生產和純化腺病毒載體的新方法

專利名稱：生產和純化腺病毒載體的新方法
技術領域：
本發明一般地涉及細胞培養和病毒生產領域。更具體而言，本發明涉及哺乳動物細胞的培養、用腺病毒感染那些細胞和由此生產感染性腺病毒顆粒的改進方法。
相關技術說明目前正通過基因療法來治療多種癌癥和遺傳病。病毒能高效地將核酸遞送至特定細胞類型，并通常避免了被感染宿主的免疫系統的檢測。這些特征使得某些病毒成為用于基因治療的基因遞送載體(vehicle)的吸引人候選者(Robbins and Ghivizzani，1998；Cristiano et al.，1998)。不能復制、因此不具備致病性的經修飾腺病毒在多種代謝病癥和腫瘤病癥中用作遞送治療基因的載體。由于DNA不被整合到宿主基因組并且轉基因表達受到限制，這些腺病毒載體可能尤其適用于最好通過瞬時治療基因表達來治療的病癥例如癌癥。腺病毒載體還可在基因置換治療中具有顯著益處，其中通過提供編碼糾正缺陷和不足的產物的置換基因的表達，來糾正該遺傳或代謝缺陷或不足。
可改良腺病毒以有效地向多種細胞類型遞送治療或報告轉基因。引起人類呼吸疾病的2型和5型重組腺病毒(分別是Ad2和AdV5)是目前正開發用于基因治療的病毒。Ad2和AdV5都屬于與人類惡性腫瘤無關的腺病毒亞型。最近，已開發出雜合腺病毒載體AdV5/F35并證明其在基因治療和相關研究中具有重要的意義(Yotnda et al.，2001)。
重組腺病毒能提供非常高水平的轉基因遞送。在多種病癥的動物模型中已經證實了這種系統在體內遞送彌補遺傳失衡的治療性轉基因的功效(Watanabe，1986；Tanzawa et al.，1980；Golasten et al.，1983；Ishibashi et al.，1993；and S.Ishibashi et al.，1994)。實際上，編碼囊性纖維化跨膜傳導調節因子(CFTR)的cDNA的重組復制缺陷型腺病毒已經被批準用于至少兩種人類CF臨床試驗(Wilson，1993)。Hurwitz，etal.，(1999)已顯示了腺病毒介導的基因治療在癌癥(視網膜母細胞瘤)鼠模型中的治療效力。
隨著臨床試驗的進展，對臨床級腺病毒載體的需求急劇增加。預計300例患者臨床試驗的年需求可達約6×1014PFU。
傳統上，可在市售的組織培養瓶或“細胞工廠”中生產腺病毒。腺病毒載體的生產通常在提供培養表面用于HEK293細胞貼壁的培養設備例如T型瓶中進行。收集并凍融被病毒感染的細胞，使得以粗制細胞裂解物形式從細胞中釋放病毒。然后通過雙CsCl梯度超速離心法純化制得的粗制細胞裂解物(CCL)。典型報道的從100個單盤細胞工廠中生產的病毒為約6×1012PFU。顯然，采用這種傳統方法生產所需量的病毒行不通。為了滿足增加的需求，必須開發新的規模化并可驗證的生產和純化方法。
CsCl梯度超速離心法的純化生產能力有限制，使得其不能滿足對基因治療應用的腺病毒載體的需求。因此，為了實現大規模生產腺病毒載體，必須開發除CsCl梯度超速離心法以外的純化方法。盡管層析法被廣泛用于純化重組蛋白質，但是有關病毒層析純化的報道非常有限。已經評估了體積排阻層析、離子交換層析以及親和層析在純化逆轉錄病毒、蜱傳腦炎病毒和植物病毒中的性能，有過不同程度地成功(Crooks，et al.，1990；Aboud，et al.，1982；McGrath et al.，1978，Smith and Lee，1978；O′Neil and Balkovic，1993)。對于采用層析純化腺病毒的研究更少。這種研究活力的缺乏可能部分地歸因于存在雖然不可規模化，但卻有效的CsCl梯度超速離心純化腺病毒的方法。
近來，Huyghe et al.(1996)報道了采用離子交換層析結合金屬螯合親和層析來純化腺病毒載體。已報道了與CsCl梯度超離心相似的病毒純度。不幸的是，雙柱純化法后，僅僅回收到23％的病毒。造成這種病毒低回收的方法因素是，作者為了從細胞中釋放病毒而采用冷凍/融化步驟來裂解細胞以及雙柱純化步驟。對本發明有益的是共有的美國公開專利申請No.2004/0106184 A1的公開內容，其公開內容通過引用作為參考，所述公開內容涉及使腺病毒顆粒制備物通過層析介質來提供純化的腺病毒顆粒的方法。
對于大多數E1缺失型第一代腺病毒載體，采用反式彌補腺病毒載體E1缺失的HEK293(人胚腎細胞，Invitrogen Corp)細胞進行生產。由于HEK293細胞的貼壁依賴型，通常在提供培養表面用于HEK293細胞附著的培養設備例如T型瓶、多層CellfactoriesTM和大規模CellCubeTM生物反應器系統中生產腺病毒載體。近來，已調整了HEK293細胞，使之適應在多種無血清培養基中進行懸浮培養，從而在懸浮生物反應器中生產腺病毒載體。很難大規模地在病毒感染時采用離心進行完全介質更換。此外，外部過濾設備必需的與介質再循環相關的剪切應力可能在無蛋白質介質中對宿主細胞具有害作用。
