專利名稱：使用AtBG1基因產(chǎn)生對多種脅迫具有增加的抗性的轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及AtBGl (擬南芥e—葡糖苷酶1)基因的用途和具有 ^MW基因插入的轉(zhuǎn)基因植物，更精確地，力M67基因通過增加一種植物 激素脫落酸(ABA)的水平用于產(chǎn)生對多種環(huán)境脅迫具有抗性的轉(zhuǎn)基因植 物的用途，和具有基因插入的具有脅迫抗性的轉(zhuǎn)基因植物。
背景技術(shù)：
植物激素脫落酸(ABA)在包括種子休眠、萌發(fā)和對環(huán)境脅迫的適 應(yīng)性反應(yīng)的生理過程中起關(guān)鍵作用(Finkelstein R. R. et al. ， /^a/7t
14: 515， 2002; J. K. Zhu. jy^i; 7fey尸h/7t53: 247， 2002;Zeevaart J. A. D. and Creelman R. A.， 爿/7/ . 7 ey. 尸〗朋t 尸/ j^io丄尸h/7t #。丄 39: 439，1988;Leung J. 和
Giraudat J. j層齡尸〗朋t尸/ ，'o"7朋t U腸丄49: 199， 1998)。 ABA幾乎同時被兩個研究組發(fā)現(xiàn)F. T. Addincott和P. F. Wareing。 F. T. Addincott組研究未成熟果實的脫落，從棉花果實的落葉分離了作 為刺激劑的abscisll。 P. F. Wareing的另一個研究組研究樹芽的冬眠， 從一種白樺Betula Pubescence分離了休眠的誘導(dǎo)劑，然后將其命名為休 眠素。在1965年，證實了休眠素和abscisll是相同的，然后他們開始被 稱作脫落酸(下文中稱作"ABA")。
休眠的種子、樹芽和鱗莖含有大量的ABA并且隨著它們萌發(fā)，ABA 含量降低。ABA還涉及氣孔運動。精確地，當植物脫水時，ABA合成加速 并且葉孔被關(guān)閉，導(dǎo)致保護植物免于失水。例如，稱作flacca的轉(zhuǎn)基因 番茄植物與野生型植物相比由于低水平的ABA而不顯示出氣孔關(guān)閉。
細胞ABA水平不斷波動以允許植物調(diào)節(jié)來改變生理和環(huán)境條件。具
體地，細胞ABA水平受到生物合成和降解之間的平衡的控制。從頭蛋白質(zhì) 合成是增加細胞ABA水平必需的。同時，由于氧化導(dǎo)致ABA降解或者連接 成無活性形式而使ABA水平降低(Zeevaart J. A. D.和R. A. Creelman， 爿/7/7. "朋t尸力j^j'o丄尸^3/^#。丄A'o丄，39: 439, 1988; Leung J.
禾卩Giraudat J. , J/7/7i/ Zfe7尸^373t尸/ j^j'cJ /^3/7t #。2 49: 199， 1998;
Cutler A. J. and Krochko J. E, ， 7^e油尸J朋"cj'面e 4: 472， 1999; Qin X.禾口 Zeevaart J". A.，尸潔.淑丄爿cW. 5"cj'.狙96: 15354， 1999)。
低水平的ABA導(dǎo)致多種生理缺陷，包括提前萌發(fā)、枯萎或者對環(huán)境 脅迫敏感(Cutler A. J.禾口 Krochko J. E. ， Tre油7/7尸^a/7t 5""'e雄4: 472， 1999; Koor騰ef M. et al. ， 粉丄61: 385， 1982;
Rock C. D.禾口 Zeevaart丄A.，尸roc. ^cad 5"c丄〃5"A 88: 7496，
1991)，其表明合成和降解之間的平衡正確控制ABA水平對于多種生理應(yīng) 答是非常重要的。細胞ABA含量通過兩種途徑降低。第一種途徑是通過細 胞色素P470CYC707A在8，位對ABA的氧化以形成不穩(wěn)定的8'-羥基ABA。 該不穩(wěn)定的中間體隨后通過自發(fā)異構(gòu)化轉(zhuǎn)化成菜豆酸(Zeevaart丄A. D. 禾口 Creelman R. A. ， j朋./fey.尸Za/7t尸力j^j'o丄 39; 439， 1988; T. Kushiro， " a丄，^M 0 / 23: 1647， 2000)。
其他降低細胞ABA含量的途徑是通過糖基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的綴合葡萄 糖，從而產(chǎn)生ABA葡萄糖酯(ABA-GE) (Cutler A. J.和Krochko J. E.， 7>e72cfe j'/7尸7a/7t5^'e/7ce4: 472， 1999; Walton D, C.和Li Y. ， j.y /^a/3t //onz a/7es1 .■尸/ ysj'cJo^7, 5ioc力e;z j.s1 tzy朋di/WeciAZai-萬j'o7c^， 140-157; Xu Z. J. et al.，尸力y幻'o/. 129: 1285， 2002)。綴合的ABA-GE 在液泡或者質(zhì)外體空間保存(Kaiser W. et al. ， / 尸h/7t119: 237， 1985; Dietz K. J. et al. ， /. ^ ta77y 51: 937， 2000)。然
而，生物學(xué)上無活性的ABA-GE是否組成保留或者保存形式的ABA的問題 仍然有待澄清。
在本發(fā)明中，發(fā)明人證實定位在ER的一種擬南芥e —葡糖苷酶同 源物AtBGl顯示出ABA-GE水解活性，并且在脫水脅迫條件下快速聚合低
分子量AtBGl成為較高分子量的形式而增加細胞ABA含量。在中具 有T-DNA插入的突變的擬南芥(下文中稱作"突變atbgl")顯示出降低 的ABA水平、有缺陷的氣孔閉合、由于葉綠體缺少產(chǎn)生的黃葉表型和對非 生物脅迫的敏感應(yīng)答。另一方面，過表達^"W基因的突變擬南芥顯示出 比對照高2. 5倍的ABA水平和對環(huán)境脅迫的更強的抗性。
因此，本發(fā)明人通過證實JMW基因?qū)τ趯Π}損害、冷損害和 脫水的多種環(huán)境脅迫具有強烈耐受性的植物可以有很大幫助。
公開 技術(shù)問題
本發(fā)明的一個目的是提供產(chǎn)生對多種環(huán)境脅迫具有強烈抗性的轉(zhuǎn) 基因植物的方法。
技術(shù)解決方案
為了實現(xiàn)上面的目的，本發(fā)明提供了編碼AtBGl (擬南芥P—葡糖 苷酶1)的基因增加植物或者其變種中對環(huán)境脅迫的抗性的用途。
本發(fā)明通過插入編碼AtBGl或者其變體的基因提供了對環(huán)境脅迫具
有抗性的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明還通過增加植物中的ABA水平提供了產(chǎn)生對環(huán)境脅迫具有抗
性的植物的方法。
本發(fā)明還通過插入JW67基因或者AtBGl蛋白質(zhì)提供了增加植物中
對脅迫的抗性的方法。
下文詳細描述本發(fā)明。
本發(fā)明提供了編碼AtBGl (擬南芥P—葡糖苷酶1)的基因增加植 物或者其變種中對環(huán)境脅迫的抗性的用途。
