根部優(yōu)先的可被創(chuàng)傷和昆蟲誘導的2-酮戊二酸依賴型玉米加氧酶啟動子及其應用的制作方法

專利名稱：根部優(yōu)先的可被創(chuàng)傷和昆蟲誘導的2-酮戊二酸依賴型玉米加氧酶啟動子及其應用的制作方法
專利說明根部優(yōu)先的可被創(chuàng)傷和昆蟲誘導的2-酮戊二酸依賴型玉米加氧酶啟動子及其應用 發(fā)明領域 本發(fā)明涉及到植物分子生物學領域，更具體的涉及到植物的基因表達調控。

背景技術：
植物基因工程領域中的新進展已經可以對植物進行工程改造，使之具有改善的特征或性狀，例如疾病抗性、昆蟲抗性、除草劑抗性，植物來源最終消費品穩(wěn)定性或保質期的提高，以及植物可食部位營養(yǎng)質量的改善。因此可將非植物來源的一個或多個具有不同或改善特性的所需基因，導入到植物基因組中。新基因即可在植物細胞中表達并表現(xiàn)出所需表型，例如新性狀或特征。
為了在植物細胞中表達新插入的基因，必須在正確的部位存在基因的正確調控信號。這些調節(jié)信號可包括但不僅限于啟動子區(qū)域、5’非翻譯前導序列和3’轉錄終止/多聚腺苷酸化序列(poly(A))。
啟動子是一段DNA序列，它在植物細胞中指揮從其本身相鄰的下游(3’)編碼序列產生RNA。啟動子區(qū)域影響基因的RNA轉錄的速率、發(fā)展階段和所屬的細胞類型。RNA轉錄物被加工產生信使RNA(mRNA)，它作為翻譯模板將RNA序列翻譯成所編碼的多肽序列。5’非翻譯前導序列是mRNA蛋白編碼區(qū)上游的區(qū)域，它可能在mRNA的起始和翻譯過程中發(fā)揮作用。3’轉錄終止/多聚腺苷酸信號是蛋白編碼區(qū)的下游區(qū)域，在植物細胞中它引起RNA轉錄的停止和RNA3’末端poly(A)的添加。
外源DNA序列在植物細胞中的表達依賴于操作性連接的啟動子的存在，在植物宿主中發(fā)揮作用。根據要在生物體中何時何地表達所需的外源DNA，來選擇啟動子序列的類型。當需要在特定組織或器官中進行表達時，可以選用組織優(yōu)先(tissue-preferred)啟動子。當需要進行刺激物響應的表達時，選用誘導型啟動子作為調控元件。相反，當需要在整個植物體細胞中進行持續(xù)表達，則用組成性啟動子。
誘導型啟動子在響應誘導物時，能夠直接或間接活化一個或多個DNA序列或基因的轉錄。當誘導物不存在時，該DNA序列或基因則不被轉錄，或者轉錄水平比誘導狀態(tài)下的低。這種誘導物可以是化學試劑，例如代謝物、生長調節(jié)物、除草劑或酚類化合物，也可以是直接作用于植物體的物理效應，例如低溫、干旱、高溫、鹽、毒素。如要抵御植物害蟲時，也需要可被植物病原體誘導的啟動子，包括植物昆蟲害蟲、線蟲或致病因子如細菌、病毒或真菌。與病原體的接觸會誘導轉錄的活化，從而一次產生有效保護植物的抗病原蛋白。病原誘導的啟動子也可用于檢測與病原的接觸，例如通過表達可檢測性標記從而評價對殺蟲劑的使用需求?？赏ㄟ^在細胞或植物體外使用誘導物處理含有誘導型啟動子的植物細胞，如通過噴霧、灌溉、加熱，或暴露于有效病原。
組成型啟動子是遍及植物體不同部分以及貫穿植物體發(fā)育的持續(xù)指導基因表達的啟動子。廣泛用于誘導轉基因植物中外源基因表達的組成型啟動子包括如，來自根瘤病土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)G藍曙紅合酶(NOS)基因啟動子(美國專利5,034,322)、花椰菜鑲嵌病毒(CaMv)35S和19S啟動子(美國專利5,352,605)，起源于任意幾種肌動蛋白基因(已知它們在大多數類型的細胞中都有表達)的啟動子(美國專利6,002,068)以及泛素啟動子(已知其是在許多細胞中累積的基因產物)。
核心啟動子序列的上游和/或下游的額外調控序列可包括于轉化載體的表達構建體中，從而在轉基因植物中引起外源基因不同水平的表達。因此，通過基因工程技術對植物進行遺傳改造以得到具備有用特性的植物的這一過程需要多種啟動子。
為了轉基因植物技術商業(yè)應用的最大化，以位點特異性方式指導引入的基因進行表達可能是有益的。例如在遭受病原攻擊的組織中產生毒素抵抗化合物，而在將被收割并被消費者食用的組織中則不產生該物質，這種方式可能是有效的。通過進行位點特異性合成或儲存所需蛋白或化合物，可將植物用作工廠或生產系統(tǒng)來產生多種具有商業(yè)價值的化合物。細胞特異性啟動子為高度分化的組織或器官如根、葉、脈管、胚芽、種子或花，提供對空間和時間上的化合物合成進行指導的能力。
或者在植物組織中抑制天然DNA序列的表達，這可能對產生所需表型也是有效的。通過轉化植株使其包含操作性連接于反義核苷酸序列的組織優(yōu)先啟動子，從而表達反義序列以產生干擾天然DNA的mRNA的翻譯的RNA轉錄物，最終達到抑制效果。
特別令人關注的啟動子是由“昆蟲侵食”這一因素所誘導的。昆蟲是世界糧食損失的主要因素。僅由玉米根蟲所引起的糧食損失即已經達到每年10億美元。在世界上的許多地區(qū)西方玉米根蟲(又稱為西方玉米根葉甲(western com rootworm))(WCRW)是主要的玉米害蟲。雖然不如WCRW那樣重要，但南方玉米根蟲(又稱為南方玉米根葉甲)和北方玉米根蟲(又稱為北方玉米根葉甲)也造成了相當大的玉米損失。玉米根蟲造成的損害可能會引起倒伏(lodging)增加、干旱抗性下降，并最終造成玉米減產。另一種主要昆蟲是玉米螟(Ostrinia nubilalis)，通常稱作玉米鉆心蟲(European corn borer(ECB))。
因為使用啟動子來控制導入的嵌合基因的表達模式，所以對分離并鑒定可控制嵌合基因表達的新型啟動子的需求在不斷增強。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供了在植物體中調控基因表達的組合物和方法。組合物含有新型誘導型啟動子核苷酸序列，它可在受到創(chuàng)傷或被昆蟲侵食時起始轉錄。更具體來說，提供了分離自玉米的轉錄起始區(qū)域。本發(fā)明另外的實施方案中包含有SEQ ID NO1中所列的核苷酸序列，SEQ ID NO1中所列核苷酸序列的片段以及植物啟動子(美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)在2004年11月3日以細菌宿主方式保藏，專利保藏號PTA-6278)。本發(fā)明的實施方案還包含與SEQ ID NO1中所列核苷酸序列至少具有95％同一性的核苷酸序列，它可在創(chuàng)傷和昆蟲誘導下驅動操作性連接的核苷酸序列的表達。也包含了SEQID NO1中所列核苷酸序列的功能片段，它可在創(chuàng)傷和昆蟲誘導下驅動操作性連接的核苷酸序列的表達。
本發(fā)明的實施方案中也包括DNA構建體，該構建體含有操作性連接于異源核苷酸序列上的啟動子，該啟動子含有本文公開的序列，并可在植物細胞中驅動上述核苷酸序列進行表達。本發(fā)明的實施方案還提供了表達載體，以及在基因組中穩(wěn)定包含上述DNA構建體的植物或植物細胞。另外組合物也包括這種植物的轉基因種子。
方法實施方案中包括在植物中選擇性表達核苷酸序列的方法，這包括使用DNA構建體轉化植物細胞并從該細胞出發(fā)再生植物體，所述DNA構建體包含啟動子和操作性連接于其上的異源核苷酸序列，而所述啟動子在受到創(chuàng)傷和昆蟲誘導時在植物細胞中起始所述異源核苷酸序列的轉錄。以這種方式，啟動子序列可在誘導方式下發(fā)揮控制操作性連接的編碼序列表達的作用。
位于啟動子下游并處于該啟動子轉錄起始調控下的序列可以是目的序列，它將對植物表型進行修飾。這種修飾包括調節(jié)內源產物的生產(如生產量、相對分布等)或者是外源表達產物的生產，以得到具有新功能或新產物的植株。例如異源核苷酸序列所編碼的基因產物提供了對除草劑、鹽、低溫、干旱、病原或昆蟲的抗性。
在另一個實施方案中，提供了在穩(wěn)定轉化植株中調節(jié)基因表達的方法，步驟包括(a)使用DNA構建體轉化植株，該構建體包含上述啟動子和操作性連接于其上的至少一個核苷酸序列；(b)在植株生長條件下培養(yǎng)植物細胞；(c)從該植物細胞出發(fā)再生一個穩(wěn)定轉化植株，其中所述核苷酸序列的表達改變了該植株的表型。
附圖簡述

圖1為來自V5階段玉米根部組織(被西方玉米根蟲侵食或未被侵食)中2-酮戊二酸(2-oxoglutarate)依賴型加氧酶表達的northern印跡分析結果。這兩種情況下的葉中都沒有檢測到該酶的表達。移植指將植株轉移到新鮮土壤中。由該過程引起的根部損傷不誘導過氧化酶的表達。因此，該圖說明了根部表達的模式和CRW的可誘導性，這與Lynx MPSS數據的預測相同。實施例2中更詳細的描述了該圖中的印跡實驗。
圖2中的northem印跡分析結果顯示了根部組織遭受損傷后，2-酮戊二酸依賴型加氧酶表達的時間過程。在該實驗的各個時間點都沒有檢測到葉組織中該酶的表達。因此，該圖說明了根部表達的模式和CRW的可誘導性，這與Lynx MPSS數據的預測相同。實施例2中更詳細的描述了該圖中的印跡實驗。
圖3為玉米的2-酮戊二酸依賴型加氧酶啟動子序列，標出了TATA盒、轉錄起始位點(TSS)(根據5’RACE作圖得到)和啟動子序列中的其它目的基序的位置。實施例4中提供了更多細節(jié)。
發(fā)明詳述 本發(fā)明的實施方案包含新型植物啟動子核苷酸序列，具體來說是可被創(chuàng)傷和昆蟲誘導的2-酮戊二酸依賴型玉米加氧酶基因啟動子(下文中稱作2OD加氧酶基因)，更具體來說，該2-酮戊二酸依賴型加氧酶基因啟動子在下文中被稱作2OD加氧酶啟動子。實施方案提供了分離的核酸分子，其中包含SEQ ID NO1中所列的核苷酸序列和植物啟動子序列(該啟動子儲存于細菌宿主中，專利號為PTA-6278(2004年11月3日))，以及該序列的片段、變異體和互補序列。
含有所述植物啟動子核苷酸序列的質粒被美國典型培養(yǎng)物保藏中心專利保藏部(Patent Depository)(位于10801 University Blvd，Manassas，VA 20110-2209)所保藏(2004年11月3日)，指定的專利保藏號為PTA-6278。該保藏物將按照國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約的規(guī)定得以維持。該保藏物僅為本領域技術人員提供便利，而不是承認該保藏物是35 USC§112條款所要求的。該保藏物不能撤回，并且在不存在限制或條件的情況下，專利一經授權公眾即可取得。但是并不能認為允許使用該保藏物就意味著可損害政府賦予的專利權利而實施本發(fā)明。
實施方案中的啟動子序列對按照可誘導方式表達操作性連接于其上的核苷酸序列來說是有用的，尤其是按照昆蟲侵食或創(chuàng)傷誘導方式進行表達時，更是如此。這些序列也可用于構建表達載體以隨后轉化到目的植物體中，用作探針以分離其它2OD加氧酶基因啟動子，用作分子標記等。
從玉米基因組DNA中分離出實施方案中的玉米2OD加氧酶基因啟動子。在本文實施例4的實驗部分描述了得到2OD加氧酶基因啟動子的特異方法。
實施方案中包括了分離或基本純化的的核酸組合物?！胺蛛x的”或“純化的”核酸分子或其生物活性部分，基本不含其它細胞成分，或者基本不含培養(yǎng)基(當使用重組技術制備時)，或基本不含化學前體或其它化學品(當進行化學合成時)?！胺蛛x的”核酸基本不含該核酸來源于的生物體基因組DNA中天然存在于該核酸側翼的核苷酸序列(即位于所述核酸3’或5’末端的核苷酸序列)。例如在不同實施方案中，分離的核酸分子可包含該核酸來源于的生物體基因組DNA中天然存在于該核酸分子側翼的核苷酸序列，而其長度小于約5kb、4kb、3kh、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb。
Lynx大規(guī)模平行特征測序系統(tǒng)(Massively Parallel SignatureSequencing(MPSS))說明，該玉米2OD加氧酶基因在受到玉米根食蟲侵食或機械損傷時，優(yōu)先在玉米根部組織中表達，將在實施例1中進一步討論。2OD加氧酶參與使用O的氧化反應，并發(fā)現(xiàn)它存在于許多初級和次級代謝物生物合成途徑中。另一個緊密相關的2OD加氧酶基因的產物與上文所述基因的預測產物有81％的氨基酸同一性，該2OD加氧酶參與DIMBOA的生物合成。DIMBOA，一種苯并噁嗪類化合物(benzoxazinoid)，是一種天然殺蟲劑，并且是影響宿主植物對微生物疾病和昆蟲抗性的重要因子，同時也是一種穩(wěn)變異構化合物(allelochemicals)。
2OD加氧酶啟動子序列以可誘導的方式指導操作性連接于其上的核苷酸序列的表達。因此，20D加氧酶啟動子序列可用于以可誘導方式表達操作性連接于其上的目的核苷酸序列。具體的，實施方案的啟動子在損傷或昆蟲侵食后進行誘導表達。
實施方案的組合物包括分離的核酸分子，這其中包含了SEQ IDNO1中所列的啟動子序列。“啟動子”一詞指DNA調控序列，其中通常含有一個TATA盒，該序列能夠指導RNA聚合酶II在合適的轉錄起始位點上起始特定編碼序列的轉錄。啟動子也可另外含有其他識別序列，它們通常位于TATA盒的上游或5’端，被稱作上游啟動子元件，這些元件能夠影響轉錄速率。應認識到當鑒別了本文所公開的啟動子區(qū)域的核苷酸序列后，分離并鑒別位于本文所鑒別的特定啟動子區(qū)域上游的5’非翻譯區(qū)內的其它調控元件就屬于現(xiàn)有技術范圍了。因此，本文公開的啟動子區(qū)域可另外包含上游調控元件，如那些負責編碼序列組織特異性和時間特異性表達的元件，增強子等。具體見澳大利亞專利(Australian Patent)AU-A-77751/94和美國專利5,466,785以及5,635,618。同樣的，能夠進行誘導表達的啟動子元件也可與其它核心啟動子一起被鑒別、分離和使用，以進行誘導表達。這些實施方案中所指的核心啟動子指沒有啟動子元件的啟動子。