對本發明有意義的是共有的美國專利No.6,194,191和共有的美國專利No.6,726,907的公開內容，其公開內容通過引用作為參考，所述公開內容涉及改進的Ad-p53生產方法，其中采用生長在無血清條件下、尤其是無血清懸浮培養中的細胞。對本發明還有意義的是基于美國系列號No.09/203,078的WO 00/32754的公開內容，其公開內容通過引用作為參考，所述公開內容涉及低培養基灌注速率在貼壁細胞培養系統中的用途。
顯然，為了滿足仍在增長的對這樣的腺病毒載體產物的需求，需要能高產率回收產物進行腺病毒載體生產的改進方法。腺病毒載體生產的改進方法可包括改進的技術使得生產更有效或操作條件的最優化以增加腺病毒載體生產。

發明內容
本發明涉及生產純化的病毒組合物的方法，所述病毒組合物包含純度足夠用于治療施用而不需要精細純化步驟的腺病毒組合物。更具體而言，本發明涉及大小分配純化技術可用于提供足夠純度的腺病毒制備物這一發現，所述腺病毒制備物可以進行治療性施用而不需要另外的純化步驟，例如層析法和其它先前認為是必需的方法。本發明不希望被任何特定理論約束，認為在無血清培養基的細胞懸浮培養物中處理病毒宿主細胞的步驟將得到污染物負載降低的病毒顆粒產物。此外，污染物具有的大小和性質使得它們能通過簡單的大小分配純化步驟容易地將它們與病毒顆粒分離開。
生產純化的腺病毒制備物而不需要傳統層析純化步驟的能力提供了顯著改進的病毒產率并且降低了成本。
尤其是，本發明提供從含病毒的組合物中去除污染物的方法，其中包括得到含有選定病毒和不合需要的污染物的含水組合物，采用具有可截留病毒并允許污染物通過以去除污染物的分配孔的大小分配膜使所述含水組合物經過大小分配純化，由此提供純化的病毒組合物。當然，優選根據待截留病毒的大小來選擇分配孔的大小，因此可選擇具有比病毒足夠小的孔或包含尺寸(inclusion size)的膜，以便截留病毒并允許污染物通過。相似地，如果所述孔或包含尺寸太小，可能截留一些不合需要的污染物。因此，最優化的孔大小是截留大多數病毒而允許大多數污染物通過的尺寸。通常，病毒的大小以及相應的建議優選的孔徑如下面表1所示。
表1

在特定實施方案中，本發明提供生產純化的腺病毒組合物的方法，其包括以下步驟a)在培養基中培養宿主細胞；b)向所述宿主細胞提供營養物；c)用腺病毒感染所述宿主細胞；d)裂解所述宿主細胞以提供包含腺病毒的細胞裂解物；和e)采用大小分配膜通過大小分配純化法從所述裂解物中純化腺病毒以提供純化的腺病毒組合物。
當病毒是腺病毒、慢病毒、腺伴隨病毒、逆轉錄病毒或皰疹病毒時，可使用本發明的方法。
本發明特別優選的方法是其中所述大小分配膜為切向流過濾設備的方法。
根據本發明的一個方面，所述大小分配膜是多孔過濾器。更具體而言，所述大小分配膜可以是透析膜。所述大小分配膜優選孔徑小于約0.08微米并且大于約0.0001微米。尤其優選孔徑小于0.05微米并且大于0.0001微米的大小分配膜和孔徑小于0.02微米并且大于0.0001微米的大小分配膜。對于例如腺伴隨病毒(AAV)的病毒，孔徑小于0.01微米并大于0.0001微米是優選的。
根據本發明的一個方面，可采用凝膠過濾純化進行大小分配純化。然而，因為凝膠過濾大小分配使得體積顯著增加并且稀釋了病毒制備物，并不優選這種方法。這樣必須重新濃縮這種稀釋的制備物，而重濃縮較昂貴且不合需要)。
根據本發明的一個方面，可不使用另外的純化步驟例如離子交換層析而將病毒純化到藥學可接受的程度。藥學可接受的程度是指基本上無動物源成分并且如SDS-PAGE凝膠上所示無其它蛋白質雜質，從而不影響所述產物的人類臨床用途。作為本發明的另一個方面，純化的腺病毒組合物的純度是每1毫升劑量中污染DNA少于10納克。
根據本發明的優選方面，從單個培養制備物中得到至少5×1015個病毒顆粒，更優選1×1016個病毒顆粒。
宿主細胞優選能在無血清培養基中生長，并生長在無血清培養基中。根據這種方法，可通過逐步減少生長培養基中胎牛血清含量而使宿主細胞適應在無血清培養基中生長。優選的宿主細胞是HEK293細胞。所述宿主細胞可至少部分時間生長在灌注室、生物反應器、柔性床平臺(flexible bed platform)上或通過補料分批培養。根據一種方法，用含葡萄糖的培養基以提供大于0.5g/L的葡萄糖濃度的速率灌注細胞，并且以提供約0.7～1.7g/L葡萄糖濃度的速率進行灌注是特別優選的。所述細胞可作為細胞懸浮培養物生長，或可選擇地作為貼壁依賴性培養物生長。
可通過包括低滲溶液、高滲溶液、沖擊射流、微流化、固體剪切、去污劑、液體剪切、高壓擠出、自溶或超聲處理的方法裂解宿主細胞。適當的去污劑包括市售的去污劑如Thesit、NP-40、Tween-20、Brij-58、Triton X-100和辛基葡萄糖苷。根據本發明的一個方面，裂解液中去污劑的存在濃度是約1％(w/v)。然后可用核酸酶例如市售的Benzonase或Pulmozym處理細胞裂解物。
根據本發明的一個方面，所述病毒顆粒意欲用于基因治療。因此，所述病毒顆粒是包含編碼外源基因構建物的腺病毒載體的腺病毒。根據本發明的又一個方面，所述基因構建物可操作地與啟動子連接。適當的啟動子包括選自SV40 IE、RSV LTR、β-肌動蛋白、CMV IE、腺病毒主要晚期、多瘤病毒(polyoma)F9-1或酪氨酸酶基因啟動子中的那些。