植物激素脫落酸(ABA)在包括種子休眠、萌發(fā)、對環(huán)境脅迫條件 的適應(yīng)性應(yīng)答的多種生理過程中起重要作用。較低水平的細胞ABA導(dǎo)致多 種表型，如提前萌發(fā)或枯萎。通過諸如糖基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的綴合葡萄糖而轉(zhuǎn) 化成無活性的ABA葡萄糖酯(ABA-GE)的途徑降低細胞ABA含量。在本發(fā)明 中，證實從擬南芥分離的P葡糖苷酶同源物AtBGl可以通過將ABA-GE轉(zhuǎn)
化成ABA而增加ABA水平，其導(dǎo)致植物中對環(huán)境脅迫的增強的抗性。環(huán)境 脅迫包括高溫、鹽損害、干旱、污染、病原體、創(chuàng)傷、低溫、過度光條件、 臭氧、除草劑、過度暴露于紫外線和滲透壓休克。
為了確定在多種環(huán)境脅迫下，J"W基因的表達模式，對擬南芥給 予高濃度的NaCl、低溫和脫水，接著觀察的表達。結(jié)果，在野生 型植物中NaCl脅迫誘導(dǎo)^MG2的表達，而沒有誘導(dǎo)編碼其他3葡糖苷酶 同源物的Gluc和psr3. l基因(圖2)。結(jié)果表明在P葡糖苷酶同源物中， 僅僅Jt萬67在植物中增加脅迫抗性。
還進行了間接研究以證實J"W是否可以增加植物中對環(huán)境脅迫的 耐受性。觀察到具有'突變atbgl'的T-DNA插入的突變株系中 的表型。不像野生型，突變株顯示出黃葉和矮株高(圖9和
圖10)。在野 生型植物中，氣孔在白天開放并且在也見關(guān)閉。然而，在'突變atbgl' 中，甚至在夜間也沒有觀察到氣孔閉合(圖13)。在干燥條件下，突變體 中失水量比野生型高1.5倍(圖15)并且脫水水平也更高，顯示出多數(shù) 葉子的枯萎(圖16)。
從結(jié)果可以證實由于缺少AtBGl蛋白質(zhì)，在'突變atbgl'中對環(huán)
境脅迫的抗性被弱化。
本發(fā)明人將^"W基因插入到'突變atbgl，中，導(dǎo)致構(gòu)建了另一 種轉(zhuǎn)基因擬南芥植物株系(下文中稱作"拯救的atbgl")。以與使用'突 變atbgl'的實驗中所述的相同的方式進行實驗以確定^突變atbgl' 的表型是否由于力"67基因中的突變引起。
結(jié)果，"拯救的atbgl"類似于野生型，在萌發(fā)后1周(lw) 、 2周(2w) (圖9)和4周(4w)(圖IO)后顯示出清楚的綠色，高度很高并且顯示出 正常的氣孔作用(即，與野生型一樣，氣孔在白天打開，在夜間關(guān)閉)(圖 13)。在脫水條件下失水量低于野生型(圖15)。在脫水條件下培養(yǎng)21天 后，觀察到"拯救的atbgl"正常生長，沒有顯示出脫水引起的微暗的葉 子(圖16)。
從這些結(jié)果證明"突變的abtgl"的表型由于^4t^77基因中的突變引起。
^MC7基因編碼的AtBGl蛋白質(zhì)增加了植物中脫落酸水平，并且從
而增強了對環(huán)境脅迫的抗性。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，檢査了 AtBGl蛋白質(zhì)是否可以水解 ABA糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生的ABA-GE。將野生型AtBGl蛋白質(zhì)和在」WW基因中 具有替代或者缺失突變得到的突變的AtBGl蛋白質(zhì)與ABA-GE (脫落酸葡 萄糖基酯)反應(yīng)，接著用HPLC分級分離ABA級分。使用抗ABA特異性抗 體，通過ELISA證實和定量ABA級分。結(jié)果，從野生型AtBGl和ABA-GE 的反應(yīng)觀察奧高水平的ABA。另一方面，從突變的AtBGl蛋白質(zhì)和ABA-GE 的反應(yīng)沒有檢測到ABA(圖17和圖18)。結(jié)果表明JMW基因編碼的AtBGl 蛋白質(zhì)通過水解ABA-GE增加ABA的水平。
通過插入將"突變的abtgl"的黃葉表型轉(zhuǎn)變成正常綠色(圖 12)并且通過力M^/插入也誘導(dǎo)了氣孔閉合(圖14)。這些結(jié)果還支持通 過AtBGl的ABA產(chǎn)生促進植物中脅迫抗性。
其他證實的結(jié)果是AtBGl定位于ER， 一種細胞內(nèi)細胞器(圖23到
26)。
從而，本發(fā)明提供了 ^WW基因用于增強植物中對脅迫抗性和它的 同源基因在另一植物中的用途?？梢詫⒈景l(fā)明的基因獨立地或者根據(jù)常規(guī) 植物轉(zhuǎn)染方法使用載體插入到植物中。例如，可以利用本領(lǐng)域中公知的擬 南芥介導(dǎo)的方法、基因槍、PEG方法和電穿孔。
變體指蛋白質(zhì)，其中AtBGl的氨基酸序列中的一些氨基酸已經(jīng)突變 但是沒有功能改變。變體包括天然或者人工變體，其與AtBGl蛋白質(zhì)同源 物具有相似的結(jié)構(gòu)和生理功能。
本發(fā)明還通過插入編碼AtBGl或者其變體的基因，提供了具有脅迫
抗性的轉(zhuǎn)基因植物。
為了產(chǎn)生對環(huán)境脅迫具有抗性的轉(zhuǎn)基因植物，本發(fā)明人構(gòu)建了含有 」MW基因的植物表達載體、BI121::AtBGl'和用該載體轉(zhuǎn)染的農(nóng)桿菌 (LBA4404)，其在2004年11月18保藏在韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所 (KRIBB)的韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)(保藏號KCTC 10729BP)。
通過花浸染法用上面的載體、BI121::AtBGl'轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染 擬南芥產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因植物。
觀察到含有^"67基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥的環(huán)境脅迫依賴的表型。結(jié)果，高水平的NaCl導(dǎo)致野生型枯萎，但是AtBGl轉(zhuǎn)基因擬南芥正常生長 (圖4)。盡管增加NaCl濃度減小了野生型的根生長速率，但是增加NaCl 濃度到固定含量增加了轉(zhuǎn)基因擬南芥的根生長速率(圖5)。上面的結(jié)果表明具有」"W插入的轉(zhuǎn)基因植物顯示出對環(huán)境脅迫如 高濃度NaCl的抗性。含有編碼AtBGl或者其變體的基因的另一轉(zhuǎn)基因植物也包括在本發(fā)明中。還理解本發(fā)明包括通過^"W插入顯示出對環(huán)境脅迫的抗性的轉(zhuǎn)基 因植物的后代或者克隆的植物和該植物的種子、果實、穗、塊莖、塊狀根、 樹、愈傷組織或原生質(zhì)體。本發(fā)明還提供了通過增加細胞ABA水平產(chǎn)生對環(huán)境脅迫具有抗性的植物的方法。上面的方法包括下列步驟iii) 向植物中插入另一植物的^"W基因/同源基因或者含有該 基因的載體；禾口iv) 通過組織培養(yǎng)再分化該植物細胞。