本文中的“調控元件”也指通常(但不總是)位于結構基因編碼序列上游(5’)的DNA序列，這包括通過提供RNA聚合酶和/或其它轉錄因子識別位點以在特定位置開始轉錄的序列。通過提供RNA聚合酶或其它轉錄因子識別位點以確保從特定位置起始轉錄的調控元件的一個例子是啟動子元件。啟動子元件包括核心啟動子元件，它負責起始轉錄，以及其它調控元件(如本文其它地方所公開的)，它們負責修飾基因表達。應當認識到內含子內的核苷酸序列或編碼區(qū)域3’端的序列也可能參與了目的編碼區(qū)域的表達調控。合適的內含子包括(但不僅限于)玉米IVS6內含子或玉米肌動蛋白內含子。調控元件也可包含那些位于轉錄起始位點下游(3’)的元件，或者位于被轉錄區(qū)域內的元件，或者同時包含兩者。本文中的轉錄后調控元件可包括哪些在轉錄起始后發(fā)揮作用的元件，如翻譯和轉錄增強子、翻譯和轉錄抑制子，以及mRNA穩(wěn)定性決定子。
實施方案中的調控元件或其片段可以與異源調控元件或啟動子操作性連接，以調節(jié)異源調控元件的活性。這種調節(jié)包括增強或抑制異源調控元件的轉錄活性、調節(jié)轉錄后事件，或既增強(或抑制)異源調控元件的轉錄活性又調節(jié)轉錄后事件。例如，實施方案中的一個或多個調控元件或其片段可以與組成型、誘導型或組織特異性啟動子(或其片段)操作性連接，以在目的組織的植物細胞中調節(jié)這些啟動子的活性。
當將玉米20D加氧酶啟動子裝配進DNA構建體，從而操作性連接于目的核苷酸序列上，并用該DNA構建體穩(wěn)定轉化植物細胞后，該啟動子能夠啟動所述核苷酸序列的表達?！安僮餍赃B接”指使得異源核苷酸序列處于啟動子作用下的連接方式?！安僮餍赃B接”也指將兩個核苷酸序列連接起來從而使每個DNA片段的編碼序列都保持在適當的閱讀框內。在這種方式下，在DNA構建體中同時提供實施方案的啟動子核苷酸序列和目的核苷酸序列(通常為要在目的植物中進行表達的異源核苷酸序列)。“異源核苷酸序列”指天然狀態(tài)下沒有與所述啟動子序列操作性連接的序列。雖然該核苷酸序列與所述啟動子序列來源不同，但它對植物宿主來說可能是同源的或天然的，或者是異源的或外源的。
應當認識到可以將實施方案的啟動子序列與它們的天然編碼序列共同使用，以提高或降低表達，從而改變轉化植物體表型。
對實施方案中分離的啟動子序列進行修飾，可以將異源核苷酸序列的表達控制在某一個范圍內。因此可將它們修飾為弱啟動子或強啟動子。一般的，“弱啟動子”指驅動編碼序列低水平表達的啟動子?！暗退健北磉_指表達水平在約1/10,000到約1/100,000到約1/500,000轉錄物。相反，強啟動子驅動編碼序列高水平表達，或者說表達水平在約1/10到約1/100到約1/1,000轉錄物。
本文所公開的啟動子序列的片段、變異體也包含在實施方案中。“片段”指啟動子序列的一部分。啟動子序列的片段可保持生物活性，從而包含能夠驅動操作性連接于其上的核苷酸序列進行可誘導的表達的序列。因此例如，可以使用不完整的本文所公開的啟動子序列驅動操作性連接于其上的目的核苷酸序列進行表達，例如編碼外源蛋白的核苷酸序列。本領域技術人員能夠確定這些片段是降低了表達水平還是改變了表達性質(即組成型表達或誘導表達)。啟動子核苷酸序列的片段如果用作雜交探針(如下文所述)，也可以不保持其調控活性。因此這些片段的長度范圍可以為至少約20核苷酸、約50核苷酸、約100核苷酸，直到為實施方案中的全長核苷酸序列。
因此，20D加氧酶啟動子核苷酸序列可以編碼20D加氧酶啟動子的一個生物活性部分，或者是可用作雜交探針或PCR(使用下文所述方法)引物的片段。可分離20D加氧酶啟動子的部分核苷酸序列并評價其活性，從而制備20D加氧酶啟動子的生物活性部分。啟動子核苷酸序列的片段即核酸分子可包含本文所公開啟動子核苷酸序列中的至少15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、800、900、1000個核苷酸，或者為全長序列，如SEQ ID NO1中所列序列的1116個核苷酸。
這些片段的核苷酸通?？砂囟▎幼有蛄械腡ATA識別序列?？墒褂孟拗菩悦盖虚_本文所公開的天然啟動子核苷酸序列，或者從天然啟動子DNA序列合成，或者使用PCR方法，制備這些片段。具體參見Mullis等.(1987)Methods Enzymol 155335-350，和Erlich，ed.(1989)PCR Technology(StocKton Press，New York)。這些啟動子片段的變異體，如通過定點突變和DNA改組(shuffling)得到的變異體，也包含在實施方案的組合物中。
實施方案中的調控元件的“類似物”包括那些調控元件序列發(fā)生替換、刪除或添加后所得的并至少保持實施方案中與調控元件相聯(lián)系的一種調控特性的序列。這些調控特性包括定向器官特異性、組織特異性(或這兩者的組合)，或者時間特異性或生長階段特異性(或這兩者的組合)。
“變異體”指與本文所公開啟動子序列具有基本相似性的序列。核苷酸序列的天然變異體包括如可通過熟知分子生物學技術(如下文所述的聚合酶鏈式反應(PCR)和雜交技術)進行鑒別的序列。變異核苷酸序列也包括人工合成所得核苷酸序列，如通過定點突變所得的序列。一般的，實施方案中特定核酸的變異體與該核苷酸序列至少具有約40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、到95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性(通過序列比對程序確定，使用默認參數，在本文其它部分描述)。實施方案中也包括了生物活性變異體。生物活性變異體包括如，實施方案中的啟動子序列發(fā)生了一個或多個核苷酸替換、刪除或插入的序列?？墒褂萌鏽orthern印跡分析或轉錄融合中報告物(reporter)的活性測定等方法來測量啟動子活性。見如Sambrook等(1989)分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningALaboratory Manual)(2ded.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork)(通過引用并入本文)，下文中簡稱為“Sambrook”。或者可測量處于啟動子片段或變異體控制下的報告基因產物如綠色熒光蛋白(GFP)等的水平。見如美國專利6,072,050(通過引用并入本文)。
本領域中熟知突變和核苷酸序列改變方法。見如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-492；Kunkel等(1987)酶學方法(Methods in Enzymol.)154367-382；美國專利4,873,192；Walker和Gaastra，eds.(1983)分子生物學技術(Techniques in MolecularBiology)(MacMillan Publishing Company，New York)，以及本文引用的其它文獻。
啟動子核苷酸序列變異體也包括通過突變或重組技術，如DNA改組，所得的產物。通過這些方法，可對一個或多個不同啟動子序列進行操作以得到保有所需特性的新啟動子。以這種方式，可從包含有具備基本序列同一性并可在體內或體外發(fā)生同源重組的序列區(qū)域的相關多核苷酸序列群體中產生重組多核苷酸文庫。本領域技術人員了解這種DNA改組的方法。見如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9110747-10751；Stemmer(1994)Nature 370389-391；Crameri等(1997)Nature Biotech.15436-438；Moore等(1997)J Mol Biol272336-347；Zhang等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 944504-4509；Crameri等(1998)Nature 391288-291；美國專利5,605,793及5,837,458。
實施方案中的核苷酸序列可用于從其它生物體中分離相應序列，如其它植物(如單子葉植物)。這樣就可根據這些相應序列與本文所列序列間的序列同源性，使用如PCR、雜交等技術來鑒別這些相應序列。因此，根據它們與本文所列的完整20D加氧酶啟動子序列(或其片段)間的序列同一性而分離的相應片段，也包括在實施方案中。實施方案的啟動子區(qū)域可從任何植物中分離，包括(但不僅限于)玉米(Zea mays)、蕓苔屬(油菜(Brassica napu)、蕪菁(Brassica rapassp.))、苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麥(Secalecereale)、高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、向日葵(Helianthusannuus)、小麥(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、煙草(Nicotianatabacum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypium hirsutum)、甜馬鈴薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Cofea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠蘿(Ananascomosus)、橘樹(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camelliasinensis)、香蕉(Musa spp.)、鱷梨(Persea americana)、無花果(Ficuscasica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄欖樹(Oleaeuropaea)、燕麥、大麥、紅花、蔬菜、觀賞植物和松類。
可設計寡核苷酸引物通過PCR從任何目的植物體的cDNA或基因組DNA提取物中擴增出相應DNA序列。本領域中熟知PCR引物設計和PCR克隆方法，見上文文獻Sambrook。也見Innis等，eds.(1990)PCR實用手冊方法指導與應用(PCR ProtocolsA Guide toMethods and APPlications)(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand等(1995)PCR策略(PCR Strategies)(Academic Press，NewYork)；nnis和Gelfand等(1999)PCR方法手冊(PCR MethodsManual)(Academic Press，New York)。已知的PCR方法包括(但不僅限于)使用成對引物、嵌套引物、單特異性引物(single speciffcprimers)、簡并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯配方法等。
在雜交方法中，所用探針為完整或部分已知核苷酸序列，它們能夠選擇性與來自選定生物基因組DNA克隆片段或cDNA片段群體(即基因組DNA或cDNA文庫)中相應核苷酸序列雜交。雜交探針可以是基因組DNA克隆片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且也可使用可檢測性標記物，如32P等，進行標記。因此，可通過對根據20D加氧酶啟動子序列合成所得的寡核苷酸進行標記，來制備雜交探針。本領域中熟知探針制備方法、cDNA和基因組DNA文庫構建方法，見上文文獻Sambrook。
例如，可將本文公開的2OD加氧酶啟動子序列或其一個或多個片段作為探針，它們能夠特異性結合到2OD加氧酶啟動子序列的相應區(qū)域上。為了在多種條件下進行特異性雜交，這些探針包含2OD加氧酶啟動子序列中的獨特序列，并且長度至少約為10個核苷酸，包括長度至少約為20個核苷酸的序列?？墒褂眠@些探針通過PCR從選定植物體中擴增出2OD加氧酶啟動子的相應序列。該方法可用于從目的植物體中分離額外的編碼序列，或者用作診斷實驗以確定植物體中編碼序列的存在。雜交技術包括雜交篩選平板DNA文庫(plated DNA libraries)(噬斑或者菌落；見如上文文獻Sambrook)。
可以在嚴緊性條件下進行這些序列的雜交?！皣谰o性條件”或“嚴緊性雜交條件”定義如下在這種條件下探針與其靶序列間的雜交水平可檢測性的高于與其它序列的雜交水平(如至少是背景的2倍)。嚴緊性條件是序列依賴性的，在不同環(huán)境中也不同。通過控制雜交嚴緊性和/或洗滌條件，可鑒別出與探針完全互補的序列(同源探查(homologous probing))?；蛘撸{節(jié)嚴緊性條件以允許一些錯配，從而檢測到相似性較低的序列(異源探查(heterologous probing))。探針長度一般小于1000個核苷酸，包括那些長小于500個核苷酸的序列。
典型嚴緊性條件為鹽濃度小于約1.5MNa離子，通常為0.01-1.0M(或其它鹽)；pH為7.0-8.3；當使用短探針(如10-50個核苷酸)時溫度至少約為30℃，使用長探針(如大于50個核苷酸)時溫度至少為60℃。也可通過添加去穩(wěn)定物質如甲酰胺來得到嚴緊性條件。低嚴緊性條件的實例包括用含有30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸鈉)的雜交緩沖液37℃雜交，用1X-2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M檸檬酸三鈉)在50-55℃進行洗滌。示例性中嚴緊性條件包括用含有40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS雜交緩沖液在37℃雜交，用0.5X-1X SSC在55-60℃進行洗滌。示例性高嚴緊性條件包括用含有50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的雜交緩沖液在37℃雜交，用0.1X SSC在60-65℃洗滌至少30min。雜交持續(xù)時間通常小于24h，一般約為4-12h。