外源性基因構建物可編碼治療基因。這樣的基因是本領域技術人員公知的，包括但不限于編碼反義ras、反義myc、反義raf、反義erb、反義src、反義fms、反義jun、反義trk、反義ret、反義gsp、反義hst、反義bcl、反義abl、Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶和p53的那些基因。
優選的病毒載體包括腺病毒載體，尤其是其中腺病毒是非復制型腺病毒的那些。這樣的非復制型腺病毒載體包括缺少至少E1-區部分的腺病毒，并且至少缺少E1A和/或E1B區部分的那些是特別優選的。根據一種方法，在能夠提供互補復制能力的宿主細胞中生產非復制型腺病毒。本發明描述了一種生產和純化腺病毒的新方法。這種新的生產方法不僅提供了規模化和可驗證性，并且提供了很好的病毒純度。
在本發明的優選實施方案中，所述腺病毒包含編碼外源基因構建物的腺病毒載體。在某些實施方案中，所述基因構建物可操作地與啟動子連接。在具體實施方案中，所述啟動子是SV40 IE、RSV LTR、β-肌動蛋白或CMV IE、腺病毒主要晚期、多瘤病毒F9-1或酪氨酸酶基因啟動子。在本發明的具體實施方案中，所述腺病毒是非復制型腺病毒。在另外的實施方案中，所述腺病毒至少缺少E1區部分。在某些方面，所述腺病毒至少缺少E1A和/或E1B區部分。在另外的實施方案中，所述宿主細胞具有互補復制的能力。在特別優選的實施方案中，所述宿主細胞是HEK293細胞。
在本發明的優選實施方案中，預期所述外源基因構建物編碼治療基因。例如，所述治療基因可編碼反義ras、反義myc、反義raf、反義erb、反義src、反義fms、反義jun、反義trk、反義ret、反義gsp、反義hst、反義bcl、反義abl、Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶或p53。
在本發明的某些方面，可以收集所述細胞并采用低滲溶液、高滲溶液、冷凍-融化、超聲處理、沖擊射流、微流化或去污劑異位(ex situ)裂解所述細胞。在另外的方面，收集所述細胞并采用低滲溶液、高滲溶液或去污劑原位裂解所述細胞。在此所用的術語“原位”是指將細胞定位在例如CellCubeTM的組織培養裝置內，“異位”是指將所述細胞從組織培養裝置中移出。
在具體實施方案中，采用去污劑裂解并收集所述細胞。在優選的實施方案中，所述去污劑可以是Thesit、NP-40、Tween-20、Brij-58、Triton X-100和辛基葡萄糖苷。在本發明的另外方面，通過被感染細胞的自溶實現裂解。在更具體的實施方案中，所述去污劑以約1％(w/v)的濃度存在于裂解溶液中。在本發明的某些另外的方面，用Benzonase或Pulmozym處理所述細胞裂解物。
在具體實施方案中，所述方法進一步包括運用膜過濾的濃縮步驟。在具體實施方案中，所述過濾是切向流過濾。在優選實施方案中，所述過濾可采用100到1000K的NMWC、再生纖維素或聚醚砜膜。
本發明還提供根據包括以下步驟的方法生產的腺病毒，這些步驟包括在培養基中培養宿主細胞，用腺病毒感染所述宿主細胞，收集并裂解所述宿主細胞以產生粗制細胞裂解物，濃縮粗制細胞裂解物，更換粗制細胞裂解物的緩沖液以及降低粗制細胞裂解物中污染核酸的濃度。
在又一個實施方案中，本發明提供純化腺病毒的方法，其包括以下步驟在無血清培養基中培養宿主細胞，用腺病毒感染所述宿主細胞，收集并裂解所述宿主細胞以產生粗制細胞裂解物，濃縮粗制細胞裂解物，更換粗制細胞裂解物的緩沖液以及降低粗制細胞裂解物中污染核酸的濃度。在優選實施方案中，所述細胞可獨立地作為細胞懸浮培養物或貼壁依賴性培養物培養。
在具體實施方案中，使宿主細胞適應在無血清培養基中生長。在更優選的實施方案中，使宿主細胞適應在無血清培養基中生長包括逐步減少生長培養基中胎牛血清含量。更具體而言，無血清培養基包含的胎牛血清含量小于0.03％v/v。
本發明還預期根據包括以下步驟的方法生產的腺病毒，這些步驟包括在無血清培養基中培養宿主細胞，用腺病毒感染所述宿主細胞，收集并裂解所述宿主細胞以產生粗制細胞裂解物，濃縮所述粗制細胞裂解物，更換粗制細胞裂解物的緩沖液以及降低所述粗制細胞裂解物中污染核酸的濃度。
本發明進一步提供針對在無血清培養基中生長進行適應的293宿主細胞。在某些方面，針對在無血清培養基中生長進行的適應包括逐步減少生長培養基中胎牛血清含量。在具體實施方案中，所述細胞適應了在懸浮培養物中生長。在具體實施方案中，本發明的所述細胞被命名為IT293SF細胞。將這些細胞保藏在美國組織培養物保藏中心(AmericanTissue Culture Collection)(ATCC)以滿足國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約。由Shuyuan Zhang博士代表IntrogenTherapeutics，Inc.(Houston，Tex.)，于1997年11月17日保藏所述細胞。IT293SF細胞系來源于本文描述的對無血清懸浮培養適應的293細胞系。所述細胞可以在補充100mg/L肝素和0.1％Puronic F-68的IS293無血清培養基(Irvine Scientific.Santa Ana，Calif.)中培養，并允許進行人腺病毒感染。
