專利名稱：：用于治療、診斷和色譜層析的泛蛋白或γ晶體綴合物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及在一種或多種基于γ～晶體蛋白或泛蛋白的多肽分子和一種或多種功能成分之間含有共價連接鍵的綴合物。并且，本發明涉及制備這種類型的綴合物的方法，以及應用所述綴合物進行診斷、治療和色譜層析的方法。γ-II-晶體蛋白屬于β-γ-晶體蛋白家族，并且是在脊椎動物中廣泛分布的眼睛晶狀體的結構蛋白(Jaenicke和Slingsby，2001)。β-γ-晶體蛋白形成高度同源性的蛋白家族，其特征在于兩個結構相同的結構域，并且主要由β折疊結構組成(Wistow和Piatigorsky，1988)。β-γ-晶體蛋白的重疊結構基序是所謂的希臘鑰匙拓撲結構。它由4個反平行β折疊鏈組成，其中兩個——一個位于另一個之上——形成晶體蛋白的結構域(Blundell等.，1981)。晶體蛋白的天然功能是基于在眼睛的晶狀體中產生高折射率，這通過達到860mg/ml的極高的局部蛋白濃度而獲得(Kumaraswamy等.，1996)。由于它們的立體結構，晶體蛋白是具有高蛋白酶抗性的非常穩定的和易于溶解的蛋白質。此外，在眼睛晶狀體內部的位置具有使γ-晶體蛋白不受蛋白周轉的作用。因此，β-γ-晶體蛋白具有一種關于蛋白的已知的最高的半衰期(Jaenicke，1996)。這一蛋白家族最有代表性的成員是牛γ-晶體蛋白。對于野生型蛋白以及對于整個范圍的點突變，可以確定不同分辨率的立體結構(Najmudin等.，1993；Kumaraswamy等.，1996；Nodedge等.，1996)。這表明，所述蛋白通過在兩個結構域之間的疏水裂口而穩定。這一裂口由N端結構域的3個殘基和C端結構域的3個拓撲相同的殘基組成的6個疏水殘基的分子內相互作用而形成(Wistow等.，1983)。針對化學試劑的die穩定性在很大程度上不依賴于連接這兩個結構域的短肽(Mayr等.，1994)。牛γ-晶體蛋白具有20kDa左右的大小，并且特征在于格外高的穩定性。它在中性pH下抗8M尿素。在1-9的pH范圍中它以其天然狀態存在(Rudolph等.，1990；Sharma等.，1990)，并且甚至在達到75℃的溫度時，所述蛋白在7M尿素中是穩定的(Jaenicke，1994)。γ-晶體蛋白在大腸桿菌(E.coli)中的重組細胞質表達是成功的，具有很高的產量(Mayr等.，1994)。Die蛋白-化學特性——高穩定性，低分子量，高細胞質表達率——使得γ-晶體蛋白的蛋白種類成為產生備選結合分子的有吸引力的候選。基于作為構架蛋白的牛γ-II-晶體蛋白，Fiedler和Rudolph建立了噬菌粒文庫(GCUCl)，其中將在位置2，4，6，15，17，19，36和38(沒有起始甲硫氨酸)的8個外露表面氨基酸在DNA水平上隨機化。通過噬菌體展示的方式經過幾輪選擇后，可以檢測具有特異性結合雌二醇和μM范圍的親和力的變化。這些結果表明，可以在牛γ-II-晶體蛋白上從頭產生先前不存在的結合特性，并且γ-晶體蛋白一般適于作為分離備選結合分子的構架蛋白(scaffold)(參見專利DE19932688A1)。在隨后的工作中，基于人γ-II-晶體蛋白，建立的新的文庫。人γ-II-晶體蛋白作為構架的選擇以及伴隨的新文庫的構建具有重要的優點1.與牛蛋白相比，人γ-II-晶體蛋白對于變性影響具有顯著更高的穩定性。2.所述蛋白的人源性應該導致各自的變化在治療應用中的很低的免疫原性，和3.最近構建的具有更高復雜性的文庫應該可以分離具有更高親和力的結合分子(Ling2003)。與GCUC1文庫相似，選擇相同的8個氨基酸位置(沒有起始甲硫氨酸，位置2，4，6，15，17，19，36，38)進行隨機化處理。基于人γ-II-晶體蛋白按照所述方法(專利DE19932688A1)建立的新文庫CR20具有5×108種獨立變體的理論大小，每種變化在所述文庫中出現大約130次。在對大于200個獨立的變體進行測序，發現所有的變體中大于80％只在所述的8個隨機化位置具有取代。此外，除第三個密碼子位置外變體在取代位置的序列表現出幾乎相同的所有可能的核苷酸的分布。因此，在8個隨機化位置具有所有32種可能的密碼子的這一文庫是高質量的。作為用于產生備選結合分子應用的第二構架蛋白由人泛蛋白制成。泛蛋白是一種小的、單體的和細胞質蛋白，其——在其序列上高度保守——存在于從原生動物(protozoa)到脊椎動物的所有已知的真核細胞中。在生物體中，它在調控細胞蛋白的可控降解中起基本作用。泛蛋白的多肽鏈由76個氨基酸組成，它們折疊成極端緊密的α/β結構(Vijay-Kumar，1987)幾乎87％的多肽鏈通過氫鍵參與形成二級結構元件。作為主要的二級結構，可以提及三個半α-螺旋轉角以及由5條鏈組成的反平行β折疊。這些元件的特征性排列——反平行β折疊暴露于蛋白表面，在所述蛋白背面充滿了垂直位于蛋白頂端的α螺旋——通常被視作所謂的泛蛋白樣折疊基序。另一種結構特征是在α螺旋和β折疊之間的蛋白內部的顯著的疏水區域。由于它的小的大小，可以通過化學合成和通過生物技術方法進行泛蛋白的人工制備。由于有利的折疊特性，泛蛋白可以通過使用微生物諸如例如大腸桿菌的遺傳工程以相對大的量在細胞質或者在壁膜間隙中產生。由于簡單和有效的細菌制備，泛蛋白可以用作其它要被制備的其生產有難度的外源蛋白的融合伴侶。通過于泛蛋白融合的方法，可以獲得提高的溶解性和由此提高的產量(Butt等.，1989)。基于可獲得的關于晶體結構的數據(PDB數據庫登錄1UBI)，使用計算機化的分析，這些氨基酸在泛蛋白構架中的位置可以位于暴露于表面，即，暴露于溶劑和潛在的結合伴侶的側鏈上。選擇的位置分別在第一氨基端β折疊鏈(pos.2，4，6)的起始處以及在環(pos.62，63)中和在羧基端β折疊鏈(pos.64，65，66)的起始處彼此在空間上靠近，與它們的氨基酸側鏈在泛蛋白的表面形成連續的區域。以這種方法，通過在仍然完整的泛蛋白的蛋白結構上的分析區域進行隨機的氨基酸取代而產生暴露于表面的超變區域(PCT/EP2004/005730，未出版)。在β折疊蛋白上產生人工結合表面代表了常規抗體的一種新型有趣的備選方案。獲得了這樣的證據，即，在γ-晶體蛋白或泛蛋白樣蛋白上人工產生的結合位點形成功能性結合分子(DE19932688A1)(PCT/EP2004/005730，未出版)。然而，直到現在還沒有這樣的建議或指示，即，將這些多肽分子偶聯到另一種成分上，形成一種綴合物，使得它們用于診斷、治療和分析應用，而沒有這兩種成分之一或二者的功能損失。因此，本發明潛在的目的是提供基于γ-晶體蛋白或泛蛋白的多肽和功能成分之間的綴合物，其中各自的多肽分子與野生型多肽相比，具有與改變的配體特異性結合的結合特性，其中所述綴合物的兩種成分在它們彼此偶聯之后保留它們的功能性或者甚至通過這樣的偶聯而使它們的功能性增強。本發明的另一個目的是提供這樣的綴合物可以被鑒別、制備并且檢驗它們的功能特性的方法。這些目的通過獨立權利要求的主題而實現。優選的實施方案可見于從屬權利要求。本發明涉及將基于γ-晶體蛋白和泛蛋白的新型結合蛋白位點特異性的和選擇性的、沒有針對性的偶聯到各種分子上，諸如例如蛋白(生色蛋白和酶)、基質(諸如葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、瓊脂糖、瓊脂糖凝膠、聚苯乙烯衍生物和纖維素)以及小分子(其中例如熒光標記、生物素、洋地黃毒苷、放射性同位素、抗生素)。這些所謂的AffilinTM分子特征在于在蛋白β折疊結構中從頭設計結合區。因此，它們不同于天然最主要的結合蛋白種類——抗體，其中結合區位于所述蛋白的柔性環區域(CDR’s)。AffilinTM和抗體之間的另一種差異在于分子大小。用作按照本發明的綴合物的第一成分的基礎的兩種多肽分別具有20(γ-晶體蛋白)和10kDa(泛蛋白)的分子量，而抗體具有150kDa(IgG)的分子量。本發明包括從這些多肽和各自的偶聯伴侶制備綴合物的方法，以及所述綴合物在不同應用中的應用，并且令人驚訝地表明，這些偶聯方法既沒有導致偶聯伴侶生物活性的損失，也沒有導致所述多肽與其配體結合特性的損失。為了示例本發明，描述了多肽成分與在BIACORE系統中的葡聚糖基質的偶聯，與熒光染料Oyster556的偶聯，與生色蛋白藻紅蛋白(PE)的偶聯，和與辣根過氧化物酶的偶聯，以及將多肽固定到支持物質上用于親和層析。按照本發明，偶聯直接針對多肽分子進行，例如針對蛋白的親核側鏈進行，或者以靶向方式針對C端肽接頭進行。令人驚訝地，偶聯方法可以應用到兩種構架上，并且不導致對這些分子結合特性的損害。特別出乎意料地是相對小的多肽分子(分別10和20kDa)可以偶聯到大蛋白上，諸如例如藻紅蛋白(240kDa)，同時保留它們的結合活性。令人驚訝地，以這種方式獲得的綴合物不限制AffilinTM分子的結合能力，相反地，對于某些綴合物，可以觀察到宏觀解離常數(親和力作用)的增加，這賦予了應用所述多肽分子的其它可能性，例如用于治療。此外，發現在與水不溶性基質偶聯后這些多肽分子還表現出結合活性，并且在用變性劑諸如尿素、胍鹽、乙醇、氫氧化鈉或鹽酸處理后，它們可以再生，即，它們的結合特性可以恢復。基于γ-晶體蛋白和泛蛋白的分子的結構數據的詳細分析提供了通過特異性靶向賴氨酸殘基而賦予非特異性偶聯選擇性的可能性。結構分析表明，在γ-晶體蛋白中，賴氨酸存在于蛋白的C端，并且因此應該適于偶聯(圖1)。此外，在泛蛋白中，可以鑒定這樣的賴氨酸殘基。然而，在進行這些偶聯策略之前，必須保證在所述結合區沒有其它的賴氨酸。對于本發明，與IgGFc(人源的)或proNGF特異性結合的多肽選自人γ-晶體蛋白文庫(CR20)，和NGF-結合多肽選自人泛蛋白文庫(UB10)，并且隨后將它們純化。通過引入包含半胱氨酸的確定長度的特異性C端肽接頭，可以以獲得選擇性偶聯而不損害結合活性的方式修飾多肽分子。為了有效地偶聯，需要消除所有剩余的可及半胱氨酸。通過多肽分子的非特異性偶聯方法，令人驚訝地，可以保留多肽的結合活性，并且通過親和方式獲得親和力的增加，并且因此制備用于診斷和治療的基于多肽的非常有吸引力的分子綴合物。這樣的備選結合分子用于治療、診斷和層析。通過將多肽偶聯到各種伴侶上，將為這些新型結合分子提供甚至更廣的應用領域。本發明特別包括下述方面和實施方案按照第一方面，本發明涉及包括下述成分的綴合物一種或多種基于γ-晶體蛋白或泛蛋白的多肽分子(I)與相應的野生型多肽相比，每種分子具有新產生的或改變的與配體特異性結合的結合特性，和共價地與其連接的一種或多種功能成分(II)其中在(I)與(II)偶聯后，所有成分的功能性得到保留。換句話說，按照本發明的綴合物不包括以其野生型形式的泛蛋白或γ-晶體蛋白，但是只以適合特異配體的形式。當與野生型形式相比時，這種特異性適合的形式提供針對各自配體的改變的(提高的)或重新產生的結合特性。作為基于γ-晶體蛋白或泛蛋白的多肽分子的普遍原理，應該指出，在兩種蛋白中，在β折疊結構上產生的人工結合表面，以賦予與目的配體的特異性結合。因此，至少存在一個β折疊結構以提供人工結合表面是本發明的主要特征。在這種情形中，綴合物是指多肽分子與另一種成分的翻譯后共價連接，并且因此，例如在遺傳水平上不同于多肽的融合。融合多肽是所謂的融合的結果。按照本發明，基于泛蛋白的多肽分子優選地選自由下列各項組成的組“泛蛋白樣蛋白”蛋白超家族的蛋白，具有泛蛋白樣折疊基序的蛋白以及其具有泛蛋白樣折疊基序的片段或融合蛋白，其中由于在包括β折疊區的至少一個β折疊鏈和任選地非β折疊區的蛋白的至少一個表面暴露區的一個或多個氨基酸修飾，所述蛋白具有分別與預先確定的結合伴侶或配體的結合親和性，這種結合親和性是先前不存在的，同時保留了泛蛋白樣的折疊基序。因此，本發明包括通過取代、插入、刪除、化學修飾或它們的組合而修飾的蛋白，其選自由下列各項組成的組“泛蛋白樣蛋白”蛋白超家族的蛋白，具有泛蛋白樣折疊基序的蛋白以及其每種具有泛蛋白樣折疊基序的片段或融合蛋白，其中所述蛋白由于這樣的修飾而表現出對于預先確定的結合伴侶的結合親和性，這種親和性是先前不存在的，其通過下述方法獲得a)選擇要被修飾的蛋白；b)確定結合伴侶；c)在蛋白的至少一個表面暴露區選擇氨基酸，所述蛋白包括β折疊區的至少一個β折疊鏈和任選地非β折疊區；d)通過取代、插入、刪除和/或化學修飾而修飾所選氨基酸，同時保留泛蛋白樣折疊基序；e)將所修飾的蛋白與在步驟b)中確定的結合伴侶相接觸；f)檢測具有與步驟b)中確定的結合伴侶的結合親和性的那些蛋白。此外，描述了制備上文提及的基于泛蛋白的修飾蛋白和應用這些修飾蛋白的各自的方法。因此，用于按照本發明的綴合物的基于泛蛋白的多肽分子(I)優選地通過分別修飾具有本申請中定義的泛蛋白樣折疊基序的蛋白或多肽而制備。這些蛋白包括“泛蛋白樣蛋白”蛋白超家族的蛋白，具有泛蛋白樣折疊基序的所有蛋白以及這些蛋白的片段或融合蛋白，條件是它們也具有泛蛋白樣折疊基序。分別起始于這些蛋白或多肽，分別修飾了在初始蛋白或多肽中的一個或多個氨基酸。所述修飾特別包括氨基酸的取代，而且包括一種或多種氨基酸的插入和刪除，以及氨基酸的化學修飾。這些修飾在要被修飾的蛋白的至少一個表面暴露區進行。至少一個氨基酸的修飾包括β折疊區的至少一個β折疊鏈，其中所述β折疊鏈必須位于蛋白表面，以便它分別接近結合伴侶或配體，所述結合伴侶或配體能夠以可以確定的親和力與所修飾的蛋白結合。在本發明的另一個實施方案中，除了在β折疊區的β折疊鏈的修飾，還修飾了非β折疊區，其優選是暴露于表面的，以影響，特別是增加與預定的結合伴侶的結合親和性，并且因此增強特異性。本領域的技術人員可以利用目前已知的各種用于修飾一種或多種氨基酸的技術。這些技術將在下文中更詳細地描述。另外，可以參考Ausuebel等.，1994以及Sambrook等.，1989的出版物。對泛蛋白的非表面暴露核區域的氨基酸的修飾已經為人所知(Finucane等.，1999；Lazar等.，1997)。其中進行的改變針對這樣的位置，即，由于它們位于疏水核心內，它們不接觸溶劑或可能的結合伴侶，所以，它們不參與結合。在本發明的情形中，術語“先前不存在的結合特性”和從頭產生的人工結合位點，以及“與野生型蛋白相比與改變的配體特異性結合的結合特性”的意思，將分別在下文中得到解釋。這些術語意欲意指，在修飾區域修飾的蛋白先前沒有表現出針對預定的結合伴侶或針對泛蛋白的天然結合伴侶的結合特性。也可以定義為配體的結合伴侶具有針對按照本發明的修飾蛋白的可測的親和性。按照本發明，對于可量化的結合特性的存在，即與伴侶結合的親和力的存在，由KD＝10-5M或更小的KD形成的復合體解離常數可以視為是最小的值。10-5M以及低于10-5M的值可以視為可量化的結合親和力。取決于應用，優選10-6M-10-12M的值，例如對于層析應用，更優選10-7-10-11M，或者例如對于診斷或治療應用更優選10-9-10-12M。更優選的結合親和力在10-7-10-10M范圍，優選地達到10-11M。確定結合親和力的方法目前是已知的，并且在下文中進一步描述。按照本發明的修飾意欲意指氨基酸的取代、插入、刪除或化學修飾。作為要按照本發明進行修飾的蛋白，可以應用“泛蛋白樣蛋白”超家族蛋白。按照本發明，這一超家族包括在Murzin等.(1995)中列出的亞組。例如，這些包括“泛蛋白相關的蛋白”、“UBX結構域”、“GABARAP樣”、“RAS-結合結構域”等蛋白家族。優選地，應用“泛蛋白相關的蛋白”蛋白家族的蛋白。按照本發明，那些蛋白還包括具有泛蛋白樣折疊基序的那些。這些蛋白的實例為SUMO-1，FAU，NEDD-8，UBL-1，和GDX以及Rub1，APG8，ISG15，URM1，HUB1，延伸蛋白B，PLIC2(N端結構域)，human帕金蛋白(N端結構域)。按照本發明可以應用的來自泛蛋白樣蛋白超家族的蛋白已經得到了高度的特征性描述。只是實例的方式，參考下列互聯網網址http:∥bip.weizmann.ac.il/scop/index.html。依據這一網址，泛蛋白樣蛋白家族被定義為超家族，泛蛋白相關蛋白屬于這一家族。這一超家族的所有成員主要特征在于反向平行方式排列并且細分成α和β片段的β折疊。折疊定義為β-Grasp，并且因此定義為泛蛋白樣的。核心區定義如下β(2)-α-β(2)，其中數字表示形成β折疊的鏈的數目和鏈的總數。如果從頂部從左向右看(氨基端在底部，羧基端在頂部)，關于鏈的位置，混合的β折疊的排列是2143。因此，泛蛋白樣蛋白成員的典型特征是暴露于蛋白的一個表面的反向平行β折疊，在蛋白的背面充滿了α螺旋，其垂直地位于蛋白的頂部。這種泛蛋白樣折疊基序是蛋白的典型特征，其可以按照本發明應用和修飾，并且清楚地區分所述家族的成員與其它蛋白。考慮到這一定義，本發明還包括PLIC-2的泛蛋白樣N端結構域和帕金蛋白的泛蛋白樣結構域。本領域的技術人員可以通過應用序列比較，所謂的序列比對，或者通過結構重疊的方式，預先判斷蛋白是否是泛蛋白樣蛋白的蛋白超家族的一員。自然地，最后的證據總是由結構分析提供，例如，通過X射線結晶學或多維核磁共振譜的結構分析。最近，應用遺傳法則的結構分析也獲得了良好的預測。例如，關于泛蛋白超家族的其它信息可以在Larsen等.，2002的出版物中找到。另外，還可以參考Buchberger等.，2001的出版物。Buchberger描述作為泛蛋白樣蛋白的典型特征的典型的βGrasp折疊，其具有β-β-α-β-β-α-β組成的二級結構，即，以21534排列的“混合折疊”形式的5個β鏈的排列。