專利名稱：：一種提高有機(jī)酸產(chǎn)量的重組微生物的制作方法一種提高有機(jī)酸產(chǎn)量的重組微生物美國政府支持聲明本發(fā)明是在美國能源部資助的No.DE-FC36-02G012001合作協(xié)議的支持下完成。美國政府對本發(fā)明具有一定的權(quán)力。相關(guān)申請的交叉引用本申請根據(jù)35U.S.C.§119(e)，要求于2005年1月26日提交的美國分案申請第60/647，141號和于2004年12月22日提交的美國分案申請第60/639,443號中的利益，前述專利申請通過全部引用并入本發(fā)明。
背景技術(shù)：
：許多目前源于石油化學(xué)材料的化學(xué)品都可以從天然碳水化合物制備而來。特別是有可能成為高容量日用化學(xué)品的琥珀酸，一種四碳二羧酸，琥珀酸可以作為商業(yè)工藝過程的起始材料，用于產(chǎn)生消費(fèi)用品工業(yè)上許多重要的中間體和精細(xì)化工材料。并且這些日用化學(xué)品目前依靠于來源于非可再生石油化工材料的源材料。例如，作為日用化學(xué)品的琥珀酸可以代替石油化工起始材料，用于制備1,4-丁二醇(BD0)和四氫呋喃(THF)化合物，而1,4-丁二醇(BD0)和四氫呋喃(THF)是許多工業(yè)中有用的溶劑和起始材料。例如，1,4-丁二醇(BD0)和四氫呋喃(THF)化合物用于生產(chǎn)汽車車身用樹脂，家用電器用熱塑材料和紡織業(yè)中萊卡等的彈性聚合物。此外，1，4-丁二醇(BD0)和四氫呋喃(THF)化合物在農(nóng)業(yè)化工和制藥工業(yè)中還有許多特殊的用途。值得注意的是，BD0的世界消費(fèi)量正以每年4X的速度增長。目前，用于生產(chǎn)BDO和THF的石油化學(xué)品包括乙炔、甲醛、丁垸、丁二烯和環(huán)氧丙垸。所有這些原料都具有各種不同的缺點(diǎn)，如極度易燃性、化學(xué)不穩(wěn)定性和毒性。而且，由于這些材料都是來源于石油，會使不可再生資源耗盡。他們的處理或者破壞，最終會向大氣中釋放碳(以二氧化碳的形式)。因此，研制琥珀酸替代石油化工源原料可以減少有害原料的處理和儲藏，提高工業(yè)和社區(qū)安全性，減少污染和環(huán)境成本，并減少對石油的依賴性。通過糖發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸和其他有機(jī)化合物是一種經(jīng)濟(jì)可行的方法，許多微生物已經(jīng)被用于以谷物糖作為碳源生產(chǎn)琥珀酸。這樣，開發(fā)琥珀酸作為石油化工起始原料的替代品，將擴(kuò)大那些可以提供發(fā)酵糖的谷物、其他農(nóng)產(chǎn)品和/或生物量的市場。正式地講，制備琥珀酸的生物化學(xué)途徑就是向三碳化合物磷酸烯醇式丙酮酸鹽(PEP)上添加一個二氧化碳分子，產(chǎn)生四碳化合物草酰乙酸鹽(OAA)。產(chǎn)生琥珀酸途徑中的下一個步驟是反三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))的一部分，包括兩個專性還原步驟。在從OAA到琥珀酸鹽的生化工藝中，OAA必須首先被還原產(chǎn)生L一蘋果酸鹽，L一蘋果酸鹽然后脫水產(chǎn)生延胡索酸鹽和水。然后，延胡索酸鹽被還原產(chǎn)生琥珀酸。在化學(xué)技術(shù)中，"還原"是指向化合物添加氫分子。通常來講，自由分子氫在細(xì)胞內(nèi)生物系統(tǒng)中未發(fā)現(xiàn)存在。因此，還原反應(yīng)是通過輔酶作為氫的生物化學(xué)等效物(即，作為分子氫的載體)來實(shí)現(xiàn)的，術(shù)語表述為"還原當(dāng)量"。還原當(dāng)量包括輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)、還原型黃素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)和還原型黃素單核苷酸(FMNH)。一般情況下，在一些微生物中，NADH和NADPH可以在吡啶二核苷酸轉(zhuǎn)氫酶作用下相互轉(zhuǎn)化。將OAA轉(zhuǎn)化為琥珀酸鹽的還原當(dāng)量通過NAD(P)K，F(xiàn)ADH2，或者其他輔助因子提供。在OAA轉(zhuǎn)化為琥珀酸鹽的反應(yīng)中，必須保證足夠量的還原當(dāng)量。如果沒有足夠量的還原當(dāng)量，生物化學(xué)途徑就不會有效地進(jìn)行，僅會有一部分0AA被轉(zhuǎn)化為所需的琥珀酸鹽。還原當(dāng)量在很多常見于細(xì)胞代謝的生物過程中都可以產(chǎn)生。例如，戊糖磷酸循環(huán)(PPC)過程中可以產(chǎn)生還原當(dāng)量。在戊糖磷酸循環(huán)過程中，葡萄糖一6—磷酸在葡萄糖一6—磷酸脫氫酶的作用下，被轉(zhuǎn)化為D—6—磷酸一葡萄糖酸-S-內(nèi)酯，葡萄糖一6—磷酸脫氫酶也稱間酶或者Zwf。NADP作為轉(zhuǎn)化反應(yīng)的一部分，被轉(zhuǎn)化為NADPH，作為還原當(dāng)量的受體。很少的微生物被發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)生足夠濃度的琥珀酸，而用于商業(yè)生產(chǎn)。其中一個微生物是Jc"7oZ^ci〃ws^/c"'加^ves，一種可以從牛瘤胃中分離出來的兼性厭氧微生物。這種微生物可以產(chǎn)生高濃度的琥珀酸，并可以耐受高濃度糖。v4c"'加^9cj77"ss"cci/70ge;7es是研究的最清楚的琥珀酸生產(chǎn)菌株之一，但是其該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物因為缺乏還原當(dāng)量而受限。因此，提高發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的產(chǎn)量，包括采用改進(jìn)的產(chǎn)生琥珀酸的微生物菌株是人們所殷切希望的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生有機(jī)酸的重組微生物。所述的重組微生物表達(dá)具有一個或者多個生物化學(xué)酶活性的多肽，該生物化學(xué)酶用于戊糖磷酸循環(huán)中。一個實(shí)施例中，該酶是葡萄糖一6磷酸一1一脫氫酶，也稱間酶或者Zwf。例如，重組微生物可以表達(dá)編碼具有Zwf酶活性的多肽的多核苷酸。另一個實(shí)施例中，重組微生物是一種通過DNA分子轉(zhuǎn)化后，表達(dá)具有Zwf酶活性的多肽的琥珀酸生產(chǎn)微生物的重組菌株。典型的重組微生物可以產(chǎn)生適合商業(yè)生產(chǎn)用的一定水平的一種或者多種有機(jī)酸。一些實(shí)施例中，重組微生物是一種可以產(chǎn)生琥珀酸的微生物。例如，該微生物可以產(chǎn)生適合商業(yè)生產(chǎn)用的濃度的琥珀酸。適合商業(yè)生產(chǎn)用的濃度可以至少約20g/L，40g/L，60g/L，80g/L，100g/L，120g/L和/或者140g/L。期望地，重組微生物能產(chǎn)生濃度約為50g/L到130g/L的琥珀酸。重組微生物可以是經(jīng)篩選和/或重組工程后，耐受相對高濃度的琥珀酸，這樣可以便于發(fā)酵系統(tǒng)中產(chǎn)生適合商業(yè)生產(chǎn)用濃度的琥珀酸。一些實(shí)施例中，重組微生物可以是經(jīng)篩選后，產(chǎn)生相對低的不希望的副產(chǎn)物，如乙酸鹽、甲酸鹽和/或丙酮酸鹽(例如不超過約2.0g/L乙酸鹽，不超過約2.0g/L甲酸鹽，和/或不超過約3.0g/L丙酮酸鹽)。該重組微生物可以是抗一定濃度的氟乙酸鈉的菌株衍生而來的(或其突變菌株)，能抵抗至少約lg/L，2g/L，4g/L,和/或8g/L。另一個實(shí)施例中，重組微生物的突變菌株可以是篩選出來的，抗一定濃度的，至少約lg/L，2g/L，4g/L，和/或8g/L的氟乙酸鈉。一個實(shí)方包例中，重纟且微生物存f生于爿ctJ'/7。Z^cj72〃ss〃ccj7o《eyes菌株(例如"As^cci/7c^e/es1，，)，或與爿c"/oZacyj^ws15Y/ccj'/c^e/es1近似種的微生物。一個合適的A^ccj'/7^^77m菌株是美國典型微生物菌種保藏中心(ATCC)保藏的細(xì)菌130Z，ATCC保藏號為55618。見美國5，504，004中描述的細(xì)菌130Z和其他合適菌株。其他合適微生物可選來制備重組微生物，可以包括經(jīng)16SrRNA序列相同性鑒定的與Awccj'/7c^e/7es近似的微生物。例如，一個合適的As〃cci/70g朋es近似微生物可以是其16SrRNA序列與As〃cci/70ge/7es的16SrRNA實(shí)質(zhì)序列相同(即，與Awcc^7^e/7es的16SrRNA至少約90X的序列相同，或者更合適的是，與Awcci/7^e77es的16SrRNA至少約95%的序列相同的微生物)。許多巴斯德菌科家族的代表性微生物的16SrRNA與As〃ccj'/7o《e/es的16SrRNA至少約90%的序列相同。例如，見Guettleretal.，INT，LJ.SYSTEMATICBACT.(1999),49，207-216，209頁表2。合適的微生物可以包括例如BisgaardTaxon6和BisgaardTaxon10的微生物?！?shí)施例中，重組微生物可以由除了As"cci/70ge/7es以外的生物制備而來。例如，重組微生物可以由任何適于在發(fā)酵系統(tǒng)中產(chǎn)生有機(jī)酸的微生物制備而來。合適的微生物可以包括大腸桿菌(￡co")。合適的￡h'菌株是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。抗氟乙酸鈉的微生物突變菌株也可以適于制備重組微生物。例如，見U.S.5，521，075和U.S.5,573,931。一個實(shí)施例中，重組微生物由As〃cci/c^e/es的——個突變株制備而來，lt匕As〃cci/7t^e/7es的一個突變株能抗至少約lg/L氟乙酸鈉。一個合適的突變菌株是FZ45，見U.S.5，573，931。保藏在ATCC，保藏號為PTA-6255的重組菌株，是來源于A幼cc^o《e77es的一個突變株，能抗至少約lg/L氟乙酸鈉(即FZ45)。重組微生物典型地可以編碼用于戊糖磷酸循環(huán)的具有一個或多個酶生化活性的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化而來。