通過下面的詳細說明，本發明另外的目的、特征和優點將變得顯而易見。然而，應當理解，僅僅以舉例說明方式給出指示本發明優選實施方案的詳細說明和具體實施例，通過詳細說明，本發明精神和范圍內的多種變化和改動對于本領域技術人員將變得更加顯而易見。
本發明另外的實施方案涉及生產腺病毒的方法，其包括(1)制備腺病毒制備物，包括步驟在生物反應器中在培養基內培養宿主細胞，用新鮮的培養基和腺病毒稀釋所述宿主細胞開始病毒感染；和(2)從腺病毒制備物中分離腺病毒。本領域技術人員公知的能支持宿主細胞生長的任何生物反應器能用于本發明。在本說明書的下述其它部分展示了對多種類型生物反應器的詳細討論。
根據本發明的一個方面，無血清培養基優選結合生物反應器使用，只要所述培養基能支持生物反應器中的細胞生長即可。在另外的實施方案中，所述培養基是無蛋白質的培養基。在一些實施方案中，所述培養基是CD293培養基(Invitrogen Corp.TM)。在本發明的實施方案中，宿主細胞可以作為貼壁依賴性培養物或非貼壁依賴性(懸浮)培養物生長。
在涉及需要生物反應器來生產腺病毒的方法的本發明實施方案中，本發明可采用本領域技術人員公知的任何生物反應器。例如，在某些實施方案中，所述生物反應器包括采用平面平臺的軸向擺動引起所述生物反應器內波動的生物反應器。在某些實施方案中，在宿主細胞所定位的滅菌聚乙烯袋內引起波動。在又一個實施方案中，所述生物反應器是一次性(disposable)生物反應器。任何尺寸的生物反應器可用于本發明。例如，所述生物反應器可以是10L、20L、高達200L或更大的生物反應器。此外，所述生物反應器可以是市售的生物反應器。例如，所述生物反應器可以是Wave Bioreactor(Wave Biotech，LLC，Bedminster，NJ)。根據本發明的一個方面，具有8L工作體積的20L Wave Bioreactor可用于培養被天然的p53基因轉化的腺病毒載體。可在感染后第2天用Tween-20收集培養物，產率為2.3×1011個病毒顆粒/mL或230,000個病毒顆粒/細胞。在這樣的產率下，預計200L的生物反應器可產生約2×1016個vp。
在涉及生產腺病毒的方法的本發明實施方案中，預計可通過本領域技術人員公知的任何技術監測或測量細胞培養的操作條件。這樣的可被監測的條件的實例包括培養基的pH值和培養基的溶氧壓。
在涉及生產腺病毒的方法的本發明實施方案中，預計可通過本領域技術人員公知的任何技術監測或測量細胞培養的操作條件。這樣的可被監測的條件的實例包括培養基的pH值和培養基的溶氧壓。
涉及生產腺病毒的方法的本發明一些實施方案還包括通過本領域技術人員公知的任何方法加工和處理所述培養基。例如，在本發明的某些實施方案中，生產腺病毒的方法包括通過過濾器灌注培養基。所述過濾器可以是生物反應器系統內置的過濾器，或是被整合到生物反應器外部的過濾器。在某些實施方案中，所述過濾器是漂浮式平面過濾器。所述漂浮式平面過濾器可用于從生物反應器中除去已被消耗的培養基。本領域技術人員公知的任何方法可用于監測并維持培養基體積。在一些實施方案中，通過引起新鮮培養基添加的負載小室(load cell)來維持培養體積。
在本發明的實施方案中，可以將培養基灌注到宿主細胞的培養物中，或可以不將培養基灌注到宿主細胞的培養物中。在本發明的一些實施方案中，在宿主細胞生長的第3天開始灌注培養基。本領域中技術人員熟悉寬范圍的可將培養基灌注到細胞培養系統中的技術和設備。
在涉及生產腺病毒的方法的本發明實施方案中，用新鮮培養基稀釋宿主細胞的步驟可以與腺病毒感染步驟相組合。基于的是發明人的如下發現，即可有效地合并這兩個步驟以提供腺病毒載體的極高產率。本發明可采用本領域技術人員公知的任何稀釋方法。在某些實施方案中，用新鮮培養基和腺病毒將宿主細胞稀釋2到50倍。在另外的實施方案中，用新鮮培養基和腺病毒將宿主細胞稀釋10倍。
在涉及生產腺病毒的方法的本發明實施方案中，可通過本領域技術人員公知的任何方法開始宿主細胞的病毒感染。例如，在包括使用生物反應器的本發明實施方案中，病毒感染可發生在另一生物反應器中。例如，可通過添加20到100個vp/宿主細胞完成宿主細胞的病毒感染。在某些另外的實施方案中，病毒感染包括添加約50個vp/宿主細胞。病毒感染可允許進行任何持續時間。本領域技術人員熟悉涉及監測病毒感染進程的技術。在本發明的某些實施方案中，允許病毒感染進行約4天。
在本發明的某些其他實施方案中，在病毒感染完成后約4天從腺病毒制備物中分離腺病毒。