本發(fā)明人用含有」^67基因的pBI121: :AtBGl載體轉(zhuǎn)染擬南芥，所 述載體可以用于通過花浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。由于JM67 基因的過表達導(dǎo)致增加水平的游離ABA，該轉(zhuǎn)基因植物顯示出對多種脅迫 條件的抗性。本發(fā)明還提供了用^"W基因或者AtBGl蛋白質(zhì)插入產(chǎn)生脅迫耐受 性轉(zhuǎn)基因植物的方法。如前文所述，AtBGl通過水解將脫落酸葡萄糖酯(ABA-GE)轉(zhuǎn)化成脫 落酸(ABA)，并且增加水平的ABA增加了植物中對脅迫條件的抗性，所述 水平的增加通過AtBGl多聚化促進。在脫水條件下，AtBGl過表達的植物由于AtBGl的激活而顯示出增 加的ABA含量(見圖27 —圖31 )并且在生產(chǎn)生長條件下，ABA-GE通過AtBGl 多聚化轉(zhuǎn)變成ABA以調(diào)節(jié)ABA的晝夜升高見圖32—圖34和圖36 —圖38)。 結(jié)果表明不是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而是AtBGl促進了細胞ABA的活性庫的增加。
不像從頭生物合成(其是相當復(fù)雜和耗時的過程)，通過AtBGl介導(dǎo)的 ABA-GE水解產(chǎn)生ABA是簡單和容易的，使得可以根據(jù)脅迫條件和持續(xù)時 間快速調(diào)節(jié)活性ABA庫。據(jù)此判斷從ABA-GE增加細胞ABA含量的途徑是 抵抗植物中的脫水脅迫。附圖描述參考附圖更好地理解本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的應(yīng)用，附圖中圖1是圖表，顯示了 AtBGl (擬南芥P —葡糖苷酶1)和其他一葡 糖苷酶同源物之間的氨基酸序列的比較，圖2 —圖6描述了環(huán)境脅迫誘導(dǎo)」MW表達并且含有」t^ 7基因的 轉(zhuǎn)基因植物顯示出對NaCl脅迫的增強的抗性，圖2是一組電泳照片，顯示了使用JZ^W、血67we (AF082157)和 *戸7^. 7 (U72153)的cDNA作為探針的RNA印跡分析的結(jié)果，其中"野生 型"擬南芥接受不同的化學(xué)脅迫(低溫、脫水、高濃度NaCl) 30分鐘、1 小時或者6小時，然后提取總RNA，圖3是一組電泳照片，顯示了使用從用JMW基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因擬 南芥提取的總RNA進行的RNA印跡分析的結(jié)果，圖4是一組照片，顯示用ZMG7或者空載體pBI121轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因 擬南芥在土壤中培養(yǎng)10天，然后用NaCl處理4天，圖5是照片，顯示了在MS板上培養(yǎng)4天然后轉(zhuǎn)化到含有高濃度NaCl (n=50)的另一平板的植物的根的生長，圖6是一組照片，顯示了在含有處于^MW啟動子控制下的6Y/S和 組織特異性^"^表達的轉(zhuǎn)基因植物培養(yǎng)開始后分別1周(1W)、2周(2W) 和三周(3W)得到的X-Glue的結(jié)果。圖7A是示意圖，顯示了具有」MW的T-DNA插入的突變株，圖7B是凝膠電泳照片，通過使用從含有T-DNA的突變的擬南芥(下 文中"突變的atbgl")分離的基因組DNA與基因特異性引物進行 PCR，證實使用JMC7的T一DNA插入是否突變了擬南芥。圖8 —圖16描述了 "突變的atbgl"和"拯救的atbgl"的表型， "拯救的atbgl"的基因缺失通過用JMW;;朋基因轉(zhuǎn)染恢復(fù)，
圖8是凝膠電泳照片，通過RT-PCR使用基因特異性引物證 實"突變的atbgl"不含有XWW轉(zhuǎn)錄物，圖9和圖10是每種野生型、"突變的atbgl"和"拯救的atbgl" 萌發(fā)后l周(1W)、 2周(2W)和4周(4W)后拍攝的照片，圖11是照片，顯示了使用抗一HA抗體(Roche)通過蛋白質(zhì)印跡分析 證實的"拯救的atbgl"中〃^^;:朋表達，圖12是一組照片，顯示了通過」MW插入對"突變的atbgl"恢復(fù)到類似于野生型的表型，圖13是曲線圖，顯示了在白天和黑夜測量的在16/8小時的白天/ 黑夜周期下培養(yǎng)的擬南芥的葉子的孔徑(n=150，條線=標準誤)，圖14是曲線圖，顯示了插入ABA或者用抑制NO合酶活性的NAME 處理后，在白天和黑色測量的"突變的atbgl"的葉子在氣孔閉合期間的 孔徑(n二200，條線=標準誤)，圖15是曲線圖，顯示了為了比較失水量，在20。C下10。X的相對濕 度的脫水條件下放置的葉子稱重的結(jié)果，圖16是一組照片，顯示了在脫水條件下，野生型、"突變的atbgl" 和"拯救的atbgl"培養(yǎng)14天(14d)或21天(21d)的結(jié)果，圖17 —圖22是照片和曲線圖，顯示了通過AtBGl對ABA-GE的水解 和由此ABA水平的改變，圖17是照片，顯示了在用AtBGl :HA、AtBGl [E207Q] 、AtBGl [AC105] 和空載體轉(zhuǎn)化的野生型植物的原生質(zhì)體中使用抗一HA抗體免疫純化的結(jié) 果，圖18是一組照片，顯示了在合適的緩沖液中ABA-GE存在下，通過 免疫純化的AtBGl :HA蛋白質(zhì)產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC結(jié)果，圖19是曲線圖，顯示了使用抗一ABA抗體，對HPLC的ABA級分的 ELISA結(jié)果，圖20是曲線圖，顯示了使用ABA抗體(Agdia)用ELISA測量野生型、 "突變的atbgl"和"拯救的atbgl"種子中ABA水平的結(jié)果，圖21是蛋白質(zhì)印跡分析的照片，顯示了"拯救的atbgl"中AtBGl :HA 水平，通過使用抗一HA抗體證實，
圖22是曲線圖，顯示了野生型、"突變的atbgl"和"拯救的atbgl"的萌發(fā)測定的結(jié)果，圖23—圖26是照片，顯示了 AtBGl的細胞內(nèi)位置，圖23是示意圖，顯示了 GEP標記的JMW基因的結(jié)構(gòu)，圖24是一組熒光顯微照片，通過使用Bip:RFP作為ER標記和GFP作為胞質(zhì)溶膠可溶蛋白顯示了 ER，圖25是一組熒光顯微照片，顯示了 AtBGl:HA和BiP:REP的細胞內(nèi)位置，圖26是照片，顯示了從用AtBGl:HA轉(zhuǎn)化但是不用衣霉素處理的原 生質(zhì)體得到的蛋白質(zhì)提取物用內(nèi)切酶H和PNGase F處理，制備試樣，并 從用AtBGl:HA轉(zhuǎn)化并用衣霉素處理的原生質(zhì)體得到的蛋白質(zhì)提取物通過 印跡分析，圖27和圖31是曲線圖和照片，表明微粒體中AtBGl的ABA-GE水解活性在脫水調(diào)節(jié)下通過AtBGl的快速多聚化增強，圖27是曲線圖，顯示了從用脫水處理或不處理的"拯救的atbgl"得到的微粒體級分的ABA-GE水解活性，圖28是一組照片，顯示了在脫水脅迫下AtBGl多聚化， 圖29是曲線圖，顯示了高分子AtBGl的ABA-GE水解活性， 圖30和圖31是照片和曲線圖，顯示了高分子AtBGl的形成， 圖32 —圖34是照片和曲線圖，顯示了與ABA的水平成比例，AtBGl多聚化形成高分子量形式，圖32是曲線圖，顯示了在"拯救的atbgl"中ABA水平的晝夜變化， 圖33是一組照片，顯示了從"拯救的atbgl"得到的蛋白質(zhì)提取物中AtBGl的一天檢測的結(jié)果，圖34是曲線圖，顯示了定量高分子量形式的AtBGl的結(jié)果， 圖35是照片，顯示了使用抗一T7抗體，接著使用抗一HA抗體通過蛋白質(zhì)印跡對來自具有PEG8000的滲透脅迫的轉(zhuǎn)基因植物的原生質(zhì)體得到的蛋白質(zhì)提取物的免疫沉淀結(jié)果，圖36 — 38是照片和曲線圖，顯示了涉及從頭ABA生物合成途徑的基因表達，