例如，重組微生物可以是編碼具有一個或多個Zwf酶(即，葡萄糖一6—磷酸脫氫酶活性和/或NADP還原酶活性)生化活性的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化而來。優(yōu)選地，該多核苷酸編碼的多肽有助于NADP向NADPH轉(zhuǎn)化。該多核苷酸或多肽可是微生物內(nèi)生，或者源于微生物中正常存在的基因或酶。一些實(shí)施例中，多核苷酸或多肽可以與微生物的內(nèi)生基因或酶同源。另一些實(shí)施例中，多核苷酸或多肽可以是異源的(即，源于正常情況下微生物中不存在的基因或酶；或者源于微生物以外的資源)。此重組微生物可以表達(dá)一種編碼多肽和/或者多肽的一種突變體的多核苷酸的突變體。該多核苷酸的一種突變體可以包括具有至少約90%的序列與該核苷酸相同的多肽，或者，優(yōu)選的是至少約95%序列相同，該多核苷酸編碼的多肽具有一個或多個Zwf酶的生物化學(xué)活性(例如，NADP還原酶活性)。一種突變體可以是至少約90%的序列與該多肽相同的多肽，或者，優(yōu)選的是至少約95%序列相同，其中，該多肽具有一個或多個Zwf酶的生物化學(xué)活性(例如，NADP還原酶活性)。這樣，合適的多核苷酸可以是編碼與選定的Zwf酶至少約95X的序列相同的多肽的多核苷酸，其中，該多肽具有NADP還原酶活性。此重組微生物可以是用編碼表達(dá)具有Zwf酶活性的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化而來，其中，該重組微生物比不用具有表達(dá)Zwf酶活性的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的微生物具有更高的Zwf酶活性。在一些實(shí)施例中，該重組微生物比不用具有表達(dá)Zwf酶活性的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的微生物具有至少約5倍(5X)多的Zwf酶活性，(或者優(yōu)選的具有至少約10倍(10X)多的Zwf酶活性，或者具有至少約50倍(50X)多的Zwf酶活性)。Zwf酶活性可以包括NADP還原酶活性。Zwf酶活性可以通過測量重組微生物中的NADPH水平而得到(例如，與不用具有表達(dá)Zwf酶活性的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的微生物相比較)。重組微生物可以表達(dá)編碼Zwf酶的多核苷酸，如Z^/基因。多核苷酸的突變體可以包括由至少約90%序列與2V/基因相同的多核苷酸，或者優(yōu)選的至少約95%序列與^r/基因相同的多核苷酸，并且該多核苷酸的突變體編碼的多肽具有一個或者更多Zwf酶的生物化學(xué)活性。多核苷酸的突變體可以包括多核苷酸的核苷酸片段。例如，片段可以包括至少約90%的Zw/基因，或者至少約95X的^r/基因。核苷酸片段可以是合適的長度，例如，該核苷酸片段是由至少10，50，100，250，500，1000和/或1400核苷酸組成。片段可以編碼具有Zwf酶的一個或者多個生物化學(xué)活性的多肽。合適的^r/基因可以包括內(nèi)生于或者重組微生物固有的^r/基因(即，正常存在于微生物中的Z『/基因，而該重組微生物是源于此微生物)或者其突變體。其他合適的Z『/基因可以包括異源于微生物的iV/基因(即，Z,/基因不是正常存在于該微生物體內(nèi)，或者不是從用于制備重組微生物的源微生物中獲得)，或者其突變體。合適的Zr/基因可以包括具有至少約90%的核苷酸序列與選定的Z『/基因相同的突變體(優(yōu)選的是至少約95%的核苷酸序列與選定的Z『/基因相同)，并且該突變體編碼的多肽具有一個或者多個Zwf酶活性(即，葡萄糖一6—磷酸脫氫酶活性和/或NADP還原酶活性)。合適的^r/基因可以包括￡coh'Zr/基因或者其突變體。該￡Zr/基因的多核苷酸序列保藏在GenBank中，登錄號NC—000913，與核苷酸1，932，863到1，934，338(SEQIDN0:1)的反向互補(bǔ)，且登錄號M55005是核苷酸708到2180(SEQIDN0:2)。合適的￡coh'Z^/基因突變體可以包括至少約90%的序列與SEQIDN0:1(或者SEQIDN0:2)的多核苷酸序列相同(優(yōu)選的是至少約95%的序列相同)，這樣，該多核苷酸就可以編碼具有Zwf酶的一個或多個生物化學(xué)活性的多肽(即，葡萄糖一6—磷酸脫氫酶活性和/或NADP還原酶活性)。合適的基因可以包括Awcci/70ge/l基因或者其突變體。最近，已經(jīng)建立并組裝出As"cc眾oge/^iV/130Z的基因組序列草圖，從2005年9月開始，在美國能源部Joint基因組研究所的網(wǎng)站面向公眾開放。Zr/基因被注釋為"葡萄糖一6—磷酸l一脫氫酶"，存在于重疊群115(conting115)，核苷酸8738-10225(SEQIDN0:5)。編碼多月太(即Asi/cci/70《e77sZwf酶)推測的氨基酸序列如SEQIDN0:6所示。使用國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站上的"BLAST"比對算法版本BLASTP2.2.12，BL0SUM62matrix,可知Zwf酶的氨基酸序列與￡co7j'Zwf酶有43%相同，60%同源。合適的A犯cc^oge/7s^^基因突變體可以包括至少約90X的序列與SEQIDN(h5的多核苷酸相同(優(yōu)選的是至少約95%的序列相同)的多核苷酸，這樣該多核苷酸就可以編碼具有Zwf酶的一個或者多個生物化學(xué)活性的多肽(即，葡萄糖一6—磷酸脫氫酶活性和/或NADP還原酶活性)。重組微生物可以表達(dá)內(nèi)生Zwf酶(即，Zwf酶存在于產(chǎn)生重組微生物的微生物體內(nèi))，或者其突變體。在其他一些實(shí)施例中，重組微生物可以表達(dá)與微生物異源的Zwf酶(即，Zwf酶不存在于、產(chǎn)生重組微生物的微生物體內(nèi)，也不在該微生物體內(nèi)表達(dá))，或者其突變體。合適的Zwf酶可以包括至少約90。/^的氨基酸序列與選定的Zwf酶的氨基酸序列相同的突變體(優(yōu)選的是至少約95。X的氨基酸序列與選定的Zwf酶相同)，并且具有Zwf酶的一個或多個生物化學(xué)活性(如NADP還原酶活性和/或葡萄糖一6—磷酸脫氫酶活性)。合適的Zwf酶可以包括f.coh'Zwf酶(例如，SEQIDN0:3，NC_000913的核酸的1，932，863到1，934，338核苷酸序列的反向互補(bǔ)核苷酸編碼的多肽)或者其突變體，和Awc"V7^e;7sZwf酶(例如，SEQIDN0:6)或者其突變體。突變體多肽可以包括Zwf酶的片段。例如，片段可以包括至少約90°%的SEQIDNO:3的氨基酸序列，或者更優(yōu)選的是至少約95%的SEQIDNO:3的氨基酸序列。在其他一些實(shí)施例中，片段可以包括至少約90%的SEQIDN0:6的氨基酸序列，或者更優(yōu)選的是至少約95%的SEQIDN0:6的氨基酸序列。多肽片段可以是任何合適的長度。例如，多肽片段可以包括(例如是SEQIDNO:3或者SEQIDNO:6中的)至少約10,50,100，200,和/或300個氨基酸。多肽片段典型地具有Zwf酶的一個或多個生物化學(xué)活性。重組微生物可以包括產(chǎn)生琥珀酸的微生物，該微生物已經(jīng)被表達(dá)編碼內(nèi)生Zwf酶(即，固有的)的內(nèi)生(即，固有的)》W基因的多核苷酸轉(zhuǎn)化。在一些實(shí)施例中，重組微生物可以包括產(chǎn)生琥珀酸的微生物，該微生物己經(jīng)被表達(dá)編碼異源Zwf酶的異源Z^/基因的多核苷酸轉(zhuǎn)化。該重組微生物保藏在美國典型微生物菌種保藏中心(ATCC)，ATCC登錄號PTA-6255，是一種產(chǎn)生琥珀酸的微生物菌株(即，Awcci/7oge/^)，該微生物表達(dá)編碼異源Zwf酶的異源Zwf基因(例如Ecoh'^r/基因)。該重組微生物可以相對高水平地表達(dá)具有Zwf酶活性的多肽(即，該多肽可以"過表達(dá)")。例如，與非重組微生物相比較而言，該重組微生物可以相對高水平地表達(dá)內(nèi)生Zwf酶。在一些實(shí)施例中，相對于沒有被DNA分子轉(zhuǎn)化的重組微生物而言，該重組微生物可以用相對高水平地表達(dá)內(nèi)生Zwf酶的DNA分子(如，質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化。多核苷酸，例如^r/基因，在所選微生物中的表達(dá)可以優(yōu)化，所述的所選微生物產(chǎn)生重組微生物。例如，異源^F/基因在非內(nèi)生微生物中的表達(dá)可以優(yōu)化。在一些實(shí)施例中，Z『/基因可以在A^/ccj'/7t^e/^中進(jìn)行表達(dá)優(yōu)化，或者在例如BisgaardTaxon6或BisgaardTaxon10等的微生物中表達(dá)優(yōu)化。在其他一些實(shí)施例中，^r/基因可以在A"h'中進(jìn)行表達(dá)優(yōu)化。多核苷酸，例如/,/基因，可以在重組微生物中通過任何合適的策略進(jìn)行表達(dá)優(yōu)化。例如，可以通過將Zwf基因可操作地連接到啟動子序列上，以便于Zw/基因在重組微生物中的表達(dá)優(yōu)化，該啟動子是便于Z『/基因在重組微生物中表達(dá)的。該啟動子序列可以優(yōu)化，以便于相對高水平地在重組微生物中表達(dá)(例如，被優(yōu)化以便于"過表達(dá)")。Z『/基因可以可操作地連接到微生物的內(nèi)生啟動子序列上(即，微生物中固有的啟動子)，或者微生物的異源啟動子序列上(即，正常情況下該微生物內(nèi)沒有的啟動子，或者源于除了該微生物的其他來源)。合適的啟動子可以包括所選iV/基因的非固有啟動子(g卩，非^F/基因啟動子，可以是內(nèi)生于微生物或異源于微生物的啟動子)。合適的啟動子可以包括誘導(dǎo)表達(dá)啟動子或者組成型啟動子。合適的啟動子可以源于產(chǎn)生琥珀酸的微生物的啟動子。在其他一些實(shí)施例中，^^基因的表達(dá)可以在翻譯水平上優(yōu)化。例如，異源Zr/基因可以被修飾，以包括微生物中具有優(yōu)化使用頻率的編碼子，所產(chǎn)生的重組微生物作為非天然基因宿主。在其他一些實(shí)施例中，多核苷酸例如》《基因的表達(dá)可以通過向重組微生物中提供相對高拷貝數(shù)量的多核苷酸而優(yōu)化。