在這一方面，必須指出，UBX在其一級序列上與例如泛蛋白(Buchberger等.，2001)沒有顯著的同源性，但是不論這一事實——由于它與例如泛蛋白的三維結構相同的三維結構——被歸類在泛蛋白樣蛋白中。在這方面，應該提及，在泛蛋白中，在位置48和49的氨基酸也被視作獨特的β鏈(Vijay-Kumar，1987)。然而，在泛蛋白結構中位于螺旋后并且以21534排列提供“混合的折疊”的第五鏈僅由2個氨基酸組成，并且實際上這種兩個氨基酸的鏈是否可以被叫作β折疊鏈是有疑問的。然而，按照Buchberger等.(2001)在上文解釋的那樣，具有21534排列的蛋白也可以毫無疑問地歸類于泛蛋白樣蛋白超家族。對于本發明，選擇在上文更詳細地描述的21543定義用于泛蛋白中β鏈的排列。上文提及的家族和超家族的蛋白通常是高度保守的。例如，按照目前已知的，在所有哺乳動物中，泛蛋白具有相同的氨基酸序列。酵母菌的泛蛋白只在3個氨基酸與該序列不同。人泛蛋白和哺乳動物的泛蛋白分別由76個氨基酸組成，并且具有在開始時描述的結構。按照本發明所用的修飾蛋白在其氨基酸序列上與被修飾的起始蛋白如人泛蛋白，應該具有至少30％，優選地至少40％或50％，更優選地至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，或至少95％的相同性，其中在任何情形中，所述蛋白具有上文詳細描述的泛蛋白樣折疊基序。按照本發明，選擇用來制備修飾蛋白的蛋白優選地是人泛蛋白或不同來源的泛蛋白，例如不同的哺乳動物泛蛋白。在哺乳動物領域中，作為哺乳動物泛蛋白，特別可以應用嚙齒動物、家畜和農業動物泛蛋白。如果應用按照本發明制備的蛋白的領域是已知的，即，例如，如果修飾蛋白要用作治療人類疾病的藥物組合物，那么人蛋白可以優選地用作要被修飾的起始蛋白；這以類似的方式應用于其它應用領域。人和哺乳動物泛蛋白分別具有76個氨基酸。按照PDB數據庫中的結構1UBQ(http:∥www.rcsb.org/pdb/index.html)，形成反向平行β鏈的4個β鏈的氨基酸是下述按照本發明的氨基酸位置第一鏈(氨基端)2-7；第二β折疊鏈12-16；第三鏈41-45；第四鏈(羧基端)66-71。如果從頂端(氨基端在底部，羧基端在頂部)從左向右看，鏈的位置為第二鏈，第一鏈，第四鏈，第三鏈，其中在第一和第四鏈之間的多肽鏈形成α螺旋。要被修飾的氨基酸的選擇和修飾基于對應的結構數據，諸如例如在蛋白數據庫TM(Berman等.，2000；http:∥www.rcsb.org/pdb)中可以免費獲得的那些結構數據，可以通過計算機化分析而定位起始蛋白如在泛蛋白蛋白構架中的那些氨基酸的位置，其側鏈是暴露于表面的，即指向溶劑和潛在的結合伴侶。可以通過計算機化分析而鑒定起始蛋白如泛蛋白中的那些氨基酸，推測它們的隨機取代對所述蛋白構架的穩定性沒有或者只有微弱的副作用。這一信息可以提供關于作為結合位點成分的每一單一氨基酸的適合性的第一指示，然后其需要實踐檢驗。在本發明的一個優選實施方案中，例如，由于它們暴露于表面，并且耐受它們隨機取代的綜合結構，所以，選擇在人泛蛋白位置2，4，6，62，63，64，65和66的氨基酸。分別在第一氨基端β折疊鏈的起始(位置2，4，6)以及在環(位置62，63)或在羧基端β折疊鏈的起始(位置64，65，66)，上文提及的位置在空間上彼此接近，并且與它們的氨基酸側鏈一起在泛蛋白表面形成鄰近的區域(圖1)。通過在分析區域的隨機氨基酸取代(“隨機化”)的方式，這樣可以另外在泛蛋白完整的蛋白結構上產生——以與抗體的抗原結合位點相似的方式——超變的表面暴露區。例如，應用ProSAII軟件(″ProteinStructureAnalysis″；ProceryonBiosciences，Salzburg)，與泛蛋白(WT)相比較，可以確定104種變異和等量的隨機采取的變異樣品的蛋白穩定性，所述變異樣品中“對照表位”的殘基(隨機化位置24，28，31，32，35，37，38，39)被取代。在這一情形中，大約19％的在結合位點區域隨機取代而產生的變體具有至少與泛蛋白(WT)穩定性一樣高的穩定性，而大約90％的變體比攜帶“對照表位”的那些更穩定(圖2)。然后，這種基于計算機的結果可以用作選擇適當的氨基酸的基礎。從可獲得的人泛蛋白結構數據開始，首先優選地選擇在要產生的結合位點區域的8個氨基酸位置。通過隨機改變這一區域的一級序列(隨機誘變)以及隨后特異性選擇的方式，獲得表現出分別與預定的半抗原或抗原或者通常與預定的結合伴侶的理想的結合活性。盡管在這種方式中，對于得到的修飾蛋白賦予從頭結合特性，但是，它們的結構和蛋白質-化學特性保持與起始蛋白的特性高度相同。因此，它們發揮這樣的優點，諸如例如小的大小，高穩定性，經濟的制備以及容易的修飾，與對于先前確定的配體的高親和性和特異性。在這方面，由于1)由于泛蛋白的小的大小，不能預測所述構架關于廣泛的氨基酸取代的耐受性，和2)包括被視作嚴緊的和不易改變的β折疊的人工結合位點的功能性，先前似乎是不可能的，所以不能預測泛蛋白作為產生人工結合蛋白的構架結構的適用性。備選地，按照本發明應用基于γ-晶體蛋白的多肽分子。如在開始時提及的那樣，γ-晶體蛋白，一類脊椎動物晶體蛋白，是具有大約22kDa分子量的單體蛋白。γ-晶體蛋白的主要結構基序是反向平行的β折疊(Hazes和Hol，1992，Richardson等.，1992，Hemmingsen等.，1994)。γ-晶體蛋白由兩個非常相似的球狀結構域組成，一個是N端結構域，一個是C端結構域，通過V形接頭肽彼此連接。γ-晶體蛋白的特有的折疊模式(，，希臘鑰匙″基序，Slingsby，1985，Wistow和Piatigorsky，1988)最可能是本質熱穩定性以及針對變性劑的穩定性的原因(Mandal等.，1987)。在其正常折疊的狀態，γ-II-晶體蛋白沒有表現出任何結合特性。在所選擇的由β折疊結構基序組成的這一蛋白的溶劑暴露區域的改變(誘變)令人驚訝地導致表面結構和蛋白的電荷模式的變化，并且由此產生新的結合特性。在這一情形中，只選擇了基本上不參與維持蛋白結構的區域或氨基酸位置。小的β折疊蛋白的誘變(Riddle等.，1997)表明，不管實質上的序列改變，高百分數的蛋白仍然可以形成天然的β折疊結構。在本文所述的方法中，靶點誘變在β折疊嚴緊區域中缺乏任何結合特性的蛋白上進行。在這種方式中，產生了具有與抗體分子相當的實質穩定性和特異的結合特性的蛋白。噬菌體展示系統作為分離具有新產生的結合特性的誘變的β折疊蛋白的適當系統。所述系統可以非常有效地篩選蛋白變體巨大的所有成分的特異的結合特性(Smith，1985)。為了這一目的，將每種蛋白變異制備在絲狀噬菌體的表面上，并且可以與固定在固相上的靶點分子相互作用。與靶點分子結合的蛋白可以通過洗脫噬菌體而獲得。在分離噬菌體DNA后，可以確定特異性結合的蛋白變體的DNA序列。除了噬菌體展示系統，還可以應用其它的選擇系統，諸如例如細菌展示(Stahl和Uhlen，1997)或核糖體展示(Hanes等.，1997)。通過所述的方法，令人驚訝地，可以改變非常穩定的β折疊蛋白γ-II-晶體蛋白，例如，通過在表面的β折疊中進行靶點位點-特異性誘變，以非結合蛋白被變成具有特異性結合特性的蛋白的方式而改變。因此，通過8個氨基酸位置的隨機化處理，第一次在蛋白相對嚴緊的區域內的構架分子中進行誘變。因此，“抗體樣”蛋白種類——關于它們特異的結合特性——從β折疊蛋白γ-II-晶體蛋白制備而來。應用上述方法，γ-II-晶體蛋白或其它小的、穩定的β折疊蛋白通常可以用作設計新的結合特性的新的構架分子。在不同應用中，模擬的β折疊蛋白可以取代例如重組抗體。在這一方面，其它和更詳細的信息可以在WO01/04144中找到，其通過參考完全結合于此。當在本文中定義時，術語“配體”是指由基于γ-晶體蛋白或泛蛋白的多肽分子特異性結合的物質。所有生化、生物技術、診斷和治療相關的分子可以用作這種結合伴侶——所謂的配體。可能的配體的列表包括一些物質種類，諸如多肽和蛋白(例如，免疫球蛋白和免疫球蛋白衍生物，可以從血漿中獲得的蛋白，血液凝結因子和抑制劑，生長因子，白介素，細胞因子，受體蛋白，病毒蛋白和細胞表面標記諸如CD14、CD25、CD34)，肽(例如，親和性標記，諸如S-標記、T7-標記、His-標記、Strep-標記、Myc-標記、FLAG-標記，和病毒源性的肽)，低分子量物質(例如，類固醇、膽固醇和有害物質諸如鹵代氫)，脂質(例如，細菌脂多糖、脂質體和脂蛋白)，糖(例如，細胞表面標記諸如LewisY)，核酸(DNA、RNA)，有機和無機聚合物，以及這些物質的衍生物。在這方面，還可以參見本文在下文中所述的優選實施方案。當用于本文時，術語“功能成分”定義綴合物的第二成分，其與基于γ-晶體蛋白或泛蛋白的多肽分子共價結合。術語“功能性”意指，適合用于診斷、治療、層析以及分析的成分，并且可能已經已知。一般說來，“功能成分”定義為具有可測定的特性如酶活性、光譜可測的特性或毒性特性的任何成分。除了上述特性，所述功能成分在所述綴合物中的結構和功能是不受限制的。唯一的要求是，在多肽分子與功能成分共價結合后，要保留所有成分的功能性。在多肽分子的情形中，這種功能性是與特異性配體結合的能力，在功能成分的情形中，例如，這種功能性是其作用染料的作用。按照本發明，一種或多種如兩種功能成分可以與多肽分子結合(如上文所述那樣)。為了實現所述成分與多肽分子的特異性結合，例如，一種成分可以形成與賴氨酸殘基特異性結合，另一種成分可以形成與多肽分子中的半胱氨酸殘基特異性結合。這種類型的兩種成分的示例是熒光染料，其中一種作為熒光供體，另一種作為熒光受體。下文描述所述成分彼此結合的性質以及優選應用的結合成分的詳細內容。如上文提及的那樣，多肽分子與配體結合活性以及偶聯伴侶(功能成分)的活性的檢測是重要的特征。與配體結合活性的檢測可以通過不同方法進行。在ELISA技術中，結合通過抗體-過氧化物酶綴合物方法檢測，而Biacore系統應用表面胞質基因組共振現象進行檢測。其它的技術，諸如熒光滴定、熒光偏振或熒光相關光譜學(FCS)是基于AffilinTM的熒光團特性。對于偶聯伴侶(也就是所謂的功能成分)的活性檢測，其已知的特性是重要的。因此，通過它們光譜特性，分析發色團或熒光團分子，諸如熒光染料或藻紅蛋白。酶諸如過氧化物酶或堿性磷酸酶通過它們對模式底物的轉換而檢測。其它分子諸如毒素可以直接在細胞培養實驗中檢測它們的生物活性。在放射性同位素的情形中，可以使用適當的計數儀測定放射活性。對于其它分子范圍，諸如糖和核酸，存在商購的檢測試劑。按照一個實施方案，如上文提及的那樣，相對于野生型多肽新產生的或改變的結合特性是基于多肽分子(I)β折疊的表面暴露區中的一個或多個氨基酸取代。為了這一目的，每個多肽分子(I)中大約6-10個優選8個氨基酸數目被取代。這同等地適用于基于泛蛋白和基于γ-晶體蛋白的多肽分子(I)。應該指出，(I)與(II)的偶聯優選在多肽分子(I)要與配體特異性結合的β折疊的表面暴露區以外的區域進行。已經發現，在這種方式中，實現了對于按照本發明的綴合物的重要要求，即保留所有成分的功能性。這里，提及與泛蛋白的Lys29，33偶聯作為實例，其位于配體結合表面外，并且更精確地，甚至位于負責與den配體結合的β折疊外(Lys29，33位于α螺旋內)。通過在空間上隔開結合位點與配體的這一氨基酸側鏈的偶聯沒有導致對綴合物成分的功能性的損害。在這一點上，特別優選在具有新產生的或改變的與配體特異結合的結合特性的多肽分子(I)的β折疊外的區域進行(I)與(II)的偶聯。在上文提及的情形中，例如，這一區域是泛蛋白分子的α螺旋，或者關于γ-晶體蛋白是另一條β折疊，即不參與同配體結合的β折疊。這在圖1中特別清楚，其中晶體蛋白的N端結構域(β折疊)具有新產生的配體結合表面，其中位于C端部分的賴氨酸殘基(突出表示的)適于與功能成分(II)偶聯。按照一個實施方案，(I)與(II)的偶聯或連接分別通過(I)的氨基酸殘基而發生。換句話說，這里偶聯通過本身存在于多肽分子(I)中的氨基酸殘基而實現。在這一情形中，偶聯位點特異性地或以通過(I)中半胱氨酸或賴氨酸側鏈的間接方式選擇性地進行。術語“位點特異的”在這里意指在分子(I)中存在半胱氨酸或賴氨酸，或者在精確確定的位點引入半胱氨酸或賴氨酸，以定義準確預先確定的結合位點。“以間接方式選擇性地”意指存在一些這樣的殘基，以致由于它們的數目，盡管選擇性地發生，但是與這些殘基的結合還要服從某些隨機因素。關于按照本發明的綴合物的兩種成分的偶聯，即，它們的共價連接，給出下列解釋蛋白含有多個官能團，通過這些官能團可以實現與其它分子的偶聯。下文將提及這些的獨特實例。通過伴侶的共價連接，例如，通過適當的交聯試劑，可能在一個分子中組合不同的活性。作為實例，提及通常與染料分子偶聯的蛋白，并且已經發現其以這種方式提供易于檢測的檢測試劑，所述試劑隨后可用于診斷。以一種相似的方式，抗體也與其它蛋白偶聯，優選地與所謂的報道酶諸如堿性磷酸酶或過氧化物酶偶聯。這些報道酶轉化底物，因而獲得可以通過吸收、熒光或發光檢測的信號。通過選擇適當的交聯試劑，蛋白，即也就是按照本發明的多肽，還可以與來自許多其它物質種類的其它功能成分偶聯多種有機的和無機聚合物、蛋白、肽、核酸、脂質、糖以及低分子量物質可以用于這一目的。來自聚合物種類的優選的偶聯伴侶為，例如，葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、聚苯乙烯、聚乙烯、硅膠、纖維素或聚乙二醇(PEG)。例如，后者修飾用于調控生物治療劑的藥物代謝動力學特性。具有適用于偶聯并且已經預先偶聯活化的官能團的PEG衍生物的大量選擇品可以商購(NektarTherapeutics)。提及的其它聚合物物質在許多生化、生物技術和診斷方法中作為載體物質。這里應該特別提及，層析應用，特別是親和層析，其中這些聚合物物質用作凝膠基質。為了這一目的，攜帶適當的化學基團的聚合物珠粒的表面被功能化并且活化，例如，以使蛋白以理想的活性偶聯。以這種方式，具有針對具體配體的特異性的結合蛋白也可以被固定，然后，得到的凝膠基質可以用于從復合物質混合物中有效地并且快速地富集所述配體。這種富集可以通過柱層析或者在濾器表面進行。此外，具有磁性特性(磁性BEADS)并且因此可以有效地從混合物中分離的那些聚合物珠粒可以有利地用于親和性富集。一個重要的實例是從真核細胞上層清液中大規模純化用于治療目的的抗體，其通過與偶聯到介質上的蛋白質A(一種具有針對抗體分子的固有親和性的細菌蛋白)的親和層析進行。除了上文提及的抗體-報道酶融合以外，還有許多將兩種蛋白成分偶聯的實例。因此，在一種最容易的情形中，可以通過將兩種和多種相同的蛋白分子偶聯而產生同源二聚體或同源多聚體。在結合蛋白的情形中，親和性作用可以通過多聚化實現，即，與單體結合蛋白的親和性相比，多聚體對于靶點物質的親和性顯著增加。然而，通過將具有針對不同靶點物質的特異性的兩種結合蛋白偶聯，可以獲得所謂的雙特異性結合分子，例如，其可以用作使得各自的靶點物質在空間上彼此接近的連接物。此外，具有針對活細胞的毒性特性的蛋白，所謂的毒素(例如，其中蓖麻毒蛋白、霍亂毒素、假單胞菌外毒素)代表針對抗體或其它結合分子的有趣的偶聯伴侶。偶聯后，這種雙功能綴合物可以通過所述結合蛋白選擇性地停靠在特異的靶點物質，例如，在腫瘤細胞表面上，并且后來靶點細胞將通過細胞毒性活性而被破壞。蛋白本質的其它相關的偶聯伴侶是蛋白生色團，諸如例如GFP及衍生物，或者含有色素的蛋白諸如藻紅蛋白。作為很好檢測的報道物質，得到的生色或熒光偶聯產物本身是用于研究或診斷的有價值的工具。然而，如上文以及提及的，生色或熒光蛋白綴合物還可以通過偶聯低分子量染料分子而獲得。多種具有交聯基團的適當的染料分子可以商購，例如從Invitrogen公司購得。其它產生用于診斷和治療的蛋白綴合物的低分子量偶聯伴侶為，例如，生物素、洋地黃毒苷、重金屬衍生物、螯合劑、放射性同位素、細胞毒性物質和抗生素。蛋白中以及在按照本發明的多肽分子中，以及在適于偶聯的功能成分中所包含的官能團主要是氨基、羧基、羥基和巰基，而且酪氨酸的苯酚官能團和芳香環系統可以作為偶聯劑攻擊的位點。適于偶聯的氨基酸殘基特征在于特異的特性一方面它們必須具有偶聯劑可及的活性側鏈。在理想的情形中，這種官能團位于蛋白表面，并且暴露于溶劑。此外，這一殘基的修飾不應該干擾蛋白的功能。優選地，要被修飾的殘基距離酶的活性位點或距離按照本發明的多肽分子的結合表面有顯著的距離；并且，這些區域還應該沒有相同類型的氨基酸殘基，相同類型的氨基酸殘基在修飾后可能導致蛋白功能的損失。因此，在各自的蛋白中稀有的氨基酸殘基也是有利的。如同上文已經提及的那樣，對于基于泛蛋白的多肽分子(I)，優選考慮通過泛蛋白分子的賴氨酸殘基29和33的偶聯。較不優選但是仍然可能的是通過賴氨酸殘基11和48偶聯，賴氨酸殘基11和48與殘基29和33相比，都位于距離所述配體的結合表面的更短的距離。在基于γ-晶體蛋白的多肽分子(I)的情形中，與野生型多肽相比，具有新產生的或改變的與配體特異性結合的結合特性的肽結構域是N端結構域，并且(I)與(II)的偶聯通過C端結構域進行。這也適用于C端肽融合的可能，其優選地含有半胱氨酸，和存在于C端結構域并且可用于偶聯功能成分的氨基酸側鏈諸如賴氨酸。優選使用γ-晶體蛋白的的殘基91和163(參見圖1)。