圖36是一組照片，顯示了使用涉及從頭生物合成的基因和AtBGl 的引物的半定量RT-PCR的結(jié)果圖37和圖38是曲線圖，顯示了依賴時間的水平。發(fā)明方式如下面的實施例中所示闡明本發(fā)明的實際的當前優(yōu)選的實施方案。然而，將理解本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮本公開，可以在本發(fā)明的精神 和范圍內(nèi)做出修飾和改進。實施例1:制備轉(zhuǎn)基因擬南芥 〈1-1>從cDNA文庫分離AtBGl基因本發(fā)明人得到了 "扣除cDNA文庫"(PihK. T. et al.，脫Ce仏 7: 567， 1997)，其含有表達通過高濃度的NaCl (滲透壓脅迫之一)誘 導(dǎo)的基因。從該文庫分離了編碼一種P —葡糖苷酶同源物的擬南芥基因 」z^ 2 (圖1)。用SEQ. ID. No 1代表的正向引物和SEQ. ID. No 2代表 的反向引物，通過使用DNA聚合酶(Taq聚合酶，Takara)進行PCR。 PCR 條件如下在94。C預(yù)變性5分鐘，在94"變性30秒，5(TC退火1秒，72 t:聚合l分鐘，從變性到聚合進行50個循環(huán)，并在72"C最終延伸10分 鐘。<1-2〉構(gòu)建用于植物轉(zhuǎn)化的表達載體為了產(chǎn)生用AtBGl基因轉(zhuǎn)化的擬南芥，本發(fā)明人首先將AtBGl基因 克隆到表達載體中。具體地，將具有卡那霉素抗性并含有CaMV 35S啟動子的pBI121 (Pharmacia LKB Biotechnology)的GUS位點用具有SEQ. ID. No 3代表 的核苷酸序列的AtBGl基因替換，得到用于植物轉(zhuǎn)化的表達載體 、BI121::AtBGl，。將 pBI121::AtBGl 載體插入農(nóng)桿菌 (^ro&c^j.咖)，并將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體LBA4404在2004年11月18日保
藏在韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所(KRIBB)的韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)(保藏號KCTC 10729BP)。〈1-3>產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因擬南芥本發(fā)明人用上面實施例〈l-2〉中構(gòu)建的含有AtBGl基因的表達載體 轉(zhuǎn)染擬南芥。具體地，通過花浸染法進行轉(zhuǎn)染(Steven J. C.和Andrew F.B. The Plant Journal, 16(6): 735-743， 1998)。為了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，將擬南 芥培養(yǎng)在MS培養(yǎng)基中，然后轉(zhuǎn)移到土壤?；ㄐ蜉S抽條后，將擬南芥的幼芽切割兩次以制備樣品。將pBI121::AtBGl轉(zhuǎn)染的農(nóng)桿菌在LB培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl)中培養(yǎng)直到穩(wěn)定期，并通過離心回收細胞，將細 胞重懸浮在接種培養(yǎng)基(5%蔗糖，0. 05% Silwet L-77 (Osi Specialties)) 中。當懸浮液的0D值達到0. 8時，將擬南芥切片底朝上浸入懸浮液中并 平緩地攪拌3 —5秒。然后，將擬南芥切片轉(zhuǎn)移到塑料盤中。用塑料圓蓋 覆蓋擬南芥切片并保持濕潤并在黑暗中培養(yǎng)12 — 24小時，得到轉(zhuǎn)基因植是生活力2:通過多種脅迫改變轉(zhuǎn)基因擬南芥 〈2-1> AtBGl基因根據(jù)多種脅迫的表達為了檢査AtBGl的表達是否通過脅迫誘導(dǎo)，從野生型擬南芥提取總 RNA。然后，對野生型植物給予環(huán)境脅迫，然后通過RNA印跡分析測量AtBGl 基因的表達。確切地，在諸如高濃度的NaCl (150 mM)和4。C的低溫的脅迫條件 下，在MS板上培養(yǎng)植物兩周并同時取出平板的遮蓋以給予脫水脅迫。使 用AtBGl， Glue (AF082157)和psr3. 1 (U72153) cDNA作為探針，通過 RNA印跡分析總RNA。使用整個cDNA文庫作為模板，用SEQ. ID. No 4代 表的正向引物和SEQ. ID. No 5代表的反向引物和DNA聚合酶(Taq聚合 酶，Takara)，通過PCR得到67"c (AF082157)和(U72153)基因 的cDNA作為探針。PCR條件如下在94。C預(yù)變性5分鐘，在94。C變性3014
秒，5CTC退火1秒，72'C聚合1分鐘，從變性到聚合進行50個循環(huán)，并 在72。C最終延伸IO分鐘。從RNA印跡分析證實通過NaCl脅迫在野生型植物中誘導(dǎo)AtBGl表 達，但是通過環(huán)境脅迫沒有誘導(dǎo)Glue和psr3.1表達(Leah R. et al. ， /O e瓜，270: 15-789， 1995; Malboobi M.，和Lefebvre D. D.，尸Za肘 U. 34: 57， 1997)，表明僅僅表達了編碼P葡糖苷酶同源物的AtBGl基因(圖2)。 g卩，不像其他P—葡糖苷酶同源物，僅僅AtBGl基因 可以增加植物的脅迫抗性?！?-2〉在多種脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型本發(fā)明人檢查了在多種環(huán)境脅迫下，用AtBGl基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因擬 南芥的表型。具體地，從每種AtBGl轉(zhuǎn)基因擬南芥Tl(轉(zhuǎn)化體l)、 T2(轉(zhuǎn)化體2) 和T3(轉(zhuǎn)化體3)和用空載體pBI121轉(zhuǎn)化的對照擬南芥提取物總RNA，接 著使用AtBGl cDNA作為探針進行RNA印跡分析。