǎo)入感染物質(zhì)。使用本發(fā)明的自我保護(hù)寡核苷酸抑制基因表達(dá)的方法可以與其他 敲減和敲除方法組合，例如基因?qū)ぐ小⒎戳xRNA、核酶、雙鏈RNA (例 如shRNA和siRNA)，以進(jìn)一步降低靶基因表達(dá)。在不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明的靶細(xì)胞是初級(jí)細(xì)胞、細(xì)胞系、無 限增殖細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞。耙細(xì)胞可以是體細(xì)胞或生殖細(xì)胞。靶細(xì)胞可 以是非分裂細(xì)胞，如神經(jīng)元，或它可能能夠在體外在合適的細(xì)胞培養(yǎng) 條件下增殖。靶細(xì)胞可以是正常細(xì)胞，或它們可以是病變細(xì)胞，包括 含有已知基因突變的細(xì)胞。本發(fā)明的真核靶細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞， 例如人細(xì)胞、鼠細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物細(xì)胞和靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施 方案中，本發(fā)明的靶細(xì)胞是干細(xì)胞，其包括例如胚胎干細(xì)胞，如鼠胚 胎干細(xì)胞。本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸和方法可以用于治療各種疾病或病癥 的任一種，包括但不限于炎癥性疾病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、 腫瘤、脫髓鞘病變、消化系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、生殖系統(tǒng)疾病、 血液和'淋巴疾病、免疫性疾病、精神疾病、肌肉骨骼疾病、神經(jīng)病學(xué) 疾病、神經(jīng)與肌肉疾病、代謝性疾病、性傳播疾病、皮膚和結(jié)締組織 疾病、泌尿系疾病和感染。在某些實(shí)施方案中，該方法在動(dòng)物上實(shí)施，在特定實(shí)施方案中， 在哺乳動(dòng)物上實(shí)施，并且在某些實(shí)施方案中，在人體上實(shí)施。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括使用自我保護(hù)寡核苷酸治 療或預(yù)防與基因失調(diào)、過量表達(dá)或突變相關(guān)的疾病的方法。例如，可 以將自我保護(hù)多核苷酸導(dǎo)入癌細(xì)胞或腫瘤，并由此抑制維持致癌/致腫 瘤表型所需的或與其相關(guān)的基因表達(dá)。為預(yù)防疾病或其他病變，可以 選擇例如疾病/病變開始或維持所需的靶基因。治療可以包括與該疾病 相關(guān)的任何癥狀或與該病變相關(guān)的臨床適應(yīng)癥的改善。此外，本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸用于治療與基因突變相關(guān)的疾 病或病癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，自我保護(hù)多核苷酸用于調(diào)節(jié)突變基因 或等位基因表達(dá)。在這類實(shí)施方案中，突變基因是自我保護(hù)多核苷酸 的靶，其可包含與突變基因區(qū)互補(bǔ)的區(qū)域。這個(gè)區(qū)域可以包括突變， 但是它不是必要的，因?yàn)橐部梢园邢蛟摶虻牧硪粋€(gè)區(qū)域，導(dǎo)致突變基因或mRM的表達(dá)降低。在某些實(shí)施方案中，這個(gè)區(qū)域包含突變，而 在相關(guān)實(shí)施方案中，所產(chǎn)生的自我保護(hù)寡核苷酸特異性抑制突變mRNA 或基因的表達(dá)，但不抑制野生型mRNA或基因的表達(dá)。這種自我保護(hù)多 核苷酸對(duì)例如一個(gè)等位基因突變而另一個(gè)沒有突變的情形尤其有效。 然而，在其他實(shí)施方案中，這個(gè)序列不一定包含突變，并因此可以只 包含野生型序列。這種自我保護(hù)多核苷酸對(duì)全部等位基因都突變的情 形尤其有效。