例如，Zw/基因可以存在于外遺傳元件上，該外遺傳元件可以復(fù)制，以在重組微生物中獲得相對高的拷貝數(shù)量(例如，質(zhì)粒)。在一些實(shí)施例中，重組微生物是一個產(chǎn)生琥珀酸的微生物重組菌株，例如Z"j'/o6aci77iA幼c"'/70ge;is或相關(guān)的微生物。這些微生物已用包括與》f基因可操作性連接的啟動子的DNA分子轉(zhuǎn)化。該^r/基因可以是內(nèi)生或異源的^r/基因，可以包括例如，Awcc如oge77S^^基因(如SEQIDN0:5)和f.coh'基因(例如SEQIDN0:1和SEQIDNO:2)。其他的力r/基因都是已知的，他們的核苷酸序列已經(jīng)被公布(參見，如GenBarik)。產(chǎn)生琥珀酸的微生物的合適的內(nèi)源或固有的啟動子序列可以包括，例如磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶啟動子序列。AWCCi770^/7S烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶啟動子序列保藏于GenBank，登錄號AY308832，核苷酸1-258(SEQIDNO:4)。烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶啟動子可以是Zr/基因的合適的異源啟動子(即，非Z^基因啟動子)。如上所述，重組微生物可以包括重組DNA分子作為外遺傳元件和/或重組DNA分子可以并入微生物基因組(例如，通過合適的重組方法)。在一些實(shí)施例中，DNA分子是質(zhì)粒、重組噬菌體、細(xì)菌人工染色體(BAC)禾卩/或EcoJiPl人工染色體(PAC)。該DNA分子可以包括可選的標(biāo)記。合適的可選標(biāo)記可以包括卡那霉素抗性、氨芐青霉素抗性、四環(huán)素抗性、氯霉素抗性和這些可選標(biāo)記的組合。在一些實(shí)施例中，可選標(biāo)記是卡那霉素抗性。如上所述，重組DNA分子可以包括一個合適的啟動子，該啟動子與編碼具有Zwf酶的一個或多個生物化學(xué)活性多肽的多核苷酸可操作地連接，用于在重組微生物(例如As"cc眾oge/^)中表達(dá)多核苷酸。該啟動子適合于在產(chǎn)生琥珀酸的微生物中表達(dá)多肽。在一些實(shí)施例中，重組DNA分子包括烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶啟動子(例如AwcciV7^"e/7s烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶啟動子)，該啟動子與^F/基因或者其突變體可操作地連接，(此突變體可以包括異源2V/基因，如￡co7iZw/基因或A5""c"'/7^e/7sZW基因)。如，DNA分子可以包括GenBank中登陸號AY308832(SEQIDN0:4)的DNA序列中的核苷酸1-258或其突變體，并與GenBank中登陸號NC—000913(SEQIDN0:1)的DNA序列中核苷酸1,932，863到1,934，338的反向互補(bǔ)核苷酸可操作地相連；或與GenBank中登陸號M55005(SEQIDN0:2)的DNA序列可操作地相連；或與SEQIDN0:5的DNA序列可操作地相連。一些實(shí)施例中，該啟動子可以包括至少約95%的序列與SEQIDN0:4的核苷酸序列相同的多核苷酸，并在重組微生物中具有啟動子活性。包括重組DNA分子的重組微生物可以用于在發(fā)酵系統(tǒng)中產(chǎn)生有機(jī)酸(例如琥珀酸或乳酸)。相對于不包括重組DNA分子的微生物，包括重組DNA分子的重組微生物可以在發(fā)酵系統(tǒng)中產(chǎn)生提高水平的有機(jī)酸(例如琥珀酸或乳酸)。本發(fā)明還提供包括一個或多個前述重組DNA分子的DNA質(zhì)粒。該DNA質(zhì)?？梢园ㄒ粋€可選標(biāo)記。合適的可選標(biāo)記可以包括一個或多個氨節(jié)青霉素抗性、鏈霉素抗性、卡那霉素抗性、四環(huán)素抗性、氯霉素抗性和磺胺抗性的基因，并與合適的啟動子可操作地連接(例如，一種組成型啟動子)。在一些實(shí)施例中，DNA質(zhì)粒包括卡那霉素抗性基因。DNA質(zhì)?？梢园ㄔ谝粋€或多個合適宿主細(xì)胞中維持和/或復(fù)制該質(zhì)粒所需要的序列。在一些實(shí)施例中，DNA質(zhì)?？梢栽诤线m的宿主細(xì)胞間作為穿梭載體。DNA質(zhì)?？梢栽贏wccjV7^e/7s和￡co/i間作為穿梭載體。本發(fā)明還提供了包括一個或多個前述DNA分子的宿主細(xì)胞。例如，該宿主細(xì)胞可以包括包含DNA分子的DNA質(zhì)粒。該宿主細(xì)胞可以用于產(chǎn)生和分離包含DNA分子的DNA質(zhì)粒。該宿主細(xì)胞適合于在發(fā)酵系統(tǒng)中，產(chǎn)生一種或多種有機(jī)酸。在一些實(shí)施例中，該宿主細(xì)胞可以在合適的水平下表達(dá)Z『/基因(進(jìn)而是Zw/酶)，此水平下，在發(fā)酵系統(tǒng)中，可以提高一種或多種有機(jī)酸的產(chǎn)量(例如，琥珀酸或乳酸)。在一些實(shí)施例中，該宿主細(xì)胞可以在合適的水平下表達(dá)^V/基因(進(jìn)而產(chǎn)生^r/酶)，此水平下，可以提高宿主細(xì)胞中還原當(dāng)量(例如NADPH)的濃度。該宿主細(xì)胞可包括Asi/cci/7oge;7s重組菌株，該A5T/cci/70《e/7S重組菌株在合適的水平下表達(dá)^r/基因(進(jìn)而產(chǎn)生^r/酶)，此水平下，可以提高菌株中還原當(dāng)量(例如NADPH)的濃度。相對于不包括該重組DNA分子的菌株，這樣的菌株可以用于在發(fā)酵系統(tǒng)中產(chǎn)生提高水平的琥珀酸。在一些實(shí)施例中，該宿主細(xì)胞能產(chǎn)生琥珀酸，其濃度至少約20g/L，40g/L，60g/L，80g/L，100g/L，120g/L，140g/L，和/或160g/L(例如，在發(fā)酵系統(tǒng)中)。在一些實(shí)施例中，該宿主細(xì)胞能產(chǎn)生琥珀酸，其濃度約50g/L到130g/L。優(yōu)選的方案是，該宿主細(xì)胞除了產(chǎn)生高濃度的琥珀酸以外，不產(chǎn)生選定的有機(jī)酸。在該宿主細(xì)胞產(chǎn)生除了琥珀酸以外的有機(jī)酸(例如乙酸、甲酸、丙酮酸及其混合)時，優(yōu)選的方案是，除了琥珀酸以外的有機(jī)酸的濃度不超過約30g/L，優(yōu)選不超過約20g/L，更優(yōu)選不超過約10g/L，甚至更優(yōu)選不超過約5g/L。前述所提到的重組微生物可以用于包括發(fā)酵營養(yǎng)基產(chǎn)生一種或多種有機(jī)酸的方法中。一些實(shí)施例中，該方法包括用表達(dá)Zwf基因(例如￡"》f基因)的重組微生物發(fā)酵營養(yǎng)基。該方法產(chǎn)生的有機(jī)酸可以包括琥珀酸和乳酸。進(jìn)一步的實(shí)施例中，該方法適合于產(chǎn)生濃度為至少約20g/L，40g/L，60g/L，80g/L，100g/L，120g/L，和/或160g/L的琥珀酸。特別是，該方法可包括用在適合于提高有機(jī)酸(例如琥珀酸)的產(chǎn)量的水平下，表達(dá)^r/基因(進(jìn)而是^F/酶)的重組Awcc眾oge/^菌株發(fā)酵營養(yǎng)基?！贰痘蚩梢园ó愒碸r/基因。表達(dá)異源Z『/基因(例如￡》rf基因)的As〃cc^o^77s重組菌株保藏于ATCC登錄號PTA-6255。在一些實(shí)施例中，該重組微生物是在適合于提高有機(jī)酸(例如琥珀酸)的產(chǎn)量的水平下表達(dá)Z『/基因(可以是異源的)的BisgaardTaxon6或BisgaardTaxon10等微生物重組菌株。合適的重組微生物還還包括在適合于提高有機(jī)酸(例如琥珀酸)的產(chǎn)量的水平下表達(dá)Z『/基因(可以是異源的)的E"7i菌株。在所述的方法中，優(yōu)選的是，用產(chǎn)生相對高水平選定的例如琥珀酸和/或乳酸等的有機(jī)酸的重組微生物發(fā)酵營養(yǎng)基。這樣，選定的重組微生物可以抗高水平的有機(jī)酸，例如琥珀酸和/或乳酸。該重組微生物也可以被選擇，以產(chǎn)生相對低水平的不需要的副產(chǎn)物。例如，重組微生物可以產(chǎn)生相對少量的乙酸、甲酸、丙酮酸及其混合(例如至多約2.0g/L，至多約2.0g/L甲酸和/或至多約3.0g/L丙酮酸)。上面描述的重組微生物對濃度約lg/L，2g/L，4g/L，和/或8g/L的氟乙酸鈉有抗性，這樣的重組微生物適合于該方法。在所述的方法中，營養(yǎng)基典型地包括可發(fā)酵的碳源?？砂l(fā)酵的碳源可以通過可發(fā)酵生物材料提供。在一些實(shí)施例中，可發(fā)酵碳源源于飼料，包括糖作物，淀粉作物，和/或纖維素作物殘渣。一般來講，可發(fā)酵碳源也可以包括糖，如葡萄糖?？砂l(fā)酵碳源也可包括糖醇。在合適的實(shí)施例中，該方法產(chǎn)生的琥珀酸的產(chǎn)率(g)相對于葡萄糖(g)而言，至少約100%。圖l:采用葡萄糖批式發(fā)酵，A卯cc^o^tls突變體FZ45的代謝流分析。圖2:采用葡萄糖批式發(fā)酵，重組Awcc^oge/7sFZ45/pJR762.73的代謝流分析。圖3:轉(zhuǎn)化菌株細(xì)胞抽提物Zwf酶活性。抽提物是通過以下描述制備，并用于Zwf酶活性試驗。所有攜帶pJR762.73的菌株顯示出Zwf酶活性以對數(shù)比例大幅增加。詳細(xì)描述較佳實(shí)施例本發(fā)明揭示了一種表達(dá)具有一種或多種生物化學(xué)酶活性的多肽的重組微生物，該酶用于戊糖磷酸循環(huán)。所述的"微生物"包括任何合適的單細(xì)胞有機(jī)體，例如細(xì)菌、真菌和酵母。所述的"重組微生物"是指用一種方法修飾生成一種非自然存在的微生物的微生物。"重組微生物"可以包括已經(jīng)被DNA分子(例如重組DNA分子)轉(zhuǎn)化的微生物。重組微生物可以包括己經(jīng)被DNA分子轉(zhuǎn)化的微生物，所述的DNA分子可以表達(dá)具有一種或多種Zwf酶生物化學(xué)活性的多肽。