結(jié)果，除了用空載體轉(zhuǎn) 化的對照擬南芥外，在T1、 T2和T3中觀察到AtBGl基因表達(圖3)。將Tl在土壤中培養(yǎng)10天，然后每2小時通過濃度為200 mM的NaCl 溶液處理土壤4天，產(chǎn)生高濃度的NaCl脅迫條件。然后將T1轉(zhuǎn)移到新鮮 的新MS板。移植后7天測量根生長(n=50)。通過高濃度的NaCl使空載體pB工121轉(zhuǎn)化的擬南芥枯萎，而用AtBGl 轉(zhuǎn)化的Tl在高濃度NaCl下顯示出正常生長(圖4)。沒有用AtBGl轉(zhuǎn)化的野生型中根生長速率隨著NaCl的濃度升高而 減小，但是用AtBGl轉(zhuǎn)化的Tl、 T2和T3的根生長速率在高達100mMNaCl 濃度下增加(圖5)。為了進一步檢查表達模式，將」MW上游區(qū)放置在P葡糖苷酶(GUS) 編碼區(qū)前面。具體地，將pBI121載體的35S:GUS區(qū)的35S啟動子用限制 酶切割并用通過PCR得到的AtBGl的啟動子區(qū)替換。用SEQ. ID. No 9和 No 10代表的引物和DNA聚合酶(Taq聚合酶，Takam)通過使用染色體 DNA作為模板進行PCR。 PCR條件如下在94。C預(yù)變性5分鐘，在94。C變 性30秒，5(TC退火30秒，72'C聚合1分鐘，從變性到聚合進行50個循
環(huán)，并在72。C最終延伸IO分鐘。結(jié)果得到AtBGl上游啟動子，將其插入 載體中。即，AtBGl基因的啟動子區(qū)用GUS標記并且通過與如上面實施例 中描述的相同方式插入到植物中。通過使用X-葡糖苷酸(Rose Scientific Ltd)根據(jù)以前的文章(Hwang I,和Sheen J. Nature. 413(6854) :383-9， 2001)描述的常規(guī)方法測量GUS活性。轉(zhuǎn)基因植物中的GUS表達非常低并 且對于蓮座葉叢和莖生葉的排水器高度特異(圖6)。同時，將培養(yǎng)兩周 的轉(zhuǎn)基因植物置于脫水條件2周，然后通過使用X-葡糖苷酸測量GUS活 性。在蓮座葉叢和莖生葉的排水器和維管系統(tǒng)中強烈誘導(dǎo)AtBGl啟動子驅(qū) 動的GUS表達，提示AtBGl參與干旱應(yīng)答(圖6)。實施例3:"突變的atbgl"的表型 〈3-1〉"突變的atbgl"的表型為了檢查AtBGl的生物功能，本發(fā)明人觀察了在多種環(huán)境脅迫下， 具有AtBGl基因的T-DNA插入的"突變的atbgl"的表型。具體地，在SALK研究所，USA構(gòu)建的具有T-DNA插入的突變株中， 分離了在AtBGl基因的第9位內(nèi)含子中具有T-函A插入的突變株(圖7A) 并證實其中的T-面A插入。用SEQ. ID. No 6代表的左邊引物和SEQ. ID. No 7代表的正向引物和SEQ. ID. No 8代表的反向引物，通過使用DNA 聚合酶(Taq聚合酶，Takara)進行PCR。 PCR條件如下在94匸預(yù)變性5 分鐘，在94。C變性30秒，5(TC退火1秒，72t聚合l分鐘，從變性到聚 合進行50個循環(huán)，并在72i:最終延伸10分鐘。結(jié)果，得到410 bp PCR 產(chǎn)物并證實了 T-DNA插入(圖7B)。使用SEQ. ID. No 25代表的AtBGl特異性正向引物和SEQ. ID. No 26代表的反向引物，通過RT-PCR研究"突變的atbgl"的總RNA。如圖8 中所示，證實不存在AtBGl mRNA。在萌發(fā)后l周(1W)、 2周(2W)(圖9)和4周(4W)(圖IO)觀察 了野生型和具有T-DNA插入的"突變的atbgl"。結(jié)果，突變植物顯示出 黃葉和矮株高表型。對培養(yǎng)1周的"突變的atbgl"應(yīng)用外源ABA，接著繼續(xù)培養(yǎng)3天。 隨著ABA水平的升高，黃葉變成正常的綠色(圖12)。
〈3-2〉"突變的atbgl"的氣孔大小的測量為了以另一種方法測量AtBGl的生物功能，本發(fā)明人測量了 "突變 的atbgl"的氣孔大小。具體地，將轉(zhuǎn)基因植物培養(yǎng)在2(TC與70%相對濕度和16/8小時光 /暗循環(huán)下并在中午和午夜測量氣孔大小(n=150)(圖13)。在野生型植 物中，氣孔在白天打開并在夜晚關(guān)閉，但是在"突變的atbgl"中，氣孔 關(guān)閉不在夜晚發(fā)生。為了研究外源ABA對氣孔關(guān)閉的影響，將"突變的atbgl"植物用 10 uM禾P50 P M ABA在23時處理并在24時測量氣孔大小(圖14)。對 照組在氣孔閉合的時間內(nèi)，即從4點開始的IO小時內(nèi)用100pl NAME(L-硝基精氨酸甲酯)處理，已知NAME為NO合酶抑制劑，并在午夜測量氣孔 大小。用NAME處理野生型導(dǎo)致氣孔閉合的缺陷，用ABA處理"突變的 atbgl"誘導(dǎo)夜間氣孔閉合，提示ABA參與夜間氣孔閉合的調(diào)節(jié)(n二200， 條線標準誤)。通過加入外源ABA使"突變的atbgl"恢復(fù)了野生型表型的這一結(jié) 果表明AtBGl基因中的突變抑制了 AtBGl基因的表達，顯示出ABA-介導(dǎo) 的應(yīng)答中的缺陷。<3-3〉在脫水條件下"突變的atbgl"的表型為了研究AtBGl的生物功能，本發(fā)明人觀察到在脫水條件下"突變 的atbgl"的失水和枯萎。為了比較失水，將葉子在2(TC與10%相對濕度(干燥條件)下保 持3小時，然后測量葉子的重量(稱量了20片蓮座葉在花芽形成前短 莖上附著的葉子)。結(jié)果，"突變的atbgl"顯示出比野生型高1.5倍的失 水(圖15)。將野生型和"突變的atbgl"移植在溫室的土壤中并在2(TC和70 %相對濕度不提供水的條件下分別培養(yǎng)14天(14d)和21天(21d)。野生
型的葉子顏色改變成淺黑色，并且"突變的atbgl"的葉子遭受嚴重的脫 水并且它們的多數(shù)枯萎(圖6)。從而，"突變的atbgl"與野生型相比顯示出對環(huán)境脅迫的抗性。<3-4〉通過互補證實為了證實"突變的atbgl"的表型是否規(guī)因于AtBGl的突變，用AtBGl 基因轉(zhuǎn)化"突變的atbgl"以過表達AtBGl基因，然后通過與實施例2中描述的相同的方式進行實驗。將病毒HA(紅細胞凝集素)標記的野生型AtBGl cDNA (AtBGl::HA) 插入植物中以誘導(dǎo)AtBGl表達，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化體中突變誘導(dǎo)的AtBGl缺失的互 補，將該轉(zhuǎn)化體稱作"拯救的atbgl"。使用抗一HA抗體，通過蛋白質(zhì)印跡分析檢查"拯救的atbgl"的蛋 白質(zhì)提取物。如圖ll中所示，證實了 AtBGl蛋白質(zhì)表達。通過與實施例3中描述的相同的方式檢查"拯救的atbgl"。結(jié)果， 萌發(fā)后l周(lw)、 2周(2w)(圖9)和4周(圖IO觀察到與野生型一樣， "拯救的atbgl"的葉子很綠和高表型，并且還拯救了缺陷的氣孔閉合， 這意味著氣孔在白天打開在夜晚閉合(圖13)。