特異性通常是雜交后洗滌的函數(function)，關鍵因子是最終洗滌溶液的離子強度和溫度。對DNA-DNA雜交體來說，熔點(Tm)溫度近似值可從以下公式得到(Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138267-284)Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L，其中M是單價陽離子的摩爾濃度，％GC是鳥嘌啉和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是雜交緩沖液中甲酰胺的濃度，L是雜交堿基對的長度。Tm是互補靶序列在規(guī)定離子強度和pH下與完全配對探針發(fā)生50％雜交的溫度。每1％的錯配使Tm下降1℃；因此可調節(jié)Tm、雜交條件就和/或洗滌條件，使得具備所需同一性的序列發(fā)生雜交。例如，如果要尋找同一性≥90％的序列，可將Tm降低10℃。通常，將嚴緊性條件選定為在規(guī)定離子強度和pH下，低于特異性序列與其互補序列的Tm約5℃。不過高嚴緊性條件的雜交和/或洗滌溫度可以為低于Tm約1、2、3或4℃；中嚴緊性條件的雜交和/或洗滌溫度可以為低于Tm約6、7、8、9、10℃低嚴緊性條件的雜交和/或洗滌溫度可以為低于Tm約11、12、13、14、15、20℃。使用上文方程、雜交和洗滌緩沖液成分以及所需Tm，本領域技術人員將充分理解本文中所述的雜交和/或洗滌條件嚴緊性的變化。如果所需的錯配程度需要Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，優(yōu)選提高SSC濃度從而可使用更高的溫度。核酸雜交方法可見Tijssen(1993)生化和分子生物學實驗室技術-核酸探針雜交(LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Acid Probes)，Part I，Chapter 2(Elsevier，New York)；Ausubel等編輯.(1995)分子生物學實驗室指南(Current Protocols inMolecular Biology)，Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)，下文簡稱作“Ausubel”。也見上文文獻Sambrook。
因此，具有誘導型啟動子活性的分離序列，可在嚴緊性條件下與本文所公開的20D加氧酶啟動子序列雜交，或者與它們片段雜交，也包括在實施方案中。
通常，具有啟動子活性的序列和可與本文所公開的啟動子序列雜交的序列，與本文所公開序列至少40-50％同源，約為60、70、80、85、90、95-98％或更高。也就是說，序列相似性至少可為40-50％，約為60、70、80、85、90、95-98％。
下列術語用于描述兩個或多個核酸或多核苷酸間的關系(a)“參考序列”，(b)“對比窗”，(c)“序列同一性”，(d)“序列同一性百分比”，和(e)“基本同一”。
(a)這里所用的“參考序列”指用于序列對比基礎的序列。參考序列可以是完整或部分特定序列；例如是全長cDNA或基因序列的片段，或者是完整cDNA或基因序列。
(b)這里所用的“對比窗”指多核苷酸序列的一個連續(xù)特定片段，其中對比窗內多核苷酸相比參考序列(不包含添加或刪除)，可包含添加或刪除(即缺口)，以對兩個序列進行最優(yōu)比對。通常對比窗長度至少為20個連續(xù)核苷酸，可任選為30、40、50、100個連續(xù)核苷酸或更長。本領域技術人員理解，為避免由于包含缺口而引起待測序列與參考序列間的高度相似性，典型做法是引入缺口扣分值，該值將從匹配數中扣除。
本領域技術人員熟知序列比對方法。因此可使用數學算法確定任意兩個序列間的一致性百分比。優(yōu)選的數學算法包括(但不僅限于)Myers and Miller(1988)CABIOS 411-17；局部同源性算法，Smith等.(1981)Adv.Appl.Math.2482；同源性比對算法，Needleman andWunsch(1970)J.Mol.Biol.48443-453；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.852444-2448；Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264，修改算法見Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877。
可使用電腦軟件對這些數學算法進行補充，以確定對比序列間的一致性。這些電腦軟件包括(但不僅限于)CLUSTAL，PC/Gene程序(來自Intelligenetics，Mountain View，California)；ALIGN程序(Version 2.0)；ALIGN PLUS程序(Version 3.0，copyright 1997)andGAP，BESTFIT，BLAST，F(xiàn)ASTA；TFASTA，Wisconsin GeneticsSoftware Package of Genetics Computer Group，Version 10(來自Aceelrys，9685 Scranton Road，San Diego，CA，92121，USA)。WisconsinGenetics Software Package Version 10中所用的記分矩陣是BLOSUM62(見Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad Sci.USA 8910915)。
這些程序中可以使用默認參數。CLUSTA程序的描述見Higgins等.(1988)Gene 73237-244(1988)；Higgins等.(1989)CABIOS5151-153；Corpet等.(1988)Nucleic Acids Res.1610881-90；Huang等。(1992)CABIOS 8155-65；Pearson等。(1994)Meth.Mol.Biol.24307-331。ALIGN和ALIGN PLUS程序都基于上文文獻Myers and Miller(1988)。當比較氨基酸序列時，在ALIGN程序中可使用PAM120重量殘基工作臺，缺口長度扣分值定為12，缺口扣分值定為4。BLAST程序見Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403，它基于上文文獻Karlin和Altschul(1990)?？墒褂肂LASTN程序進行BLAST核苷搜索，參數為score＝100，wordlength＝12，以確定待測核苷酸序列與實施方案中蛋白編碼核苷酸序列間的同源性?？墒褂肂LASTX程序進行BLAST蛋白搜索，參數為score＝50，wordlength＝3，以確定待測蛋白與實施方案中蛋白或多肽間的同源性。為進行對比而確定缺口比對，可使用Gapped BLAST(inBLAST2.0)，見Altschul等.(1997)Nucleic Acids Res.253389，或者使用PSI-BLAST(in BLAST2.0)進行反復搜索，以檢測分子間的遠距離相關性。見上文文獻Altschul等.(1997)。當使用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST時，可使用這些程序的默認參數(如使用BLASTN處理核苷酸序列，使用BLASTX處理蛋白)。見美國國家生物技術信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)的網站。可通過瀏覽相關信息而進行手動比對。
如果沒有特別指出，本文所提供隊序列同一性/相關性都是使用GAP程序(默認參數，或其它等價程序)而獲得的。“等價程序”指任何對任意兩個待測序列進行對比的程序，當與從GAP所得的相應比對結果相比較時，相應它們可生成含有同一核酸或氨基酸殘基匹配的比對結果，以及序列同一性百分比。
GAP程序使用上文文獻Needleman和Wunsch(1970)的比對方法，以得到兩個完整序列間的最大匹配數和最小缺口。GAP考慮所有的可能的比對和缺口位置，并建立含有最大數目匹配堿基和最少缺口的比對結果，它允許在匹配堿基單位內提供缺口建立扣分值和缺口延伸扣分值。GAP程序必須為每個由它插入的缺口，在匹配堿基缺口建立扣分數目上獲利。如果選定的缺口延伸扣分值大于零，GAP必須另外為每個插入的缺口，在缺口延伸扣分的缺口時間長度上獲利。在Wisconsin Genetics Software Package Version 10的蛋白分析中，默認的缺口建立扣分值和缺口延伸扣分值分別為8和2，在核酸分析中，默認的缺口建立扣分值和缺口延伸扣分值分別為50和3。缺口建立扣分值和缺口延伸扣分值可以為從0-200間的整數。因此，缺口建立扣分值和缺口延伸扣分值可以為如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更高。
(c)這里所用的兩個核酸或多肽序列間的“序列同一性”或“一致性”指當在一個特定對比窗內進行比對以獲得最大對應性(correspondence)時，兩個序列間相同的殘基。當用序列同一性百分比用于蛋白時，應認識到殘基不同的位置上通常都是發(fā)生的保守性氨基酸替換，其中的氨基酸殘基被其它具有相似化學特性(如電荷或疏水性)的氨基酸所替換，從而并沒有改變分子的功能特性。當序列間的不同是由保守性替換所引起的時候，可根據替換的保守性特征將序列同一性百分比向上調整以進行校正。這種因保守性替換而不同的序列即具有所述的“序列相似性”或“相似性”。本領域技術人員熟知進行這種調整的方法。典型作法是將保守性替換作為部分不匹配而不是完全不匹配來進行賦值，從而提高序列同一性百分比。因此例如，當給相同的氨基酸賦值1，而因非保守性替換不同的氨基酸賦值0，則因保守性替換而不同的氨基酸賦值在0到1之間。保守性替換的賦值可通過如PC/GENE程序(Wisconsin GeneticsSoftware Package of Genetics Computer Group，Mountain View，California)來進行。
(d)這里所用的“序列同一性百分比”指通過在對比窗內對兩個進行最優(yōu)比對的序列進行對比所得的值，其中在與參考序列(它不包含添加或刪除)對比時，對比窗內的多肽序列部分可包含殘基添加或刪除(即缺口)，以對兩個序列進行最優(yōu)比對。確定序列間核酸堿基或氨基酸殘基相同的位置數目，得到匹配位置數，然后除以對比窗內的總位置數，再乘以100，即得到序列同一性百分比。
(e)(i)多核苷酸序列的“基本同一”指多核苷酸包含一段序列同一性(使用上文所述的比對程序并使用標準參數，與參考序列相比)至少為70、80、90或至少為95％的序列。本領域技術人員應認識到，在考慮密碼子簡并性、氨基酸相似性、閱讀框位置等因素后，可對這些值進行適當調整以確定兩個序列所編碼蛋白間的相應同一性。用于這些目的的氨基酸序列基本同一通常所指的序列同一性為至少60、70、80、90、95％。
其它說明核苷酸序列具有基本同一性的標志是，它們可以在嚴緊性條件下進行雜交。一般的，將嚴緊性條件選定為在規(guī)定的離子強度和pH，溫度低于特定序列的Tm約5℃。但是如同本文其它部分所定義的，嚴緊性條件也包括溫度低于Tm約1-20℃，這依賴于本文其它地方確定的所需嚴緊性程度。如果兩個核酸在嚴緊性條件下不發(fā)生雜交，但是它們所編碼的多肽具有基本同一性，那么這兩個核酸分子仍然具有基本同一性。當一個核酸在復制時使用了遺傳密碼子的最大程度簡并性時，這種情況就可能發(fā)生。當一個核酸分子編碼的多肽對另一核酸分子編碼的多肽具有免疫交叉反應活性時，說明這兩個核酸分子具有基本同一性。
本文所公開的20D加氧酶啟動子及其變異體和片段可用于植物基因工程，例如制備轉化或轉基因植物，以產生目的表型。這里所用的“轉化植物”或“轉基因植物”指在基因組內含有外源多核苷酸的植物。通常轉化植物或轉基因植物基因組穩(wěn)定含有這些外源多核苷酸，以連續(xù)的將該外源多核苷酸傳遞給下一代。這些外源多核苷酸可單獨或與重組DNA構建體一起存在于基因組中。當然這里所用的“轉基因物質”包括任何細胞、細胞系、愈傷組織、組織、植物體部分或完整植物體，只要它們的基因型被外源核酸的存在所改變，包括通過轉基因操作而改變的起始宿主，以及這些起始宿主進行有性或無性繁殖所得的后代。這里所用的“轉基因物質”并不包括通過傳統(tǒng)植物種植方法或天然事件(例如隨機雜交、非重組病毒感染、非重組細菌轉化、非重組轉座或自發(fā)突變)改變了基因組(染色體或染色體外)的植物。
轉基因“事件”通過以下步驟而得到，使用外源DNA構建體(含有核酸表達盒，其中又含有目的轉基因)轉化植物細胞，從所得的在基因組插入了轉基因的植物細胞出發(fā)再生大量植物體，根據在基因組特定位置插入了轉基因這一特征進行篩選。轉基因事件的典型表型特征是轉基因的表達。在遺傳水平上，轉基因事件是植物基因組成(makeup)的一部分。轉基因“事件”也指轉化植物體與其它植物體進行遠交所得的含有外源DNA的后代。
這里所用的“植物”包括整株植物、植物器官(如葉、莖、根等)、種子、植物細胞，以及它們的后代。實施方案中轉基因植物的部分植株應理解為包括如轉基因植物或其后代的植物細胞、原生質體、組織、愈傷組織、晶胚，以及從轉基因植物或其后代長出的花、莖、果實、胚珠、葉或根，因為轉化有實施方案的DNA分子，因此這些部位都至少含有部分轉基因細胞。
這里所用的“植物細胞”包括但不僅限于種子懸浮培養(yǎng)物、胚芽、分生組織區(qū)域、愈傷組織、葉、根、芽、配子、花粉、孢子體和小孢子?？捎糜诒疚乃_方法的植物種類包括所有可進行轉化的高等植物，包括單子葉植物和雙子葉植物。