戊糖磷酸循環(huán)采用幾種酶，包括葡萄糖一6—磷酸一1一脫氫酶，(也稱間酶或Zwf酶)；6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶；6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶，(也稱Gnd);核糖一5—磷酸異構(gòu)酶A和B;核酮糖磷酸3—差向異構(gòu)酶；轉(zhuǎn)酮醇酶I和II;轉(zhuǎn)醛基酶A和B。在這些酶中，Zwf和Gnd可以以NADPH的形式產(chǎn)生兩個氫當(dāng)量。該重組微生物可以表達(dá)任何適合的具有一種或多種Zwf酶(例如葡萄糖一6—磷酸一1—脫氫酶活性和NADP還原酶活性)生物化學(xué)活性的多肽或其突變體。例如，一種合適的Zwf酶是EWZwf酶或其突變體。在一些實(shí)施例中，相對于非重組微生物而言，該重組微生物可以表達(dá)提高水平的Zwf酶(即"過表達(dá)"酶)。該重組微生物可以表達(dá)突變多肽，該突變多肽至少約90%的氨基酸序列與Zwf酶相同，更優(yōu)選至少約95X的氨基酸序列與Zwf酶相同。在一些實(shí)施例中，重組微生物可以表達(dá)Zwf酶突變體，該Zwf酶突變體至少約96%,97%，98X或99X的氨基酸序列與Zwf酶相同。優(yōu)選地，該突變體多肽具有一種或多種Zwf酶生化活性。這種突變體多肽可以包括Zwf酶的片段。合適的Zwf酶包括Aswc"'/7o《e/sZwf酶，￡co7j'Zwf酶及其突變體。該重組微生物可以表達(dá)編碼具有一種或多種Zwf酶生化活性的多肽的多核苷酸，例如，iV/基因或其突變體。例如，該重組微生物可以表達(dá)Zw/基因或其突變體，該突變體的DNA序列至少約90^與^r/基因序列相同，優(yōu)選地至少約95%與^^基因序列相同。在一些實(shí)施例中，該重組微生物可以表達(dá)包含至少約96%、97%、98%或99%的序列與^r/基因相同的DNA序列的Z^/基因突變體。較佳地，該突變體多核苷酸編碼具有一種或多種Zwf酶生化活性的多肽。突變體多核苷酸可以包括Zw/基因的片段。在一些實(shí)施例中，該重組微生物可以表達(dá)A5y/cc^0ge/lsZw/基因，Eco"Zwf基因，或其突變體。該重組微生物可以源于任何合適的微生物。典型地，微生物可以產(chǎn)生適合商業(yè)生產(chǎn)水平的有機(jī)酸。這里的"有機(jī)酸"包括至少一個羧基基團(tuán)。例如，"有機(jī)酸"包括琥珀酸和乳酸。這里的有機(jī)酸可以被有機(jī)酸陰離子或其鹽交換代替；例如，"琥珀酸"可以指"琥珀酸鹽"；"乳酸"可以指"乳酸鹽"；"乙酸"可以指"乙酸鹽"；"丙酮酸"可以指"丙酮酸鹽"。在此，制備重組微生物的合適微生物可以包括但不限于包括j.5Y/ccj'/2c^e/7S1在內(nèi)的/4cz^'/o/acj7JiAsge/7W5"成員；5j.5^aanyra義o"6;e〃z^ro;A3禾口棒狀菌群(例如6br7"eZa"er_z'd//z^"ii/ta/Hicuffl,Coryne^gcterj'w/h^&wyZa"ari〃/z7c/j.ra".cst咖)；乳酸菌屬Lactobacillusgenus的成員；酵母(例如Saccharomycesgenus成員)；及其任何亞類。制備重組微生物的合適的微生物可以包括產(chǎn)生琥珀酸的微生物。該重組微生物典型地表達(dá)^r/基因，該iV/基因可以是異源的。Zr/基因在此重組微生物中的表達(dá)可以優(yōu)化。例如，基因可以與一啟動子可操作地連接，與非重組微生物相比，該啟動子可以促進(jìn)基因的過表達(dá)。啟動子可以是微生物內(nèi)生的(即該重組微生物從中衍生出的微生物固有的)，或異源于微生物(即，重組微生物可以從除此微生物以外的來源獲得)。啟動子可以是內(nèi)生的》《基因或異源于Zfr/基因(即，非》K基因啟動子)。啟動子可以便于組成和/或誘導(dǎo)Zw/基因的表達(dá)，和/或啟動子可以通過合適的方法被修飾后，促進(jìn)組成和/或誘導(dǎo)^r/基因的表達(dá)。Zr/基因可以被修飾，以促進(jìn)相應(yīng)mRNA的翻譯。例如，^r/基因可以修飾包括不存在內(nèi)生的或固有的基因內(nèi)的密碼子。這些非內(nèi)生的密碼子可以被選擇，以反映其在重組微生物中的使用頻率。許多對于一些微生物來說，密碼子使用表已開發(fā)出并且本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知該表。Z『/基因被修飾，以反映其在Aswc"/oge/7s中的使用頻率。如下^cz^./7o/3cj72wsswccj./70ge/7es的典型密石馬子^[吏用頻率。來源GenBankRelease144.0[2004年11月12日]Triplet[frequencyperthousand]UUU[20.4]UCU[1.9]UAU[13.0]UUC[29.7]UCC[14.8]UAC[16.7]UUA[35.3]UCA[13.0]UAA[1.9]UUG[20.4]UCG[5.6]UAGUGU[7.4]UGC[3.7]UGAUGG[16.7]CUU[13.0]CUC[1.9]CUACUG[5.6]CCU[5.6]CCCCCA[3.7]CCG[35.3]CAU[5.6]CAC[7.4]CAA[18.6]CAG[3.7]CGU[20.4]CGC[9.3]CGA[1.9]CGGAUU[27.8]AUC[22.3]AUAAUG[20,4]ACU[18.6]ACC[31.5]ACA[5.6]ACG[18.6]AAU[13.0]AAC[39.0]AAA[76.1]AAG[1,9]AGU[7.4]AGC[3.7]AGA[1.9]AGGGUU[26.0]GUC[7.4]GUA[11.1]GUG[27.8]GCU[13.0]GCC[13.0]GCA[22.3]GCG[35.3]GAU[33.4]GAC[29.7]GAA[64.9]GAG[5.6]GGU[61.2]GGC[24.1]GGAGGG[5.6]該重組微生物可以包括表達(dá)Z^/基因(例如內(nèi)生Z^/基因和/或異源Zr/基因，如AcoW^rf基因等)的A^7cc幾o(hù)ge77s重組菌株。其他產(chǎn)生重組微生物的合適微生物包括BisgaardTaxon6(保藏在瑞典G5teborg大學(xué)的培養(yǎng)物中心(CCUG)，保藏號15568);BisgaardTaxon10(保藏在CCUG，保藏號15572);和任何合適的本領(lǐng)域人員熟知的Ecoh'菌株。該重組微生物可以源于可以產(chǎn)生高水平的一種或多種有機(jī)酸如琥珀酸和乳酸的菌株，和/或重組微生物可以被篩選出和/或工程化后，相對于非重組微生物而言，產(chǎn)生高水平或提高產(chǎn)量的一種或多種有機(jī)酸如琥珀酸和乳酸。該重組微生物可以源于對相對高水平的副產(chǎn)物具有抗性的菌株，和/或產(chǎn)生相對低水平的副產(chǎn)物的微生物。這些副產(chǎn)物可以包括甲酸鹽(或甲酸)、乙酸鹽(或乙酸)和/或丙酮酸鹽(或丙酮酸)。篩選產(chǎn)生低水平乙酸鹽的菌株的方法是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。見例如U.S.5,521,075和U.S.5，573，931，以上通過引用并入本發(fā)明。例如，產(chǎn)生相對低水平乙酸鹽的微生物菌株可以通過將微生物培養(yǎng)在毒性乙酸鹽衍生物，如濃度約為1.0到8.Og/L的氟乙酸鈉條件下篩選。篩選出的菌株在葡萄糖發(fā)酵中可以產(chǎn)生相對低水平的乙酸鹽(如不大于2.0g/L)、甲酸鹽(如不大于2.0g/L)和/或丙酮酸鹽(如不大于3.0g/L)。一種合適的產(chǎn)生重組微生物的氟乙酸鈉抗性菌株為AS"CCiT7C^eT7S菌株即FZ45，其是A^yccj'77t^e/^的衍生物，保藏在ATCC，保藏號55618。見U.S.5,573，931，該文獻(xiàn)中描述了制備氟乙酸鈉抗性微生物菌株的方法。該重組微生物可以被篩選和/或工程化，以對相對高水平的不需要的副產(chǎn)物具有抗性和/或產(chǎn)生相對低水平的不需要的副產(chǎn)物。例如，轉(zhuǎn)化后，重組微生物菌落可以培養(yǎng)在氟乙酸鈉條件下，篩選出對相對高水平乙酸鹽具有抗性和/或可以產(chǎn)生相對低水平的乙酸鹽的菌株。編碼具有一種或多種Zwf酶生化活性的多肽的DNA序列可以通過本領(lǐng)域內(nèi)已知方法得到(例如，對帶有合適的引物的^^基因與進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆為合適的DNA載體)。合適的^r/基因的多核苷酸序列己公開(見例如GenBank)。例如，As"cc幾o(hù)ge/7s的Z^/基因的多核苷酸序列已經(jīng)被公布(SEQIDN0:5&6)。(見美國能源部基因研究所網(wǎng)站)。該￡Zw/基因在GenBank中有(例如GenBank中登錄號NC—000913(SEQIDN0:1)和GenBank中登錄號M55005(SEQIDN0:2))。Z^/基因及其突變體可以通過對帶有合適的引物的微生物基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到。DNA載體可以是在重組微生物中表達(dá)基因的合適載體。合適的載體包括質(zhì)粒、人工染色體(例如細(xì)菌人工染色體)和/或修飾過的噬菌體(例如噬菌粒)。該載體可以被設(shè)計為外遺傳元件和/或與微生物基因組重組。DNA分子典型地包括與編碼具有Zwf酶活性多肽的多核苷酸可操作地連接的一個啟動子。該啟動子可以是產(chǎn)生重組微生物的微生物內(nèi)生的或固有的，或異源于該微生物(即，除了重組微生物的其他來源)。此外，該啟動子也可以是對選定的^^基因的固有的啟動子或?qū)x定的iV/基因的固有的啟動子以外的啟動子(即，非Zr/基因啟動子)。當(dāng)該重組微生物是Aswcci/20ge/^菌株的時候，合適的內(nèi)生或固有啟動子為Awcc^^e/7s磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶啟動子(SEQIDN0:4)，保藏在GenBank，登錄號為AY308832，包括核苷酸1一258，或其突變體。該啟動子可以是采用現(xiàn)有技術(shù)中的克隆方法與^r/基因可操作地連接。例如，該啟動子與^r/基因可以采用包括配伍限制性酶識別位點(diǎn)的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的啟動子和基因然后用酶消化，并克隆入合適的包括多個克隆位點(diǎn)的載體中。此外，DNA分子可以包括可選標(biāo)記。該可選標(biāo)記可以對一個或多個抗生素試劑賦予抗性。