在蛋白原性氨基酸中，必須主要指出在其側鏈中具有ε氨基的賴氨酸以及具有其巰基功能的半胱氨酸。這些官能團特別有活性，并且因此非常適于作為按照本發明的多肽分子與功能成分特異性偶聯的伴侶。因此，在文獻中描述了特異性只與巰基反應并且因此可以按照本發明進行應用的試劑，其中例如，順丁烯二酰亞胺、碘代乙酸酯、羥基汞基苯甲酸酯、Ellman′s試劑。在各自的課本諸如Voet&Voet(1995)或Lottspeich&Zorbas(1998)中可以找到其它的實例。這些還描述了許多賴氨酸-特異性側鏈試劑，諸如例如酸酐(其中乙酸酐、N-羥基琥珀酰亞胺，其也用于本發明)。除了它們的反應性，賴氨酸具有其它的偶聯有利特性由于側鏈是帶電的，所以它通常位于蛋白表面，即，是溶劑可及的，在生物系統中溶劑主要是水。這種可及性也是偶聯試劑必需的，并且因此應該存在。在蛋白中，暴露于表面的游離半胱氨酸相對稀少，在胞外蛋白中，這些半胱氨酸主要參與通常穩定二聚體相互作用的二硫鍵。然而，二硫鍵可以通過還原而分解，以致所包含的半胱氨酸是可以進行修飾的。如果按照本發明的多肽分子不含對偶聯試劑敏感的半胱氨酸殘基，那么可以通過誘變在適當的位點引入這樣的殘基。在這一方面，由于這有助于預測適于偶聯的暴露于表面的氨基酸位置，所以關于蛋白空間結構的知識是有利的。然而，如果在蛋白中存在一些半胱氨酸殘基，這使得不可能進行位點特異的偶聯(與確定的半胱氨酸殘基的偶聯，參見上文)，那么這些可以通過定點誘變的方法而消除。在這一情形中，優選用具有相似特性的絲氨酸殘基取代所述板冠苷酸殘基。然而，通常不可能通過誘變在目的蛋白序列中獲得適于偶聯的氨基酸殘基。如果蛋白在N或C端耐受氨基酸殘基插入或者融合，那么可以在遺傳水平上在這些位點引入含有適于偶聯的氨基酸殘基的肽序列。因此，按照另一個實施方案，(I)與(II)的偶聯通過與(I)融合的另外的末端肽中的氨基酸殘基進行。這些末端肽融合體的可及性的檢驗，例如，可以通過使用具有生色團特性的側鏈特異性偶聯試劑如針對半胱氨酸的Ellmann′s試劑進行(也可以參見實例)。其中，這些末端肽融合體的可及性可以通過它們的長度而調節。例如，要被偶聯的氨基酸側鏈的可及性的增加可以通過在要被偶聯的氨基酸側鏈和蛋白之間插入所謂的間隔而實現，在肽融合體的情形中，這些是附加的、惰性的氨基酸殘基。由于它們小的大小并且因此可以呈現非常靈活的結構，甘氨酸和絲氨酸殘基是特別適用的。取決于蛋白中偶聯試劑可及的官能團的數目以及其特異性，可以區別不同的偶聯類型。例如，如果使用半胱氨酸特異的偶聯試劑，那么只有半胱氨酸殘基將選擇性地反應；然而，例如，如果存在一些半胱氨酸殘基，那么不能預先確定精確的偶聯位點；這叫作選擇性的但是非定向的偶聯。然而，如果只有一個偶聯試劑可及的半胱氨酸存在，那么偶聯位點特異性地發生。多種適宜的偶聯試劑可以商購(例如，從Pierce公司)。按照本發明可以應用的偶聯試劑的具體形式是指交聯劑或只是接頭(Herrmann&Morse，1973；Takamiya等.，1975；Reichlin，1980)。接頭定義為通過共價鍵連接兩個(或多個)分子的物質。接頭含有兩個(或多個)活性(活化的)官能團，它們的空間距離可以通過其它連接它們的化學基團而調節。具有相同功能團的接頭叫作同源-雙功能接頭，相反具有不同官能團的叫作異源-雙功能接頭。因此，通過接頭物質的適當選擇，還可能將完全不同的物質種類彼此連接在一起。作為按照本發明可以應用的接頭的實例，參考SPC-1-A7-Cys的C端部分，參見下述表2。然而，蛋白偶聯的一個具體情形不需要活化的接頭例如，在蛋白二聚體化中二硫鍵的形成。在氧化條件下，巰基殘基具有足夠高足以形成二硫鍵即在兩個硫原子之間形成共價鍵的反應性。按照本發明，偶聯反應可以作為一步反應或幾步反應進行。在每種只有一個活性殘基的兩種相同分子的簡單二聚體化的情形中，充分地溫育偶聯成分和同源-雙功能接頭以獲得確定的綴合物。在還攜帶不同活性基團的不同偶聯伴侶的情形中，只可能使用適當的異源-雙功能接頭進行一步反應。備選地，具有相同活性基團的不同偶聯伴侶(反應物)之間的偶聯還可以在多步驟過程中進行。對于這一目的，在大多數情形中，開始只溫育一種反應伴侶和過量的接頭，并且在它通過所述接頭其余的游離官能團連接到第二反應物上之前，將得到的單價反應物-接頭綴合物分離。生物化學和生物技術中應用的多種化學物質可以以所謂的活化形式即已經與活性接頭連接的形式商購獲得(Pierce公司、Invitrogen公司)。如果存在多于一種的活性基團，那么，偶聯的程度，即綴合物中單個成分的相對比例可以通過化學計量所用的反應物而調節到一定程度。與不同偶聯伴侶的確定的多個偶聯可以通過順序偶聯或者通過應用不同的偶聯化學，例如通過將第一功能成分與半胱氨酸偶聯，同時將功能成分2附著到各自多肽的賴氨酸上。典型的實例是附著用于FRET檢測的熒光供體/受體對。適于這一目的的染料分子組合可從Invitrogen公司獲得。不依賴于形成按照本發明的綴合物的所選擇的偶聯機制，應該再次指出，所述綴合物的功能活性是出乎意料和令人驚訝的。因此，還可以參考本文在上文中所解釋的內容。此外，應該提及，本領域的技術人員沒有預料到可以產生本發明中公開的綴合物，同時單個成分的全部功能性得到保留或者甚至被增強。在一方面按照本發明的多肽分子和另一方面的功能成分之間的大小比例是非常不同的。有時，要被結合的分子，例如藻紅蛋白，比多肽分子大10-12倍，但是有時也是小的，諸如熒光染料Oyster。令人驚訝地，多肽分子的結構以及針對配體的結合親和力都得以保留，特別是在更大的結合分子中。在這種方式中，這是不可能預料到的。如上文已經解釋的那樣，與功能成分偶聯的側鏈優選地位于(I)與配體的結合表面之外，以便與配體的結合功能性不被破壞。按照另一個優選的實施方案，與(I)融合的末端肽包含——如上文提及的——一個或多個半胱氨酸殘基或一個或多個賴氨酸殘基，其中這些氨基酸殘基優選地不參與(I)與配體的相互作用。功能成分(II)優選地選自由下列各項組成的組多肽和蛋白、有機和無機聚合物、核酸、脂質、糖、低分子量物質、肽以及這些物質的衍生物。關于結合和偶聯試劑的原理參見上文的解釋。按照優選的實施方案，功能成分(II)是肽、多肽或蛋白、優選蛋白生色團、酶、免疫球蛋白、免疫球蛋白衍生物、毒素或按照I的多肽。如果功能成分(II)是聚合物，那么它優選地選自葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、聚乙烯、聚苯乙烯、硅膠、纖維素或聚乙二醇、或聚合物衍生物。如果功能成分(II)是低分子量物質，那么它優選為染料、生物素、洋地黃毒苷、重金屬、螯合劑、放射性同位素、抗生素或細胞毒性物質。按照一個優選的實施方案，與成分(I)特異結合的配體優選地選自由下列各項組成的組多肽、肽、低分子量物質、脂質、糖、核酸、有機和無機聚合物以及這些物質的衍生物。如果這種配體是多肽或蛋白，那么優選應用免疫球蛋白及免疫球蛋白衍生物，獲得于血漿的蛋白，血液凝固因子和抑制劑，生長因子，白介素，細胞因子，受體蛋白，病毒蛋白和細胞表面標記，優選CD14、CD25、CD34。如果所述配體是肽，那么它優選為親和標記，優選S-標記，T7-標記，His-標記，Strep-標記，Myc-標記或FLAG-標記，或病毒源性的肽。所述配體還可以是低分子量物質，優選為類固醇、膽固醇和毒性物質諸如例如鹵代氫、或脂質或脂質衍生物、優選細菌脂多糖、脂質體和脂蛋白。按照優選的實施方案，按照本發明的綴合物的成分(II)是一種或多種基于γ-晶體蛋白或泛蛋白的多肽，其與(I)相同并且共價與(I)連接，其中針對(I)的配體的親和性的增加通過親和作用的方法而實現。對于詳細的解釋，參加上文所述。此外，成分(II)優選地是成分(I)與之以多種方式共價連接的多肽、蛋白或聚合物，其中針對(I)的配體的親和性的增加通過親和作用的方法而實現。備選地，成分(II)是這樣的多肽或聚合物，即，在與成分(I)共價連接后，其與這一類型的其它綴合物共價或非共價結合，其中針對(I)的配體的親和性的增加通過親和作用的方法而實現。按照一個優選的實施方案，成分(I)是分子SPC1-A1(SEQIDNO2)，SPC1-A7(SEQIDNO3)，SPU11-3-A1(SEQIDNO12和13)，SPC1-G3(SEQIDNO4)，和SPC7-E9(SEQIDNO8)中的一種。然而，本發明不僅包括正確的氨基酸序列，還包括其變異。按照本發明，“變異”特別是這樣的核酸，即，與在SEQIDNO.中定義的核酸相比，其中存在一個或多個取代、插入和/或刪除。在這些變異中，在核酸的一端或兩端，或者在核酸的內部部分，優選至少1個和2、3、4個或更多個核苷酸被刪除，或者被其它核苷酸取代。因此，本發明的核酸還包括具有基本上與各自的SEQIDNO.的核酸相等的序列的核酸。例如，按照本發明的核酸可以具有同SEQIDNO.的核酸至少約80％，典型地至少約90％或95％的序列同一性。術語“核酸序列”涉及核苷酸的異源聚合物或者涉及這些核苷酸的序列。當用于本文時，術語“核酸”包括RNA、DNA兩種，DNA包括cDNA、基因組DNA和合成的(例如化學合成的)堿基以及與其它聚合物諸如PNA結合的堿基。本發明還包括這樣的變異，即，其在中等嚴緊條件下與按照本發明的核酸雜交。嚴緊雜交和洗滌條件通常是指這樣的反應條件，在所述條件下，只形成寡核苷酸和理想的靶點分子之間的雙聯體分子(完美雜化物)，或者只檢測理想的靶點生物體。在這一方面，嚴緊的雜交條件特別是指在65℃0.2×SSC(0.03MNaCl，0.003M檸檬酸鈉，pH7)。在更短的片段的情形中，例如達到20個核苷酸的寡核苷酸的情形中，雜交溫度低于65℃，例如，高于55℃，優選地高于60℃，但是無論如何低于65℃。嚴緊雜交溫度分別取決于核酸的大小或長度，并且取決于它們的核苷酸組成，并且可以由本領域的技術人員通過手工實驗而確定。例如，中等嚴緊條件在42℃并且通過在42℃用0.2×SSC/0.1％SDS洗滌而實現。各自的溫度條件可以是不同的，其取決于所選的實驗條件，并且取決于要檢驗的核酸樣品，并且在這種情形中必須適當地調節。例如，在放射性標記的分子的情形中，雜交產物的檢測可以通過放射性自顯影而進行，或者如果應用熒光-標記的分子，雜交產物的檢測通過熒光測定法而進行。本領域的技術人員可以以本身已知的方式使所述條件適應所選的檢驗方法，以真正獲得中等嚴緊條件，并且能夠進行特異的檢測方法。例如，適當的嚴緊條件可以通過參考雜交的方法而確定。必須應用適當的核酸或寡核苷酸濃度。雜交必須在適當的溫度進行(溫度越高，雜化物的結合越弱)。按照第二方面，本發明涉及從具有已知序列的成分(I)起始制備上文定義的綴合物的方法，所述方法包括下述步驟通過分析蛋白的空間結構，優選地在(I)與配體相互作用表面之外的殘基的空間結構，而鑒定適用于偶聯的氨基酸殘基；通過適當的偶聯試劑活化偶聯伴侶；進行偶聯反應；分離綴合物；和檢測所述綴合物的兩種成分的功能性。一種制備本發明的綴合物的改良方法——從具有已知序列的成分(I)起始，在成分(I)中沒有鑒定出適于偶聯的氨基酸殘基——包括下述步驟通過取代、插入或融合而引入適于偶聯的氨基酸殘基，優選地引入在(I)與配體相互作用的表面之外暴露于表面的殘基；檢測引入的氨基酸殘基的可及性；檢測以這種方式改變的成分(I)的功能性；通過適當的偶聯試劑活化偶聯伴侶；進行偶聯反應；分離綴合物；和檢測所述綴合物的兩種成分的功能性。對于偶聯方法等的更詳細的解釋參加上文。按照第三方面，本發明提供可以按照上文提及的方法制備的綴合物。此外，本發明包括含有上文定義的綴合物的診斷試劑盒。本發明的另一方面是藥物組合物，其包括按照本發明的綴合物和藥用載體。在所述藥物組合物中，所述綴合物治療或者至少減輕疾病的劑量與適當的載體或載體物質混合。這種類型的組合物可以包含(除了活性劑和載體之外)稀釋劑、填充物質、鹽、緩沖液、穩定劑、增溶劑和本領域公知的其它物質。術語“藥用”定義分別不損害活性成分或活性劑的生物活性功效的無毒物質。載體的選擇取決于給藥途徑。所述藥物組合物可以另外含有增強活性劑活性或者補充其在治療中的活性或應用的其它藥劑。這樣的其它因子和/或藥劑可以包含在藥物組合物中，以分別獲得協同作用或者將副作用或不利作用最小化。分別關于配制和制備的技術，以及本申請的綴合物的施用，可以在″Remington′sPharmaceuticalSciences″，MackPublishingCo.，Easton，PA，最新版本中找到。此外，治療有效量涉及足以實現癥狀的改善如治療、治愈、預防或改善這樣的病癥的化合物的量。適當的給藥途徑可以包括，例如，口服、直腸、跨黏膜或腸內給藥和腸胃外給藥，腸胃外給藥包括肌內、皮下、髓內注射以及鞘內、直接心室內、靜脈內、腹膜內或鼻內注射。優選對患者進行靜脈內給藥。按照另一方面，本發明涉及本文定義的綴合物、試劑盒或組合物在診斷、治療和親和層析中的應用。描述的偶聯方法和用所述方法獲得的數據使得綴合物的各種應用成為可能，包括將所述綴合物用于親和層析。關于這種應用的實例分別是取代蛋白質A純化抗體，和通過親和層析純化血漿蛋白、生長因子或流感疫苗，以及純化通過遺傳加工具有親和標記而制備的蛋白，或者去除內毒素和白蛋白。此外，通過與基質偶聯，可以考慮用于血漿提取法或生物去污法。另一個應用領域是診斷。在這方面，可以考慮在血庫中篩選細菌或病毒感染的應用，或者在經典檢測技術諸如ELISA，或新的研發諸如在Luminex系統中的應用。在診斷和治療中，這樣的綴合物可以用于細胞分離物中。按照本發明的綴合物在治療中的應用可以是可能的，特別是作為轉運分子的一般應用。治療中的其它應用在基因治療中，指導按照本發明的多肽分子的靶向和與基因轉移系統的偶聯。通過指導靶向并且偶聯到細菌毒素上，還可以獲得在治療中作為免疫毒素的應用。在下文中，本發明將考慮到一些附圖和附屬實施例進行解釋，然而，這些附圖和實施例并不是意欲顯著本發明的范圍，而僅僅是舉例說明本發明。圖1γ-II-晶體蛋白的空間結構。在N端結構域從新產生的結合表面繪成黃色。位于所述結合表面外的賴氨酸殘基的C端位置用紅色半球突出表示。圖2關于AffilinTM變體SPC1-A1(A)，SPC1-A7(B)和SPC-1-G3(C)與具有固定的IgGFc的CM5芯片競爭結合的Biacore實驗的傳感圖。對于本實驗，180RU的多克隆IgGFc固定。對于結合競爭，使用變體和IgGFc的指示濃度。流速30μl/min的HBS-EP用作運行緩沖液。圖3檢測SPC7-E9與proNGF結合的濃度-依賴性ELISA。將微量滴定平板用10μl/mlproNGF包被。1∶1000稀釋的抗-人-γ-II-晶體蛋白抗體-POD綴合物作為檢測抗體。表示的吸收值為兩次平行檢測的平均值。可以計算出200nM的表觀KD值。圖4檢測SPC1-A7_Cys與人IgGFc結合的濃度-依賴性ELISA。將微量滴定平板用10μl/mlIgGFc包被。1∶1000稀釋的抗-人-γ-II-晶體蛋白抗體-POD綴合物作為檢測抗體。表示的吸收值為兩次平行檢測的平均值。可以計算出233nM的表觀KD值。圖5SPC1-A7BB-PE綴合物與具有固定的IgGFc的CM5芯片結合的Biacore實驗的傳感圖。3000RU的IgGFc固定，并且將濃度為121nM(紅色)，75nM(綠色)和6nM(藍色)的SPC1-A7BB-PE流過芯片。締合相是1min，然后是3min解離相。流速30μl/min的HBS-EP用作運行緩沖液。從曲線可以計算出15nM的宏觀KD值。圖6檢驗SPC1-A7Oyster556與具有固定的IgGFc的CM5的結合的Biacore實驗的傳感圖。將1000RUIgGFc固定在芯片上，并且將濃度為1μM(藍色)和5μM(紅色)的SPC1-A7Oyster556流過所述芯片。每種情形中締合相和解離相為3min。流速30μl/min的HBS-EP用作運行緩沖液。圖7通過ELISA檢測AffilinTM-POD綴合物與IgG的結合。將10μg/ml的人IgG固定在微量滴定平板上。將AffilinTM-POD綴合物在PBS中的不同稀釋液在微量滴定平板上溫育1h。在洗滌步驟后，通過TMB底物溶液檢測結合的POD活性。圖8SPU11-3-A1_Cys與NGF結合的Biacore實驗的傳感圖。將200RU的SPU11-3-A1_Cys通過PDEA方法偶聯到CM5芯片上，并且將不同濃度的NGF流過芯片。流速30μl/min的PBS(1mMEDTA，0.005％表面活性劑P20)作為運行緩沖液。從曲線可以計算出46nM的KD值。圖9SPC7-E9與具有proNGF的CM5芯片的結合的Biacore實驗的傳感圖。將280RU的proNGF固定，并且將不同濃度的proNGF流過芯片。流速30μl/min的PBS-EP作為運行緩沖液。從曲線可以計算出1.4nM的KD值。圖10從SPC7-E9親和柱上洗脫proNGF。使用400μg純化的proNGF(0時刻，粉色虛線)，隨后用20柱體積的運行緩沖液進行潤洗。洗脫用0,1M甘氨酸pH2.2進行(綠線)。運行以1ml/min的流速進行。在280nm處進行蛋白檢測(藍線)。圖11從BSA溶液和從大腸桿菌粗提取物中分離proNGF的SDSPAGE。(從左到右)泳道1標記蛋白，泳道2BSA標準物，泳道3proNGF標準物，泳道4BSA和proNGF標準物的混合物(起始)，泳道5穿透峰，泳道6使用0.2M甘氨酸(pH2.2)的洗脫液，泳道7空白，泳道8大腸桿菌粗提取物(Bl21)和proNGF標準物的混合物，泳道9穿透峰，泳道10使用0.2M甘氨酸(pH2.2)的洗脫液。