在涉及生產腺病毒的本發明實施方案中，可采用宿主細胞。只要細胞能支持腺病毒復制，任何細胞類型都可用作宿主細胞。本領域技術人員熟悉寬范圍的可用于由宿主細胞生產腺病毒的宿主細胞。例如，在本發明的一些實施方案中，所述宿主細胞可對復制缺陷型腺病毒的生長提供互補。復制缺陷型腺病毒可以是至少缺少E1-區部分的腺病毒，或至少缺少E1A和/或E1B區部分的腺病毒。例如，所述宿主細胞可以是293、HEK293、PER.C6,911和IT293SF細胞。在本發明的某些實施方案中，宿主細胞是HEK293細胞。
在本發明的一些實施方案中，腺病毒是重組腺病毒。例如，所述重組腺病毒可編碼可操作性地連接啟動子的重組基因。可使用本領域技術人員公知的任何啟動子，只要所述啟動子能起到啟動子的功能即可。例如，在某些實施方案中，所述啟動子是SV40 IE、RSV LTR、β-肌動蛋白、CMV-IE、腺病毒主要晚期、多瘤病毒F9-1或酪氨酸酶啟動子。
在腺病毒是編碼重組基因的腺病毒的本發明實施方案中，任何重組基因，尤其是治療基因，可用于本發明。例如，所述重組基因可選自反義ras、反義myc、反義raf、反義erb、反義src、反義fms、反義jun、反義trk、反義ret、反義gsp、反義hst、反義bcl、反義abl、Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶、mda7，fus、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、ADP(腺病毒死亡蛋白)或p53。在一些實施方案中，所述重組基因是p53基因。在另外的實施方案中，所述重組基因是mda-7基因。
在本發明的一些實施方案中，所述重組基因是反義ras、反義myc、反義raf、反義erb、反義src、反義fms、反義jun、反義trk、反義ret、反義gsp、反義hst、反義bcl、反義abl、Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶、mda7、fus、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、ADP、p53、ABLI、BLC1、BLC6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS2、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MII、MYB、MYC、MYCI1、MYCN、NRAS、PTM1、PMT、RET、SRC、TAL1、TCL3、YES、MADH4、RB1、TP53、WT1、TNF、BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、ApoAI、ApoAIV、ApoE、Rap1A、胞嘧啶脫氨酶、Fab、ScFv、BRCA2、zac1、ATM、HIC-I、DPC-4、FHIT、PTEN、ING1、NOEY1、NOEY2、OVCA1、MADR2、53BP2、IRF-1、Rb、zac1、DBCCR-1、rks-3、COX-1、TFPI、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、VEGF、FGF、血小板反應蛋白、BAI-1、GDAIF或MCC。
在本發明的另外實施方案中，所述重組基因是編碼ACP去飽和酶、ACP羥化酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、ATP酶、醇脫氫酶、淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、過氧化氫酶、纖維素酶、環氧化酶、脫羧酶、糊精酶、酯酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、透明質酸合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、GTP酶、解旋酶、半纖維素酶、透明質酸酶、整合酶、轉化酶、異構酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂氧合酶、裂解酶、溶菌酶、果膠酯酶、過氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶(peptidease)、普魯蘭酶(pullanase)、重組酶、逆轉錄酶、拓撲異構酶、木聚糖酶、報告基因、白細胞介素或細胞因子的基因。