本文所公開的啟動子序列在宿主植物中可調控任何異源核苷酸序列的表達。因此，所述的異源核苷酸序列可以是操作性連接于本文所公開的啟動子之上的結構基因(編碼目的蛋白)。目的基因考慮市場需求，尤其是農作物研發(fā)中感興趣的基因。農作物和市場發(fā)生了變化，同時由于發(fā)展中國家和地區(qū)向世界市場開放，新型農作物和技術將會出現(xiàn)。此外，當我們所理解的農業(yè)特性和特征如產出和雜種優(yōu)勢增長時，目的基因的選擇也相應發(fā)生變化。實施方案中的目的基因通常種類包括如參與信息的基因如鋅指結構基因，參與通信的基因如激酶基因，持家基因如熱休克蛋白基因。更具體來說轉基因的種類包括如，所編碼蛋白賦予植物對非生物壓力的抗性的基因，所述壓力如干旱、溫度、鹽度和毒素如殺蟲劑和除草劑，或者所編碼蛋白賦予植物對生物壓力的抗性的基因，如真菌、病毒、細菌、昆蟲和線蟲的攻擊，以及與這些生物相關的疾病。表型的目的變化包括，修飾植物中的一個基因的表達，改變植物對病原體或昆蟲的防御機制，提高植物對除草劑的抗性，根據環(huán)境壓力改變植物的生長階段等。這些改變可通過在植物體內表達外源基因或提高內源基因表達來得到?；蛘咄ㄟ^減少植物體內一個或多個內源基因產物的生成，特別是酶、轉運蛋白、輔因子，通過影響植物的營養(yǎng)攝取來得到。這些變化是由轉化植物體表型的變化所引起的。
應認識到，可將任何目的基因操作性連接到實施方案中的啟動子序列上，并在植物體中進行表達。
可通過如下文所述的轉化方法使用含有這些目的基因之一的DNA構建體轉化植物，以在敏感表型植株中建立對疾病或昆蟲的抗性，或者提高敏感表型植株對疾病或昆蟲的抗性。因此，實施方案中包括了保護植物抵御真菌病原、細菌、病毒、線蟲和昆蟲等的方法。通過“疾病抗性”或“昆蟲抗性”植物可避免由植物-病原相互作用所引起的有害癥狀。
疾病抗性和昆蟲抗性基因例如溶菌酶基因、有抗菌作用的昆蟲抗菌肽(cecropin)、兩棲動物抗茵肽(maganin)、硫蛋白基因，或者病原相關蛋白蛋白(如葡聚糖酶和幾丁質酶、抗真菌)基因，或者控制線蟲或昆蟲的蘇云金芽胞桿菌內毒素基因，蛋白酶抑制物基因，膠原酶基因，血凝素基因，糖苷酶基因。
實施方案中的病原包括(但不僅限于)病毒或類病毒、細菌、昆蟲、線蟲、真菌等。病毒包括煙草或黃瓜鑲嵌病毒、環(huán)斑病毒、壞疽病毒、玉米矮花葉病毒等。線蟲包括寄生線蟲，如根結線蟲、孢囊線蟲、根腐線蟲(lesion nematode)。
昆蟲抗性基因可以編碼對引起大量減產的昆蟲具有抗性的產物，如根蟲、毛蟲、玉米鉆心蟲等。這些基因包括蘇云金芽胞桿菌毒蛋白基因(美國專利5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser等.(1986)Gene 48109)；凝集素基因(lectin)(Van Damme等.(1994)Plant Mol.Biol.24825)等。
編碼產物具有疾病抗性特性的基因包括包括解毒基因(detoxification genes)，如針對伏馬菌素(fumonisin)的基因(美國專利5,792,931)，無毒基因(avirulence(avr))和疾病抗性(R)基因(Jones等.(1994)Science 266789；Martin等.(1993)Science 2621432；Mindrinos等.(1994)Cell 781089)等。
可通過轉入編碼產物對除草劑具有抗性的基因來向植物導入除草劑抗性，如產物對抑制乙酰甲醇合酶(ALS)活性的除草劑具有抗性的基因，這種除草劑具體如磺酰脲類類除草劑(如含有突變的乙酰乳酸合酶(ALS)基因，從而引起這種抗性，特別是S4和/或Hra突變)，產物對抑制谷氨酸合酶活性的除草劑具有抗性的基因，如草胺磷或basta基因(如bar基因)，或者本領域所知的其它該種基因。bar基因編碼產物對basta除草劑具有抗性，nptII基因編碼產物對卡那霉素和遺傳霉素(geneticin)具有抗性，ALS基因編碼產物對氯磺隆除草劑具有抗性。
草甘膦抗性由突變的5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate)合酶(EPSPS)和aroA基因所導入。如見美國專利4,940,835(Shah等)，該文公開了一種能夠帶來草柑膦抗性的EPSPS的核苷酸序列。美國專利5,627,061(Barry等)也描述了EPSPS酶編碼基因。也可見美國專利6,248,876、6,040,497、5,804,425、5,633,435、5,145,783、4,971,908、5,312,910、5,188,642、4,940,835、5,866,775、6,225,114、6,130,366、5,310,667、4,535,060、4,769,061、5,633,448、5,510,471、RE36,449、RE37,287和5,491,288，和國際公布說明書WO97/04103、WO97/04114、WO00/66746、WO01/66704、WO00/66747和WO00/66748，它們通過引用并入本文。也可通過編碼草柑膦氧化還原酶的基因的表達來向植物導入草柑膦抗性，更全面的敘述見美國專利5,776,760和5,463,175，它們通過引用并入本文。另外，也可通過草柑膦N-乙酰基轉移酶基因的過度表達來導入草柑膦抗性。如見.美國專利申請10/004,357、10/427,692和10/835,615。
也可在DNA構建體中包含不育基因，從而為植物去雄提供一種方法候選。這種基因例如雄性組織優(yōu)先基因和具有雄性不育表型的基因，如QM見美國專利5,583,210。其它這種基因包括激酶基因和編碼對雄性和雌性配子發(fā)育均有毒性的化合物的基因。
市場所需特性也可由一個或多個可提高表達的基因編碼，如生成淀粉以用于乙醇生產，或者提供蛋白表達。其它重要的轉化植物的市場用途包括生成聚合體和原生質體，例如見美國專利5,602,321。如β-硫解酶基因、PHB合酶(聚羥基丁酸合酶(polyhydroxybutryratesynthase))基因和乙酰輔酶A還原酶基因(見Schubert等(1988)J.Bacteriol.1705837-5847)能促進聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate(PHA))的表達。
可使用實施方案的方法從遺傳上改變影響農作物質量的重要農業(yè)特性，如油脂的水平、種類、飽和和不飽和，必需氨基酸的質量和數量，纖維素和淀粉的水平，以及蛋白成分等。修飾包括提高油酸成分，飽和和不飽和油脂，提高賴氨酸和硫的水平，提供必需氨基酸以及修飾淀粉。在玉米中進行硫素蛋白(Hordothionin)修飾見美國專利5,990,389、5,885,801、5,885,802和5,703,049，它們通過引用并入本文。其它例子如通過大豆2S白蛋白基因編碼富賴氨酸和/或硫種子蛋白，見美國專利5,850,016(申請于1996年3月20日)，和通過大麥基因編碼胰凝乳蛋白酶抑制物，見Williamson等(1987)Eur.J.Biochem.16599-106，這些文獻通過引用并入本文。
外源基因產物包括植物酶，以及來自其它原核生物和真核生物的產物，如酶、輔因子、激素等。
其它可用的基因及其相關表型例如，編碼病毒衣殼蛋白和/或RNA的基因，或其它賦予植物病毒抗性的病毒或植物基因；賦予植物真菌抗性的基因；賦予植物害蟲抗性的基因；促進產物產出的基因；以及賦予植物對外界壓力抗性的基因，例如由高溫和高鹽引起的脫水，有毒金屬或微量元素等。
在本發(fā)明的其它實施方案中，2OD加氧酶啟動子序列上操作性連接的目的基因，是在高密度種植條件下，可促進植物生長或提高農作物產出的基因。例如，2OD加氧酶啟動子序列上操作性連接了表達重要農業(yè)特性的基因，它可改善初級根和側根系統(tǒng)。這些基因包括(但不僅限于)營養(yǎng)成分/水轉運蛋白基因和生長誘導物基因，例如(但不僅限于)玉米H+-ATPase基因(MHA2)(Frias等(1996)PlantCell 81533-44)；AKT1基因，產物是擬南芥中鉀攝取裝置的成分，(Spalding等(1999)J Gen.Physiol.113909-18)；RML，它在根尖細胞中活化細胞分裂循環(huán)(Cheng等1995)Plant Physiol.108881)；玉米谷氨酸合酶基因(Sukanya等(1994)Plant Mol.Biol.261935-46)；和血色素基因(Duff等(1997)J.Biol.Chem.2716749-16752；Arredondo-Peter等(1997)Plant Physiol.1151259-1266；Arredondo-Peter等(1997)Plant Physiol.114493-500，以及這些文獻中的參考文獻)。20D加氧酶啟動子也可用于表達某些基因的反義核酸，這些基因在高密度種植條件下抑制根部系統(tǒng)的發(fā)展。
操作性連接于本文所公開的2OD加氧酶啟動子(及其生物活性片段或變異體)上的異源核苷酸序列，可以是某些靶基因的反義序列。“反義DNA核苷酸序列”指與一段與該核苷酸序列正常的5’→3′方向相反的核苷酸序列。當導入到植物細胞中后，反義DNA序列的表達能夠防止靶基因DNA序列的正常表達。反義核苷酸序列編碼的RNA轉錄物與靶基因轉錄生成的內源mRNA互補，并可與其雜交。這樣，由靶基因編碼的天然蛋白的生成就受到抑制，從而得到所需的表型反應。當序列發(fā)生雜交并干擾了相應mRNA的表達時，反義序列修飾就隨即發(fā)生。以這種方式，可使用與相應反義核酸具有70、80、85％序列同一性的反義構建體。另外，也可使用反義核苷酸的部分序列破壞靶基因的表達。序列長度通常至少為50、100、200個核苷酸或更高。因此，本文公開的啟動子序列可與反義DNA序列操作性連接，以減少或抑制植物天然蛋白的表達。
在在本發(fā)明的其它實施方案中，2OD加氧酶啟動子序列上操作性連接的目的基因，是在高密度種植條件下，可促進植物生長或提高農作物產出的基因。例如，2OD加氧酶啟動子序列上操作性連接了表達重要農業(yè)特性的基因，它可改善初級根和側根系統(tǒng)。這些基因包括(但不僅限于)營養(yǎng)成分/水轉運蛋白基因和生長誘導物基因，例如(但不僅限于)玉米H+-ATPase基因(MHA2)(Frias等(1996)Plant Cell 81533-44)；AKT1基因，產物是擬南芥中鉀攝取裝置的成分，(Spalding等(1999)J.Gen.Physiol.113909-18)；RML，它在根尖細胞中活化細胞分裂循環(huán)(Cheng等(1995)Plant Physiol.108881)；玉米谷氨酸合酶基因(Sukanya等1994)Plant Mol.Biol.261935-46)；和血色素基因(Duff等(1997)J.Biol.Chem.2716749-16752；Arredondo-Peter等(1997)Plant Physiol.1151259-1266；Arredondo-Peter等(1997)Plant Physiol.114493-500，以及這些文獻中的參考文獻)。2OD加氧酶啟動子也可用于表達某些基因的反義核酸，這些基因在高密度種植條件下抑制根部系統(tǒng)的發(fā)展。
“RNAi”指一系列降低基因表達的的方法(如美國專利6,506,559)。現(xiàn)在認為被稱作其它名稱的舊時方法依賴的機制相同，只是名稱不同。這些方法包括“反義抑制”，生成可抑制靶蛋白表達的反義RNA轉錄物，“共抑制”或“正義抑制(sense-suppression)”，指生成可抑制序列相同或基本相似的外源或內源基因表達的正義RNA轉錄物(美國專利5,231,020，通過引用并入本文)。這些技術都依賴于使用核苷酸構建體，該構建體可通過一條與待沉默靶基因序列互補的核酸鏈，引起雙鏈RNA的積累。實施方案中的2OD加氧酶啟動子序列(以及本文公開的與其相關的生物活性片段或變異體)，可被用來驅動這種會引起RNA干擾(包括微RNA和siRNA)的核苷酸構建體。
在本發(fā)明的一個實施方案中，DNA構建體含有一個轉錄起始區(qū)域，其中含有一個本文公開的啟動子序列(或其片段或變異體)，在該啟動子序列上操作性連接了一個外源基因，該基因的表達受到啟動子序列的可誘導式控制。在這種DNA構建體中包含多個限制性酶識別位點，以插入待受到調控區(qū)域轉錄調控的序列。另外，這種DNA構建體還可含有可選的標記基因。
按照轉錄的5’-3’方向，所述DNA構建體依次包含轉錄起始區(qū)域(即實施方案中的誘導型啟動子)，翻譯起始區(qū)域，目的外源基因，翻譯終止區(qū)域，并可任選含有在宿主生物中具有活性的轉錄終止區(qū)域。調控區(qū)域(即啟動子，轉錄調控區(qū)域，翻譯終止區(qū)域)和/或實施方案的多核苷酸，二者間彼此可以是天然的/類似的，或者對宿主細胞可以是天然的/類似的?；蛘哒{控區(qū)域和/或實施方案的多核苷酸，二者間彼此可以是異源的，或者對宿主細胞可以是異源的。這里所用的“異源”指序列來源相對宿主來說是異種的，或者如果是同種，那么該序列相比其天然形式在組成和/或基因組位置上被人工進行了實質上的修飾。例如，操作性連接于啟動子序列上的外源多核苷酸的來源與啟動子來源是異種的，或者如果是同種，那么啟動子和外源多核苷酸二者中的一個(或兩個同時)在其起始形式和/或基因組位置上進行了實質上的修飾，或者啟動子序列不是該操作性連接的多核苷酸的天然啟動子。
可任選包含的轉錄終止區(qū)域對轉錄起始區(qū)域來說可以是天然的，或者對操作性連接的目的多核苷酸來說可以是天然的，或者對宿主植物細胞來說可以是天然的，或者其來源與啟動子、目的多核苷酸、宿主(或者這三者的任意組合)的來源可以不同(即外來或異源)?？梢詮母┺r桿菌(又稱為根癌土壤桿菌)Ti質粒獲得方便的終止區(qū)域，如羧乙基精氨酸合酶或胭脂氨酸合酶基因終止區(qū)域。也見Guerineau等(1991)Mol.Gen.Genet.262141-144；Proudfoot(1991)Cell 64671-674；Sanfacon等(1991)Genes Dev.5141-149；Mogen等(1990)Plant Cell 21261-1272；Munroe等(1990)Gene 91151-158；Ballas等(1989)Nucleic Acids Res.177891-7903；Joshi等(1987)Nucleic Acids Res.159627-9639。在具體的實施方案中，使用馬鈴薯蛋白酶抑制物II基因(PinII)的終止子。如見Keil等(1986)Nucl.Acids Res.145641-5650；及An等(1989)Plant Cell 1115-122，均通過引用并入本文。
含有實施方案的啟動子序列和操作性連接于其上的異源核苷酸序列的DNA構建體也可至少包含一個有待共轉化入有機體的基因的額外核苷酸序列?；蛘呖赏ㄟ^另外的DNA構建體提供這種額外序列。