本領(lǐng)域已知與基因突變相關(guān)的或由其引起的各種疾病和 病癥，本發(fā)明包括用自我保護(hù)多核苷酸治療任何這種疾病或病癥。例 如，在一個(gè)實(shí)施方案中，使用靶向嚢性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR) 基因的自我保護(hù)多核苷酸治療嚢性纖維化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使 用靶向p53基因或等位基因的自我保護(hù)多核苷酸治療癌癥。在某些實(shí) 施方案中，p53基因或等位基因是突變p53基因或等位基因。在某些實(shí)施方案中，乾向病原體基因進(jìn)行抑制。例如，該基因可 以直接引起宿主的免疫抑制或?qū)Σ≡w復(fù)制、病原體傳染或感染的維 持必不可少。此外，靶基因可以是病原體基因或負(fù)責(zé)病原體進(jìn)入其宿 主、被病原體或宿主藥鉤代謝、病原體基因組的復(fù)制或整合、宿主中 感染的建立或傳播或病原體下一代的裝配的宿主基因。預(yù)防(即預(yù)防 或降低感染危險(xiǎn))，以及降低與感染相關(guān)癥狀的出現(xiàn)率或嚴(yán)重性的方法 包括在本發(fā)明中。例如，處于被病原體感染的危險(xiǎn)之中的細(xì)胞或已經(jīng) 受感染的細(xì)胞，尤其是人類免疫缺陷性病毒(HIV)感染，可以通過導(dǎo)入 根據(jù)本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸而被靶向進(jìn)行治療.
在其他具體實(shí)施方案中，本發(fā)明用于治療任何類型的癌癥或開發(fā) 其治療方法?？梢允褂帽疚乃龇椒ㄖ委煹姆瘟鰧?shí)例包括但不限于神 經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨髄瘤、前列腺癌、小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、非 小細(xì)胞肺癌、腦腫瘤、乳腺癌、白血病、淋巴瘤等等。自我保護(hù)多核苷酸和表達(dá)載體(包括病毒載體和病毒)可以導(dǎo)入體 外或離體細(xì)胞，然后放入動(dòng)物進(jìn)行治療，或可以通過體內(nèi)給予將它們 直接導(dǎo)入患者。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基因治療的 方法。本發(fā)明的組合物可以以許多方式中的任何一種給予患者，包括 腸胃外、靜脈內(nèi)、全身、局部、口服、腫瘤內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、 吸入或任何這樣的遞送方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物腸胃外給 予，即，關(guān)節(jié)內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌內(nèi)給予。在一個(gè)具體實(shí) 施方案中，脂質(zhì)體組合物通過靜脈內(nèi)輸注給予或通過快速濃注腹膜內(nèi) 給予。本發(fā)明的組合物可以被配制為適于遞送給受試者的藥物組合物。 本發(fā)明的藥物組合物常常會(huì)進(jìn)一步包含一種或多種緩沖液(例如中性 緩沖鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水)、糖類(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、右 旋糖或右旋糖酐)、甘露糖醇、蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化劑、抑菌劑、螯合劑如EDTA或谷胱甘肽、助劑(例如氫氧化鋁)、使 該制劑與受體血液等滲、低滲或弱高滲的溶質(zhì)、懸浮劑、增稠劑和/ 或防腐劑。作為選擇，本發(fā)明的組合物可以被配制成凍干劑。醫(yī)師基于各種因素，例如，包括疾病和由所用載體表達(dá)的自我保 護(hù)寡核苷酸(在給予載體的情況下)水平，可以容易地確定給予患者的 自我保護(hù)寡核苷酸的量。典型地選擇每一劑給予的量高于最低治療劑 量但是低于中毒劑量。