例如，可選標(biāo)記可以包括氨芐青霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、氯霉素抗性基因、磺胺抗性基因或這些標(biāo)記基因的組合。典型地，該可選標(biāo)記與利于標(biāo)記表達(dá)的啟動子可操作地相連。包括可選標(biāo)記的質(zhì)粒和其他克隆載體是現(xiàn)有技術(shù)已知的。DNA分子典型地用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞包括用于保存和/或產(chǎn)生DNA分子的任何細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞可以包括表達(dá)DNA分子上任何基因的細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞還可以包括可以在發(fā)酵過程中產(chǎn)生有機(jī)酸的細(xì)胞，如濃度適于商業(yè)生產(chǎn)的琥珀酸(例如至少約20g/L，優(yōu)選地至少約為50g/L，更優(yōu)選地至少約為100g/L)。產(chǎn)生有機(jī)酸的方法典型地包括用表達(dá)Zw/基因的重組微生物在培養(yǎng)基上發(fā)酵。例如，該方法可以包括表達(dá)^r/基因(例如異源^r/基因，如￡co7/力f基因)的重組As"cc^o《e/7s在培養(yǎng)基上發(fā)酵。發(fā)酵中產(chǎn)生的有機(jī)酸可以包括琥珀酸。該方法中一種合適的重組微生物為表達(dá)2V/基因的As"c"'/joge/7s重組菌株，保藏在ATCC，保藏號PTA—6255。該方法還可以包括在培養(yǎng)基上發(fā)酵表達(dá)iV/基因(例如異源^r/基因，如￡coh'Zwf基因)的BisgaardTaxon6或BisgaardTaxon10重組菌株，產(chǎn)生琥珀酸。該方法還可以包括在培養(yǎng)基上發(fā)酵表達(dá)^r/基因(或過表達(dá)Z『/基因)的￡cW/重組菌株，產(chǎn)生一種或多種如乳酸等的有機(jī)酸。該方法可以使用對產(chǎn)生的相對高水平的有機(jī)酸(如琥珀酸)有抗性的重組微生物。該方法還可以使用對相對高水平的不需要的副產(chǎn)物有抗性的微生物菌株，和/或產(chǎn)生相對低水平的不需要的副產(chǎn)物的微生物菌株。該培養(yǎng)基典型地包括可發(fā)酵性碳源。該可發(fā)酵性碳源可以通過可發(fā)酵生物材料得到?？砂l(fā)酵生物材料可以源于各種作物和/或飼料，包括糖作物(例如，糖、甜菜、甜高粱、甘蔗、詞料甜菜)；淀粉作物(例如，谷物類如玉米、小麥、高粱、大麥和塊莖類如馬鈴薯和甘薯)；纖維類作物(例如，玉米稈、玉米纖維、小麥稈和草料類如蘇丹草和高粱)。此生物材料可以被處理以便于釋放可發(fā)酵碳源(例如糖)。例如，生物材料可以用如纖維素酶和/或木聚糖酶等酶處理，釋放簡單的糖?？砂l(fā)酵碳源可以包括簡單的糖和糖醇，如葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和其混合。該方法典型地會產(chǎn)生相對于輸入碳源如葡萄糖相對高產(chǎn)率的琥珀酸。例如，該方法可以相對于葡萄糖輸入量(g)產(chǎn)生琥珀酸至少約90%?？梢源娴氖?，產(chǎn)率可以用琥珀酸產(chǎn)量(mol)/葡萄糖輸入量(mol)計算。因此，該方法可以有琥珀酸產(chǎn)率(mol)相對于葡萄糖輸入(mol)至少約140%。優(yōu)選地，該方法為，琥珀酸(mol)的產(chǎn)率相對于葡萄糖輸入量(mol)至少約130%或至少約170%。該方法也典型地產(chǎn)生相對高濃度的琥珀酸(例如，相對發(fā)酵中使用非重組微生物的方法而言)。例如，發(fā)酵可以產(chǎn)生濃度至少約50g/L的琥珀酸。優(yōu)選地是，發(fā)酵可以產(chǎn)生濃度至少約90g/L的琥珀酸，或更優(yōu)選的是，產(chǎn)生濃度至少約130g/L的琥珀酸。在一些實(shí)施例中，發(fā)酵典型地并不產(chǎn)生大量的不需要的副產(chǎn)物，如乙酸鹽、甲酸鹽、丙酮酸鹽和其混合(例如，不多于2.0g/L的乙酸鹽，不多于2.0g/L的甲酸鹽，和/或不多于3.0g/L的丙酮酸鹽)。該方法可以用于產(chǎn)生相對高濃度的乳酸(例如，相對于發(fā)酵中采用非重組微生物的方法而言)。例如，在發(fā)酵過程中采用的該重組微生物產(chǎn)生乳酸的濃度為至少約25g/L。在一些實(shí)施例中，發(fā)酵產(chǎn)率可以是每克葡萄糖生成約0.5g乳酸。產(chǎn)生乳酸的方法可以包括將表達(dá)(或過表達(dá))具有一種或多種^r/基因的生化活性的多肽的重組￡W在合適的碳源上發(fā)酵。例如，該方法可以包括將表達(dá)源于如質(zhì)粒等的外遺傳元件的￡coh'Z^"基因的重組￡^'在合適的碳源上發(fā)酵，具體實(shí)施方式—實(shí)施例中，該重組微生物是一種表達(dá)異源基因的^c"/70/a"77iAS.縱ci/7。,s的重組菌株。該異源Z『/基因在爿c"'yo/acj'"〃s.s〃cci/7oge/7s中可以優(yōu)化表達(dá)。異源Z『/基因可以編碼￡co7iZwf酶，該重組菌株可以包括保藏在ATCC，保藏號PTA—6255的重組1""oAaciy7^.縱"V卿/5"。該重組菌株可以產(chǎn)生濃度約為50g/L到130g/L的琥珀酸(例如，在利用合適碳源的發(fā)酵系統(tǒng)中)。該重組菌株可以抗至少約lg/L的氟乙酸鈉?！?shí)施例中，重組菌株是一種表達(dá)異源Z『/基因的屬于BisgaardTaxon6或BisgaardTaxon10的重組菌株。異源^r/基因可以編碼￡co"Zwf酶。另一實(shí)施例中，重組菌株是包含包括力c"'/70^c/WiAS.5〃cc^o《e/s的轉(zhuǎn)錄啟動子與異源基因可操作性相連的DNA分子的^c"/70^cj77^.^i/c"'/70《e/^重組菌株，該轉(zhuǎn)錄啟動子可以包括磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶啟動子或其突變體(例如SEQIDNO:4的多核苷酸或與SEQIDNO:4至少約95。％序列相同的多核苷酸，其中該多核苷酸具有磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶啟動子活性)。異源Z^/基因可以編碼E"WZwischenferment酶或其突變體(例如SEQIDNO:1的多核苷酸或與SEQIDNO:1至少約95%序列相同的多核苷酸，其中該多核苷酸具有Zwischenferment酶活性)。異源^r/基因可以包括￡co"'^r/基因?？蛇x擇的是，該Zw/"基因可在^cz^'/oA3cj77〃s.■si/cc&ogews中的表達(dá)可以優(yōu)化。DNA分子可以是外遺傳的(例如存在于質(zhì)粒上)。該DNA分子可以包括可選標(biāo)記(例如，卡那霉素抗性，氨芐青霉素抗性，鏈霉素抗性，磺胺抗性，四環(huán)素抗性，氯霉素抗性或其混合)。另一實(shí)施例中，重組微生物是一種包括異源Zwf酶的/Jc"/70Z3"'7k縱"'770卿s的重組菌株。該異源Zwf酶可以由"/7oZ3"7M薦ci/。,s已被優(yōu)化表達(dá)的M基因表達(dá)而來。該異源Zwf酶可以包括￡Zwischenferment酶。該重組菌株可以包括保藏在ATCC，保藏號PTA—6255的重組Aswc"'/7oge/s。該重組菌株可以產(chǎn)生濃度約為50g/L到130g/L的琥珀酸。可選擇的是，該重組菌株可以抗至少約lg/L的氟乙酸鈉。—實(shí)施例中，產(chǎn)生琥珀酸的方法包括用表達(dá)異源Zr/基因的重組微生物在培養(yǎng)基上發(fā)酵。該重組微生物可以包括J"i/70&CJ'"iA.WC"'/7^e/7S重組菌株(例如，保藏在ATCC，保藏號PTA—6255的Awcci'加ge77s重組菌株)。該重組微生物可以包括BisgaardTaxon6重組菌株或BisgaardTaxon10重組菌株。該異源Zr/基因可以包括Acoh'Z『/基因?？梢赃x擇的是，該重組菌株能抗至少約lg/L的氟乙酸鈉?？梢赃x擇的是，該重組菌株可以產(chǎn)生濃度約為50g/L到130g/L的琥珀酸。該培養(yǎng)基可以包括可發(fā)酵糖(例如葡萄糖)。典型的是，該方法的琥珀酸產(chǎn)率(g)相對于葡萄糖的量(g)至少約為100%?！獙?shí)施例中，該重組DNA分子包括與異源Zw/基因可操作性連接的AS〃CCJ'/Oge/7S轉(zhuǎn)錄啟動子。例如，該轉(zhuǎn)錄啟動子可以包括AS〃CCJ'/70ge/7S磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶啟動子或其突變體(如SEQIDNO:4的多核苷酸或與SEQIDNO:4至少約95%序列相同的多核苷酸，其中該多核苷酸具有力c""o力ac777i/s.si/cciVo《e/^磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶啟動子活性)。—實(shí)施例中，該重組DNA分子存在于DNA質(zhì)粒中。典型地，該DNA質(zhì)粒包括一個可選標(biāo)記(例如，氨芐青霉素抗性，卡那霉素抗性，鏈霉素抗性，四環(huán)素抗性，氯霉素抗性，磺胺抗性和其混合的基因)。存在于質(zhì)粒中的DNA分子可以存在于宿主細(xì)胞中，該宿主細(xì)胞可以在發(fā)酵系統(tǒng)中產(chǎn)生濃度約為50g/L到130g/L的琥珀酸。—實(shí)施例中，重組微生物是已經(jīng)被表達(dá)具有Zwf酶活性的多肽的DNA分子轉(zhuǎn)化的、可以產(chǎn)生琥珀酸的微生物的重組菌株。該DNA分子可以包括編碼具有Zwf酶活性的多肽的多核苷酸，所述的Zwf酶活性包括NADP還原酶活性。該DNA分子可以包括編碼具有至少約90X的氨基酸序列(或優(yōu)選地至少95%序列相同)與Zwf酶(例如，SEQIDN0:3或SEQIDNO:6)相同的多肽的多核苷酸，該多肽具有Zwf酶活性(如NADP還原酶活性)。該DNA分子可以包括至少約90%序列(或優(yōu)選地至少約95%的序列)與2V/基因的多核苷酸(例如SEQIDNO:1;SEQIDNO:2;或SEQIDNO:5)相同的多核苷酸，其中該多核苷酸編碼具有Zwf酶活性的多肽。