在脫水條件下，"拯救的 atbgl"中的失水量小于野生型中的失水量(圖15)。在脫水條件下培養(yǎng) 21天后，轉(zhuǎn)化體顯示出正常生長，沒有變成淺黑色葉子(圖16)。從結(jié)果可以證實"突變的atbgl"的表型規(guī)因于AtBGl基因的突變。實施例4: AtBGl對ABA-GE水解〈4-1〉通過ELISA定量HPLC的ABA級分本發(fā)明人檢查了 AtBGl蛋白質(zhì)是否可以通過ABA糖基轉(zhuǎn)移酶水解 ABA-GE(Xu Z. J. et al.，尸h/7t129: 1285， 2002)。具體地，用AtBGl:HA、 AtBGl [E207Q] :HA、 AtBGl [AC105] :HA和作 為對照的空白載體轉(zhuǎn)化擬南芥，并在轉(zhuǎn)化后24小時得到蛋白質(zhì)提取物。 AtBGl[E207Q] :HA含有207位核苷酸的替代突變，207位核苷酸是P _糖 苷酶的活性位點(G. Davies禾B B. Henrissat， 5Yr"c"re 3: 853，1995; Marana S. R. et al.，腸c/ j'瓜腸p/ /s.爿cZia， 1545: 41， 2001)。 AtBGl[AC105]含有缺失突變，其在C-末端缺少105個氨基酸殘基。用抗一HA抗體免疫純化表達的蛋白質(zhì)(圖17)，并將免疫純化的蛋 白質(zhì)與ABA-GE (APEX ORGANICS LTD.)在體外在100 mM擰檬酸鹽緩沖液 (pH 5.5) 37。C下溫育1.5小時。通過裝配特定溶劑(40%甲醇，0.1 M 乙酸，10mg/l苯甲醇丁酸酯)包裝柱(RT 250-4柱，MERCK)的HPLC分離 反應(yīng)物。結(jié)果，AtBGl :HA和AtBGl [E207Q] :HA在ABA位置顯示出新的峰(圖18) 。使用抗ABA抗體(不能識別ABA-GE)通過ELISA定量ABA峰。AtBGl [E207Q]:HA釋放的ABA的量顯著減少到野生型的20% (圖19) ，表明207位的谷氨酸對于水解活性是重要的，與其他e—葡糖苷酶 類似(Davies G.禾口 Henrissat B. ， 5"加ct, 3: 853， 1995; Ma腦a S. R. etal.，扁c力j'瓜Az.o*s.爿"a 1545: 41， 2001)。然而，AtBGl [△ C105]:HA和載體對照都沒有顯示出從ABA-GE產(chǎn)生的ABA的可檢測的水平， 與ABA產(chǎn)生在"突變的atbgl"中減少或者受到抑制的其他結(jié)果相一致。 這些結(jié)果一起表明AtBGl :HA水解ABA-GE形成ABA。〈4-2〉種子中ABA水平的研究種子比植物的任何其他部分含有更多的ABA。為了驗證上面的結(jié)果， 本發(fā)明人測量了野生型、"突變的atbgl"和"拯救的atbgl"的種子中 ABA水平。使用80%乙醇從通過液氮磨碎的種子提取化合物，通過裝備C18 柱(J. T. Baker)的HPLC得到ABA峰。使用抗一ABA抗體(Agdia)通過ELISA 測量ABA級分。"突變的atbgl"種子中ABA含量為野生型的約40% (圖20)。在 "拯救的atbgl"植物種子中，ABA含量為野生型的86。/。到250X。即，"突 變的atbgl"種子中ABA含量與野生型中相比非常低，但是"拯救的atbgl" 種子中ABA含量與野生型中的含量相似或者加倍。還使用抗一HA抗體定 量"拯救的atbgl"種子中AtBGl :HA含量(圖21)，得到與通過HPLC定量的相似的ABA水平(圖20)。因此，證實ABA含量與AtBGl蛋白質(zhì)水平 密切相關(guān)。<4-3〉萌發(fā)研究本發(fā)明人檢查了種子中ABA含量是否與萌發(fā)有關(guān)。確切地，在野生 型、"突變的atbgl"和"拯救的atbgl"中進行萌發(fā)測定。結(jié)果，與野生 型相比，萌發(fā)在"拯救的atbgl"中延遲，而"突變的atbgl"更早萌發(fā) (圖22)。結(jié)果表明"atbgl突變體"比野生型含有更低水平的ABA，不 再含有atbgl突變基因的AtBGl蛋白質(zhì)不水解ABA-GE形成ABA，即使含 有少量ABA。實施例5:使用熒光顯微鏡證實細胞AtBGl的位置 <5-1〉在熒光顯微鏡上觀察GFP-標記的AtBGl一種惰性脫落酸ABA-GE定位于ER。 AtBGl水解ABA-GE形成ABA并 且含有REEL的序列繼續(xù)，其在C-末端類似于ER保留序列KDEL(Davies G. 和B. Henrissat， 5^2T/cz^re 3: 853， 1995)。基于此，本發(fā)明人在熒光 顯微鏡下觀察了 AtBGl以證實AtBGl像ABA-GE —樣也定位于ER。具體地，將擬南芥用GFP:AtBGl和BiP:RFP轉(zhuǎn)化，GFP:AtBGl是其 中前導(dǎo)序列的下游用綠色熒光蛋白(GFP)標記的重組AtBGl基因，BiP:RFP 是其中ER伴侶蛋白結(jié)合蛋白BiP (免疫球蛋白結(jié)合蛋白)用紅色熒光蛋 白(REP)標記的重組BiP，然后在熒光顯微鏡下觀察(圖24)。GFP:AtBGl顯示出多種網(wǎng)絡(luò)模式(小圖c)，暗示ER結(jié)構(gòu)，而GFP 僅顯示出擴散的模式(圖23，小圖a)。 GFP:AtBGl模式與BiP:REP (小圖 d)、 ER伴侶蛋白結(jié)合蛋白(小圖e)的緊密重疊(Jin J. B. ， eta丄，/^s"t13: 1511， 2001)。結(jié)果表明AtBGl與Bip—起定位于ER。使用抗一HA抗體通過免疫組織化學(xué)檢査AtBGl :HA以證實AtBGl定 位于ER。結(jié)果，AtBGl:HA顯示出與BiP:RFP的緊密重疊的特征性ER特異 性網(wǎng)絡(luò)模式(圖24)。<5-2〉 AtBGl糖基化為了證實上面的結(jié)果AtBGl定位于ER，本發(fā)明人檢査了 AtBGl糖 基化。蛋白質(zhì)的糖基化產(chǎn)生聚糖并且定位于ER的蛋白質(zhì)的該聚糖部分對 于內(nèi)切H和PNGase F都是敏感的，意味著糖基部分可以容易地被內(nèi)切H 和PNGaseF酶活性消化(KuznetsovG. et al. ， / O e瓜268: 2001，1993)。衣霉素是糖基化的抑制劑。使用抗HA抗體，通過印跡檢查了從用內(nèi)切H和PNGaseF處理(沒 有用衣霉素處理)的AtBGl:HA轉(zhuǎn)染的植物的原生質(zhì)體得到的蛋白質(zhì)提取 物、從衣霉素處理的用AtBGl轉(zhuǎn)化的擬南芥的原生質(zhì)體得到的蛋白質(zhì)提取 物和用AtBGl轉(zhuǎn)化的沒有用衣霉素處理的擬南芥的原生質(zhì)體得到的蛋白 質(zhì)提取物。從衣霉素處理的原生質(zhì)體得到的AtBGl:HA的大小小于用沒有用衣 霉素處理的原生質(zhì)體得到的AtBGl:HA的大小，表明通過衣霉素不發(fā)生糖 基化，從而不產(chǎn)生聚糖。其中用內(nèi)切H和PNGase F消化的聚糖部分的 AtBGl:HA與衣霉素處理的AtBGl:HA具有相同大小，其支持上面的說明。 