如果可行，那么可對處于誘導型啟動子控制下的異源核苷酸序列和任何額外核苷酸序列進行優(yōu)化以提高它們在轉化植物體中的表達。也就是說，可以使用植物偏好密碼子合成這些核苷酸序列以改善表達。本領域中已有這種合成植物偏好核苷酸序列的方法。見如美國專利5,380,83l和5,436,391，Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17477-498，它們通過引用并入本文。
已知對額外序列進行修飾可以提高基因在宿主細胞中的表達。這些方法包括刪除掉編碼假poly-A信號、編碼外顯子-內含子拼接信號、編碼轉座子樣重復的序列，以及其它可能對基因表達有害的序列。異源核苷酸序列的G-C含量可以調整到給定宿主細胞的平均水平，這參考已知在該宿主細胞中表達的基因進行計算而得到。如果可能，對額外序列進行修飾以避免可能出現(xiàn)在mRNA中的發(fā)夾結構。
所述DNA構建體還可含有5’前導序列。這種前導序列可提高翻譯水平。本領域已知翻譯前導序列，包括小核糖核酸病毒前導序列如EMCV前導序列(腦心肌炎病毒5′非編碼區(qū)(Encephalomyocarditis 5′noncoding region))(Elroy-Stein等(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 866126-6130)；馬鈴薯Y病毒屬(potyvirus)前導序列，如TEV前導序列(煙草蝕紋病毒(Tobacco Etch Virus))(Allison等(1986)Virology 1549-20)；MDMV前導序列(玉米矮花葉病毒(Maize Dwarf Mosaic Virus))；人免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)(Macejak等(1991)Nature 35390-94)；來自玉米鑲嵌病毒衣殼蛋白mRNA的非翻譯前導序列(AMV RNA 4)(Jobling等(1987)Nature325622-625)；煙草鑲嵌病毒前導序列(TMV)(Gallie等(1989)RNA的分子生物學(Molecular Biology of RNA)，pages 237-256)；玉米退綠斑點病毒前導序列(MCMV)(Lommel等(1991)Virology 81382-385)。也見Della-Cioppa等(1987)Plant Physiology 84965-968。其它可用以提高翻譯水平和/或mRNA穩(wěn)定性的方法也可使用，如內含子，如玉米泛素內含子(Christensen和Quail(1996)Transgenic Res.5213-218；Christensen等(1992)Plant Mol Biol 18675-689)，或者玉米AdhI內含子等(Kyozuka等(1991)Mol.Gen.Genet.22840-48；Kyozuka等(1990)Maydica 35353-357)。
實施方案的DNA構建體也可進一步包含增強子，根據需要，可以是翻譯增強子也可以是轉錄增強子。這些增強子區(qū)為本領域技術人員所熟知，可包括ATG起始密碼子和鄰近序列。起始密碼子必須出現(xiàn)在編碼序列的閱讀框中，以確保整個序列都被翻譯。翻譯控制信號和起始密碼子可以來自多種來源，可以是天然的也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域來自于轉錄起始區(qū)域，或者來自于結構基因。翻譯起始區(qū)域也可來自于被選擇以表達基因的調控元件，或者可被特異性修飾以提高mRNA的翻譯。應當認識到，為提高轉錄水平，可以同時使用增強子和啟動子。本領域技術人員熟知增強子，包括SV40增強子區(qū)域、35S增強子元件等。
在制備DNA構建體的過程中，可操作這些種類不同的DNA片段，以為該DNA序列提供正確的方法和正確的閱讀框。向著此末端方向，可使用連接序列或接頭連接DNA片段，或者采用其它操作以在構建體中提供方便使用的限制性酶位點?？上驅嵤┓桨傅男蛄刑砑踊騽h除限制性酶位點，或者可刪除掉所述序列中的多余序列，或者進行其它類似修飾。因此，可使用體外突變、引物修復、限制性酶解、退火、再替換，如轉換和顛換。
DNA構建體中可包含報告基因或篩選標記基因。本領域中的合適報告基因如下列文獻中所述，Jefferson等(1991)在植物分子生物學手冊(Plant Molecular Biology Manual)、Gelvin等(KluwerAcademic Publishers)，pp.1-33；DeWet等(1987)Mol.Cell.Biol.7725-737；Goff等(1990)EMBO J.92517-2522；Kain等(1995)BioTechniques 19650-655；及Chiu等(1996)Current Biology 6325-330。
用以選出轉化細胞或組織的篩選標記基因可包括抗生素抗性基因或除草劑抗性基因。合適的篩選基因包括(但不僅限于)氯霉素抗性基因(Herrera Estrella等(1983)EMBO J.2987-992)；甲氨蝶呤抗性基因(Herrera Estrella等.(1983)Nature 303209-213；Meijer等.(1991)Plant Mol.Biol.16807-820)；潮霉素抗性基因(Waldron等.(1985)Plant Mol.Biol.5103-108；Zhijian等.(1995)Plant Science108219-227)；鏈霉素抗性基因(Jones等.(1987)Mol.Gen.Genet.21086-91)；大觀霉素抗性基因(Bretagne-Sagnard等.(1996)Transgenic Res.5131-137)；博來霉素抗性基因(Hille等.(1990)Plant Mol.Biol.7171-176)；磺胺抗性基因(Guerineau等.(1990)Plant Mol.Biol.15127-136)；辛酰溴苯腈抗性基因(Stalker等.(1988)Science 242419-423)；草柑膦抗性基因(Shaw等.(1986)Science 233478-481)；草胺膦抗性基因(DeBlock等(1987)EMBOJ.62513-2518)。
其它可用于標記轉基因事件但最終產物可能不需要的基因包括如(但不僅限于)GUS(b-葡萄糖苷酸酶；Jefferson(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5387)，GFP(綠色熒光蛋白Chalfie等.(1994)Science263802)，熒光素酶(Riggs等.(1987)Nucleic Acids Res.15(19)8115；Luehrsen等.(1992)Methods Enzymol.216397-414)和參與玉米花青素合成的基因(Ludwig等.(1990)Science247449)。
實施方案中的核酸分子可用于指導植物中的核苷酸序列的表達。這可通過使用DNA構建體轉化目的植物細胞，然后從所述的植物細胞轉化子再生出穩(wěn)定的轉化植株來實現(xiàn)，該構建體中包含本文鑒別的啟動子，以及操作性連接于其上的異源核苷酸序列。實施方案中的方法也指導植物中核苷酸序列的可誘導式表達。這些方法包括，使用含有本文鑒別的啟動子(它在植物細胞中以可誘導方式起始轉錄，并且在其上操作性連接了異源核苷酸序列)的DNA構建體來轉化植物細胞，從所述的植物細胞出發(fā)再生轉化植物，用所需的刺激物處理該植物體以誘導表達。
含有實施方案的特定啟動子序列以及連接于其上的目的核苷酸序列的DNA構建體可用來轉化任何植物。以這種方式，可得到遺傳修飾(即轉基因或轉化)的植物體、植物細胞、植物組織、種子、根等。
適于本發(fā)明實施方案的植物種類包括(但不僅限于)玉米(Zeamays)、蕓苔類(如油菜，蕪菁，芥菜)，特別是用作種子油來源的蕓苔類(Brassica species)、苜蓿(Medicago sativa)、大米(Oryza sativa)、裸麥(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、粟類(如，珍珠小米(pearl millet)(Pennisetum glaucum)、黍稷(Panicummiliaceum)、谷子(Setaria italica)、雞爪粟(Eleusine coracana)、向日葵(Helianthus annuus)、紅花(Carthamus tinctorius)、小麥(Triticumaestivum)、大豆(Glycine max)、煙草(Nicotiana tabacum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypiumbarbadense、Gossypium hirsutum)、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡豆(Cofea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、鳳梨(Ananas comosus)、柑橘樹(Citrus spp.)、可可豆(Theobromacacao)、茶葉(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鱷梨(Perseaamericana)、無花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄欖(Olea europaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳大利亞堅果(Macadamiaintegrifolia)、杏仁(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麥、大麥、蔬菜、觀賞植物和松類。
蔬菜類包括番茄(Lycopersicon esculentum)、苦菜類(Lactucasativa)、綠豆(Phaseolus vulgaris)、萊豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和一部分甜瓜屬如黃瓜(C sativus)、哈密瓜(C.cantalupensis)和香瓜(C. melo)。觀賞植物包括杜鵑花(Rhododendronspp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、木槿(Hibiscusrosasanensis)，玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙花(Narcissus spp.)、矮牽牛花(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、猩猩木(Euphorbia pulcherrima)和菊花。
可用于本發(fā)明實施方案的松類植物包括如，松樹如火炬松(Pinus taeda)、濕地松(Pinus elliotii)、北美黃松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)和輻射松(Pinus radiata)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)、西部鐵杉(Tsuga canadensis)、西岸云杉(Picea glauca)、紅杉(Sequoia sempervirens)、冷杉如銀樅(Abies amabilis)和香脂冷杉(Abies balsamea)以及雪松如西部紅雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黃檜(Chamaecyparis nootkatensis)。實施方案中的植物可以是農作物(例如，玉米、紫花苜蓿、向日葵、蕓苔、大豆、棉花、紅花、花生、高粱、小麥、粟類、煙草等等)。例如，此項發(fā)明適合于任何單子葉植物，包括但不僅限于玉米、稻、大麥、燕麥、小麥、高粱、黑麥、甘蔗、鳳梨、山藥、洋蔥、香蕉、椰子和海棗(date)。
這里所用的“載體”指用以向宿主細胞導入核苷酸構建體(如DNA構建體)的DNA分子，如質粒、粘粒、噬菌體。典型的克隆載體含有一個或較少的幾個限制內切酶識別位點，通過這些位點可插入(以可確定方式(in a determinable fashion))外源DNA序列(而同時不損害載體中必需的生物功能)，此外還含有標記基因(它適于鑒定并選出被克隆載體轉化的細胞)。典型的標記基因包括四環(huán)素抗性基因、潮霉素抗性基因或氨芐青霉素抗性基因。
實施方案中的方法包括向植物細胞中導入核苷酸構建體。這里所用的“導入”指將核苷酸構建體以某種方式遞送至植物體從而使得所述構建體進入植物細胞內部。實施方案中的方法并不依賴于特定的導入方法，只要所述構建體能夠進入至少一個植物細胞即可。本領域中已知植物細胞核酸導入方法，包括(但不僅限于)穩(wěn)定轉化方法，瞬時轉化方法和病毒介導的方法。
“穩(wěn)定轉化”指導入的核苷酸構建體被整合進植物基因組，并可被宿主后代所繼承?！八矔r轉化”指導入的核苷酸構建體沒有被整合進植物基因組。
可通過使植物與病毒或病毒核酸相接觸來導入實施方案中的核苷酸構建體。通常，這種方法涉及到將實施方案的核苷酸構建體整合到病毒RNA或DNA分子內。本領域已知通過病毒RNA或DNA將核苷酸構建體導入植物細胞并表達其編碼的蛋白質的方法。見如美國專利5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931，它們通過引用并入本文。