實施例1從人-γ-II-晶體蛋白文庫篩選與IgGFc和proNGF結合的AffilinTM變體，表達并且純化所述AffilinTM變體從人-γ-II-晶體蛋白文庫CR20起始，通過噬菌體展示系統進行篩選過程。甚至在第一輪篩選后，可以選到和分離一些在單一噬菌體ELISA中表現出與IgGFc特異結合的AffilinTM變體。應該意識到，當用于本文時，術語″AffilinTM″對應綴合物按照本發明的多肽分子成分，所述綴合物基于泛蛋白或γ-晶體蛋白，并且相對野生型，具有關于與配體特異結合的改變的結合特性。在將基因克隆到pET20b表達載體(Novagen)中后，AffilinTM變體以重組方式在大腸桿菌(BL21(DE3)，Stratagene)中過量表達，并且隨后在兩步層析(IMAC和凝膠過濾)中純化。在蛋白濃度-依賴性ELISA中，和在BIACORE實驗中，可以確定具有nM范圍的解離產生的與IgGFc的特異性結合。對于篩選與IgGFc結合的AffilinTM變體，將1mlCR20文庫(6.5×1010cfu)在37℃和220rpm在11具有2％葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素的2xYT培養基中溫育，直到光學密度OD600＝0.4。然后，將細菌培養物與10倍過量的輔助噬菌體M13KO7(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)一起在37℃和100rpm溫育感染1h。然后，將細菌混懸液在1000xg離心20min，并且將沉淀重懸在11具有8mMGSH、100μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素的2xYT培養基中。噬菌體生產或噬菌體釋放分別在30℃和200rpm進行過夜。對于噬菌體分離，使用由Kay，Winter和McCafferty(1996)所述的流程。在室溫(RT)下，將1ml分離的噬菌體(1.4×1014cfu)用1ml在PBS中的6％BSA封閉1h。同時，將用100μl在PBS中的10μg/mlIgGFc單克隆溶液(Roche)在RT封閉過夜的10孔微量滴定平板(NUNC)用PBS；0.1％吐溫20洗滌3次。然后，將每個孔中的游離結合位點用300μlPBS(3％BSA，0.5％Tween20)在RT封閉2h，然后將孔用PBS(0.1％Tween20)洗滌3次。在每孔加入100μl封閉的噬菌體后，在RT和20rpm溫育1h。通過用2xPBS洗滌2次，用2xPBS，3％BSA洗滌2次，最后用2xPBS洗滌2次，分別移除未結合的和弱結合的噬菌體。通過加入100μl/孔100mM的三乙胺并且在RT溫育10min，而洗脫仍然結合的噬菌體。對于洗脫在堿性培養基中的噬菌體的中和，向其中(總共1ml)加入500μl1MTris/HClpH7.4。隨后將孔用PBS洗滌3次。在37℃，將盡管用三乙胺洗脫仍然保留在微量滴定平板上的緊密結合的噬菌體直接用100μl指數生長的XL1-Blue細胞培養液(OD600＝0.4)溫育，重感染30min。對于XL1-Blue細胞與洗脫在堿性培養基中的噬菌體的重感染，將750μl中和的洗脫液與9ml具有OD600＝0.4的XL1-Blue細胞一起在37℃溫育30min。然后，將洗脫在堿性培養基中的噬菌體的重感染細胞和緊密結合的噬菌體的重感染細胞組合，涂布在含有SOBAG培養基(包括氨芐青霉素)的16×16cm平板上，并且在37℃溫育過夜。在淘選過程后，獲得大約2000個克隆，用大約12.5ml2xYT培養基；20％甘油將其從平板上浮選下來，并且保存在-80℃。對于單個噬菌體的培養，將在第一輪淘選后得到的細胞庫接種在選擇培養基(SOBAG)上，并且在37℃溫育過夜。將92個單一克隆從SOBAG平板上轉移到24×5ml深孔平板上，每孔含有2ml/孔具有2％葡萄糖和100μg/mlamp的2xYT培養基，并且在37℃和180rpm溫育過夜。另外，每個平板上有一個含有在噬菌粒載體中的人野生型γ-晶體蛋白基因的單克隆(Xl1-blue)作為對照。將含有2.5ml/孔具有2％葡萄糖和100μg/mlamp的2xYT培養基的無菌24×5ml深孔平板分別用1％的過夜培養物接種體接種，并且將細菌培養物在37℃和180rpm培養到OD600約0.4。然后，將所述培養物每孔用2.5μl1013cfu/ml的輔助噬菌體M13K07感染，并且在37℃和100rpm溫育1h，隨后將細菌通過離心沉淀，倒掉上層清液，并且將沉淀重懸在每孔2.5ml2xYT培養基，8mMGSH，100μg/ml氨芐青霉素，50μg/ml卡那霉素中，并且在30℃和200rpm溫育過夜。微量獲得噬菌體上層清液，將平板在4600rpm離心。噬菌體的沉積(Precipitation)和沉淀(pelleting)按Kay，Winter和McCafferty所述進行，并且將噬菌體沉淀重懸在大約200μlPBS，3％BSA，pH7.4中。通過這一流程，噬菌體可以濃縮，并且隨后用于ELISA。為了這一目的，將NUNC平板的孔用100μl抗原溶液(分別10μg/ml人單克隆IgGFc或BSA)在4℃包被過夜。第二天，將ELISA平板用封閉緩沖液(PBS，3％BSA，0.5％Tween20，pH7.4)在室溫下溫育2h。在將孔用洗滌緩沖液(PBS，0.1％吐溫20，pH7.4)洗滌后，將100μl每種封閉的噬菌體制備物加入到孔中，并且在RT溫育1h。在用洗滌緩沖液(PBS，0.1％吐溫20，pH7.4)再洗滌一次后，應用在PBSpH7.4中的1∶5000稀釋的單克隆抗-M13抗體(POD-綴合的；MoBiTec，Gttingen)(100μl/孔)，并且再在RT下溫育1h。然后，將孔用洗滌緩沖液(PBS，0.1％吐溫20，pH7.4)洗滌3次，和PBS洗滌3次，并且使用TMBPlus(Kementec，DK)開始顏色反應(100μl/孔)。20分鐘后，加入0.2MH2SO4終止顏色反應。得到的黃色顏色在450nm處讀取(參考波長620nm)并且記錄。使用引物pCAN700，測序來自表現出關于與單克隆IgGFc結合的明顯信號并且幾乎不能檢測到與BSA的結合的那些噬菌體制備物的γ-II-晶體蛋白變異的基因。使用限制性位點NcoI和BstEII，將從中得到的3個克隆，SPC1-A1，SPC1-A7和SPC1-G3亞克隆到pET20b表達載體中，并且引入表達菌株BL21(DE3)，pUBS520(Stratagene)。將細胞37℃和200rpm在具有100μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素的2xYT培養基中培養直到光學密度OD600＝0.6-0.8，隨后用IPTG(1mM終濃度)誘導重組蛋白表達。在30℃和200rpm生長4小時后，通過離心(6000xg，20min，4℃)收集細胞。在存在5mMβ-巰基乙醇下，通過溶菌酶(0.1mg/ml)和超聲(6×15sec，在用冰冷卻下)方法在NPI-10緩沖液(Qiagen)中進行細胞分解。離心(40.000xg，30min，4℃)后，將上層清液上樣到IMAC柱(HiTrapChelatingHP，AmershamBioscience)上，并且用NPI-20(Quiagen，+5mMβ-巰基乙醇)(20個柱體積)洗滌。洗脫通過用30個柱體積的NPI-500(Quiagen，+5mMβ-巰基乙醇)線性梯度進行。含有γ-II-晶體蛋白的級分通過SDSPAGE進行分析，將各自的樣品收集到一起，并且上樣到凝膠過濾柱(1.6×60，Sephadex75，AmershamBiosciences)上。流速為0.75ml/min的PBS作為運行緩沖液。凝膠過濾的分析通過SDSPAGE方法進行，將含有γ-II-晶體蛋白的級分組合在一起，并且保存在4℃。在這一純化流程后，AffilinTM變體具有＞95％的純度(SDSPAGE)。現在，按照上文所述在濃度-依賴性ELISA中檢測純化蛋白的結合特性。對于這一目的，使用不同濃度的(100nM-10μM)的AffilinTM變體，并且將抗-γ-II-晶體蛋白抗體(具有POD的單克隆抗體綴合物)用作檢測抗體。發現檢測到的所有3種AffilinTM變體表現出與人IgGFc的特異結合，并且與BSA或與微量滴定平板的非特異結合是不可檢測的。用作對照的人野生型γ-II-晶體蛋白沒有表現出與IgGFc，BSA或微量滴定平板的結合。在BIACORE實驗中，確定三種AffilinTM變體的解離常數。對于這一目的，將大約180RU人IgGFc(50μg/ml，在50mM檸檬酸鈉中，pH5.0)固定在CM5芯片上。游離的結合位點最終用1M乙醇胺(pH8.5)滅活。然后，以30μl/min的流速，6種不同濃度(166nM-1μM)流過所述芯片180sec。然后，將所述芯片以相同的流速用HBS，0.005％表面活性劑P20(Biacore)潤洗180sec。使用BiaEvaluation軟件(Biacore，Uppsala，Sweden)從得到的傳感圖中，可以確定下列AffilinTM變體與IgGFc的解離常數SPC1-A1230nM，SPC1-A7280nM和SPC1-G3800nM。在競爭實驗中，可以檢測到AffilinTM變體與IgGFc特異結合，但是不與芯片基質特異結合(圖2)。以與變體SPC1-A1、SPC1-A7和SPC1-G3篩選相似的方法，分離針對靶點分子proNGF的AffilinTM變體SPC7-E9。通過BIACORE-Messungen方法，可以確定解離常數為1-6nM(圖3)。實施例2從人泛蛋白文庫(UB10)篩選針對半胱氨酸結蛋白(cysteineknotprotein)的AffilinTM變體-表達并且純化所述變體提供用于篩選具有新產生的結合親和性的修飾蛋白的合成的泛蛋白基因按照本領域技術人員已知的標準流程，諸如例如Sambrook等(1989)的那些標準流程，進行遺傳加工工作。對于制備作為制備人工結合蛋白起點的修飾的泛蛋白蛋白構架的DNA序列(SeqIDNo.2)，所述修飾的泛蛋白蛋白構架具有取代Ile44Ala，Lys48Arg，Arg54Leu，Val70Ala，Arg72Leu，Gly75Ala以及Gly76缺失，方法如下對于基因合成，在50μl體積中進行PCR反應，其中六種寡脫氧核苷酸(SeqIDNo.26，SeqIDNo.27，SeqIDNo.28，SeqIDNo.29，SeqIDNo.30，SeqIDNo.31；每種0.1μM)每種2.5μl作為模板存在，它們的堿基對序列在一起代表要合成的基因。所用的寡脫氧核苷酸的序列每種分別對應人工基因的編碼和非編碼DNA鏈的片段，所述人工基因具有40-50個堿基對的長度，備選地在它們的3′和5′末端重疊大約15個堿基。另外，樣品含有2.5μl每種旁側引物(flankingprimers)(SeqIDNo.32，SeqIDNo.33；10μM)以及5μl10×Taq緩沖液(100mMTris/HClpH9.0，500mMKCl，1％(v/v)TritonX-100)，3μl25mMMgCl2，和4μldNTP混合物(dATP，dCTP，dGTP，dTTP每種2.5mM)。用H2O補足后，將反應樣品在熱循環儀中加熱2min達到94℃進行變性。然后，在加熱過程中加入2.5UTaq聚合酶(Promega)(熱啟動)，并且開始PCR程序。溫育進行25個循環，每個循環在94℃1min，55℃1min，和72℃1.5min。最后的溫育在72℃進行5min。需要的PCR產物通過分析性瓊脂糖凝膠電泳的方法進行鑒定，并且使用MinEluteReactionCleanup試劑盒(Qiagen)從樣品中純化出來。將1.0ng分離的DNA用作第二次擴增的模板，第二次擴增這次使用Pfu聚合酶(Promega)進行，也是50μl的體積。為了這一目的，使用5μl提供的10×Pfu緩沖液(200mMTris/HCl，pH8.8，20mMMgCl2，100mMKC1，100mM(NH4)28O4，1％(v/v)TritonX-100，1mg/mlBSA)以及4μldNTP混合物，并且用H2O補足。另外，樣品含有旁側引物(SeqIDNo.32，SeqIDNo.33；10μM)，以引入適當的限制性位點。需要的PCR產物通過制備瓊脂糖凝膠電泳方法分離，并且使用ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒(Invitrogen)，按照制造者的用法知道，將其插入到克隆載體pCR4Blunt-TOPO中。將提供的化學感受態細胞轉化相應的連接反應樣品，并且涂布到LB/amp/kan培養基的瓊脂平板上。將平板在37℃溫育16hrs，并且對于理想的連接產物分析生長的菌落。為了這一目的，使用Quiagen公司的質粒分離試劑盒，按照制造者的用法指導，少量制備質粒DNA，并且由于識別序列已經通過旁側引物的方法而引入到PCR產物中，所以，使用NdeI和XhoIDNA核酸內切酶(NewEnglandBiolabs)進行限制性消化。對于表現出期望的切割模式的質粒，使用TaqDNA聚合酶在插入的基因盒區域進行DNA序列分析。對于這一目的，按照制造者的用法指導，使用CycleReaderTMAutoDNA測序試劑盒(Fermentas)，以及0.5μg質粒DNA和1.0pM的每種熒光-標記的引物。在聚合酶反應過程中新合成的DNA鏈被標記，并且通過結合雙脫氧核苷酸而統計學性地但是以堿基-特異性方式而終止。然后，通過聚丙烯酰胺-尿素凝膠電泳，將得到的熒光DNA片段在溶液測序裝置中分離，并且在相鄰的泳道中可見A，C，G，T的條帶模式。通過制備性NdeI/XhoI限制性消化，將具有正確的DNA序列的基因盒從克隆載體pCR4Blunt-TOPO上切下，并且通過制備性瓊脂糖凝膠電泳分離。將修飾的泛蛋白構架的基因分別插入到表達載體pET20B(-)(Novagen)中，以產生相應的蛋白，或者插入到質粒載體pMUBI-1中，以構建方便變體的文庫。制備泛蛋白變體文庫對于分別在合成的泛蛋白基因氨基端和羧基端的8個密碼子的隨機位點-特異性誘變，進行兩次連續的PCR反應。第一擴增步驟使用Pfu聚合酶(Promega)在10×50μl的體積中進行。為了這一目的，每份樣品使用5μl提供的10xPfu緩沖液以及4μldNTP混合物，并且用H2O補足。此外，每種樣品含有2.5μl旁側引物(SeqIDNo.34，SeqIDNo.35；10μM)，以引入需要的堿基對取代。使用1.0ngpMUBI-1作為模板，其攜帶沒有突變的合成泛蛋白基因。在加入2.5UPfu聚合酶后(參見上文)，進行25個循環的溫育，每個循環在94℃1min，60℃1min，和72℃1.5min。最后的溫育在72℃進行5min。對于所用的模板DNA的選擇性降解，每份反應樣品中加入10UDpnI，并且在37℃溫育1小時。需要的PCR產物通過制備性瓊脂糖凝膠電泳的方法和QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)分離。第二擴增步驟在1,000μl的樣品體積中進行，其中使用在第一PCR反應中獲得的大約1.0ng產物，并且使用Taq聚合酶。吸取反應樣品——調整到20倍體積——如上文詳細所述那樣，其由下列各項組成10xTaq緩沖液，25mMMgCl2，dNTP混合物以及旁側引物(SeqIDNo.36，SeqIDNo.37；10μM)，所述引物在它們的5′末端被生物素化，并且每一引物攜帶SfiI核酸內切酶的識別位點，引物之間彼此不匹配。用H2O補足之后，在加熱時加入2.5UTaq聚合酶，并且起始PCR程序。進行25個循環的溫育，每個循環在94℃1min，60℃1min，和72℃1.5min。最后的溫育在72℃進行5min。直接在PCR反應樣品中對得到的擴增產物進行隨后的切割。為了這一目的，在4,000μl的總體積中，將完全的PCR反應溶液與相應體積的提供的10x緩沖液II(100mMTris/HCl，pH7.9，100MgCl2，500mMNaCl，10mM二硫蘇糖醇)，10XBSA溶液和H2O混合。此外，加入4,000U限制性酶SfiI(NewEnglandBiolabs)，并在50℃溫育16hrs。使用MinEluteReactionCleanup試劑盒(Qiagen)將DNA從樣品中分離，并且重懸在400μl無菌H2O中。為了分離沒有被SfiI切割的PCR產物，將分離的DNA與等體積的“結合溶液”(Dynal)混合并且在室溫(RT)下在滾筒混合器上溫育4.5hrs，其中所述“結合溶液”含有使得鏈霉抗生物素蛋白偶聯于其表面的1.0mg/ml磁珠(″DynabeadsKilobaseBinder″)。與任選地仍然存在生物素化的DNA結合的珠子被沉淀下來，而完全被SfiI切割的DNA應該不再具有生物素化的末端，并且保留在上層清液中，并且過夜被沉淀下來。將得到的由SfiI切割并且在需要位置誘變的泛蛋白基因溶解在無菌H2O中，使用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen)再次脫鹽，并且最后在H2O中具有200fmoles/μl的濃度。