即，AtBGl:HA的聚糖部分對內(nèi)切H和PNGase F非常敏感并且對此類酶的 消化非常敏感，導(dǎo)致與衣霉素處理的AtBGl具有相同大小(圖25)。結(jié)果 表明AtBGl定位于ER。實施例6:通過脫水脅迫誘導(dǎo)的多聚化對AtBGl的ABA-GE水解活性為了確定受到脫水的"拯救的atbgl"植物中ABA含量的實質(zhì)增加 的原因，本發(fā)明人比較了在30。^相對濕度的條件下脫水10小時的"拯救 的atbgl"植物與在正常條件下生長的"拯救的atbgl"的微粒體從ABA-GE 產(chǎn)生ABA的能力。將植物的微粒體在勻漿緩沖液(250mM蔗糖25mMHEPES pH 7. 0， 10 mM MgCl2， 1 mM DTT)中粉末化，然后以3， 000 rpm離心5分 鐘和以14， 000離心5分鐘。將分離的上清液以100， OOOg超速離心。通過 將所得的微粒體在100 mM檸檬酸鹽緩沖液(pH 5.5)中反應(yīng)并使用含有 ABA抗體的ELISA試劑盒(Agdia)定量ABA含量。結(jié)果，與在正常條件下 生長的對照微粒體相比，用脫水預(yù)處理的"拯救的atbgl"植物的微粒體 顯示出ABA產(chǎn)生的顯著增加(圖27)。
本發(fā)明人還研究了脫水脅迫激活A(yù)tBGl的機理。以前的研究表明P一葡糖苷酶的聚合形式比二聚體形式具有更高的酶活性(Kim和Kim， 1998)。從而，本發(fā)明人研究了脫水脅迫激活A(yù)tBGl的機理是否規(guī)因于 AtBGl多聚化。根據(jù)與上述實施例中所述的相同方法，從用AtBGl、 AtBGl :HA和AtBGl :T7的兩種不同標記的形式共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體制備蛋白 質(zhì)提取物，并用于用抗一T7抗體共免疫沉淀。使用抗一HA抗體通過蛋白 質(zhì)印跡分析免疫沉淀物以研究AtBGl分子之間的相互作用。結(jié)果，在用 T7抗體免疫沉淀的沉淀物中檢測到HA標記的AtBGl (圖35)。此外，當 用10% PEG 8000 (—種誘導(dǎo)脫水脅迫的化學(xué)品)處理原生質(zhì)體12小時時， 沉淀物中HA標記的AtBGl的量增加大約3倍(通過密度計量軟件測量， 圖35)。因此，本發(fā)明人斷定AtBGl經(jīng)歷同數(shù)相互作用，其在脫水脅迫條 件下被增強。為了進一步解決該可能性，在脫水脅迫存在和不存在下，在勻漿緩 沖液(50mM磷酸鈉，pH7.0， 0. 15MNaCl， 0. 02%關(guān)3， 0. 1% Triton X-100) 中破碎"拯救的atbgl"植物的葉子，然后以14,000 g離心5分鐘。從 上清液得到蛋白質(zhì)提取物。將蛋白質(zhì)提取物裝載到S印hacryl S-300高分 辨柱(Amersham)上并通過使用洗脫緩沖液(50 mM磷酸鈉，pH 7.0， 0.15 M NaCl， 0. 02% NaN3)以0. 5 ml/min每3. 0 ml級分體積的流速得到蛋白 質(zhì)級分。使用抗一HA抗體通過蛋白質(zhì)印跡分析級分。結(jié)果，沒有受到脫水脅迫的來自"拯救的atbgl"的AtBHl:HA主要 作為單體存在，存在少數(shù)的高分子量形式(圖30)。相比，進行脫水脅迫 的來自"拯救的atbgl"的AtBHl:HA以更高的分子量形式存在，幾乎沒 有二聚體或者單體(圖28)。脫水處理的植物中AtBGl的主要峰的分子量 對應(yīng)于600 kDA以上，其等同于AtBGl 10聚體。結(jié)果表明脫水脅迫誘導(dǎo) 了 AtBGl的多聚化。比較了 AtBGl的高和低分子量形式的酶活性。使用與上面實施例中 使用的相同的柱子從凝膠過濾得到的高和低分子量級分用抗HA抗體免疫 沉淀，然后通過ELISA定量ABA含量。高分子量形式顯示出4倍更高的 AtBGl活性(圖29)，其與如下發(fā)現(xiàn)一致來自脫水脅迫的植物的微粒體 具有增強的ABA-GE水解活性(圖27)。 接著，發(fā)明人測量了脫水脅迫時AtBGl裝配成更高分子形式的速率。在脫水脅迫時30分鐘、1小時和3小時的不同時間點從進行脫水的"拯 救的atbgl"植物制備蛋白質(zhì)提取物，并通過凝膠過濾層析分級分離，使 用抗一HA抗體通過蛋白質(zhì)印跡檢查。結(jié)果，脫水后30分鐘出現(xiàn)了更高分子量形式并且其隨著時間逐漸 增加(圖30和31)。在脫水脅迫后10小時，觀察到80%的更高分子量 AtBGl (圖30和圖31)。從而，當脫水脅迫時，AtBGl向更高分子量形式 的裝配是快速和廣泛的。實施例7: AtBGl向更高分子量形式的多聚化模式在正常生長條件下l天內(nèi)，植物中的水狀態(tài)不斷改變。在明亮陽光 下，蒸騰速度在中午達到最高水平，其周期性降低水勢或?qū)е轮形鐣r的暫 時水不足。因此，本發(fā)明人假設(shè)葉子中的ABA水平經(jīng)歷晝夜波動。具體地， 當陽光更明亮?xí)r的中午觀察到更高的細胞ABA水平，在夜晚具有較低的 ABA水平。為了證實該理論，本發(fā)明人每6小時測量了在正常條件下生長的野 生型和"拯救的atbgl"植物的葉子中的ABA水平。具體地，切割葉子的 上面部分并浸入80X甲醇中并通過研缽破碎，并在4'C下進行提取3小時， 然后分離的上清液穿過C-18柱(BMS)，然后冷凍干燥。將所得物質(zhì)溶解 在TBS緩沖液(Agdia)中并通過ELISA測量ABA水平。結(jié)果，葉子的ABA 水平在給定的一天內(nèi)顯示出晝夜波動，在"拯救的atbgl"植物中在8:00 AM和2:00PM分別具有最低和最高的濃度(圖32)。野生型植物顯示出類 似的ABA模式，但是具有稍低的水平。為了研究ABA的晝夜波動中該增加的原因，本發(fā)明人在一天內(nèi)不同 時間點測量了野生型植物中AtBGl轉(zhuǎn)錄物以及AtABAl、AtABA2和AtNCED3 轉(zhuǎn)錄物的水平，它們對于從頭ABA生物合成是關(guān)鍵的(圖36)。用10 mg 總RNA和10 ng每種引物(總反應(yīng)體積為100 ml, RT反應(yīng)混合物5ml) 如下進行RT-PCR: 94X:30秒，5CTC30秒和72°C30秒，根據(jù)基因水平確 定的循環(huán)數(shù)為15到35。 SEQ. ID. No 11和No 12 (AtBGl) ， No 13和No 14 (ABAl)， No 15和No 16 (ABA2)， No 17和No 18 (NCED3)' No 19和 No 20 (陽性對照CCA1), No 21和No 22 (陽性對照T0C1)，和No 23禾口 No 24 (陰性對照肌動蛋白)代表的基因特異性引物用于RT-PCR。從RT-PCR證實在使用的正常生長條件下，給定的一天內(nèi)，AtBGl 和AtABA2mRNA水平保持恒定(圖36—圖38)，表明在這些條件下，植物 不經(jīng)歷脫水脅迫。而且，更高的ABA含量不是由于AtBGl的增強的表達。 AtABAl轉(zhuǎn)錄物的水平發(fā)生波動，在下午2:00增加約1. 