可根據待轉化靶植物或植物細胞的種類，即單子葉或雙子葉植物，來選擇轉化方法和核苷酸序列導入方法。將核苷酸序列導入植物細胞并隨之插入到植物基因組中的合適方法包括微注射法(Crossway等.(1986)Biotechniques 4320-334)，電穿孔法(Riggs等.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835602-5606，農桿菌介導的轉化(Agrobacterium-mediated transformation)(美國專利5,981,840和5,563,055)，直接基因轉移(Paszkowski等.(1984)EMBO J.32717-2722)，彈道微粒加速作用(ballistic particle acceleration)(見如美國專利4,945,050；5,879,918；5,886,244；5,932,782；Tomes等.(1995)in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture；Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等.(1988)Biotechnology 6923-926)。也見Weissinger等.(1988)Ann.Rev.Genet.22421-477；Sanford等.(1987)Particulate Science andTechnology 527-37(onion)；Christou等.(1988)Plant Physiol.87671-674(soybean)；McCabe等.(1988)Bio/Technology 6923-926(soybean)；Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P175-182(soybean)；Singh等.(1998)Theor.Appl.Genet.96319-324(soybean)；Datta等.(1990)Biotechnology 8736-740(rice)；Klein等.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 854305-4309(maize)；Klein等.(1988)Biotechnology 6559-563(maize)；U.S.Patent 5,240,855；5,322,783 and 5,324,646；Klein等.(1988)PlantPhysiol. 91440-444(maize)；Fromm等.(1990)Biotechnology8833-839(maize)；Hooykaas-Van Slogteren等.(1984)Nature(London)311763-764；U.S.Patent 5,736,369(cereals)；Bytebier等.(1987)Proc.Natl.Acad Sci.USA 845345-5349(Liliaceae)；DeWet等.(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman等.(Longman，New York)，pp.197-209(pollen)；Kaeppler等.(1990)Plant Cell Reports 9415-418 and Kaeppler等.(1992)Theor.Appl.Genet.84560-566(whisker-mediated transformation)；D＇Halluin等.(1992)Plant Cell 41495-1505(electroporation)；Li等.(1993)Plant Cell Reports 12250-255 and Christou and Ford(1995)Annals of Botany 75407-413(rice)；Osjoda等.(1996)NatureBiotechnology 14745-750(maize via Agrobacterium tumefaciens)，上述所有文獻均通過引用并入本文。
按照常規(guī)的方法，細胞轉化子可生長成植物體。見如McCormick等(1986)Plant Cell Reports 581-84。然后可種植這些植物，并使用經相同轉化的植株或不同株對這些植物授粉，然后鑒別出所得雜種中誘導表達了所需表型特征的雜種?？煞N植兩代或更多代，以確認所需表型特征的誘導表達被穩(wěn)定維持并遺傳，然后收集種子以確保獲得所需表型特征的誘導表達。因此，這里使用的“轉化種子”指在植物基因組中穩(wěn)定整合有所導入核苷酸構建體的種子。
有多種方法可從植物組織出發(fā)再生植物體。根據起始植物組織和特定的待再生植物種類來選擇特定的再生方法。從單個植物原生質體轉化子或從多種轉化子出發(fā)，再生、發(fā)展和培養(yǎng)植物體的方法在本領域中眾所周知(Weissbach和Weissbach，(1988)植物分子生物學方法(Methods for Plant Molecular Biology)(Eds.)，Academic Press，Inc.，San Diego，CA)。這種再生和培養(yǎng)方法的典型步驟包括，選擇轉化的細胞，通過生根苗(rooted plantlet)階段的一般胚芽發(fā)育階段培養(yǎng)單個細胞。類似的，再生轉基因胚芽和種子。所得的轉基因生根苗隨后被種植在合適的植物培養(yǎng)基中，如土壤。對再生的植物優(yōu)選進行自身授粉，以提供純合子轉基因植株。另外，使用從再生植株得到的花粉與重要農作物品系的種子生成植物體進行雜交。相反，使用從這些重要農作物品系的種子生成植物體得到的花粉對再生植物授粉。使用本領域技術人員熟知的方法，培養(yǎng)實施方案中的含有所需多核苷酸的轉基因植物。
實施方案提供了用以篩選在植物體內調節(jié)表達的化合物的組合物。可使用載體、細胞、植物體來篩選候選分子，以得到2OD加氧酶啟動子的拮抗劑或激動劑。例如，可將一個報告基因操作性連接于2OD加氧酶啟動子上，并作為轉基因在植物體中進行表達。加入待測化合物，并測量報告基因的表達水平以確定該物質對啟動子活性的影響。
下文的實施例僅用以闡述本發(fā)明，而不是對本發(fā)明做出任何限制。
實驗 通過下文實施例進一步定義本實施方案，其中如果沒有特別指出，份和百分比均為重量份和重量百分比，溫度為攝氏度。所用的分子生物學方法均參照上文Ausubel或Sambrook所述進行。當然這些實施例僅以說明的方式闡明實施方案。通過上文所述和這些實施例，本領域技術人員可掌握實施方案的本質特征，并且在不偏離實施方案的精髓和范圍的情況下，可以根據不同用途和條件，對實施方案做出多種改變和改進。因此，鑒于前述說明書所述，除本文所述實施方案之外，實施方案的多種修改方案對本領域技術人員而言也將會是顯而易見的。這些修改方案也在所附的權利要求書范圍內。
所有列出的參考文獻均通過引用整體并入本文。
實施例12OD加氧酶基因的鑒定 使用大規(guī)模平行特征測序(Massively Parallel SignatureSequencing technology(MPSS))技術鑒定所述的加氧酶基因(見Brenner S，等.(2000)Nature Biotechnology 18630-634，Brenner S等(2000)Proc Natl Acad Sci USA 971665-1670)。該技術涉及到從已反轉錄的mRNA樣品中得到17個堿基的特征標簽。標簽進行測序，同時將其指定為基因或EST(表達標簽序列)。對這些標簽的豐度進行賦值，這些值被規(guī)格化為PPM，這樣就可對不同組織中標簽的表達或豐度加以比較。因此，可通過MPSS平臺來確定特定基因的表達及其在不同組織中的表達水平。
在MPSS數據庫中查詢到在受到玉米根蟲(CRW)侵食時優(yōu)先受到上調的特征標簽，就可鑒別出相應于玉米2OD加氧酶基因的標簽。從用CRW處理的V5階段玉米植株中查詢鑒別到了根標簽序型。從未用CRW處理的V6階段玉米植株中也查詢鑒別到了根標簽序型。對二者進行對比，發(fā)現(xiàn)在發(fā)生CRW侵食后的24h內，2OD加氧酶標簽從704ppm被增量調節(jié)到2566ppm。在MPSS數據庫中對所有實驗和組織進行比較，發(fā)現(xiàn)2OD加氧酶基因在根部被優(yōu)先表達。
實施例2加氧酶基因表達的誘導 通過northern印跡(圖1)證實該加氧酶基因是被誘導表達的。使B73玉米植株的根受到玉米根蟲侵食破壞24h，從植株的節(jié)根和V5階段的V5葉(5頸圈葉(collared leaves))中分離RNA。所得結果表明2OD加氧酶基因的表達受到CRW侵食破壞的強烈上調。僅在根部觀察到這種誘導，而沒有在葉中觀察到。
為確定昆蟲直接侵食葉組織是否會誘導2OD加氧酶表達，使玉米鉆心蟲(又稱歐洲玉米螟(European com borer))侵食V5階段玉米24h。通過MPSS確定輪生體/葉轉換帶中的表達水平，結果表明幼蟲對葉的損傷沒有增量調控該表達，因為其表達水平仍在背景水平(7ppm)。
在CRW侵食實驗中，移植一些植株而另一些不移植，以確定該過程造成的根部損傷是否會誘導所述加氧酶基因的表達。移植指將植株移栽到新土壤中。該過程造成的根部損傷不誘導2OD加氧酶基因的表達。
根部的機械損傷，具體來說是折斷根尖，會誘導所述加氧酶基因的表達。MPSS分析結果表明，這種損傷對所述基因的誘導作用約在損傷發(fā)生后的3h時達到峰值，然后逐步降低，直到24h時(該實驗的時間終點)。通過northem印跡分析(圖2)也得到了相似的結果。在V5階段植株的根尖引入機械損傷，然后在損傷后的0、2、6、12和24h時收集節(jié)根(nodal root)和V5葉。結果表明在根部該基因的表達約在損傷后的6h時達到峰值，然后逐步下降直到24h。實驗中沒有檢測到在葉中的表達。因此，根據這些數據可說明2OD加氧酶基因在根部受到誘導，誘導時間段約為損傷后的3-6h。
總而言之，實驗結果表明所述加氧酶基因的表達在根部受到CRW侵食和機械損傷時發(fā)生增量調控。這種增量調控和表達是根部優(yōu)先(root preferred)的，這使得該啟動子成為一種合適的候選分子，用以在需要昆蟲侵食或損傷誘導轉基因進行表達時，在植物體(如玉米)中指導轉基因進行顯著水平的表達。
材料和方法 在溫室條件下培養(yǎng)B73系玉米到V5階段，并使75個第二齡CRW幼蟲侵食。在侵食24h后收集葉(V5葉)和節(jié)根。使用未被侵食的V5階段葉樣本作為對照。用RNA Easy Maxi Kit試劑盒(Qiagen，Valencia，CA.)從組織中提取RNA。
用Northem Max Denaturing Gel Buffers緩沖液(Ambion，Austin，TX.)進行RNA樣品的標準甲醛凝膠電泳。然后用20X SSC洗滌凝膠一次，15min，隨后在20xSSC溶液中將RNA轉印到尼龍膜上，反應過夜(Turboblotter，來自S&S)。膜用UV進行交聯(lián)反應2min。50℃在15mL DIG Easy Hyb Solution溶液(Roche Applied Sciences，Indianapolis，IN.)中預雜交3h。使用PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche)通過PCR從2OD加氧酶EST獲得單鏈DNA探針。根據試劑盒的推薦使用說明，每1mL DIG Easy Hyb溶液加入2μL變性探針。隨后50℃下在10mL溶液中雜交過夜。次日，用低嚴緊性緩沖液(2X SSC，含有0.1％SDS)室溫下洗滌5min，再用高嚴緊性緩沖液(0.1X SSC，含有0.1％SDS)在55℃下洗滌兩次，每次15min。
使用DIG0MNI Systemfor PCR Probes探針系統(tǒng)和DIG Washand Block Buffer Set緩沖液(均來自Roche)使2OD加氧酶轉錄物顯形。簡短來說，室溫下在洗滌緩沖液(0.1M馬來酸，0.15M NaCl，pH7.5；0.3％(v\v)Tween20)中平衡膜2min。然后放入封阻溶液(將10X封阻緩沖液按1∶10的比例稀釋在馬來酸緩沖液中(0.1M馬來酸，0.15M NaCl，pH7.5))中放置30min。加入抗體溶液(將抗DIG-堿性磷酸鹽按110,000稀釋在封阻溶液中(將10X封阻緩沖液按110的比例稀釋在馬來酸緩沖液中))溫育30min，然后用洗滌緩沖液洗滌兩次共30min。在檢測緩沖液(0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH9.5)中平衡3min后，將膜放置在塑料顯相夾(plastlc development folder)(AppliedBioSystems)中，并向膜滴加1mL CDP-Star工作溶液(將CDP-Star液(25mM，12.38mg/mL)按1100的比例稀釋在檢測緩沖液中)。室溫下溫育5min后，將膜暴露在X射線膠片下顯影，顯影時間為20min至過夜。
實施例3進行5’RACE實驗以鑒別轉錄起始位點 5’RACE被用來進行20D加氧酶mRNA轉錄起始位點作圖，并根據快速擴增cDNA末端的5’RACE系統(tǒng)(5’RACE System for theRapid Amplification of cDNA Ends)(Invitrogen，Carlsbad，CA)附帶的操作說明，用從同系繁殖B73玉米植株根部分離的RNA進行操作。根據鑒別的EST序列針對2OD加氧酶基因3’UTR設計基因特異性探針(GSP)。針對富GC模板，可使用SuperScript II ReverseTranscriptase反轉錄酶(試劑盒中提供)和GSP1R(SEQ ID NO2)(定位在互補鏈上，位于2OD加氧酶基因翻譯起始位點(ATG)的+1321到+1340bp)合成第一條鏈，而隨后的RNase處理、反應處理(clean-up)和cDNA的dC-加尾反應這些步驟均使用常規(guī)系統(tǒng)方法。使用GSP2R(SEQ ID NO3)(也定位在互補鏈上，位于2OD加氧酶基因轉錄翻譯位點(ATG)的+1252和+1271bp之間)，和Abridged錨引物(試劑盒中提供)以及HotStarTaq Polymerase(Qiagen)進行PCR擴增。PCR的溫度循環(huán)為，首先95℃15min；然后35個循環(huán)94℃30s，55℃45s，72℃1min；最后72℃10min。