每劑的量的選擇將取決于很多因素，如患者的 病史、其他療法的使用和疾病的性質(zhì)。此外，給予的量在治療的始終 都可以進(jìn)行調(diào)節(jié)，這取決于患者對(duì)治療的反應(yīng)和任何治療相關(guān)副作用 的存在或嚴(yán)重程度。本發(fā)明進(jìn)一步包括鑒定基因在生物中的功能的方法，包括使用自 我保護(hù)多核苷酸抑制以前功能未知的靶基因的活性。代替通過傳統(tǒng)的 基因篩選耗時(shí)費(fèi)力地分離突變體，功能基因組學(xué)預(yù)想通過利用本發(fā)明 確定未表征基因的功能，以減少靶基因活性的量和/或改變其時(shí)限。本 發(fā)明可以用于確定用于制藥學(xué)的潛在靶、了解與發(fā)育相關(guān)的正常和病 理事件、確定負(fù)責(zé)出生后發(fā)育/衰老的信號(hào)傳導(dǎo)途徑等等。從基因組和 表達(dá)的基因來源獲得核苷酸序列信息，包括酵母、黑腹果蠅和C.e/ew/^基因組的總序列的不斷增長(zhǎng)的速度可以與本發(fā)明結(jié)合以確定 基因在生物(例如線蟲)中的功能。不同生物使用特定密碼子的偏好、 檢索相關(guān)基因產(chǎn)物的序列數(shù)據(jù)庫(kù)、將遺傳性狀的連鎖圖與核苷酸序列 源自其的物理圖鐠聯(lián)系起來和人工智能方法可以用于定義由按照這類 測(cè)序方案獲得的核苷酸推定的可讀框。在一個(gè)實(shí)施方案中，自我保護(hù)寡核苷酸用于抑制基因表達(dá)，基于 可從表達(dá)序列標(biāo)記(EST)獲得的部分序列，例如為了確定該基因的功能 或生物活性。生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝、抗病性或其他生物過程的功能改變 將表明EST的基因產(chǎn)物的正常功能。自我保護(hù)多核苷酸可以被導(dǎo)入含有靶基因的完整細(xì)胞/生物的容 易性使得本發(fā)明能被用于高流通量篩選(HTS)。例如，含有能夠抑制不微量滴定板上的各個(gè)孔中，可以測(cè)定每孔中完整細(xì)胞/生物由于靼基因 活性的抑制而引起的性能或發(fā)育上的任何變化或改變。當(dāng)基因活性被 抑制時(shí)，可以從靶基因?qū)?xì)胞/生物所具有的影響來測(cè)定乾基因的功 能。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸用于化學(xué)基因組 (chemocogenomic)篩選，即，4吏用本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸測(cè)試 化合物逆轉(zhuǎn)通過降低基因表達(dá)建立模型的疾病的能力。如果通過RFLP或QTL分析確定一種生物的特征與多態(tài)性在遺傳上 相關(guān)聯(lián)，則本發(fā)明可用于了解該遺傳多態(tài)性是否可能直接負(fù)責(zé)該特征。 例如，可以擴(kuò)增限定這種遺傳多態(tài)性的片段或在該遺傳多態(tài)性附近的 序列以產(chǎn)生RNA，自我保護(hù)多核苷酸可以導(dǎo)入生物，并且可以確定該 特征的改變是否與抑制相關(guān)。本發(fā)明也可有效允許抑制必需基因。這類基因可能是僅在特定發(fā) 育階段或細(xì)胞區(qū)室中的細(xì)胞或生物生存力所需的。當(dāng)乾基因不是生存 力所需的時(shí)候或情況下，通過抑制靶基因的活性可以產(chǎn)生條件突變的 功能等同物。本發(fā)明允許在生物的特定發(fā)育時(shí)期和位置添加自我保護(hù) 多核苷酸，同時(shí)不將永久突變導(dǎo)入靶基因組。同樣，本發(fā)明包括僅在 需要時(shí)表達(dá)自我保護(hù)多核苷酸的誘導(dǎo)型或條件型載體的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及證實(shí)基因產(chǎn)物是否是藥物發(fā)現(xiàn)或研制的靼的方法。將靶向相當(dāng)于用于降解的基因的mRNA的自我保護(hù)多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞 或生物。將細(xì)胞或生物維持在發(fā)生mRNA降解的條件下，導(dǎo)致基因表達(dá) 降低。