為了制備受體載體，將質粒pMUBI-1按照制造者的用法指導用SfiI切割，并且通過制備性瓊脂糖凝膠電泳和QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)的方法分離大的(載體-)片段。為了避免分子內部的連接，將其5′末端去磷酸化處理。為了這一目的，在200μl的總體積中，使用0.5U來自甲殼類動物(shrimp)的堿性磷酸酶(Pandalusborealis)以及提供的緩沖液。將混合物在37℃溫育90min，將DNA用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen)從樣品中分離，并且再次脫鹽(QIAquickPCR純化試劑盒)。最后，載體片段的DNA在H2O中具有50fmoles/μl的濃度。對于連接，在1,600μl(50mMTris/HCl，pH7.6，10mMMgCl2，1mMATP，1mMDTT，5％(w/v)PEG-8,000)的總體積中，將1.6pmolPCR片段和8.0pmolpMUBI-1載體片段在2UT4DNA連接酶(GibcoBRL)的存在下在16℃溫育3天。在將樣品加熱到65℃15min后，將DNA沉淀下來。為了這一目的，將100μl的每種反應溶液與100μl的乙醇以及10μl5MNaAc，pH3.0混合，并且在-20℃保存16hrs。隨后，進行離心(60min，12,500g)，將樣品用乙醇(70％v/v，-20℃)洗滌，再次離心，并且最后將沉淀的DNA溶解在60μl無菌H2O中。對于電穿孔，在冷室中在4℃使用GenePulserII系統(Biorad)以及具有1.0mm電極間隔的杯子(Biozym)。使用3.5μl每種上述獲得的溶液，按照制造者的用法指導，轉化電感受態大腸桿菌XL1Blue(Stratagene)。將得到的細胞混懸液涂布在5個含有LB/氯霉素培養基的瓊脂平板(20x20cm)上。將平板在-37℃溫育16hrs，并且計數生長的菌落。因此，構建的文庫包括2.8×107種獨立的克隆，每種克隆應該在文庫中出現10,000次。然后，將菌落浮選在100ml含有10％(v/v)甘油的SOC培養基中，并且以1.0ml的等分保存在-80℃。從得到的克隆中，使用Qiagen公司出售的DNAMiniprep試劑盒從12個隨機選擇的克隆中分離質粒載體，并且分析在誘變的泛蛋白基因區域的DNA序列。所有這些克隆都表現出功能性序列——即，沒有通過插入或刪除引起的閱讀框移碼——以及在誘變位置上性質完全不同的取代。在誘變區之外不存在隨機取代。以這種基于人泛蛋白的文庫為基礎，以與實施例1相似的方法進行選擇，通過本領域技術人員已知的噬菌體展示系統方法的方式進行。引入小的修飾僅僅是為了選擇所用的抗生素(氯霉素而不是氨芐青霉素)。來自半胱氨酸knot蛋白家族的生長因子作為靶點。泛蛋白AffilinTMSPU11-3-A1具有通過ELISA確定的nM范圍的解離常數，并且在BIACORE系統中用于偶聯研究。使用限制性位點NdeI和XhoI，將從中選擇的一種變體，SPU11-3-A1，克隆到pET20b表達載體中。培養條件和純化方法與實施例1中所述用于SPCAffilinTM(IMAC，凝膠過濾)的培養條件和純化方法相同。為了檢測結合特性，進行濃度-依賴型ELISA。為了這一目的，將不同濃度(10nM-1μM)的AffilinTM變體應用到用靶點分子包被的微量滴定平板(MTP)上，并且將多克隆抗-泛蛋白抗血清(Sigma)用作一級檢測試劑。在RT溫育(1h)后，將MTP的孔用PBS洗滌3次，并且在第二步中，使用具有POD的單克隆抗體綴合物(抗-IgG，Sigma)作為檢測抗體。發現檢測的AffilinTM變體表現出與人NGF的特異性結合，并且沒有檢測到與BSA或與微量滴定平板的非特異性結合。作為對照的人野生型泛蛋白沒有表現出與NGF、BSA或與微量滴定平板的結合。實施例3AffilinTM與含有半胱氨酸的肽接頭的C端融合用于與不同分子選擇性偶聯下述實例證明與IgGFc結合的AffilinTM變體SPC1-A7可以通過C端半胱氨酸選擇性地與不同分子偶聯。除了位于蛋白內部的7個半胱氨酸之外，所用的AffilinTM變體SPC1-A7已經在可變位置4攜帶溶液-可及的并且因此是游離的半胱氨酸。這首先應用QuickChangePCR用絲氨酸取代。用這種修飾的AffilinTM(SPC1-A7BB)起始，除了已經存在的6個組氨酸外，2個甘氨酸和1個半胱氨酸以及4個其它的組氨酸通過QuickChangePCR方法插入到C端。親和標記延長到10個組氨酸的目的是可以進行提高的純化。使用Ellmann′s試劑的滴定實驗表明，由于與在AffilinTM變體中存在的其它半胱氨酸的半胱氨酸改組(shuffling)事件，引入的半胱氨酸不適于偶聯實驗。由于這一原因，所述半胱氨酸在DNA水平上被絲氨酸(TCT)取代，并且從這一構建體開始，在Gly4Ser接頭后引入新的半胱氨酸。這起到加大插入的半胱氨酸與蛋白中半胱氨酸的距離并且抑制半胱氨酸改組的作用。最后，將得到的構建體測序，并且使用Ellmann′s試劑的滴定實驗表明它適用于偶聯實驗。對于在AffilinTM變體SPC1-A7中位置4用絲氨酸取代半胱氨酸，使用QuickChangePCR方法(Stratagen，LaJolla，USA)，其使用引物A7Cys4Ser_for和A7Cys4Ser_rev。對于PCR反應，使用5μl10x反應緩沖液(100mMKCl，100mM(NH4)2SO4，200mMTris-HCl，pH8.8，20mMMgSO4，1％TritonX-100，1mg/mlBSA)，125ng兩種引物的每種，1μlPfuTurboDNA聚合酶，1μldNTP混合物和H2O，達到總體積50μl。在pET20b載體中的AffilinTM變體SPC1-A7的基因作為模板DNA。反應以在95℃3min的變性步驟起始，之后是18個重復循環的變性、引物退火和合成。在95℃的變性進行30sec，引物退火在60℃進行1min。合成步驟的持續為在68℃5min。在PCR末期，進行在68℃5min的最后合成。擴增通過瓊脂糖凝膠電泳監測。在成功擴增后，通過限制性酶DpnI進行對所用的模板DNA的限制性消化。將1μl所述酶(10U/μl)吸入到PCR樣品中，混合并且在37℃溫育1h。然后通過電穿孔方法將載體引入到感受態菌株(Xl-1blue，Stratagene)中。為了這一目的，將在冰上的1μlDpnI-處理的限制性樣品吸入到50μl電感受態XL-1blue細胞中，混合并且在2-5kV，25μF，和200Ω在冰冷的電穿孔杯(0.1mm)中進行脈沖。將細胞重懸在1mlSOC培養基中，并且在500rpm的搖動下在37℃培養60min。然后，將細胞涂布到選擇培養基(2xYT，100μg/ml氨芐青霉素)上，并且在37℃培養16h。將12個得到的克隆分別用pETTerm引物測序以檢驗正確的插入。將正確的克隆的載體用作下一次QuickChangePCR的模板DNA，其中在C端引入1個半胱氨酸和4個另外的組氨酸。如上文所述，進行使用引物A7Gly2Cys_for和A7Gly2Cys_rev的QuickChangePCR，隨后進行DpnI消化，并且通過電穿孔方法轉化XL1-Blue菌株。為了控制正確的引入，再一次測序12個克隆。將正確克隆的質粒(SPC-1-A7JJ)引入到攜帶質粒pUBS520的BL21表達菌株中，以便隨后表達并且在兩步層析步驟(在Ni-NTA上的親和層析和在交聯葡聚糖75上的凝膠過濾)中純化AffilinTM變體SPC1-A7BB，如上文所述那樣(實施例1)。為了檢驗引入的半胱氨酸殘基的可及性(Haber，1972)，所有的游離SH基團應該通過Ellmann′s試劑(DTNB溶液)的方法進行滴定。為了這一目的，向1mlAffilinTM變體SPC1-A7JJ的蛋白溶液(50-350μg蛋白，在100mMTris/HCl；pH8.0中)加入30μlDTNB溶液(4mg/mlDTNB，在100mMTris/HCl；pH8.0中)。1ml蛋白溶液和30μl緩沖液(100mMTris/HCl；pH8.0)作為空白值1。1ml緩沖液(100mMTris/HCl；pH8.0)和30μlDTNB溶液作為空白值2。將樣品在室溫下溫育15min，并且測定在410nm處的吸收。從測試樣品的吸收中減去空白值1和2的吸收。使用DTNB-SH的消光系數(ε410[DTNB-SH]＝13,600M-1cm-1)從得到的吸收值計算游離SH基團的摩爾濃度，并且除以所用的蛋白濃度。結果得到每個蛋白分子游離的硫醇基團數目。游離的半胱氨酸殘基可以在構建的AffilinTM變體SPC1-A7JJ3-4中進行滴定。由于使用AffilinTM變體SPC-1-A7Cys4Ser滴定的對照表明蛋白中存在的半胱氨酸是不可及的，所以預計有1個游離的半胱氨酸。這表明引入的C端半胱氨酸與包埋在蛋白內的半胱氨酸的半胱氨酸改組，并且因此表明引入的半胱氨酸與蛋白的距離太短。由于這一原因，如上文所述，使用引物A7Gly2Serfor和A7Gly2Serrev，在QuickChangePCR中將AffilinTM變體SPC-1-A7JJ的C端半胱氨酸用絲氨酸取代。在檢驗了正確的引入之后，這一構建體作為PCR模板以引入其后接著半胱氨酸的Gly4Ser-接頭。PCR使用引物Gly4SerCys_HindIII和A7Cys4Ser_Nde進行。對于PCR反應，使用5μl10x反應緩沖液(100mMKCl，100mM(NH4)2SO4，200mMTris-HCl，pH8.8，20mMMgSO4，1％TritonX-100，1mg/mlBSA)，125ng兩種引物的每一種，1μlPfuTurboDNA聚合酶，1μldNTP混合物和H2O，達到總體積50μl。此外，向反應混合物中加入2μlDMSO，以分解引物的二級結構。與上述步驟相反，在不同的引物退火溫度58℃進行25個重復步驟的變性、引物退火和合成。這一AffilinTM變體(SPC1-A7_Cys)的PCR產物的擴增通過瓊脂糖凝膠電泳的方法進行檢驗。表2給出本文所述的構建體的概述(表2)。引物A7Cys4Ser_Nde含有酶NdeI的結合的限制性位點，并且引物Gly4SerCys_HindIII含有酶HindIII的位點，由此可以在其純化和通過這兩種酶限制性消化后將PCR產物連接到也用NdeI和HindIII處理的載體pET20b中。這兩種酶的限制性消化以雙消化的方式同時進行。對于這一目的，將大約1μgAfffilinTM變體SPC1-A7_Cys的PCR產物或1μg的載體pET20b分別與1μl限制性酶NdeI(NewEnglandBiolabs，FrankfurtamMain，Germany，20U/μl)和1μl限制性酶HindIII(NewEnglandBiolabs，FrankfurtamMain，Germany，20U/μl)以及10μl10x反應緩沖液NEB緩沖液2(50mMNaCl，10mMTris-HCl，pH7.9，10mMMgCl2，1mMDTT)在100μl的總體積中在37℃溫育4h。將得到的片段分別通過制備性瓊脂糖凝膠電泳進行純化。對于連接，在20μl的總體積中，使用20ng純化的NdeI/HindIII處理的載體pET20b片段，和120ng相似處理的AffilinTM變體SPC1-A7Cys的片段，以及2μl10x反應緩沖液(300mMTris-HCl，pH7.8，100mMMgCl2，100mMDTT，10mMATP)和0.5μlT4DNA連接酶(Promega，Mannheim，Germany，1-3U/μl)。將反應樣品在16℃溫育16h，并且如上文所述，將得到的載體通過的電穿孔引入到XL-1blue細胞中。在轉化后通過用引物pETTerm測序檢驗12個克隆的所述基因的正確引入。隨后，將大腸桿菌細胞(BL21(DE3)，+pUBS520)用具有正確序列的載體AffilinTM變體SPC1-A7Cys轉化。在如上文所述，表達并且純化AffilinTM變體SPC1-A7(實施例1)后，對于AffilinTM變體SPC1-A7_Cys，通過上文所述的Ellmann′s試劑方法再次滴定游離的半胱氨酸殘基。如預計的那樣，只可能檢測到1個半胱氨酸殘基，這證實在與蛋白充分的距離處成功引入了溶劑可及的C端半胱氨酸，以用于與適當的伴侶偶聯(表1)。單一可及半胱氨酸的這種檢測是AffilinTM與適當的偶聯伴侶和基質的選擇性偶聯的基礎。為了提供具有1個C端半胱氨酸的AffilinTMSPU11-3-A1，將SPU11-3-A1基因通過NcoI和XhoI限制性位點克隆到為AffilinTMSPC1-A7修飾的pET20b中(參見上文)。AffilinTMSPU11-3-A1_Cys的表達和純化與SPC1-A7_Cys的步驟相同。實施例4分析用肽接頭(C端半胱氨酸)修飾的AffilinTM體SPC1-A7_Cys的結合特性在濃度-依賴型ELISA中檢測在實施例3中純化的AffilinTMSPC1-A7_Cys的結合特性。為了這一目的，將NUNC平板的孔用100μl抗原溶液(10μg/ml人單克隆IgGFc片段，Roche)在4℃包被過夜。第二天，將ELISA平板用PBS(3％BSA，0.5％吐溫20)在室溫下封閉2h。在將孔用PBS(0.1％吐溫20)洗滌后，將修飾的AffilinTM以濃度-依賴性方式(濃度范圍10μM-0μM)加入，并且在RT溫育1h。在將孔用PBS(0.1％吐溫20)再次洗滌后，以1∶1000的稀釋應用單克隆抗-hGC抗體(POD-綴合的；Biogenes，Berlin)(50μl/孔)，并且再在RT下溫育1h。然后，將孔用PBS(0.1吐溫20)洗滌3次，用PBS洗滌3次，并且用TMBPlus(Kementec，DK)開始顏色反應(50μl/孔)。在室溫下溫育20分鐘后，加入0.2MH2SO4(50μl/孔)終止顏色反應。得到的黃色在450nm處讀取(參考波長620nm)并且記錄下來。(圖4)測定值的評估表明233nM的表觀KD值，其大致等于未修飾的AffilinTMSPC1-A7和SPC1-A7BB(280nM)。因此，用包括半胱氨酸的肽接頭對AffilinTMSPC1-A7進行C端修飾對于所述變體的結合能力沒有影響。實施例5IgG-結合的AffilinTMSPC1-A7_Cys與藻紅蛋白(PE)的選擇性偶聯結合IgG的AffilinTMSPC1-A7_Cys與活化的PE的偶聯進行如下將1mg/ml的SPC1-A7_Cys(在PBS)中在室溫下用10mMDTT還原30min。在還原期間，將PD-10柱(AmershamBiosciences)用5個柱體積的PBS潤洗。在還原進行之后，將反應混合物上樣到平衡的PD-10柱上，以便分離過剩的DTT。將以這種方法還原的SPC1-A7_Cys以5∶1的摩爾比加入順丁烯二酰亞胺-活化的藻紅蛋白(Prozyme)，并且在輕微的搖動下在室溫溫育1h。然后，通過加入NEM(N-乙基順丁烯二酰亞胺)，將AffilinTM沒有反應的巰基基團在RT封閉20min。隨后，將反應混合物通過凝膠過濾(SephadexS-200HR)的方法純化，并且將相應的級分組合在一起并保存在4℃。分光光度法進行綴合物的分析。為了這一目的，檢測在250-750nm范圍的吸收光譜，并且分別通過確定的或提供的消光系數確定PE和AffilinTM的濃度。將得到的AffilinTMSPC1-A7_Cys和PE(SPC1-A7_Cys_PE)綴合物在BIACORE中檢測其與IgGFc的結合特性。為了這一目的，在30μl/min的連續流下并且使用HBS-EP作為運行緩沖液，使用與IgGFc偶聯的CM5芯片。將不同濃度的SPC1-A7_Cys_PE相繼流過所述芯片，并且用BIACORE評估軟件分析得到的傳感圖。發現通過偶聯得到親和作用，其導致宏觀解離常數從KD＝10-7M下降到KD＝10-8M(圖5)。實施例6熒光染料Oyster556與IgG-結合的AffilinTMSPC1-A7BB的非特異性偶聯熒光染料Oyster556(MolecularProbes)與IgG-結合的AffilinTMSPC1-A7BB偶聯(無游離半胱氨酸！)，并且進行關于結合的檢驗。偶聯步驟進行如下將在10mM磷酸緩沖液(pH8.5)中的1mg/mlSPC1-A7BB以1∶2的摩爾比加入熒光染料Oyster556(溶解在20μl干DMF中)，并且在RT溫育30min。偶聯反應通過加入1體積的10％甘油溶液終止，并且將樣品通過PD-10柱進行純化。然后，偶聯的程度通過分光光度法定量。為了這一目的，綴合物的濃度通過280nm處的吸收而確定，并且用提供的校正因子(MolecularProbes)校正。然后，偶聯程度從Oyster556和綴合物濃度的商獲得，并且可以確定為1摩爾AffilinTM/0.8摩爾Oyster556。得到的綴合物的結合能力的分析通過濃度-依賴型ELISA(如在實施例1中進行的那樣)以及通過Biacore檢測(圖6)進行。發現在與熒光染料Oyster偶聯后，AffilinTMSPC1-A7BB的結合能力沒有受到影響。