使用GSP3R(SEQ ID NO4)(定位在互補鏈上的+1141到+1160bp)，和試劑盒中提供的AUAP引物，以及HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen)，以第一輪PCR產物為模板進行第二輪PCR反應。溫度循環(huán)為，首先95℃15min；然后35個循環(huán)94℃30s，55℃45s，72℃1min；最后72℃10min。
5’RACE產物被TA-克隆到pCR2.1(Invitrogen)中，并使用M13正向和反向引物進行測序。5’RACE序列鑒別出20D加氧酶mRNA的轉錄起始位點位于2OD加氧酶翻譯起始位點(ATG)的-39bp處。
實施例42OD加氧酶基因啟動子的分離和序列分析 實施例1和實施例2中對2OD加氧酶基因的分析說明該基因可被根部的機械損傷和昆蟲侵食所誘導。因此，2OD加氧酶啟動子可被用來在根部受到機械損傷和昆蟲侵食后指導玉米植株中的基因表達。
從2OD加氧酶基因中分離到了長約1116bp的啟動子(SEQ IDNO1)。在2OD加氧酶基因轉錄起始位點(ATG)的-35和-29bp之間鑒別到一個推測為TATA盒的序列(圖3)。在SEQ ID NO1所述序列的遠端鑒別到由TTGAC組成的兩個序列基序(相應為“W-盒”)。受到環(huán)境脅迫時，由水楊酸誘導的WRKY-DNA結合蛋白識別“W-盒”基序(Chen等.，2002，Plant Cell.14559-574)。
根據從兩個EST克隆得到的EST序列使用多反復(multiplereiterative)BLASTN搜索工具在Genome Survey Sequence(GSS)數據庫中分離所述序列。每次對GSS數據庫進行搜索時，使用從前一個搜索所得的序列沿著基因組序列進行“步移”，直到沒有另外的重疊序列被鑒別到。GSS搜索得到在2OD加氧酶轉錄起始位點上游597bp的序列。通過下文所述的基因組步移得到了另外一個長486bp的GSS-起源的上游序列。
使用從GSS搜索得到的序列進行基因組步移反應，以得到更多的上游側翼序列。使用Universal Genome Walker Kit試劑盒(來自Clontech/BD Biosciences(Palo Alto，CA))完成反應。根據試劑盒使用說明使用B73植株基因組DNA構建基因組DNA文庫。使用PlatinumPfx DNA Polymerase(Invitrogen)進行PCR反應，溫度循環(huán)條件見附錄C(GeneAmp System 9600)。第一輪反應使用GSPlGW(SEQ ID NO5)(相應于互補鏈上2OD加氧酶翻譯起始位點的-362bp到-336bp之間的序列)和AP1引物(試劑盒中提供)進行。第二輪反應使用第一輪的反應產物作為模版，并使用GSP2GW(SEQ ID NO6)或GSP3GW(SEQ ID NO7)序列，以及AP2引物(試劑盒中提供)。GSP2GW和GSP3GW分別相應于互補鏈上2OD加氧酶翻譯起始位點的-442bp到-416bp之間和-468bp到-440bp的序列。第二輪反應的產物DNA被克隆到TA載體pCR2.1(Invitrogen)上并進行測序。
使用Platinum Pfx DNA Polymerase聚合酶(Invitrogen)以及寡核苷酸引物OligoXbaI(SEQ ID NO8)和OligoBamHINcoI(SEQ ID NO9)，在2X緩沖液中進行PCR反應以從基因組DNA中分離出2OD加氧酶啟動子。在產物中引入XbaI、NcoI和BamH限制性酶位點以便于隨后的克隆。PCR反應的溫度循環(huán)為，首先95℃5min；然后35個循環(huán)94℃30s，60℃45s，68℃2min；最后68℃10min。
實施例52OD加氧酶啟動子的活性 為證實被作為2OD加氧酶啟動子序列而分離的序列具有啟動子功能，進行微顆粒瞬時轟擊(transient particle bombardment)實驗。該實驗可快速評價受試DNA序列是否能夠指導基因表達。
從基因組DNA中用PCR擴增所述的1116bp啟動子，并克隆到表達載體中，在該序列后有B-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因以驗證該啟動子是否驅動表達。使用該表達盒對3日齡的玉米籽苗進行Biolistic轟擊，結果在胚芽鞘上可觀察到GUS著色點，其著色水平低于對照(對照為組成型根啟動子Rootmetpro2(見美國專利申請11/022,449)，它驅動基因的表達)。這些結果說明1116bp的2OD加氧酶啟動子能夠在瞬時轉染的玉米細胞中驅動表達。
Biolistic瞬時根部表達實驗所用的材料和方法 沿發(fā)芽紙(預先用7％的蔗糖溶液浸泡過)的邊緣放置B73種子，然后用同樣大小并經同樣浸泡的發(fā)芽紙蓋住這些種子。隨后卷起該包有種子的兩層紙，并置于盛有7％蔗糖溶液的燒杯中，從而使得溶液可以沿著發(fā)芽紙浸潤位于發(fā)芽紙卷頂端的種子。這樣即可使根呈直線生長。27-28℃下，在黑暗中使這些種子生長2-3d。轟擊前除去覆蓋胚芽鞘的外層鞘，然后將秧苗放置在無菌陪替氏平皿(60mm)上(在陪替氏平皿中鋪有一層用1mL水浸濕的Whatman#1濾紙)。每個平皿中按相對位置放置兩個秧苗，用0.5％瓊脂糖溶液將它們固定在濾紙上。
按以下方法制備轟擊用的DNA/金微?；旌衔?。取0.6-1.0微米大小的金顆粒60mg，首先用乙醇洗滌，然后用無菌蒸餾水漂洗，并用總體積為1mL的無菌水重懸浮。將此懸浮液分成50微升每份，室溫下保藏于硅化Eppendorf管中。按50μL的0.6μM金顆粒(預先洗滌)，5-10μg待測DNA，50μL2.5M CaCl2和25μL的0.1M亞精胺的順序使它們結合，從而將DNA沉淀在金顆粒的表面上。隨后立即振搖該溶液3min，并短暫離心使得DNA/金顆粒沉淀。用500μL100％乙醇洗滌DNA/金顆粒一次，并用終體積為50μL的100％乙醇重懸。-20℃下溫育DNA/金混合物至少60min，然后在每個MylarTM的大載體使用該混合物6μL。
用該DNA/金顆粒轟擊經上文所述制備的秧苗兩次，裝置為PDS-1000/He槍(1100psi，真空壓力為27-28英寸Hg柱)。大載體和停止屏(screen)間的距離在6-8cm之間。轟擊后將平板置于密封容器中，27-28℃下在黑暗中溫育24h。
溫育18-24h后，使用轟擊過的秧苗進行瞬時GUS表達實驗。將秧苗浸在10-15mL的GUS實驗緩沖液中(含100mM NaH2PO4-H2O(pH7.0)，10mM EDTA，0.5mM K4Fe(CN)6-3H2O，0.1％Triton X-100，2mM5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖醛酸化物)，37℃下在黑暗中溫育24h，用100％乙醇替換GUS著色溶液以停止反應。在顯微鏡下觀察GUS的表達/著色情況。
實施例62OD加氧酶在轉基因植物中的表達 使用土壤桿菌(又稱為農桿菌(Agrobacterium))按照實施例8中所述所述方法制備穩(wěn)定轉化的植株，以得到啟動子活性的更詳細地特征，所用方法中包括通過機械損傷和昆蟲侵食誘導啟動子。
將1116bp的2OD加氧酶啟動子(SEQ ID NO1)操作性連接于Adhl內含子和GUS基因上(簡寫為20D加氧酶(Adhl內含子1)GUS)，以通過組化著色植物組織表示的GUS酶活檢測啟動子活性。GUS著色的模式反應了啟動子發(fā)揮活性的部位。引入Adhl內含子的目的是提高基因表達，這是因為已知在谷類植物細胞的基因結構中含有內含子可以提高外源基因的表達(Callis等.(1987)Genesand Development 11183-1200；Kyozuka等.(1990)Maydica 35353-357)。
在正常生長條件下，機械損傷條件下和CRW侵食條件下，測試了V5階段的植株(5頸圈葉)。使用鋸齒鉗折斷約1英寸長的根尖，從而在2OD加氧酶植株的節(jié)根引入機械損傷，并在損傷后的24h采集組織樣本。在罐中的根下放置約100個第二齡的CRW幼蟲，從而引入CRW侵食。48h后收集葉和根。在以上兩種處理前也對植株進行測試(即在正常溫室條件下)，以為計算每種處理的誘導水平提供基準。
在不經任何處理的溫室植株中基本沒有表達。但是機械損傷引起表達，每個處理的植株均表現(xiàn)出GUS的誘導表達。有趣的是，這種表達僅位于損傷部位，而在損傷的鄰近部位和根部損傷的上游部分都沒有檢測到表達。
這種定位反應也出現(xiàn)在CRW侵食實驗中。在被CRW損傷或穿透的根部部位及鄰近部位的根組織觀察到GUS表達。但不同于機械損傷，在CRW侵食根的根尖上游部分以及在根成熟區(qū)內部，都可檢測到表達。在這些植株的葉中沒有觀察到表達，這與機械損傷植株的表現(xiàn)相似?？傊@些結果表明2OD加氧酶啟動子在轉基因植株的根部是可誘導的。
對R1-R2階段的植株(表征是出須和落粉)的花粉、穗(tassels)和須(silks)中的2OD加氧酶驅動的表達進行鑒定。在所有植株的花粉中都沒有觀察到表達。但是在穗中，GUS組化分析結果表明大約有一半的植株樣本發(fā)生了GUS活性著色。該組織著色的水平往往較低，并且與根部的著色水平相比，僅相當或低于根部水平。而須分析表明，除一株外所有植株都有一定水平的GUS表達。不是在所有須絲(strand)上都有表達，而是在每個樣本中有約5-50％的須絲發(fā)生了表達。這些表達幾乎都位于位于脈管(vein)中，但須絲的整體著色不一致。
對植物組織進行組化著色以分析GUS活性 從轉化植株中采集組織，并置于盛有0.5-5mL GUS實驗緩沖液(實施例5中所述的實驗緩沖液)的48、12或6孔板中檢測GUS活性。將板置于室內真空系統(tǒng)中10min，然后37℃下溫育過夜。室溫下在100％乙醇中連續(xù)溫育1-3個12h時段，以清洗組織著色。然后將組織在4℃下保藏于乙醇中。
實施例8農桿菌(Agrobacterium)介導的玉米轉化和轉基因植株的再生 按照Zhao所述的方法(美國專利5,981,840，(下文稱作‘840專利)和PCT專利申請WO98/32326，它們通過引用并入本文)使用實施方案的2OD加氧酶啟動子通過農桿菌介導轉化玉米。
在800培養(yǎng)基的主平板上28℃下黑暗中培養(yǎng)農桿菌3d，然后保藏于4℃下(時間可長達1個月)。在810培養(yǎng)基農桿菌工作板上，28℃下黑暗中溫育1-2d。
簡短來說，胚芽從新鮮無菌玉米穗(ear)中分出，并保持在561Q培養(yǎng)基中直至收集到所有需要的胚芽。然后使胚芽與農桿菌懸浮液(叢工作板制得)相接觸，農桿菌含有包含了實施方案所述啟動子序列的質粒。在562平板上共培養(yǎng)胚芽和農桿菌，如‘840專利所述將胚芽軸朝下(axis down)置于平板。
在562P培養(yǎng)基中一周后，將胚芽轉移到563Q培養(yǎng)基中。在新鮮563Q培養(yǎng)基中次培養(yǎng)胚芽，每兩周更換一次培養(yǎng)基，并在相同條件下繼續(xù)溫育。經選擇在6-8周后開始出現(xiàn)愈傷組織。
當愈傷組織達到合適大小后，將它們轉移到再生(288W)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在黑暗中保持2-3周以起始植株再生。體細胞胚成熟后，將充分發(fā)育的體細胞胚轉移到再生272V培養(yǎng)基中并轉移到光照培養(yǎng)室中以進行再生。約7-10d后，將發(fā)育中的幼苗轉移到不含激素的272V培養(yǎng)基試管中，保持7-10d直到幼苗充分長大。然后將植株轉移到含有盆栽土的育苗盤(flats)(相當于2.5”罐)中的插入式培養(yǎng)板(inserts)中，并在生長室中培養(yǎng)1周，隨后在溫室中再培養(yǎng)1-2周，然后轉移到的常規(guī)的600罐中(1.6加侖)并培養(yǎng)至成熟。
農桿菌介導的轉化和轉基因玉米再生過程中使用的培養(yǎng)基 561Q培養(yǎng)基含有4.0g/L N6基本鹽類(basal salts)(SIGMA C-1416)，1.0mL/L Eriksson＇sVitamin Mix復合維生素(1000x SIGMA-1511)，0.5mg/L鹽酸硫胺，68.5g/L蔗糖，36.0g/L葡萄糖，1.5mg/L2，4-D，0.69g/L L-脯氨酸(用KOH調節(jié)到pH5.2后用蒸餾水定容)，2.0g/L GelriteTM(用dI H2O定容后添加)，8.5mg/L硝酸銀(培養(yǎng)基滅菌并冷卻到室溫后加入)。
800培養(yǎng)基含有50.0mL/L母液A和850mL dI H2O，用dI H2O補足定容所缺少的l00mL/L(brought to volume minus 100mL/L withdI H2O)，然后加入9.0g植物瓊脂。滅菌并冷卻后，加入50.0mL/L母液B以及5.0g葡萄糖和2.0mL的50mg/mL大觀霉素母液。母液A含有60.0g K2HPO4和20.0g單堿性磷酸鈉(磷酸二氫鈉)，溶解在950mL水中，用KOH調節(jié)到pH7.0后用dI H2O定容到1.0L。母液B含有20.0g NH4Cl，6.0g MgSO4·H2O，3.0g氯化鉀，0.2gCaCl2，0.05g FeSO4·7H2O，均用蒸餾水定容，滅菌并冷卻。
810培養(yǎng)基含有5.0g酵母提取物(Difco)，10.0g蛋白胨(Difco)，5.0g NaCl，溶解在dI H2O中，調節(jié)到pH6.8后定容，然后加入15.0g細菌瓊脂，滅菌并冷卻，然后加入1.0mL的50mg/mL大觀霉素母液。
562P培養(yǎng)基含有4.0g/L N6基本鹽類(SIGMA C-1416)，1.0mL/LEriksson＇s Vitamin Mix復合維生素(1000x SIGMA-1511)，0.5mg/L鹽酸硫胺，30.0g/L蔗糖，2.0mg/L 2，4-D(用KOH調節(jié)到pH5.8后dI水定容)，3.0g/L GelriteTM(用蒸餾水定容后添加)，0.85mg/L硝酸銀和1.0mL的100mM乙酰丁香酮母液(都在培養(yǎng)基滅菌并冷卻后添加)。