一實(shí)施例中，該重組微生物可以源于至少約90%的16SrRNA與^c"/o^c^i"s.^/c"77oge/7s的16SrRNA序列相同的微生物。例如，該重組微生物可以源于力"i/7(9力3"77ws1.S77c"'/7c^e/751、BisgaardTaxon6或BisgaardTaxon10。另一實(shí)施例中，該重組微生物為已被異源力f基因轉(zhuǎn)化的產(chǎn)琥珀酸的微生物重組菌株。該異源Zr/基因在微生物中的表達(dá)可以被優(yōu)化。一些實(shí)施例中，該異源7『/基因可以編碼￡co乃'Zwf酶。一些實(shí)施例中，Zw/基因可以包括至少約95%序列與SEQIDNO:1相同的多核苷酸，其中該多核苷酸具有Zwf酶活性。另一實(shí)施例中，該重組微生物為己被DNA分子轉(zhuǎn)化的產(chǎn)琥珀酸的微生物重組菌株，該DNA分子包括酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶轉(zhuǎn)錄啟動子，該轉(zhuǎn)錄啟動子與編碼具有Zwf酶活性的多肽的多核苷酸可操作地相連。該轉(zhuǎn)錄啟動子可以包括力"j'/7oZacj7hs.s〃cci/7oge/7s的酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶啟動子。在一些實(shí)施例中，該啟動子可以包括至少約95X序列與SEQIDN0:4相同的多核苷酸，其中該多核苷酸具有啟動子活性。另一實(shí)施例中，該重組微生物是被外遺傳DNA分子轉(zhuǎn)化的重組菌株，該DNA分子可以存在于質(zhì)粒中。另一實(shí)施例中，該重組微生物為可以產(chǎn)生濃度約為50g/L到130g/L的琥珀酸的重組菌株。該重組菌株對至少約lg/L的氟乙酸鈉有抗性。在一些實(shí)施例中，該重組菌株是重組^cz^'/70^3Cj77iAS.■swccj'/wge/AS,保藏在ATCC，保藏號PTA—6255。另一實(shí)施例中，該重組微生物被用于產(chǎn)生琥珀酸的方法中，該方法包括將重組微生物在培養(yǎng)基中發(fā)酵。培養(yǎng)基典型地包括可發(fā)酵的糖，如葡萄糖。該方法相對于葡萄糖(g)，可以產(chǎn)生琥珀酸的產(chǎn)率(g)至少約100%?！?shí)施例中，DNA分子包括產(chǎn)生琥珀酸的微生物的轉(zhuǎn)錄啟動子與異源^r/基因可操作地相連。該轉(zhuǎn)錄啟動子可以包括酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶啟動子。在一些實(shí)施例中，該啟動子包括至少約95%序列與SEQIDNO:4相同的多核苷酸，其中該多核苷酸具有啟動子活性。該DNA分子可以存在于質(zhì)粒中。該DNA分子可以存在于宿主細(xì)胞中(例如，該宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生濃度約為50g/L到130g/L的琥珀酸)。具體實(shí)施例微生物菌株和質(zhì)粒As"cci"oge/^菌株FZ45是一種穩(wěn)定的力c^'/7^acj77iA.5Y/ccjV7oge/^130Z的細(xì)菌突變體，其對氟乙酸鈉有抗性。見Guettleretal.，INT，LSYST.BACT.(1999)49:207-216;和美國專利5，573，931?！阠oW-Asi/cc&oge/^穿梭載體pLS88(保藏在美國典型微生物菌種保藏中心ATCC，保藏號no.86980)，可以從加拿大Manitoba大學(xué)Dr.LeslieSlaney處獲得。質(zhì)粒pLS88已經(jīng)從yyae/7o;/7j7wso^crej^'中分離出來，并具有磺胺抗性、鏈霉素抗性和卡那霉素抗性。遺傳操作重組DNA操作一般可參照現(xiàn)有技術(shù)的方法。采用堿性裂解法抽提質(zhì)粒DNA。用標(biāo)準(zhǔn)50ul溶劑重懸1.5ml細(xì)菌培養(yǎng)物所得的高拷貝質(zhì)粒。較大量的質(zhì)粒提取采用Qiagen中量或大量質(zhì)粒純化試劑盒，方法按照生產(chǎn)廠家的說明書操作。限制性內(nèi)切酶分子量標(biāo)準(zhǔn)物，和預(yù)染標(biāo)記從NewEnglandBiolabs和Invitrogen公司購買，除了用約5倍過量的酶進(jìn)行消化外，其余按照生產(chǎn)廠家的說明書操作。DNA在含有溴乙非啶的Tris-醋酸瓊脂糖膠分離后，采用Qiagen公司的膠回收試劑盒，按照說明書提供的方法，回收瓊脂糖中的DNA。采用羅氏公司的蝦堿性磷酸酶和消化產(chǎn)物合并后去磷酸化。磷酸酶在70攝氏度滅活15分鐘。連接反應(yīng)采用20ul反應(yīng)體積，3到5倍摩爾過量的插入片斷與載體DNA混合，加入lulT4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs)，25攝氏度反應(yīng)1小時?！阠oh'轉(zhuǎn)化采用Invitrogen公司的"建庫用高效感受態(tài)細(xì)胞"，步驟按照廠商說明進(jìn)行。連接混合物轉(zhuǎn)化菌株不經(jīng)稀釋涂布在含有適當(dāng)?shù)目股氐臉?biāo)準(zhǔn)LB平板。按照PerkinElmer手冊進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物按照發(fā)表的序列設(shè)計(如國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫所提供的)。引物中包含了工程性限制性酶切位點(diǎn)。引物還經(jīng)過VectorNTI程序進(jìn)行二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的檢測。所有的弓l物都從密西根州MacromolecularstructureFacility訂購。PCR擴(kuò)增是在Eppendorf梯度MasterPCR儀上進(jìn)行的，或者在PerkinElmerPCR進(jìn)行。起始的退火溫度根據(jù)VecterNTI程序?qū)γ繉σ餀z測。用于消化擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶購于Invitrogen或NewEnglandBiolabs。質(zhì)粒pJR762.55從Awcci/7oge/75FZ45基因組DNA擴(kuò)增出Awcci/70ge/s的酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶啟動子序列(P,k，SEQIDNO:4，GenBank登記號AY308832，包括核苷酸1—258)采用以下引物擴(kuò)增正向引物，5，-AAAGAATTCTTAATTTCTTTAATCGGGAC(SEQIDNO:7);和反向引物5，-GCGTCGACATACTTCACCTCATTGAT(SEQIDNO:8);包括AcoRI禾H限制序列(下劃線核苷酸)，便于克隆，結(jié)果當(dāng)feoRI/6"WI片段插入PLS88時，0.27-kbPP^片段也被插入到PLS88，由此產(chǎn)生質(zhì)粒pJR762.55。質(zhì)粒pJR762.73從菌株BL21(DE3)基因組DNA(ATCC保藏號NC_000913)擴(kuò)增出￡co〃》《基因，采用以下引物正向引物，5，-CCGCTCGAGGGCGGTAACGCAAACAGC(SEQIDNO:9);反向引物5，-CCGCTCGAGTTACTCAAACTCATTCCAGGSEQIDNO:10)。zl7o1限制序列(下劃線核苷酸)被包括進(jìn)去，以便于克隆，并確保1.5kb力f片段插入pJR762.55的5s7I位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒pJR762.73。A5^CCJ'77g^61/751的轉(zhuǎn)化Succinogenes的電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞是用大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)中生長到0D600約為0.6的細(xì)胞制備的。細(xì)胞離心下來后，用無菌水洗兩次，10%甘油洗兩次，然后用含有ioy。甘油的o.oix的原始培養(yǎng)體積重懸。細(xì)胞急速冷凍后保存在-80攝氏度。約40微升的細(xì)胞解凍后用于電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化在BioRadGenePulser儀器上進(jìn)行，參數(shù)設(shè)置如下400w，25mF，1.8kV，使用0.lcm反應(yīng)器。電轉(zhuǎn)化后，lml室溫的TSB培養(yǎng)基立即加入，在37攝氏度下培養(yǎng)1小時，然后涂布在含有卡那霉素(100ug/ml)的TSB瓊脂平板上。As^7cjV70《e7^的光學(xué)密度測定樣品經(jīng)鎂中和發(fā)酵后于420Xg離心2分鐘使MgCO:,沉淀，然后用0.5N的HC1稀釋以溶解其它殘留的沉淀，后于OD,測值。A，CJ'/7卿/7S的批式發(fā)酵Aswccj770ge/^發(fā)酵是在包含以下培養(yǎng)基(除非特別指出)的51個發(fā)酵罐中進(jìn)行，80g/L葡萄糖，85g/L液體詞料槳(liquidfeedsyrup)(LFS)，0.2mg/L生物素，5mM磷酸，3g/L酵母提取物，SensientAG900。用Mg(0H)2調(diào)節(jié)PH保持在7.0。攪拌速度設(shè)置在250rpm，溫度38。C，二氧化碳以0.025v.v.m.的速度噴入。發(fā)酵罐中接種量為1.25%，種子在含有上述培養(yǎng)基的血清瓶中培養(yǎng)。Awcci/7t^e;^重組菌株的發(fā)酵基含有100ug/ml卡那霉素。LFS清洗要求通過光學(xué)密度測量生長的發(fā)酵來講，采用LFS的冷水抽提的方法。在SorvallGSA離心機(jī)中在轉(zhuǎn)速9，OOOrpm下離心20分鐘，去除LFS中懸浮固體和一些油類。上清液可以放在分離漏斗中，室溫條件下放置3h。下層水相代表57%(w/v)粗LFS。