在本發明的另外實施方案中，所述重組基因是編碼氨基甲酰合成酶I型、鳥氨酸氨甲酰轉移酶、精氨基琥珀酸合成酶、精氨基琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羥化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受體、膽色素原脫氨酶、因子VIII、因子IX、胱硫醚β-合酶、支鏈酮酸脫羧酶、白蛋白、異戊酰-CoA脫氫酶、丙酰CoA羧化酶、甲基丙二酰CoA歧化酶、戊二酰CoA脫氫酶、胰島素、β-葡萄糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脫羧酶、H-蛋白、T-蛋白、Menkes病銅轉運ATP酶、Wilson病銅轉運ATP酶、胞嘧啶脫氨酶、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶、苯丙氨酸羥化酶、葡萄糖腦苷脂酶、鞘磷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、HSV胸苷激酶或人胸苷激酶的基因。作為替代，所述重組基因可編碼生長激素、催乳素、胎盤催乳素、黃體生成素、促卵泡激素、絨毛膜促性腺激素、促甲狀腺素、瘦蛋白、促皮質素、血管緊張素I、血管緊張素II、β-內啡肽、β-黑素細胞刺激素、膽囊收縮素、內皮素I、甘丙肽、腸抑胃肽、胰高血糖素、胰島素、促脂解素、神經垂體素運載蛋白、生長抑素、降鈣素、降鈣素基因相關肽、β-降鈣素基因相關肽、惡性腫瘤因子的高血鈣(hypercalcemia of malignancy factor)、甲狀旁腺激素相關蛋白、甲狀旁腺激素相關蛋白、胰高血糖素樣肽、胰抑制素、胰多肽(pancreatic peptide)、YY肽、PHM、促胰液素、血管活性腸肽、催產素、加壓素、加壓催產素、腦啡肽酰胺(enkephalinamide)、metorphinamide、α-促黑素細胞激素、心鈉素、支鏈淀粉、淀粉樣蛋白P組分、促腎上腺皮質激素釋放激素、生長激素釋放因子、黃體激素釋放激素、神經肽Y、K物質、P物質或促甲狀腺激素釋放激素。
本發明的某些實施方案涉及從腺病毒制備物中分離腺病毒來生產腺病毒的方法。本領域技術人員公知的從腺病毒制備物中分離腺病毒的任何方法均適用于本發明。在本發明的某些實施方案中，在感染后但是在被腺病毒裂解之前收集宿主細胞，并通過冷凍-融化、自溶或去污劑裂解來裂解宿主細胞。在本發明的另外某些實施方案中，生產腺病毒的方法包括降低腺病毒制備物中污染核酸的濃度。
在本發明的某些實施方案中，將分離的腺病毒置于藥學可接受的組合物中。本領域技術人員熟悉應用于制備藥學可接受組合物的廣泛方法和技術。本發明預期可以將腺病毒配制于其中的任何藥物組合物。例如，本發明的某些實施方案涉及用于口服施用、局部施用或靜脈內施用的腺病毒藥物制劑。
本發明的一些實施方案包括分析病毒產量。例如，可采用HPLC分析病毒產量。技術人員公知的任何用于分析病毒產量的技術可適用于本發明。
在本發明的一些實施方案中，上述以及本說明書另外部分中公開的生產腺病毒的方法涉及分離和純化腺病毒的方法，所述方法包括得到具有一種或多種下述性質的純化的腺病毒組合物(1)病毒滴度為1×109～約1×1013pfu/ml；(2)病毒顆粒濃度為約1×1010～約2×1013個顆粒/ml；(3)顆粒pfu比例為約10～約60；(4)每1×1012個病毒顆粒中BSA小于50ng；(5)每1×1012個病毒顆粒中污染的人DNA為約50pg～1ng；(6)單個HPLC洗脫峰基本上由97～100％的峰下面積組成。在某些實施方案中，根據上述步驟制備的腺病毒組合物含有5×1014～1×1018個病毒顆粒。在另外的實施方案中，所述組合物是藥學可接受的組合物。


下述附圖構成本說明書的一部分，并且包括在說明書中來進一步證明本發明的某些方面。結合本文呈現的具體實施方案的詳細說明，通過參考這些附圖中的一個或多個可以更好地理解本發明。
圖1表示單獨采用切向流過濾(TFF)滲濾和采用TFF滲濾與層析純化相結合來生產和純化腺病毒的流程圖；圖2(掃描圖)表示對切向流過濾(TFF)純化的病毒(1-5條帶)和通過采用層析柱的傳統方法純化的病毒的分析；圖3表示灌注型生物反應器系統的圖表；圖4表示細胞生長以及存活與培養天數的關系曲線。
圖5表示灌注培養中葡萄糖和乳酸鹽濃度(g/L)與培養天數的關系曲線。
圖6表示通過CellCube和Wave生物反應器方法生產的病毒產物的基因表達比較。
具體實施例方式
已經顯示腺病毒載體可成功地用在真核基因表達和疫苗開發中。近來，動物研究已證實重組腺病毒可用于基因治療。向不同組織施用重組腺病毒的成功研究已證明了腺病毒載體在治療中的功效。這個成功引起在人臨床試驗中使用這樣的載體。現在，可用于多種治療的腺病毒載體的生產需求仍在增加。目前可用的技術不足以滿足這樣的需求。本發明提供大量生產用于這樣治療的腺病毒的方法。
因此，本發明被設計成利用大規模培養系統以及純化方面的改進來生產和純化腺病毒載體。下面詳細闡述這種系統的多種組分和以其生產腺病毒的方法。