7倍(圖36和圖 37)。此外，AtNCED3 mRNA表達在下午8:00增加1.8倍，并且保持升高 直到上午2:00，但是在上午8:00恢復(fù)到基底水平。上面的結(jié)果表明AtABAl 和AtNCED3mRNA水平都顯示出晝夜波動。然而，這些mRNA水平的振蕩模 式不與ABA水平的重疊。此外，mRNA水平的波動程度小于2倍。如上述，涉及從頭生物合成的基因的表達模式與ABA的不同，其表 明ABA的從頭合成不可能對中午時ABA水平的升高有貢獻。檢査了 CCA1和T0C1轉(zhuǎn)錄物濃度作為生理節(jié)律的陽性對照，肌動蛋 白作為生理節(jié)律的陰性對照(Wang和Tobin， 1998; Strayer et al., 2000) (圖36和38)。本發(fā)明人接著檢查了 AtBGl是通過AtBGl的多聚化介導(dǎo)的激動促進 ABA水平的晝夜波動。在不同時間點從正常條件下生長的"拯救的atbgl"植物得到的總 蛋白質(zhì)提取物用凝膠過濾柱分級分離，并使用抗一HA抗體通過蛋白質(zhì)印 跡分析。結(jié)果，較高分子量的AtBGl顯示出晝夜波動(圖33和34)。水 平在下午2:00達到峰值，接著快速下降，在上午8:00最低。在下午2:00， 約半數(shù)總AtBGl以更高的分子量形式存在，而在上午8:00，觀察到少于 10X的高分子量AtBGl。高分子量AtBGl的濃度與日間葉組織中ABA含量 的增加顯著相關(guān)，強烈表明AtBGl的多聚化介導(dǎo)的激活造成晝夜波動期間 ABA水平的升高。工業(yè)實用性如前文解釋的，含有本發(fā)明的AtBGl基因的轉(zhuǎn)基因植物可以極大地 促進農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的提高，因為在轉(zhuǎn)基因植物中表達的AtBGl蛋白質(zhì)激活脫落 酸(ABA)并從而增加對多種環(huán)境脅迫的抗性。
序列表文件SEQ. ID. No l和No 2時用于從扣除cDNA文庫分離一種擬南芥基 因JMW的引物序列，SEQ. ID. No 3是AtBGl基因的核苷酸序列，SEQ. ID. No4和No5是用于從完整cDNA文庫得到67wc (AF082157) 和psi^.7 (U72153)的引物序列，SEQ. ID. No 6、 No 7和No 8是用于證實AtBGl基因中T-DNA插入 的引物序列，SEQ. ID. No 9和No 10是用于得到AtBGl上游1. 7 kb區(qū)的引物序列，SEQ. ID. No ll和No 12是AtBGl特異性引物序列，SEQ. ID. No 13和No 14是ABA1特異性引物序列，SEQ. ID. No 15和No 16是ABA2特異性引物序列，SEQ. ID, No 17和No 18是NCED3特異性引物序列，SEQ. ID. No 19和No 20是陽性對照CCA1特異性引物序列，SEQ. ID. No 21和No 22是陽性對照T0C1特異性引物序列，SEQ. ID. No 23和No 24是陰性對照肌動蛋白的特異性引物序列，SEQ. ID. No 25和No 26是AtBGl特異的引物序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解前面描述中公開的概念和具體實施方案可 以容易地用作修飾或設(shè)計用于執(zhí)行本發(fā)明的相同目的的其他實施方案的 基礎(chǔ)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將還理解此類等同實施方案不背離所附權(quán)利要求 書中給出的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.用于增強植物對環(huán)境脅迫抗性的組合物，其含有編碼衍生自擬南芥的β-葡糖苷酶1(AtBG1)或者其變體的基因。
2. 如權(quán)利要求1所述的用于增強植物對環(huán)境脅迫抗性的組合物，其中所 述基因具有SEQ. ID. No3代表的核苷酸序列。
3. 如權(quán)利要求1所述的用于增強植物對環(huán)境脅迫抗性的組合物，其中環(huán) 境脅迫選自高溫、鹽損害、干旱、污染、病原體、創(chuàng)傷、低溫、過度光 條件、臭氧、除草劑、過度暴露于紫外線和滲透壓休克。
4. 如權(quán)利要求1所述的用于增強植物對環(huán)境脅迫抗性的組合物，其通過 ABA葡萄糖酯(ABA-GE)的水解增加脫落酸(ABA)含量而提供對植物的脅 迫抗性。
5. 如權(quán)利要求1所述的用于增強植物對環(huán)境脅迫抗性的組合物，其中所 述基因插入到載體中。
6. 如權(quán)利要求1所述的用于增強植物對環(huán)境脅迫抗性的組合物，其中所 述載體是pBIG:AtBGl:HA (保藏號KCTC 10729BP)。
7. 用權(quán)利要求5的載體轉(zhuǎn)化的植物細胞。
8. 含有權(quán)利要求7的植物細胞的轉(zhuǎn)基因植物。
9. 權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因植物的后代或者克隆。
10. 權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因植物的種子、果實、穗、塊莖、塊狀根、樹、愈 傷組織或原生質(zhì)體。
11. 產(chǎn)生對環(huán)境脅迫具有抗性的植物的方法，其包括以下步驟i) 向植物細胞中插入權(quán)利要求1的基因或者含有該基因的載體；禾口i i)通過組織培養(yǎng)再分化該植物細胞。
12. 給植物提供脅迫抗性的方法，其包括增加衍生自擬南芥的P —葡糖苷酶1"MW)基因的表達。
13. 如權(quán)利要求12所述的給植物提供脅迫抗性的方法，其通過ABA葡萄 糖酯(ABA-GE)的水解增加脫落酸(ABA)含量而提供對植物的脅迫抗性。
14. 如權(quán)利要求13所述的提供對植物的脅迫抗性的方法，其中通過AtBGl 多聚化催化ABA-GE的水解。
全文摘要
本發(fā)明涉及AtBG1(擬南芥β-葡糖苷酶1)基因的用途和具有AtBG1基因插入的轉(zhuǎn)基因植物，更精確地，AtBG1基因通過增加一種植物激素脫落酸(ABA)的水平用于產(chǎn)生對多種環(huán)境脅迫具有抗性的轉(zhuǎn)基因植物的用途，和具有AtBG1基因插入的具有脅迫抗性的轉(zhuǎn)基因植物。由于升高水平的ABA，植物對包括低溫、鹽損害和脫水的多種環(huán)境脅迫具有增強的抗性。從而，增加ABA水平的方法可以極大地促進農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的提高。
文檔編號C12N15/29GK101133159SQ200580046713
公開日2008年2月27日 申請日期2005年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月22日
發(fā)明者李光熙, 黃仁煥 申請人:學(xué)校法人浦項工科大學(xué)校;Fnp株式會社