實施例7辣根過氧化物酶(POD)與IgG-結合的AffilinTMSPC1-A7BB的非特異性偶聯AffilinTM變體SPC1-A7BB可以與POD酶非特異性地偶聯，并且結合研究表明AffilinTM的結合活性和POD的酶促活性得到保留。所述綴合物按照下述流程制備將5mg凍干的辣根過氧化物酶(POD，Sigma)溶解在250μl純水中，加入37,5μl0，1M的高碘酸鈉溶液，并且在20℃溫育10min。然后，加入25μl乙二醇并且在20℃進一步溫育5min。將過氧化物酶通過凝膠過濾(G25，NAP-5柱)針對純水進行透析。將250μl純化的AffilinTMSPC1-A7BB(IMAC，凝膠過濾，4mg/mlPBS)加入100μl0.1M的碳酸緩沖液(pH9.6)，并且加入1mg活化的過氧化物酶(Sigma)(約100μl)。將偶聯混合物在20℃在搖動下溫育2h。然后，每ml偶聯混合物中加入10μl0.5M的氫硼化鈉，簡單混合并且在4℃不攪動再溫育2h。使用G25柱將反應樣品針對PBS進行緩沖。加入乙基汞硫代水楊酸鈉(Roth)，0,1％用于保存。所述綴合物與人IgG的結合活性的研究進行如下將標記的AffilinTM稀釋在PBS(0.5％BSA，0.05％吐溫20，0.01％乙基汞硫代水楊酸鈉)中，并且將溶液應用到用人IgG(10μg/ml，100μl/ml)包被的微量滴定平板上。在室溫下溫育時間是1h。然后，將孔每次用250μlPBS(0.1％吐溫20，0.01％乙基汞硫代水楊酸鈉)洗滌3次，并且在室溫下再用100μlTMB溫育10-20min。通過加入100μl0.5M的硫酸而終止反應。在微量滴定平板光度計中測定吸收(450nm相對620nm作為參考)(圖7)。直到反應樣品1∶10,000稀釋還可以檢測到POD活性，這表明POD與SPC1-A7BB的成功偶聯。通過對照檢測排除了未偶聯的POD干擾信號。實施例8基于γ-II-晶體蛋白和泛蛋白的AffilinTM與基質的特異性和非特異性偶聯AffilinTM與基質的偶聯可以通過下述方法獲得1.)AffilinTMSPU3-A1_Cys通過C端半胱氨酸與葡聚糖基質偶聯，2.)AffilinTMSPC7-E9通過一級氨基基團與BIACORE系統的葡聚糖基質偶聯，和3.)AffilinTMSPC7-E9通過EDC/NHS方式與聚甲基丙烯酸酯基質非特異性偶聯。1.)SPU3-A1_Cys與BIACORE系統的葡聚糖基質的偶聯通過引物的C端半胱氨酸而選擇性地進行。為了這一目的，在2min的接觸時間內將葡聚糖基質的羧基基團用NHS/EDC活化，并且隨后加入硫醇偶聯劑PDEA(2-(2-吡啶基二硫代)乙酰胺(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine)，在0，1M硼酸緩沖液pH8.5中)。在4min的反應時間后，將純化的SPU3-A1_Cys(在20mM磷酸緩沖液中，pH6.0)加入到以這種方式修飾的葡聚糖芯片中，并且反應繼續進行7min。未反應的PDEA基團的滅活使用50mML-半胱氨酸(1MNaCl)進行4min。使用這種方法，350個單位(RU)的SPU3-Al_Cys可以固定在芯片中，并且用于進一步的動力學分析。動力學檢測后，將芯片用0.1甘氨酸(pH2.2)，6MGua/HCl，6M尿素和20％乙醇進行再生。在這種方法中，即使在20-30個再生循環后，AffilinTM芯片的結合能力仍然沒有改變(圖8)。2.)此外，SPC7-E9可以以下述方式通過NHS/EDC方法經由暴露于表面的氨基(賴氨酸)與BIACORE葡聚糖基質的羧基非特異性地偶聯將CM5芯片用NHS/EDC活化7min，然后再將純化的SPC7-E9(在20mM磷酸鈉緩沖液中，pH6.0)流過所述芯片7min。在進行偶聯之后，用1M的乙醇胺(pH8.5)將剩余的活性基團滅活7min。為了分析靶點的解離常數，將proNGF以不同濃度流過所述芯片，在線監測結合(圖9)，并且隨后，使用BiaEvaluation軟件評估曲線。在這種方法中，KD值可以確定為1.4nM。在動力學檢測之后，將芯片用0.1甘氨酸(pH2.2)，10mMHCl，10mMNaOH，6MGua/HCl，6M尿素和20％乙醇進行再生。在這種方法中，即使在一些再生循環之后，AffilinTM芯片的結合活性仍然沒有改變。3.)將純化的SPC7-E9蛋白(4mg)在PD-10柱(Amersham)上緩沖到0,1M硼酸緩沖液(0.5MNa2SO4，pH9)中，并且偶聯到FractogelEMDEpoxy(M)上。為了這一目的，將凝膠(0.5g)在RT在0,1M硼酸緩沖液(0.5MNa2SO4，pH9)中溫育2h，然后用這種緩沖液洗滌幾次。偶聯反應通過向epoxy基質中加入SPC7-E9而起始，并且在連續的攪動下在RT溫育24h。沒有SPC7-E9的參照柱作為對照，并且以相同的方法處理。通過RT下1M乙醇胺(pH9.5)處理48h而終止反應，并且將凝膠基質用乙酸鈉緩沖液(0.1M，pH4.0)，1MNaCl和PBS(每次50個柱體積)洗滌。將以這種方式生成的AffilinTMSPC7-E9親和基質填滿C柱(AmershamBiosciences，1×10cm)，并且連接到層析系統(ktaExplorer，AmershamBiosciences)。在所有的情形中，流速1ml/min的PBS(0.5mMEDTA)用作運行緩沖液。為了檢驗以這種方法生成的AffilinTM柱的結合能力，應用純化的proNGF。在用10-20個柱體積的運行緩沖液潤洗所述柱后，用0.1M甘氨酸(pH2.2)洗脫結合的proNGF(圖10)。此外，可以從與BSA的物質混合物和從大腸桿菌粗提取物中分離proNGF。為了這一目的，將1mlBSA溶液(5mg/ml，Sigma)與0.5mlproNGF(1.3mg/ml)混合，并且應用到AffilinTM柱上。在用20個柱體積的運行緩沖液潤洗所述柱后，用甘氨酸(0.1M，pH2.2)洗脫結合的proNGF。此外，在用10個柱體積的6MGua/HCl將柱再生后，將1ml大腸桿菌粗提取物(50mlBl21過夜培養物的細菌沉淀的細胞分解(溶菌酶/benzonase/超聲)后的可溶上層清液)和0.5mlproNGF(1.3mg/ml)的混合物應用到AffilinTM柱上。在用20個柱體積的運行緩沖液潤洗所述柱后，也用甘氨酸(0.1M，pH2.2)洗脫結合的proNGF。隨后將柱用0.1M甘氨酸(pH2.2)，10mMHCl，10mMNaOH，6MGua/HCl，6M尿素和20％乙醇進行再生。通過凝膠電泳的方法分析來自從BSA和大腸桿菌提取物的分離物的洗脫級分(圖11)。在10次檢測運行后，可以觀察到proNGF與SPC7-E9柱的未改變的結合。附件表1表2SPC-1-A75′-ATGGGTCTGATCTGTCTCGAGCACCACCACCACCACCAC-3SPC-1-A7BB5′-ATGGGTCTGATCTCTCTCGAGCACCACCACCACCACCAC-3′SPC-1-A7JJ5′-ATGGGTCTGATCTCTCTCGAGTGCGGCGGCCATCACCATCACCACCACCACCACCACCAC-3′SPC-1-A7_Cys5-′ATGGGTCTGATCTCTCTCGAGTCCGGCGGCGGGGGGGGAGGATCTTGCCATCACCATCACCACCACCACCACCACCAC人γ-II-晶體蛋白文庫的DNA序列CR20(SEQIDNO1)ATGGGTNNKATCNNKTTCNNKGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTNNKTACNNKTGCNNKACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCNNKGTTNNKTCCGGTTGCTGGATGATCTACGAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCGTCACCAGTACTTCCTGCGGCGTGGGGAGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACTCCATCCGCTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAGAATGAAGATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGAGCTCACAGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACTGAAATTCACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGAGATGCCCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTGCTGAGGCCGGGGGAGTACAGGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGCTCTCTTAGACGAGTCATGGATTTGTACGCG基于γ-II-晶體蛋白的AffilinTM的DNA-序列SPC1-A1(SEQIDNO2)ATGGGTTTTATCTGGTTCATGGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTAGGTACGATTGCGGTACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCAAGGTTAAGTCCGGTTGCTGGATGATCTACGAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCGTCACCAGTACTTCCTGCGGCGTGGGGAGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACTCCATCCGCTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAGAATGAAGATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGAGCTCACAGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACTGAAATTCACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGAGATGCCCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTGCTGAGGCCGGGGGAGTACAGGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGCTCTCTTAGACGAGTCATGGATTTGTACGCGSPC1-A7(SEQIDNO3)ATGGGTCTGATCTGTTTCTCTGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTAGGTACATGTGCCTGACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCAATGTTTGGTCCGGTTGCTGGATGATCTACGAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCGTCACCAGTACTTCCTGCGGCGTGGGGAGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACTCCATCCGCTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAGAATGAAGATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGAGCTCACAGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACTGAAATTCACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGAGATGCCCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTGCTGAGGCCGGGGGAGTACAGGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGCTCTCTTAGACGAGTCATGGATTTGTACGCGSPC1-G3(SEQIDNO4)ATGGGTTCTATCATTTTCCTTGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTATTTACGGTTGCACTACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCGTGGTTCAGTCCGGTTGCTGGATGATCTACGAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCGTCACCAGTACTTCCTGCGGCGTGGGGAGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACTCCATCCGCTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAGAATGAAGATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGAGCTCACAGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACTGAAATTCACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGAGATGCCCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTGCTGAGGCCGGGGGAGTACAGGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGCTCTCTTAGACGAGTCATGGATTTGTACGCGSPC1-A7BB(SEQIDNO5)ATGGGTCTGATCTCTTTCTCTGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTAGGTACATGTGCCTGACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCAATGTTTGGTCCGGTTGCTGGATGATCTACGAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCAGTACTTCCTGCGGCGTGGGGAGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACTCCATCCGCTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAGAATGAAGATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGAGCTCACAGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACTGAAATTCACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGAGATGCCCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTGCTGAGGCCGGGGGAGTACAGGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGCTCTCTTAGACGAGTCATGGATTTGTACCTCGAGCACCACCACCACCACCACSPC1-A7JJ(包括His10)(SEQIDNO6)ATGGGTCTGATCTCTTTCTCTGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTAGGTACATGTGCCTGACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCAATGTTTGGTCCGGTTGCTGGATGATCTACGAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCAGTACTTCCTGCGGCGTGGGGAGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACTCCATCCGCTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAGAATGAAGATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGAGCTCACAGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACTGAAATTCACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGAGATGCCCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTGCTGAGGCCGGGGGAGTACAGGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGCTCTCTTAGACGAGTCATGGATTTGTACCTCGAGTGCGGCGGCCATCACCATCACCACCACCACCACCACCACSPC1-A7_Cys(包括His10)(SEQIDNO7)ATGGGTCTGATCTCTTTCTCTGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTAGGTACATGTGCCTGACCGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCAATGTTTGGTCCGGTTGCTGGATGATCTACGAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCAGTACTTCCTGCGGCGTGGGGAGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACTCCATCCGCTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAGAATGAAGATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGAGCTCACAGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACTGAAATTCACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGAGATGCCCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTGCTGAGGCCGGGGGAGTACAGGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGCTCTCTTAGACGAGTCATGGATTTGTACCTCGAGTCCGGCGGCGGGGGGGGAGGATCTTGCCATCACCATCACCACCACCACCACCACCACSPC7-E9(包括His6)(SEQIDNO8)ATGGGTTTTATCTGTTTCTTGGAAGACCGTGCTTTCCAGGGTCGTTCTTACGCTTGCGATACTGACTGCCCGAACCTGCAGCCGTACTTCTCCCGTTGCAACTCCATCAGTGTTCTGTCCGGTTGCTGGATGATCTACGAACGTCCGAACTACCAGGGTCACCAGTACTTCCTGCGGCGTGGGGAGTACCCCGACTACCAGCAATGGATGGGCCTCAGCGACTCCATCCGCTCCTGCTGCCTCATCCCCCCCCACTCTGGCGCTTACAGAATGAAGATCTACGACAGAGATGAATTGAGGGGACAAATGTCAGAGCTCACAGACGACTGTCTCTCTGTTCAGGACCGCTTCCACCTCACTGAAATTCACTCCCTCAATGTGCTGGAGGGCAGCTGGATCCTCTATGAGATGCCCAACTACAGGGGGAGGCAGTATCTgCTGAGGCCGGGGGAGTACAGGAGGTTTCTTGATTGGGGGGCTCCAAATGCCAAAGTTGGCTCTCTTAGACGAGTCATGGATTTGTACCTCGAGCACCACCACCACCACCAC人泛蛋白文庫的DNA序列泛蛋白野生型(SEQIDNO9)ATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTGACCGGCAAGACCATCACTCTGGAGGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAAAATGTGAAGGCCAAGATCCAAGATAAAGAAGGCATTCCCCCCGACCAGCAGAGGCTCATCTTTGCAGGCAAGCAGCTGGAAGATGGCCGCACTCTTTCTGACTACAACATCCAGAAAGAGTCGACCCTGCACCTGGTCCTCCGCCTGAGGGGCGGC修飾的泛蛋白(MUBI)(SEQIDNO10)ATGCAAATCTTCGTTAAAACCCTGACGGGAAAGACTATCACCCTGGAGGTAGAACCGTCCGACACCATCGAAAATGTCAAAGCTAAAATCCAAGACAAAGAAGGAATTCCACCTGACCAGCAACGCCTAGCTTTCGCAGGACGACAACTAGAGGACGGGCTCACCCTGTCTGACTACAACATCCAAAAAGAATCCACCCTCCACCTGGCACTCCTCCTGCGGGCCUB10(文庫)(SEQIDNO11)ATGNNKATCNNKGTTNNKACCCTGACGGGAAAGACTATCACCCTGGAGGTAGAACCGTCCGACACCATCGAAAATGTCAAAGCTAAAATCCAAGACAAAGAAGGAATTCCACCTGACCAGCAACGCCTAGCTTTCGCAGGACGACAACTAGAGGACGGGCTCACCCTGTCTGACTACAACATCNNKNNKNNKNNKNNKCTCCACCTGGCACTCCTCCTGCGGGCC基于泛蛋白的AffilinTM的DNA序列SPU11-3-A1(包括His6)(SEQIDNO12)ATGCGGATCCGTGTTGCTACCCTGACGGGAAAGACTATCACCCTGGAGGTAGAACCGTCCGACACCATCGAAAATGTCAAAGCTAAAATCCAAGACAAAGAAGGAATTCCACCTGACCAGCAACGCCTAGCTTTCGCAGGACGACAACTAGAGGACGGGCTCACCCTGTCTGACTACGACATCCGTCATGGTACGTCGCTCCACCTGGCACTCCTCCTGCGGGCCCTCGAGCACCACCACCACCACCACSPU11-3-A1_Cys(包括His10)(SEQIDNO13)ATGCGGATCCGTGTTGCTACCCTGACGGGAAAGACTATCACCCTGGAGGTAGAACCGTCCGACACCATCGAAAATGTCAAAGCTAAAATCCAAGACAAAGAAGGAATTCCACCTGACCAGCAACGCCTAGCTTTCGCAGGACGACAACTAGAGGACGGGCTCACCCTGTCTGACTACGACATCCGTCATGGTACGTCGCTCCACCTGGCACTCCTCCTGCGGGCCCTCGAGTCCGGCGGCGGGGGGGGAGGATCTTGCCATCACCATCACCACCACCACCACCACCAC引物pCAN700(5’-CCATGATTACGCCAAGCTTTGGAGCC-3’)(SEQIDNO14)A7Cys4Ser_for(5’-CCATGGGTCTGATCTCTTTCTCTGAAGACCG-3’)(SEQIDNO15)A7Cys4Ser_rev(5’-CGGTCTTCAGAGAAAGAGATCAGACCCATGG-3’)(SEQIDNO16)pETTerm(5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGC-3’)(SEQIDNO17)A7Gly2Cys_for(5’-GGATTTGTACCTCGAGTGCGGCGGCCATCACCATCACCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGC-3’)(SEQIDNO18)A7Gly2Cys_rev(5’-GCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGATGGTGATGGCCGCCGCACTCGAGGTACAAATCC-3’)(SEQIDNO19)A7Gly2Ser_for(5’-GGATTTGTACCTCGAGTCCGGCGGCCATCACC-3’)(SEQIDNO20)和A7Gly2Serrev(5’-GGTGATGGCCGCCGGACTCGAGGTACAAATCC-3’)(SEQIDNO21)A7Gly2Ser_rev(5’-GGTGATGGCCGCCGGACTCGAGGTACAAATCC-3’)(SEQIDNO22)Gly4SerCys_HindIII(5’-GGGGGAAGCTTTTATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGATGGTGATGGCAAGAT-3’)(SEQIDNO23)A7Cys4Ser_Nde(5’-GGAGATATACAATATGGGTCTGATCTCTTTCTCTG-3’)(SEQIDNO24)SEQIDNO25ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCC60ATGGCCATGCAAATCTTCGTTAAAACCCTGACGGGAAAGACTATCACCCTGGAGGTAGAA120CCGTCCGACACCATCGAAAATGTCAAAGCTAAAATCCAAGACAAAGAAGGAATTCCACCT180GACCAGCAACGCCTAGCTTTCGCAGGACGACAACTAGAGGACGGGCTCACCCTGTCTGAC240TACAACATCCAAAAAGAATCCACCCTCCACCTGGCACTCCTCCTGCGGGCC291SEQIDNO26ATGCAAATCTTCGTTAAAACCCTGACGGGAAAGACTATCACCCTGGAGGT50SEQIDNO27GGATTTTAGCTTTGACATTTTCGATGGTGTCGGACGGTTCTACCTCCAGGGTG53SEQIDNO28GTCAAAGCTAAAATCCAAGACAAAGAAGGAATTCCACCTGACCAGCAACGCCT53SEQIDNO29GGGTGAGCCCGTCCTCTAGTTGTCGTCCTGCGAAAGCTAGGCGTTGCTGG50SEQIDNO30GACGGGCTCACCCTGTCTGACTACAACATCCAAAAAGAATCCACCCTCCA50SEQIDNO31GAGTGCTCGCAGCAGGAGTGCCAGGTGGAGGGTGGATTC39SEQIDNO32GATATACATATGCAAATCTTCG22SEQIDNO33GTGGTGCTCGAGTGCTCG18SEQIDNO34CCAGCCGGCCATGGCCATGNNKATCNNKGTTNNKACCCTGACGGGAAAGACTATC55SEQIDNO35CAGGAGGAGTGCCAGGTGGAGMNNMNNMNNMNNMNNGATGTTGTAGTCAGACAGG55SEQIDNO36GTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCATG34SEQIDNO37GAGTTTTTGTTCGGCCTCGAGGGCCCGCAGGAGGAGTGCCAGGTGGAG48參考文獻Ausuebel，F.M.，Brent，R.，Kinston，R.E.，Moore，D.D.，Seidmann，J.G.，Smith，J.A.andStruhl，K.(1994)Currentprotocolsinmolecularbiology.JohnWiley&Sons，Inc.Berman，H.M.，Westbrook，J.，Feng，Z.，Gilliland，G.，Bhat，T.N.，Weissig，H.，Shindyalov，I.N.undBourne，P.E.(2000)TheProteinDataBank.NucleicAcidRes.，28，235-242.Blundell，T.，Lindley，P.，Miller，L.，Moss，D.，Slingsby，C.，Tickle，I.，Turnell，B.，andWistow，G.(1981).Themolecularstructureandstabilityoftheeyelensx-rayanalysisofgamma-crystallinII.Nature289，771-777.BuchbergerA，HowardMJ，ProctorM，BycroftM，NationalLibraryofMedicine，JMolBil.2001Mr16；307(1)；17-24.Butt，T.R.，Jonnalagadda，S.，Monia，B.P.，Stemberg，E.J.，Marsh，J.A.，Stadel，J.M.，Ecker，D.J.andCrooke，S.T.(1989)UbiquitinfusionaugmentstheyieldofclonedgeneproductsinEscherichiacoli.PNAS86，2540-2544.Finucane，M.D.，Tuna，M.，Lees，J.H.，andWoolfson，D.N.(1999).Core-directedproteindesign.I.Anexperimentalmethodforselectingstableproteinsfromcombinatoriallibraries.Biochemistry38，11604-11612.Finucane，M.D.，andWoolfson，D.N.(1999).Core-directedproteindesign.II.Rescueofamultiplymutatedanddestabilizedvariantofubiquitin.Biochemistry38，11613-11623.Haber，A.F.S.A.(1972).ReactionofproteinsulfhydrylgroupswithEllman′sreagent.InMethodsEnzymology，C.H.Hirs，andS.N.Timasheff，eds.，pp.457-464.Hanes，J.etal.(1997)Invitroselectionandevolutionoffunctionalproteinsbyusingribosomedisplay.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94，4937-42.Hazes，B.andHol，W.G.J.(1992)Comparisonofthehemocyaninβ-barrelwithothergreekkeyβ-barrelspossibleimportanceofthe，，β-zipper″inproteinstructureandfolding.ProteinsStruct.，Funct.Gen.12，278-298.Hemmingsen，J.M.，Gemert，K.M.，Richardson，J.S.andRichardson，D.C.(1994)Thetyrosinecomerafeatureofmostgreekkeyβ-barrelproteins.Prot.Science3，1927-1937.Herrmann，J.E.，andMorse，S.A.(1973)CouplingofperoxidasetopoliovirusantibodyCharacteristicsoftheconjugatesandtheiruseinvirusdetection.InfectionandImmunity，645-649.Jaenicke，R.(1994).Eye-lensproteinsstructure，superstructure，stability，genetics.Naturwissenschaften81，423-429.Jaenicke，R.(1996).Stabilityandfoldingofultrastableproteinseyelenscrystallinsandenzymesfromthermophiles.FasebJ10，84-92.Jaenicke，R.，andSlingsby，C.(2001).Lenscrystallinsandtheirmicrobialhomologsstructure，stability，andfunction.CritRevBiochemMolBiol36，435-499.Kumaraswamy，V.S.