確定基因表達(dá)降低是否對(duì)細(xì)胞或生物具有影響。如果基因表達(dá) 降低具有影響，則該基因產(chǎn)物是藥物發(fā)現(xiàn)或研制的耙。C.設(shè)計(jì)和生產(chǎn)自我保護(hù)多核苷酸的方法本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸包含一組新的和獨(dú)特的功能序列，該 序列以使其采用含有一個(gè)或多個(gè)雙鏈區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(典型地是莖-環(huán)結(jié) 構(gòu))的方式排列，其賦予自我保護(hù)多核苷酸的優(yōu)點(diǎn)。因此，在某些實(shí)施 方案中，本發(fā)明包括設(shè)計(jì)本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸的方法。這類方 法典型地包括適當(dāng)選擇自我保護(hù)多核苷酸的不同序列成分。在一個(gè)實(shí)施方案中，自我保護(hù)多核苷酸的基本設(shè)計(jì)如下設(shè)計(jì)基序(莖A)(環(huán)A)(莖B) (X)(乾)00 (莖C)(環(huán)B)(莖D) X-任選的間隔區(qū)因此，在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，自我保護(hù)多核苷酸設(shè)計(jì)如下a. 從靶核苷酸序列開始。長(zhǎng)度和組成規(guī)定所有莖和環(huán)區(qū)的長(zhǎng)度和 序列組成。b. 莖A & D可能需要對(duì)于酶相容性的特異性核苷酸。c. 建立具有(4-12)個(gè)核苷酸的候選莖A & B，其具有主導(dǎo)等長(zhǎng)耙 區(qū)域的解鏈溫度。莖鏈彼此具有A-T、 G-C互補(bǔ)性。d. 建立具有(4-12)個(gè)核苷酸的候選莖C & D，其具有主導(dǎo)等長(zhǎng)乾 區(qū)域的解鏈溫度。莖鏈彼此具有A-T、 G-C互補(bǔ)性，但是沒有與莖Aft
B的互補(bǔ)性。e. 建立具有(4-8)個(gè)富含A-T核苷酸的環(huán)候選者成為環(huán)A & B。f. 形成每個(gè)基序候選者的鄰接序列。g. 使用軟件以期望參數(shù)折疊候選序列。h. 根據(jù)輸出數(shù)據(jù)，定位具有單鏈靶區(qū)域的結(jié)構(gòu)，其側(cè)接于期望莖 /環(huán)結(jié)構(gòu)的任一個(gè)或兩個(gè)末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)包含一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的自身 互補(bǔ)區(qū)的多核苷酸序列(即自我保護(hù)多核苷酸)的方法包括(a)選擇長(zhǎng) 度為17至30個(gè)核苷酸并且與靶基因互補(bǔ)的第一序列；和(b)選擇一個(gè) 或多個(gè)長(zhǎng)度為12至48個(gè)核苷酸的附加序列，其包含自身互補(bǔ)區(qū)并且 與第一序列非互補(bǔ)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括(c)選擇 一個(gè)或多個(gè)長(zhǎng)度為2至12個(gè)核苷酸的另外的附加序列，其與靶基因非 互補(bǔ)或部分互補(bǔ)并且其與步驟(b)中選擇的附加序列非互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，這些方法包括確定或預(yù)測(cè)步驟(b)中所選序列 采用的二級(jí)結(jié)構(gòu)，例如為了確定它們能夠采用莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。同樣，這些方法可以包括驗(yàn)證步驟，其包含測(cè)試設(shè)計(jì)的多核苷酸 序列抑制靶基因表達(dá)的能力，例如在體內(nèi)或體外測(cè)試系統(tǒng)中。本發(fā)明進(jìn)一步包括計(jì)算機(jī)程序基于本文描述的互補(bǔ)特征來選擇自 我保護(hù)多核苷酸序列的應(yīng)用。