A.腺病毒腺病毒包含線性雙鏈DNA，其中基因組大小為30～35kb(Reddy et al.，1998；Morrison et al.，1997；Chillon et al.，1999)。有50種以上的人腺病毒血清型和80種以上的相關形式，根據免疫學、分子和功能標準將它們分成6個家族(Wadell et al.，1980)。外形上，腺病毒是中等大小的二十面體病毒，其含有雙鏈線性DNA基因組，對于腺病毒5型是35,935個堿基對(Chroboczek et al.，1992)。腺病毒需要進入宿主細胞，并向細胞核轉運病毒基因組來感染細胞以及復制病毒。腺病毒基因組的突出特點是早期區(E1、E2、E3和E4基因)、中期區(PIX基因、Iva2基因)、晚期區(L1、L2、L3、L4和L5基因)、主要晚期啟動子(MLP)、反向末端重復序列(ITR)和ψ序列(Zheng，et al.，1999；Robbins et al.，1998；Graham andPrevec，1995)。早期基因E1、E2、E3和E4在感染后由病毒表達，并編碼調節病毒基因表達、細胞基因表達、病毒復制和細胞凋亡抑制的多肽。在病毒感染期間，進一步地MLP被激活，導致晚期基因(L)的表達，所述晚期基因編碼腺病毒包殼所需要的多肽。中期區編碼腺病毒殼體組分。腺病毒反向末端重復序列(ITRs；長度100～200bp)是順式元件，它起到復制起始位點作用并且是病毒DNA復制所必需的ψ序列是腺病毒基因組包裝所必需的。
已經廣泛研究了腺病毒(尤其是血清型2和5的腺病毒)感染的機制。已經確認命名為CAR(柯薩奇病毒-腺病毒受體)的宿主細胞表面蛋白質是這些腺病毒的主要結合受體。但是還沒有闡明CAR的內源細胞功能。纖突結(fiber knob)和CAR之間的相互作用足夠將腺病毒結合到細胞表面。然而，隨后的五鄰體基底和另外的細胞表面蛋白質、αv整合素家族成員之間的相互作用是有效的病毒內化所必需的。在內化期間腺病毒開始解裝配；纖維蛋白質保留在結合CAR的細胞表面。腺病毒的剩余部分隨病毒顆粒通過細胞質被轉運到核膜的孔復合體上而以循序漸進方式分解。病毒DNA通過核膜被排除到核內，在此復制病毒DNA、表達病毒蛋白質并組裝新的病毒顆粒。這種腺病毒感染機制的特定步驟可能是調節病毒感染和基因表達的潛在靶標。
在本發明的某些實施方案中，在生產腺病毒的方法中使用的腺病毒可以是復制缺陷型腺病毒。例如，所述腺病毒可以是至少缺少E1區部分的復制缺陷型腺病毒。在某些實施方案中，所述腺病毒可至少缺少E1A和/或E1B區部分。在另外的實施方案中，所述腺病毒是重組腺病毒(下面進一步討論)。
B.宿主細胞本發明的多種實施方案包括生產腺病毒的方法。“宿主細胞”被定義為能支持腺病毒復制的細胞。可用作宿主細胞的任何細胞類型可用于本發明，只要所述細胞能支持腺病毒復制。例如，所述宿主細胞可以是HEK293、PER.C6,911或IT293SF細胞。本領域技術人員熟悉寬范圍的可用于生產腺病毒的方法中的宿主細胞。
在某些實施方案中，腺病毒載體的產生和增殖依賴于獨特的輔助細胞系，被命名為293，其是通過腺病毒血清型5(Ad5)DNA片段由人胚腎細胞轉化的，并且組成性表達E1蛋白質(Graham et al.，1977)。由于E3區是Ad基因組不必要的(Jones and Shenk，1978)，現有的Ad載體，在293細胞的幫助下，可以在E1區、E3區或在這兩個區均攜帶外源DNA(Graham and Prevec，1991；Bett et al.，1994)。
用于本發明多種實施方案的宿主細胞例如可來源于哺乳動物細胞例如人胚腎細胞或靈長類細胞。另外的細胞類型可包括但不限于Vero細胞、CHO細胞或建立了組織培養技術的任何真核細胞，只要所述細胞是腺病毒許可性的即可。術語“腺病毒許可性的”是指腺病毒或腺病毒載體能在細胞環境內完成整個細胞內病毒生命周期。
宿主細胞可來源于現有的細胞系例如293細胞系或從頭建立的細胞系。這樣的宿主細胞表達對腺病毒基因組中的缺失反式互補所必需的腺病毒基因或支持原本為缺陷型的腺病毒載體(例如E1、E2、E4、E5)的復制和晚期功能的腺病毒基因。腺病毒基因組的特定部分，E1區，已經用于產生補充細胞系。不論是整合型還是附加型，當導入到細胞系中時，缺少病毒復制起點的腺病毒基因組部分甚至在細胞被野生型腺病毒超感染時也不能復制。此外，由于主要晚期單元的轉錄是在病毒DNA復制后，腺病毒的晚期功能不能充分地被細胞系表達。因此，與晚期功能(L1-5)重疊的E2區將由輔助病毒提供而不是細胞系提供。典型地，根據本發明的細胞系將表達E1和/或E4。
表達部分腺病毒基因組的宿主細胞，即重組宿主細胞，也可用作本發明的宿主細胞。本文所用的術語“重組”細胞是指已經導入基因，例如來自腺病毒基因組或來自另外一種細胞的基因的細胞。因此，重組細胞不同于不含有重組導入的基因的天然細胞。因此，重組細胞是含有通過“人為”引入的一個或多個基因的細胞。
重組宿主細胞系能支持腺病毒重組載體和具有某些腺病毒基因缺陷的輔助病毒的復制，即“許可”這些病毒和載體的生長。所述重組細胞還指能夠對非復制型腺病毒載體中的缺陷進行互補和支持非復制型腺病毒載體復制的輔助細胞。
可與有復制能力的病毒一起使用或轉變成互補性宿主細胞與復制缺陷型病毒一起使用的其它有用的哺乳動物細胞系實例是Vero細胞和HeLa細胞，以及中國倉鼠卵巢細胞、W138、BHK、COS-7、HepG2、3T3、RIN和MDCK細胞的細胞系。