，Lindley，P.F.，Slingsby，C.，andGlove，I.D.(1996).Aneyelensprotein-waterstructure1.2angstromresolutionstructureofgammaB-crystallinat150K.ActaCrystallogrDBiolCrystallogr52，611.LarsenCN，WangH.，NationalLibraryofMedicine；JProteomeRes.2002Sep-Oct；1(5)411-9.Lazar，G.A.，Desjarlais，J.R.，andHandel，T.M.(1997).Denovodesignofthehydrophobiccoreofubiquitin.ProteinSci6，1167-1178.Ling，M.M.(2003).Largeantibodydisplaylibrariesforisolationofhigh-affinityantibodies.CombChemHighThroughputScreen6，421-432.Lottspeich，F.，andZorbas，H.(1998).Bioan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agtacttcctg180cggcgtggggagtaccccgactaccagcaatggatgggcctcagcgactccatccgctcc240tgctgcctcatccccccccactctggcgcttacagaatgaagatctacgacagagatgaa300ttgaggggacaaatgtcagagctcacagacgactgtctctctgttcaggaccgcttccac360ctcactgaaattcactccctcaatgtgctggagggcagctggatcctctatgagatgccc420aactacagggggaggcagtatctgctgaggccgggggagtacaggaggtttcttgattgg480ggggctccaaatgccaaagttggctctcttagacgagtcatggatttgtacgcg534<210>4<211>534<212>DNA<213>人工的<220><223>基于γ-II-晶體蛋白的Affilin-SPC1-G3的DNA序列<400>4atgggttctatcattttccttgaagaccgtgctttccagggtcgtatttacggttgcact60accgactgcccgaacctgcagccgtacttctcccgttgcaactccatcgtggttcagtcc120ggttgctggatgatctacgaacgtccgaactaccagggtcaccgtcaccagtacttcctg180cggcgtggggagtaccccgactaccagcaatggatgggcctcagcgactccatccgctcc240tgctgcctcatccccccccactctggcgcttacagaatgaagatctacgacagagatgaa300ttgaggggacaaatgtcagagctcacagacgactgtctctctgttcaggaccgcttccac360ctcactgaaattcactccctcaatgtgctggagggcagctggatcctctatgagatgccc420aactacagggggaggcagtatctgctgaggccgggggagtacaggaggtttcttgattgg480ggggctccaaatgccaaagttggctctcttagacgagtcatggatttgtacgcg534<210>5<211>549<212>DNA<213>人工的<220><223>基于γ-II-晶體蛋白的Affilin-SPC1-A7BB的DNA序列<400>5atgggtctgatctctttctctgaagaccgtgctttccagggtcgtaggtacatgtgcctg60accgactgcccgaacctgcagccgtacttctcccgttgcaactccatcaatgtttggtcc120ggttgctggatgatctacgaacgtccgaactaccagggtcaccagtacttcctgcggcgt180ggggagtaccccgactaccagcaatggatgggcctcagcgactccatccgctcctgctgc240ctcatccccccccactctggcgcttacagaatgaagatctacgacagagatgaattgagg300ggacaaatgtcagagctcacagacgactgtctctctgttcaggaccgcttccacctcact360gaaattcactccctcaatgtgctggagggcagctggatcctctatgagatgcccaactac420agggggaggcagtatctgctgaggccgggggagtacaggaggtttcttgattggggggct480ccaaatgccaaagttggctctcttagacgagtcatggatttgtacctcgagcaccaccac540caccaccac549<210>6<211>570<212>DNA<213>人工的<220><223>基于γ-II-晶體蛋白的Affilin-SPC1-A7JJ的DNA序列<400>6atgggtctgatctctttctctgaagaccgtgctttccagggtcgtaggtacatgtgcctg60accgactgcccgaacctgcagccgtacttctcccgttgcaactccatcaatgtttggtcc120ggttgctggatgatctacgaacgtccgaactaccagggtcaccagtacttcctgcggcgt180ggggagtaccccgactaccagcaatggatgggcctcagcgactccatccgctcctgctgc240ctcatccccccccactctggcgcttacagaatgaagatctacgacagagatgaattgagg300ggacaaatgtcagagctcacagacgactgtctctctgttcaggaccgcttccacctcact360gaaattcactccctcaatgtgctggagggcagctggatcctctatgagatgcccaactac420agggggaggcagtatctgctgaggccgggggagtacaggaggtttcttgattggggggct480ccaaatgccaaagttggctctcttagacgagtcatggatttgtacctcgagtgcggcggc540catcaccatcaccaccaccaccaccaccac570<210>7<211>588<212>DNA<213>人工的<220><223>基于γ-II-晶體蛋白的Affilin-SPC1-A7-Cys的DNA序列<400>7atgggtctgatctctttctctgaagaccgtgctttccagggtcgtaggtacatgtgcctg60accgactgcccgaacctgcagccgtacttctcccgttgcaactccatcaatgtttggtcc120ggttgctggatgatctacgaacgtccgaactaccagggtcaccagtacttcctgcggcgt180ggggagtaccccgactaccagcaatggatgggcctcagcgactccatccgctcctgctgc240ctcatccccccccactctggcgcttacagaatgaagatctacgacagagatgaattgagg300ggacaaatgtcagagctcacagacgactgtctctctgttcaggaccgcttccacctcact360gaaattcactccctcaatgtgctggagggcagctggatcctctatgagatgcccaactac420agggggaggcagtatctgctgaggccgggggagtacaggaggtttcttgattggggggct480ccaaatgccaaagttggctctcttagacgagtcatggatttgtacctcgagtccggcggc540ggggggggaggatcttgccatcaccatcaccaccaccaccaccaccac588<210>8<211>549<212>DNA<213>人工的<220><223>基于γ-II-晶體蛋白的Affilin-SPC7-E9的DNA序列<400>8atgggttttatctgtttcttggaagaccgtgctttccagggtcgttcttacgcttgcgat60actgactgcccgaacctgcagccgtacttctcccgttgcaactccatcagtgttctgtcc120ggttgctggatgatctacgaacgtccgaactaccagggtcaccagtacttcctgcggcgt180ggggagtaccccgactaccagcaatggatgggcctcagcgactccatccgctcctgctgc240ctcatccccccccactctggcgcttacagaatgaagatctacgacagagatgaattgagg300ggacaaatgtcagagctcacagacgactgtctctctgttcaggaccgcttccacctcact360gaaattcactccctcaatgtgctggagggcagctggatcctctatgagatgcccaactac420agggggaggcagtatctgctgaggccgggggagtacaggaggtttcttgattggggggct480ccaaatgccaaagttggctctcttagacgagtcatggatttgtacctcgagcaccaccac540caccaccac549<210>9<211>228<212>DNA<213>人工的<220><223>人泛蛋白文庫-野生型泛蛋白的DNA序列<400>9atgcagatcttcgtgaagaccctgaccggcaagaccatcactctggaggtggagcccagt60gacaccatcgaaaatgtgaaggccaagatccaagataaagaaggcattccccccgaccag120cagaggctcatctttgcaggcaagcagctggaagatggccgcactctttctgactacaac180atccagaaagagtcgaccctgcacctggtcctccgcctgaggggcggc228<210>10<211>225<212>DNA<213>人工的<220><223>修飾的泛蛋白(MUBI)<400>10atgcaaatcttcgttaaaaccctgacgggaaagactatcaccctggaggtagaaccgtcc60gacaccatcgaaaatgtcaaagctaaaatccaagacaaagaaggaattccacctgaccag120caacgcctagctttcgcaggacgacaactagaggacgggctcaccctgtctgactacaac180atccaaaaagaatccaccctccacctggcactcctcctgcgggcc225<210>11<211>225<212>DNA<213>人工的<220><223>UB10(文庫)<220><221>misc_feature<222>(4)..(5)<223>nisa，c，g，或者t<220><221>misc_feature<222>(10)..(11)<223>nisa，c，g，或者t<220><221>misc_feature<222>(16)..(17)<223>nisa，c，g，或者t<220><221>misc_feature<222>(184)..(185)<223>nisa，c，g，或者t<220><221>misc_feature<222>(187)..(188)<223>nisa，c，g，或者t<220><221>misc_feature<222>(190)..(191)<223>nisa，c，g，或者t<220><221>misc_feature<222>(193)..(194)<223>nisa，c，g，或者t<220><221>misc_feature<222>(196)..(197)<223>nisa，c，g，或者t<400>11atgnnkatcnnkgttnnkaccctgacgggaaagactatcaccctggaggtagaaccgtcc60gacaccatcgaaaatgtcaaagctaaaatccaagacaaagaaggaattccacctgaccag120caacgcctagctttcgcaggacgacaactagaggacgggctcaccctgtctgactaca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或多項的綴合物，其中所述成分(I)表現出新產生的或改變的關于與配體特異性結合的結合特性，所述配體是多肽或蛋白，優選是免疫球蛋白及免疫球蛋白衍生物，獲得于血漿的蛋白，血液凝固因子和抑制劑，生長因子，白介素，細胞因子，受體蛋白，糖蛋白，病毒蛋白和細胞表面標記，優選CD14、CD25、CD34。18.按照前述權利要求中一項或多項的綴合物，其中所述成分(I)表現出新產生的或改變的關于與配體特異性結合的結合特性，所述配體是肽，優選為親和標記，優選S-標記，T7-標記，His-標記，Strep-標記，Myc-標記或FLAG-標記，或病毒源性的肽。19.按照前述權利要求中一項或多項的綴合物，其中所述成分(I)表現出新產生的或改變的關于與配體特異性結合的結合特性，所述配體是低分子量物質，優選為類固醇、膽固醇和毒性物質諸如例如鹵代氫。20.按照前述權利要求中一項或多項的綴合物，其中所述成分(I)表現出新產生的或改變的關于與配體特異性結合的結合特性，所述配體是脂質或脂質衍生物，優選細菌脂多糖、脂質體和脂蛋白。21.按照前述權利要求中一項或多項的綴合物，其中所述成分(II)是一種或多種基于γ-晶體蛋白或泛蛋白的多肽，其與(I)相同并且共價與(I)連接，從而實現針對(I)的配體的親和性的增加由親和作用。22.按照前述權利要求中一項或多項的綴合物，其中所述成分(II)是多肽、蛋白或聚合物，成分(I)與其共價連接幾次，從而實現針對(I)的配體的親和性的增加由親和作用。23.按照前述權利要求中一項或多項的綴合物，其中所述成分(II)是多肽或聚合物，在與成分(I)共價連接后，其與這一類型的其它綴合物共價或非共價結合，從而實現針對(I)的配體的親和性的增加由親和作用。24.按照前述權利要求中一項或多項的綴合物，其中所述成分(I)是分子SPC1-A1(SEQIDNO2)，SPC1-A7(SEQIDNO3)，SPC1-G3(SEQIDNO4)，SPU11-3-A1(SEQIDNO12和13)，和SPC7-E9(SEQIDNO8)中的一種。25.制備按照前述權利要求中一項或多項的綴合物的方法，其從具有已知序列的成分(I)起始，所述方法包括下述步驟通過分析蛋白的空間結構，優選地在(I)與配體相互作用表面之外的殘基的空間結構，而鑒定適于偶聯的氨基酸殘基；通過適當的偶聯試劑活化偶聯伴侶；進行偶聯反應；分離綴合物；和檢測所述綴合物的兩種成分的功能性。26.制備按照權利要求1-24中一項或多項的綴合物的方法，其從具有已知序列的成分(I)起始，在成分(I)中沒有鑒定出適于偶聯的氨基酸殘基，所述方法包括下述步驟通過取代、插入或融合而引入適于偶聯的氨基酸殘基，優選地引入在(I)與配體相互作用的表面之外暴露于表面的殘基；檢測引入的氨基酸殘基的可及性；檢測以這種方式改變的成分(I)的功能性；通過適當的偶聯試劑活化偶聯伴侶；進行偶聯反應；分離綴合物；和檢測所述綴合物的兩種成分的功能性。27.可以按照權利要求25或26的方法制備的綴合物。28.一種診斷試劑盒，其含有按照權利要求1-24或27中一項或多項的綴合物。29.一種藥物組合物，其包括按照權利要求1-24或27中一項或多項的綴合物和藥用載體。30.一種用于親和富集的組合物，其包括按照權利要求1-24或27中一項或多項的綴合物，其中所述功能成分是膜、聚合物珠子或層析支持物質。31.按照權利要求1-24中一項或多項的綴合物、按照權利要求27的綴合物或按照權利要求28、29或30的試劑盒或組合物用于診斷、治療和親和層析的應用。全文摘要本發明涉及在一種或多種基于γ－晶體蛋白或泛蛋白的多肽分子和一種或多種功能成分之間含有共價連接鍵的綴合物。此外，本發明涉及制備這樣的綴合物的方法以及所述綴合物在診斷、治療和層析中的應用。文檔編號C12N9/00GK101084237SQ200580042536公開日2007年12月5日申請日期2005年10月11日優先權日2004年10月11日發明者埃里克·菲德勒,希爾馬·埃伯斯巴赫,托馬斯·海伊,烏爾麗克·菲德勒申請人:希爾蛋白質有限公司