生物化學(xué)試驗驗證Zr/的表達(dá)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶檢測按照Choi等2003年發(fā)表的文獻(xiàn)描述的方法進(jìn)行(見Choi，Jae-Chulk，Shin，Hyun-Dong，Lee，Yong-Hyun(2003)EnzymeandMicrobialTechnology32，pl78-185;"Modulationof3-hydroxyvaleratemolarfractiononpoly(3-hydroxybutyrate-3-hydroxyvalemte)usingRalstoniaeutrophatmnsformantco-amplifyingphbCandNADPHgeneration-relatedZwfgenes")。D-6-磷-葡萄糖-S-內(nèi)酯的合成速度通過檢測NADPH的增長得知，而NADPH則通過檢測在340nm的吸收值獲得。反應(yīng)體系為1ml，含有50ul[1M]的Tris—HCl，pH7.5，200ul[50mM]的MgCUlOOul[lOmM]的NADP，100ul[10mM]葡萄糖-6-磷酸，450ulH20，和100ul細(xì)胞提取物。按照以下公式計算特異酶活特異酶活二dA/dt/0.623X(蛋白濃度)，或umol/minmg—'。在所有含有A.succinogenesPEPCK啟動子表達(dá)￡co乃'Zwf基因的pJR762.73質(zhì)粒的重組菌株中都檢測到Zwf活力的增加。在轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pJR762.73的Jcz^z'/7oZsci7Jw5"菌株(FZ45)，BisgaardTaxon6(BT6)禾口BisgaardTaxon10(BT10)菌株中活力都有提高。這些結(jié)果如圖3所示?！阠o"的發(fā)酵￡coJi菌株DH5a/pJR762.73(Zwf)、DH5a/pJR762.17(Zwf)和DH5a/pLS88在NBS5-literBiofloIII發(fā)酵罐中培養(yǎng)，用4升含有以下成分的培養(yǎng)基培養(yǎng)900AG酵母提取物15克，玉米漿15克，Na2HP0d1.16克；NaH2P04'H20，0.84克;(NH4)2S04，3克;MgS(X>7H20，0.61克;CaCl22H20，0.25克；葡萄糖，45克每升。通過自動添加K2C0:!(3.3N)使pH值穩(wěn)定在6.7。發(fā)酵通過加入1.25%的種子開始。開始時，在適合^ZI快速生長的有氧環(huán)境中培養(yǎng)，500rpm的轉(zhuǎn)速攪拌，對培養(yǎng)基以0.5升/升.分的頻率噴射空氣。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到6.20D,的最小值時，在缺氧的環(huán)境中培養(yǎng)，該環(huán)境有利于有機(jī)酸的產(chǎn)生；然后以0.2升/升-分鐘的頻率噴射C02和H2的混合物(95:5)，攪拌速度降至250rpm。定時取樣，通過HPLC檢測有機(jī)酸和殘余葡萄糖的濃度。發(fā)酵肉湯分析琥珀酸，葡萄糖，乳酸，丙酮酸鹽，乙醇和甲酸濃度通過反向高壓液相色譜(HPLC)測定，具體包括Waters1515等度泵，Waters717自動進(jìn)樣器和一個Waters2414示差折光檢測器，溫度35匸。該HPLC系統(tǒng)采用WatersBreeze軟件(3.3版本)進(jìn)行控制、數(shù)據(jù)采集和處理。采用Bio-RadAminexHPX-87H(300mmX7.8mm)柱，陽離子H保護(hù)柱，55。C進(jìn)行。移動相為0.021N硫酸，速度為0.5ml/min。樣品通過0.45um過濾器過濾，向柱中注入5.0yl，運(yùn)行時間為三十分鐘。C。2測定質(zhì)量流量控制器(Brooksmodel58501)用于向發(fā)酵罐噴入系統(tǒng)監(jiān)控和提供C02，速度為100ml/min。質(zhì)量流量計(Brooksmodel58501)通過排氣冷凝器系統(tǒng)測定發(fā)酵罐中存在的C02。兩個C(V流量計通過4一20maBio-CommandInterface與計算機(jī)相連，該BioCo腿andplus生物處理軟件每6O秒處理一次入口和出口處的CO2。C(V消耗速率(ml/min)在任何特定時間，就是入口和出口處速率之差(C02使用二C02入口一CO2出口)。在任何特定發(fā)酵間隔期間C02的消耗體積等于該間隔內(nèi)每分鐘的總速率。C0J肖耗的摩爾數(shù)通過理想氣體法則計算(消耗升除以22.4升/moh消耗摩爾數(shù))。質(zhì)量流量計通過C02生產(chǎn)者校準(zhǔn)和精確度為1X或2ml/m。發(fā)酵設(shè)備通過氣體泄漏監(jiān)控，該泄漏的氣體是在C(V混入5%氫。氫泄漏是采用Tif8800co/可燃?xì)怏w分析儀。A薦"'w面發(fā)酵的代謝流量分析^c"/Maci"〃s.s〃cci/^e/^厭氧琥珀酸生產(chǎn)的代謝流量分布(MFA)采用流量分析儀軟件包進(jìn)行分析。流量分析儀軟件包是從SteffenKlamt教授(MaxPlanckInstitute,Magdeburg,Germany)處獲得。并根據(jù)手冊中提供的說明書操作。流量分析儀軟件包通過提供MATLAB編程軟件的圖形用戶界面分析代謝流量，執(zhí)行真實(shí)的數(shù)學(xué)運(yùn)算。MATLAB軟件從MathWork公司購買。通過測量整個代謝通路中己知的組分和期望組分的細(xì)胞外濃度的變化，采用下面描述的代謝網(wǎng)絡(luò)模型，計算主要細(xì)胞內(nèi)代謝的細(xì)胞內(nèi)流量。對20個已知的代謝、27個下面顯示的反應(yīng)(沒有考慮生物材料成分和生長率)建立了專門的網(wǎng)絡(luò)(標(biāo)記的Awcc如o《e/LS)。Asz/cci/^"e/7s的代謝網(wǎng)絡(luò)模型葡萄糖(內(nèi))一葡萄糖葡萄糖一葡萄糖-6P葡萄糖-6P+2NAD—2PEP+2NADHPEP—丙酮酸鹽PEP+C02—OAA丙酮酸鹽(內(nèi))一丙酮酸鹽丙酮酸鹽+NAD-丙酮酸鹽+NADH+C02—蘋果酸乙酰-coA—乙酸鹽乙酸鹽一乙酸鹽(外)乙酸鹽+OAA—檸檬酸鹽檸檬酸鹽+NAD—C02+NADH+a-KGOAA+NADH—蘋果酸+NAD蘋果酸一延胡索酸鹽(Rl)(R2)(R3)(R4)(R5)(R6)乙酰-coA+NADH+(R7)(R8)(R9)(RIO)(Rll)(R12)(R13)(R14)C02延胡索酸鹽+NADH—琥珀酸+NAD(R15)琥珀酸一琥珀酸(外)(R16)C02(內(nèi))一C02(R17)甘油(內(nèi))一甘油(R18)甘油+2NAD—PEP+2NADH(R19)山梨醇(內(nèi))一山梨醇(R20)山梨醇+NAD—葡萄糖-6P+NADH(R21)木糖(內(nèi))一木糖(R22)木糖一R5P(R23)R5P+5/3NAD—5/3PEP+5/3NADH(R24)葡萄糖-6P+2NADP—R5P+C02+2NADPH(R25)乙酰-coA+2NADH—乙醇+2NAD(R26)乙醇(內(nèi))一乙醇(R27)采用以前描述的分析方法對發(fā)酵樣品的發(fā)酵過程進(jìn)行分析。葡萄糖、甘油、阿拉伯糖、木糖、山梨醇、琥珀酸、乙酸、乙醇、丙酮酸鹽、乳酸和發(fā)酵體積在每一個采樣時間測定。代謝量根據(jù)公式計算(代謝物，g二V(發(fā)酵罐，l)*C(代謝物，g/1)。t0-tl時間內(nèi)，在時間段tft,期間代謝物消耗率或代謝物生產(chǎn)率采用下面的公式計算代謝物消耗率(mol/h，"U和1:,)=[量(代謝物，g，U)—量(代謝物，g，t,)]/[(t,-t(,^代謝物分子量]。所有時間段的代謝流量比較，在流量圖上代謝物的消耗率或生產(chǎn)率被校正，假設(shè)葡萄糖的消耗率在流量圖上為100。在圖上代謝物消耗率或生產(chǎn)率在圖上"Mcp"通過以下公式計算Mcp二(代謝消耗率/或代謝生產(chǎn)率)X100/(葡萄糖消耗率)。各種代謝物的消耗率或生產(chǎn)率根據(jù)操作說明，輸入到流量分析軟件包的代謝網(wǎng)絡(luò)模型中。函數(shù)"計算/平衡率"用于計算所有可計算的率。如果系統(tǒng)是非冗余的，可以從優(yōu)化的程序開始，線性目標(biāo)函數(shù)最小。如果系統(tǒng)是冗余的，三種方法中(簡單的最小二乘法、方差加權(quán)最小二乘法I和方差加權(quán)最小二乘法II)中一個或多個可以用于率的計算。流量率直接顯示在流量圖中。最后流量圖被拷貝在MicrosoftExcel文檔保存。A^ccj'/76^e;^FZ45生物化學(xué)途徑的代謝流量分析代謝流量分析用于評估不同碳源在Awcc^7c^e"sFZ45批式發(fā)酵中生產(chǎn)琥珀酸中的效果。對A5Y/cc//7^"ev^FZ45中生產(chǎn)琥珀酸的主要途徑分析通過以下方式酸烯醇式丙酮酸鹽(PEP)—草酰乙酸鹽(OAA)—蘋果酸鹽—延胡索酸鹽一琥珀酸。乙醛酸支路和PEP運(yùn)輸系統(tǒng)(PTS)并沒有大量的用于有機(jī)體中。葡萄糖發(fā)酵到濃度為6L7g/L，琥珀酸產(chǎn)率約94%，(琥珀酸(g)/葡萄糖(g))。發(fā)酵采用還原性更強(qiáng)的碳源，如山梨醇，產(chǎn)生更多的琥珀酸(77.3g/L),并具有更高的產(chǎn)率(108%琥珀酸(g)/葡萄糖(g)),表明還原性能可能成為葡萄糖發(fā)酵的限速因子。通過過表達(dá)Zwf提高由葡萄糖產(chǎn)生琥珀酸的產(chǎn)量菌株FZ45、FZ45/pLS88和FZ45/pJR762.73培養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)條件下，除了在轉(zhuǎn)化菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加lOOug/ml的卡那霉素以外。FZ45/pLS88作為第二對照物，用不帶PEP羧激酶啟動子或^f基因的克隆載體轉(zhuǎn)化。碳源為葡萄糖。菌株FZ45/pJR762.73顯示出較對照菌株FZ45和FZ45/pLS88增加的琥珀酸產(chǎn)量，琥珀酸最終濃度有相應(yīng)的增加。由葡萄糖生產(chǎn)琥珀酸的總量從284g增加到302g，琥珀酸的摩爾產(chǎn)率從144%增加到155%(摩爾琥珀酸/100摩爾葡萄糖)，重量產(chǎn)率從94.7%增加到101.9%,在發(fā)酵肉湯中琥珀酸最終濃度從62g/L提高到65g/L。