5630培養(yǎng)基含有4.0g/LN6基本鹽類(SIGMA C-1416)，1.0mL/L Eriksson＇s Vitamin Mix復合維生素(1000x SIGMA-1511)，0.5mg/L鹽酸硫胺，30.0g/L蔗糖，1.5mg/L2，4-D，0.69g L-脯氨酸，和0.5g MES緩沖液(用KOH調節(jié)到pH5.8后用去離子(D-I)水定容)。然后加入6.0g/L UltrapureTM瓊脂-瓊脂(EM Science)，隨后培養(yǎng)基滅菌并冷卻。然后再加入0.85mg/L硝酸銀，3.0mL的1mg/mLBialaphos母液，和2.0mL的50mg/mL羧芐青霉素母液。
288W含有4.3g/L MS鹽(GIBCO 11117-074)，5.0mL/L MS維生素母液(0.100g煙酸、0.02g/L鹽酸硫胺、0.10g/L鹽酸吡哆辛、0.40g/L甘氨酸(用精制(polished)D-I H2O定容)(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15473)、100mg/L肌(myo)-肌醇、0.5mg/L玉米素和60g/L蔗糖，調節(jié)到pH5.6后用精致去離子水定容。隨之加入6.0g/L的UltrapureTM瓊脂-瓊脂(EM Science)，隨后培養(yǎng)基滅菌并冷卻。再加入1.0mL/L的0.1mM脫落酸、1.0mg/L吲哚乙酸和3.0mg/L Bialaphos以及2.0mL的50mg/mL羧芐青霉素母液。
無激素培養(yǎng)基(272V)含有4.3g/L MS鹽(GIBCO 11117-074)，5.0mL/L MS維生素母液(0.100g/L煙酸、0.02g/L鹽酸硫胺、0.10g/L鹽酸吡哆辛、0.40g/L甘氨酸(用精制去離子水定容)、0.1g/L肌(myo)-肌醇、40.0g/L蔗糖調節(jié)到pH5.6后用精制去離子水定容)、6g/L Bacto-瓊脂(用精致去離子水定容后添加)，然后對培養(yǎng)基滅菌并冷卻到60℃。
發(fā)明詳述中涉及到的所有公布說明書和專利申請對本發(fā)明所屬領域的技術人員來說都是可理解的。當每篇單獨的發(fā)明公開和發(fā)明申請都被具體的通過個別引用并入本文時，所有公開和發(fā)明申請都通過相同程度的引用結合至本文。
盡管在上文已經通過說明和實施例為了清晰理解的目的對本發(fā)明進行了闡述，但顯然可以在附錄的權利要求書的范圍之內對本發(fā)明進行一定的變化和修改。
序列表
<110>Pioneer Hi-Bred International,Inc.
E.I.DuPont de Nemours & Co。
<120>A ROOT-PREFERRED，WOUND-AND INSECT-INDUCIBLE
2-OXOGLUTARATE-DEPENDENT OXYGENASE PROMOTER FROM MAIZE AND
ITS USE
<130>1887-PCT
<150>60/636,890
<151>2004-12-17
<160>9
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>1116
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<400>1
gtcgacatgt cacgttatca atgtagagac tgataaaaat ttgactctgt ttcgtgaaag 60
ttgacatgca ctatgtgtag aaacctagcc ggccttcaca tgaaatcata aaacttctac 120
ggaggtcggc taggtttgta tacacaacac tcgacaaaga aggcatatct ggaaaccgat 180
atggcttttt tttataagtg ttgtagtcct gacactcgac aaagaagctc catttgccga 240
gtgcctccca gcacacttgg caaagtgact ggcaaagggg cccactattg ccccctttgt 300
cgagagtgcc aggctggcag tcactcgaca aagatgctcc ctttgccaag tgtcaattgc 360
ggctctcggc acaaaggctg tcgtgggggc ccactggagc cttatttgcc gagtgtcacg 420
ccagcaggca ctcgataaag gcttccttt tgccgagtgc cattgaggac actcgacata 480
gtctctgtca ccatcacttg tcgctgtcac ggcaatttt ctttgccgag cactagggga 540
cacttggtaa agactttgcc gagtgtccga cataatgcta tcggtaaaga ggtcgttgct 600
gatgtacagt tcactgagtc ctttttacta agtgtcacac tcgacaaaga gtttgttgag 660
tgttttttag gctttgccga gtgcttgcga cactcggcaa agcagtatgt tttggtagtg 720
aggtcgttgt cgataaacag ttcaccgatc cctatttgcc gaatgctaca ctcgaagtgc 780
cgcaggcact cgggaaagaa ccctgtttcg gttgtgactt ggtattgtta ggctgtgtat 840
tgaatccaat gctatcacat tagatataaa ctagataacc gcgtatacag tgttttattc 900
gataaaactc taccctctcc tatgaaactg tctctatatc tttcctctta attacagtca 960
tgttccgcac atgatgctgt atcaccgcac atggagagag agaaaaatag attggtcagg 1020
ctgtttgtat atgcaaggcc tacgcttcta tttaaagacc gtatcgtggt tgcaggcaga 1080
agcacacaag ctagcaattg aaaaaaaaaa caggca1116
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物GSP1R
<400>2
cacaaaggta ccacacacac 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物GSP2R
<400>3
tctgcggatg aagggaatgg 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物GSP3R
<400>4
caagactaga cgtggtgtgc20
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物GSP1GW
<400>5
gcctgcggca cttcgagtgt agcattc 27
<210>6
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物GSP2GW
<400>6
tactgctttg ccgagtgtcg caagcac 27
<210>7
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物GSP3GW
<400>7
cactcggcaa agcctaaaaa acactcaac 29
<210>8
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物OligoXbaI
<400>8
cgcgtctaga gtcgacatgt cacgttatc 29
<210>9
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物OligoBamHINcoI
<400>9
gcggtcggag ccatggatcc tgcctg26
App.Ref.1887-PCT
權利要求
1.一種分離的核酸分子，所述核酸分子含有的核苷酸序列選自
a)含有SEQ ID NO1中所示序列的核苷酸序列或其互補序列；
b)含有專利保藏號為PTA-6278的質粒的植物啟動子序列的核苷酸序列，或其互補序列；
c)含有SEQ ID NO1所示序列中的至少20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述序列在植物細胞中起始轉錄；和
d)包含的序列與SEQ ID NO1所示序列至少有95％的序列同一性的核苷酸序列，其中所述序列在植物細胞中起始轉錄。
2.一種DNA構建體，所述構建體含有權利要求1的核苷酸序列，該核苷酸操作性連接于目的異源核苷酸序列。
3.一種載體，所述載體含有權利要求2的DNA構建體。
4.一種植物細胞，所述細胞含有穩(wěn)定整合入其基因組的權利要求2的DNA構建體。
5.權利要求4的植物細胞，其中所述植物細胞來自單子葉植物。
6.權利要求5的植物細胞，其中所述單子葉植物是玉米。
7.權利要求4的植物細胞，其中所述植物細胞來自雙子葉植物。
8.一種植物，所述植物含有穩(wěn)定整合入其基因組的權利要求2的DNA構建體。
9.權利要求8的植物，其中所述植物是單子葉植物。
10.權利要求9的植物，其中所述單子葉植物是玉米。
11.權利要求8的植物，其中所述植物是雙子葉植物。
12.一種權利要求8的植物的轉基因種子。
13.權利要求8的植物，其中所述目的異源核苷酸序列編碼的基因產物賦予植物對除草劑、鹽、低溫、干旱、病原體或昆蟲的抗性。
14.一種在植物體中表達核苷酸序列的方法，所述方法包括向植物體導入DNA構建體，所述DNA構建體含有啟動子及操作性連接于所述啟動子的目的異源核苷酸序列，其中所述啟動子含有的核苷酸序列選自
a)含有SEQ ID NO1所示序列的核苷酸序列；
b)含有專利保藏號為PTA-6278的質粒的植物啟動子序列的核苷酸序列；
c)含有SEQ ID NO1所示序列中的至少20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在所述植物中起始轉錄；和
d)包含的序列與SEQ ID NO1所示序列至少有95％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物細胞中起始轉錄。
15.權利要求14的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
16.權利要求14的方法，其中所述植物是單子葉植物。
17.權利要求16的方法，其中所述單子葉植物是玉米。
18.權利要求14的方法，其中所述的異源核苷酸序列編碼的基因產物賦予植物對除草劑、鹽、低溫、干旱、病原體或昆蟲的抗性。
19.權利要求1 4的方法，其中所述目的異源核苷酸序列在根部選擇性表達。
20.一種在植物細胞中表達核苷酸序列的方法，所述方法包括向植物細胞導入DNA構建體，所述DNA構建體含有操作性連接于目的異源核苷酸序列的啟動子，其中所述啟動子含有的核苷酸序列選自
a)含有SEQ ID NO1所示序列的核苷酸序列；
b)含有專利保藏號為PTA-6278的質粒的植物啟動子序列的核苷酸序列；
c)含有SEQ ID NO1所示序列中至少20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物細胞中起始轉錄；和
d)包含的序列與SEQ ID NO1所示序列至少有95％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物細胞中起始轉錄。
21.權利要求20的方法，其中所述植物細胞來自單子葉植物。
22.權利要求21的方法，其中所述單子葉植物是玉米。
23.權利要求20的方法，其中所述植物細胞來自雙子葉植物。
24.權利要求20的方法，其中所述的異源核苷酸序列編碼的基因產物賦予植物對除草劑、鹽、低溫、干旱、病原體或昆蟲的抗性。
25.一種在植物根部選擇性表達核苷酸序列的方法，所述方法包括向植物細胞導入DNA構建體，并從所述植物細胞出發(fā)再生出轉化植株，所述DNA構建體含有啟動子及操作性連接于所述啟動子的目的異源核苷酸序列，其中所述啟動子含有的核苷酸序列選自
a)含有SEQ ID NO1所示序列的核苷酸序列；
b)含有專利保藏號為PTA-6278的質粒的植物啟動子序列的核苷酸序列；
c)含有SEQ ID NO1所示序列中的至少20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述序列在植物根部細胞中起始轉錄；
d)包含的序列與SEQ ID NO1所示序列至少有95％序列同一性的核苷酸序列，其中所述序列在植物根部細胞中起始轉錄。
26.權利要求25的方法，其中所述異源核苷酸序列的表達改變了所述植物的表型。
27.權利要求25的方法，其中所述植物是單子葉植物。
28.權利要求27的方法，其中所述的單子葉植物是玉米。
29.權利要求25的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
30.權利要求25的方法，其中所述的異源核苷酸序列編碼的基因產物賦予植物對除草劑、鹽、低溫、干旱、病原體或昆蟲的抗性。
全文摘要
本發(fā)明提供了在植物體中調節(jié)異源核苷酸序列表達的組合物和方法。組合物包括一種用于2-酮戊二酸依賴型玉米加氧酶編碼基因的誘導型啟動子的新型核苷酸序列。提供了使用本文所公開的啟動子序列在植物中表達異源核苷酸序列的方法。該方法包括，在植物細胞基因組中穩(wěn)定整合一段操作性連接本發(fā)明根部優(yōu)先啟動子的核苷酸序列，并再生表達該核苷酸序列的穩(wěn)定轉化植物體。
文檔編號C12N15/82GK101146910SQ200580048126
公開日2008年3月19日 申請日期2005年12月15日 優(yōu)先權日2004年12月17日
發(fā)明者S·迪恩, 盧偉柏, B·F·麥卡琴, L·E·辛斯, K·R·沃德 申請人:先鋒高級育種國際公司, 納幕爾杜邦公司