因此本發(fā)明提供了欲用于選擇自我保護(hù) 多核苷酸序列的計(jì)算機(jī)軟件程序，和包含所述軟件程序的計(jì)算機(jī)可讀 介質(zhì)，以及含有本發(fā)明的程序之一的計(jì)算機(jī)。在某些實(shí)施方案中，用戶提供具有關(guān)于靶基因的序列、位置或名 稱的信息的計(jì)算機(jī)。該計(jì)算機(jī)在本發(fā)明的程序中使用這個(gè)輸入信息鑒 定一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)?shù)陌谢騾^(qū)域，和輸出或提供用在本發(fā)明的自我保 護(hù)多核苷酸中的互補(bǔ)序列。然后該計(jì)算機(jī)程序使用這個(gè)序列信息選擇 自我保護(hù)多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)自身互補(bǔ)區(qū)的序列。典型地，該程序 將選擇不與基因組序列，包括靶基因，或和靶mRNA互補(bǔ)的自我保護(hù)多 核苷酸的區(qū)域互補(bǔ)的序列。此外，該程序?qū)⑦x擇彼此不互補(bǔ)的自身互 補(bǔ)區(qū)序列。當(dāng)需要時(shí)，該程序還提供缺口區(qū)的序列。在選擇適當(dāng)序列
時(shí)，該計(jì)算機(jī)程序給用戶輸出或提供這個(gè)信息。本發(fā)明的程序可以進(jìn)一步使用關(guān)于含有靶基因的生物之基因組序 列的輸入信息，例如公共或?qū)Ｓ脭?shù)據(jù)庫(kù)，以及預(yù)測(cè)特定序列的二級(jí)結(jié) 構(gòu)和/或雜交特征的另外的程序，以便確保自我保護(hù)多核苷酸采用正確 的二級(jí)結(jié)構(gòu)并且不與非靶基因雜交。本發(fā)明部分地基于令人驚奇的發(fā)現(xiàn)-本文描述的自我保護(hù)多核苷 酸在降低靶基因表達(dá)中極其有效。該自我保護(hù)多核苷酸提供優(yōu)于以前描述的反義RNA的顯著優(yōu)點(diǎn)，包括穩(wěn)定性增加或?qū)嗣傅目剐栽黾樱?和有效性增加。此外，本發(fā)明的自我保護(hù)多核苷酸提供優(yōu)于用于siRNA 的傳統(tǒng)dsRNA分子的另外的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樽晕冶Ｗo(hù)多核苷酸的使用基本 上消除了與dsRNA分子相關(guān)的偏離靶的抑制。本發(fā)明的實(shí)施將使用各種細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)和 重組DNA的常規(guī)技術(shù)，它們?cè)诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍之內(nèi)。文獻(xiàn) 中充分描述了這類技術(shù)。參見例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.， ed. by Sambrook， Fritsch， and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); 和DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985)。實(shí)施例1靶向GL2自我保護(hù)多核苷酸的pSUPER表達(dá)載體的設(shè)計(jì)和制備使用pSUPER載體主鏈根據(jù)下列設(shè)計(jì)參數(shù)制備命名為GL2-1289 pSUPER、 GL2-0209 pSUPER和GL2-1532 pSUPER的表達(dá)載體，其表達(dá) 乾向GL2 mRM的自我保護(hù)多核苷酸。"5'-3'non-coding"是指質(zhì)粒 中的非編碼DNA鏈；"5'-3'RNA-trans"是指從質(zhì)粒表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄 物；"5'-3' RNA-struct"是指從質(zhì)粒表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物的折疊結(jié)構(gòu)； 而"3'-5' coding-as"是指質(zhì)粒中的編碼DNA鏈。1. GL2-1289 pSUPER的spDNA設(shè)計(jì)邏輯