這些結(jié)果在表1.中有所總結(jié)。所有轉(zhuǎn)化的FZ45衍生物相對于未轉(zhuǎn)化的FZ45顯示出較慢的生長，這可能是染色體外質(zhì)粒DNA復(fù)制所引起。表1FZ45、FZ45/pLS88和FZ45/pJR762.73菌株從葡萄糖生產(chǎn)琥珀酸的產(chǎn)量<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>此外，菌株FZ45/pJR762.73也產(chǎn)生較少的2種代謝物，乙酸和丙酮酸，如表2所示。表2用FZ45和FZ45/pJR762.73菌株生成其它的代謝物<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>FZ45和FZ45/pJR762.73的代謝流量分析顯示，相對于未轉(zhuǎn)化的FZ45，F(xiàn)Z45/pJR762.73有更多的碳源加入戊糖磷酸途徑(見Figure1和Figure2)。因此，在葡萄糖作為碳源時候，Z^/蛋白的過表達(dá)足以提高琥珀酸的產(chǎn)率，并減少其他代謝物的產(chǎn)生。采用還原型碳源發(fā)酵As"ccj'/70卵/^FZ45/pJR762.73采用甘露醇作為碳源，對Awc"'770ge/7sFZ45/pJR762.73進(jìn)行發(fā)酵。甘露醇是6—碳糖醇，較葡萄糖具有更強(qiáng)的還原性。采用甘露醇的時候，Z^/"的表達(dá)也可以提高琥珀酸的產(chǎn)量(見Table3)。然而，采用該糖醇發(fā)酵，即使用未轉(zhuǎn)化的FZ45菌株也顯示出提高的產(chǎn)量。可見增加代謝還原當(dāng)量的量可提高琥珀酸的產(chǎn)量。表3用甘露醇作碳源生產(chǎn)琥珀酸<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>Z^/在重組BisgaardTaxon6和BisgaardTaxon10菌株中表達(dá)的效果^rf在其他物種中的表達(dá)效果通過BisgaardTaxon6(BT6)和BisgaardTaxon10(BT10)有機(jī)體驗證。這兩種有機(jī)體都屬于巴斯德菌科，與A幼cc^o《e/7s菌株相近似。而且，這兩種有機(jī)體都是已知產(chǎn)生琥珀酸的菌株。采用上面描述的方法和相同的質(zhì)粒pJR762.73(攜帶A^/cc^7o《e/7s/^RX啟動子控制下的^F/基因)，BisgaardTaxa被轉(zhuǎn)化。使用葡萄糖作為碳源，這些轉(zhuǎn)化菌株都顯示出提高產(chǎn)量的琥珀酸。這些結(jié)果顯示在Table4中。表4BT6/pJR762.73和BT10/pJR762.73菌株從葡萄糖生產(chǎn)琥珀酸的產(chǎn)量<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>BisgaardTaxa菌株參與的這些發(fā)酵的流量分析顯示，在攜帶質(zhì)粒的菌株中，戊糖磷酸途徑的適用確實(shí)提高了。BT6/pJR762.73通過戊糖磷酸途徑較對照組利用了更多的碳源(33mol%vs.20mol%)。與此相類似，BT10/pJR762.73通過戊糖磷酸途徑利用了35mol^的碳源，而對照組僅利用5mo1%。很明顯，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，可以對此發(fā)明進(jìn)行修改和替代，只要不背離本發(fā)明的范圍和主旨。本文件中闡述的發(fā)明可以在缺少一種或幾種因素的條件下完成，這里并沒有特別的限制。本發(fā)明作用的術(shù)語和表達(dá)方式只是用于描述，而不是限制性的。除了已知的、被描述的特征的任何等同，使用這些術(shù)語和表達(dá)的并沒有特別的意圖，但是，可以看出，各種修改都可能在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，應(yīng)該理解為盡管該發(fā)明采用具體的實(shí)施例、選擇的一些特征來描述，各種概念的修改和/或改變可以歸為該領(lǐng)域內(nèi)的常識，這樣的修改和變化應(yīng)落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，在本發(fā)明的特征和方面可以用馬庫什組(Marknshgroup)或其他可代替物描述的地方，本發(fā)明也可以以馬庫什組或其他組的成員或亞組來描述。除非指明是相反的，采用任何兩種不同數(shù)值描述實(shí)施例和附加實(shí)施例中的各種數(shù)值為范圍的端點(diǎn)值，這樣的范圍也屬于本發(fā)明的范圍。說明書中所有的參考，專利和/或引用作為參考整體并入本發(fā)明，包括任何表格，圖表。權(quán)利要求1.一種產(chǎn)琥珀酸的微生物重組菌株，其特征在于，所述的菌株被表達(dá)具有Zwf酶活性的多肽的DNA分子轉(zhuǎn)化。2.如權(quán)利要求1所述的重組菌株，其特征在于，所述的微生物是一種至少約90%的16SrRNA序列與^c"/o力aci^〃s.s〃c"Voge/7s的16SrRNA相同的微生物。3.如權(quán)利要求2所述的重組菌株，其特征在于，所述的微生物選自Zc"'/7o63"72t/51.5Y/ccj./7c^e/51，BisgaardTaxon6禾口BisgaardTaxon10。4.如權(quán)利要求1所述的重組菌株，其特征在于，Zwf酶活性包括NADP還原酶活性。5.如權(quán)利要求1所述的重組菌株，其特征在于，所述的微生物被異源Z^基因轉(zhuǎn)化。6.如權(quán)利要求5所述的重組菌株，其特征在于，所述的異源Zw/基因在微生物中優(yōu)化表達(dá)。7.如權(quán)利要求5所述的重組菌株，其特征在于，所述的異源Zw/基因編碼Ecoh'Zw/酶。8.如權(quán)利要求5所述的重組菌株，其特征在于，所述的Z^/基因包括至少約95X的序列與SEQIDNO:1相同的多核苷酸。9.如權(quán)利要求1所述的重組菌株，其特征在于，所述的多肽至少約95X的氨基酸序列與SEQIDNO:3相同。10.如權(quán)利要求1所述的重組菌株，其特征在于，所述的DNA分子包括與編碼具有Zwf酶活性多肽的多核苷酸可操作連接的酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶轉(zhuǎn)錄啟動子。11.如權(quán)利要求10所述的重組菌株，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)錄啟動子包括^cti/7o/7aci^iA.wccjV^"e/7s酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶啟動子。12.如權(quán)利要求10所述的重組菌株，其特征在于，該啟動子包括至少約95X的序列與SEQIDNO:4相同、并具有啟動子活性的多核苷酸。13.如權(quán)利要求1所述的重組菌株，其特征在于，該DNA分子是外遺傳的。14.如權(quán)利要求13所述的重組菌株，其特征在于，該DNA分子存在于質(zhì)粒中。15.如權(quán)利要求1所述的重組菌株，其特征在于，該重組菌株可以產(chǎn)生濃度約為50g/L到130g/L的琥珀酸。16.如權(quán)利要求1所述的重組菌株，其特征在于，該重組菌株對至少約lg/L的氟乙酸鈉具有抗性。17.如權(quán)利要求1所述的重組菌株，其特征在于，該重組菌株是保藏在ATCC，保藏號PTA—6255的重組Zc""o6acj77iAs.si/cci/c^e/7s。18.—種產(chǎn)琥珀酸的微生物重組菌株，其己經(jīng)被表達(dá)具有NADP還原酶活性的多肽的DNA分子轉(zhuǎn)化，該多肽的至少約95%的序列與SEQIDN0:3相同。19.一種產(chǎn)琥珀酸的方法，該方法包括用權(quán)利要求1一18中任一項所述的重組微生物來發(fā)酵培養(yǎng)基。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述的培養(yǎng)基包括葡萄糖。21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，該方法產(chǎn)生的琥珀酸產(chǎn)率(g)相對于葡萄糖(g)，至少約為100%。22.—種DNA分子，包括產(chǎn)琥珀酸的微生物的啟動子，該啟動子與異源Z^/基因可操作地相連。23.如權(quán)利要求22所述的DNA分子，其中，該產(chǎn)琥珀酸的微生物為24.如權(quán)利要求22所述的DNA分子，其中，該轉(zhuǎn)錄啟動子包括酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶啟動子。25.如權(quán)利要求22所述的DNA分子，其中，該啟動子包括至少約95%的序列與SEQIDNO:4相同的多核苷酸，且該多核苷酸具有啟動子活性。26.—種DNA質(zhì)粒，包括如權(quán)利要求22—25中任一項所述的DNA分子。27.—種宿主細(xì)胞，包括權(quán)利要求26中所述的DNA質(zhì)粒。28.如權(quán)利要求27所述的宿主細(xì)胞，其中，該宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生濃度約為50g/L到130g/L的琥珀酸。全文摘要本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生有機(jī)酸的重組微生物。該重組微生物表達(dá)一種用于戊糖磷酸循環(huán)的具有酶活性的多肽。該重組微生物可以包括已經(jīng)被轉(zhuǎn)化的，可以表達(dá)6-磷酸葡糖脫氫酶(Zwf)基因的琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)。該重組微生物可以用于產(chǎn)生有機(jī)酸的發(fā)酵過程，例如，琥珀酸和乳酸。本發(fā)明還涉及一種用于轉(zhuǎn)化微生物以產(chǎn)成表達(dá)如Zwf酶的重組微生物的新的質(zhì)粒。文檔編號C12N15/74GK101128577SQ200580048242公開日2008年2月20日申請日期2005年12月16日優(yōu)先權(quán)日2004年12月22日發(fā)明者簡·易,蘇珊娜·克勒夫,邁克爾·V·居特勒申請人:密歇根生物技術(shù)研究所