5'-3' non-coding- GATCCGCT CAAGA AGCGGATC GTCAACTATGAAG AAGTGT AAACCTCAAT AGGTTTTTA卿ID NO: 1)5'-3' RNA-trans.= GAUCCGCU CAAGA AGCGGAUC GUCAACUAUGAAG AAGUGU AAACCUCAAU AGGUUU (SEQ ID NO: 2)5'-3' RNA-stmct=((((((((……))))))))................((((((.…))))))(-16.90)3,-5/ coding-as = GGCGA GTTCT TCGCCTAGCAGTTGATACTTCTTCACA TTTGGA GTTA TCCAAAAATTCGA (SEQ ID NO: 3)2. GL2-0209 pSUPER的spDNA設(shè)計(jì)邏輯5,-3/ non-coding- GATCCGCT CAAGA AGCGGATC TGGGCTCAATACAAA TCAC AAACCT CAAT AGGTTTTTA (SEQ ID NO:4)5'-3' RNA-trans.- GAUCCGCU CAAGA AGCGGAUC UGGGCUCAAUACAA AUCAC AAACCU CAAU AGGUUU (SEQ ID NO:5)5'-3' RNA-Struct=((((((((……))))))))...............((((((....))))))(-16.50)3, -5' coding扁as = GGCGA GTTCT TCGCCTAG ACCCGAGTTATGTTTAGTG TTTGGA GTTATCCAAAAATTCGA (SEQ ID NO: 6)3. GL2-1532 pSUPER的spDM設(shè)計(jì)邏輯5,-3' non-coding- GATCCGCT CAAGA AGCGGATCCACAACTCCTCCGCGCAAC AAACCT CAAT AGGTTTTTA (SEQ ID NO: 7)S^S' RNA-trans. = GAUCCGCU CAAGA AGCGGAUC CACAACUCCUCC GCGCAAC AAACCU CAAU AGGUUU (SEQ ID NO:8)5'-3' RNA-struct- ((((((((……))))))))...............((((((….))))))(-16.10)3W coding誦as = GGCGA GTTCT TCGCCTAGGTGTTGAGGAGGCGCGTTG TTTGGA GTTATCCAAAAATTCGA (SEQ ID NO: 9)
使用下列寡核苷酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增亞克隆入pSuper載體的GL2 基因的區(qū)域spDNA19一GL2-1289:GATCCGCTCAAGAAGCGGATCGTCAACTATGAAGAAGTGTAA ACCTCAATAGGTTTTTA (SEQ ID NO: 10) spDNA19一GL2-1289-As:AGCTTAAAAACCTATTGAGGTTTACACTTCTTCATAGTTGACG ATCCGCTTCTTGAGCGG (SEQ ID NO:11) spDNA19一GL2-0209:GATCCGCTCAAGAAGCGGATCTGGGCTCAATACAAATCACAA ACCTCAATAGGTTTTTA (SEQ ID NO: 12) sp腿19-GL2-0209一As:AGCTTAAAAACCTATTGAGGTTTGTGATTTGTATTGAGCCCAG ATCCGCTTCTTGAGCGG (SEQ ID NO: 13) spDNA19-GL2-1532:GATCCGCTCAAGAAGCGGATCCACAACTCCTCCGCGCAACA AACCTCAATAGGTTTTTA (SEQ ID NO:14) spDM19一GL2-1532一As:AGCTTAAAAACCTATTGAGGTTTGTTGCGCGGAGGAGTTGTG GATCCGCTTCTTGAGCGG (SEQ ID NO: 15).使用普通分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)將擴(kuò)增的序列亞克隆入 pSuper載體(PCT
發(fā)明者托德·M·豪澤, 阿龍·盧米斯 申請(qǐng)人:托德·M·豪澤;阿龍·盧米斯