已經采用兩種方法使293細胞適應懸浮培養。Graham在裸鼠中通過3次傳代使293A細胞適應懸浮培養(293N3S細胞)(Graham，1987)。發現懸浮293N3S細胞能支持E1-腺病毒載體。然而，Garnier et al.(1994)觀察到293N35細胞在懸浮中具有相對長的初始停滯期，低生長速率和強烈傾向于聚團。
已經采用的第二個方法是使293A細胞逐步適應懸浮生長(ColdSpring Harbor Laboratories，293S細胞)。Gamier et al.(1994)報道了采用293S細胞從腺病毒載體中生產重組蛋白質。所述作者發現293S細胞在無鈣培養基中更少聚團，并在病毒感染時更換新鮮培養基可顯著增加蛋白質產量。發現葡萄糖是無培養基更換的培養中的限速因子。
1.在選擇性培養基中生長在某些實施方案中，運用排除不需要的細胞的生長的選擇性體系可能是有用的。這可借助永久地用可選擇標記物轉化細胞系或用編碼可選擇標記物的病毒載體轉導或感染細胞系來完成。在任一種情況下，用適當的藥物或選擇性化合物進行轉化/轉導細胞的培養將導致細胞群體中攜帶所述標記物的那些細胞的增加。
標記物的實例包括但不限于分別在tk-、hgprt-或aprt-細胞中的HSV胸苷激酶、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶和腺嘌呤磷酸核糖轉移酶基因。而且，抗代謝物抗性可用作選擇賦予甲氨蝶呤抗性的dhfr、賦予霉酚酸抗性的gpt、賦予氨基糖苷G418抗性的neo、賦予潮霉素抗性的hygro的基礎。
2.斷血清生長貼壁依賴型細胞向無血清懸浮培養的斷血清適應已經被用于生產重組蛋白質(Berg，1993)和病毒疫苗(Perrin，1995)。直到最近，對293細胞適應無血清懸浮培養的報道依然很少。Gilbert報道了293細胞向無血清培養的適應過程用于生產腺病毒和重組蛋白質(Gilbert，1996)。相似的適應方法已經用于使A549細胞適應無血清懸浮培養來生產腺病毒(Morris etal.，1996)。然而，在經過適應的懸浮細胞中細胞特異性病毒的產率低于貼壁母細胞達到的產率的約5～10倍。
采用相似的斷血清方法，本發明人已經成功地使293A細胞適應無血清懸浮培養(293SF細胞)。在這個過程中，通過逐步降低T培養瓶中FBS濃度，使293細胞適應于市售293培養基。簡要地，培養基中初始血清濃度為T-75培養瓶中含有約10％FBS DMEM培養基，通過逐步降低培養基中FBS濃度，使所述細胞適應于T培養瓶中無血清IS293培養基。在T-75培養瓶中傳代6次后，估計FBS％為約0.019％和293細胞。將所述細胞在T培養瓶中再傳代培養兩次，然后將細胞移入旋轉角瓶。本文下面描述的結果顯示細胞良好地生長在無血清培養基(IS293培養基，IrvineScientific，Santa Ana，Calif.)中。所述細胞的平均倍增時間是20～35小時，無培養基更換時達到3-5×106個細胞/ml的穩定細胞濃度。
3.細胞適應懸浮培養已經采用兩種方法使293細胞適應懸浮培養。Graham在裸鼠中通過3次傳代使293A細胞適應懸浮培養(293N3S細胞)(Graham，1987)。發現懸浮293N3S細胞能支持E1-腺病毒載體。然而，Garnier et al.(1994)觀察到293N35細胞在懸浮中具有相對長的初始停滯期，低生長速率和強烈傾向于聚團。
已經采用的第二個方法是使293A細胞逐步適應懸浮生長(ColdSpring Harbor Laboratories，293S細胞)。Garnier et al.(1994)報道了采用293S細胞從腺病毒載體生產重組蛋白質。所述作者發現，293S細胞在無鈣培養基中更少聚團，并且在病毒感染時更換新鮮培養基可顯著增加蛋白質產量。發現葡萄糖是無培養基更換培養中的限速因子。
在本發明中，使已適應在無血清條件下生長的293細胞適應懸浮培養。將所述細胞轉移到無血清250mL旋轉懸浮培養(100mL工作體積)中用于懸浮培養，起始細胞濃度為約1.18E+5vc/mL～約5.22E+5vc/mL。所述培養基中可補充肝素以防止細胞聚集。這種細胞培養系統允許細胞密度增加一些并維持細胞存活。一旦這些細胞生長在培養物中，將這些細胞在旋轉角瓶中再傳代培養約7次。應當注意，所述細胞的倍增時間逐漸縮短直到連續傳代結束時，倍增時間是約1.3天，即與貼壁細胞培養在10％FBS培養基中的1.2天具有可比性。在補充肝素的無血清IS293培養基中，幾乎所有細胞在懸浮培養中以單個細胞存在，不聚集成團。
C.細胞培養系統生產感染性病毒載體的能力對于制藥工業，尤其是在基因治療的情形下日益重要。在過去的十年中，生物技術的發展已導致生產出多種重要的具有治療、疫苗和生產蛋白質機器潛在用途的病毒載體。在哺乳動物培養物中應用病毒載體與在細菌或其它低級生命形式宿主中生產的蛋白質相比很有優勢，因為它們能夠翻譯后加工復雜蛋白質結構，例如二硫鍵依賴性折疊和糖基化。
開發用于生產病毒載體的細胞培養已經得到以下方面大力幫助設計與構建在哺乳動物細胞培養中高效的載體系統的分子生物學技術的開發、一系列有用的選擇標記物、基因擴增方案和對涉及從導入的載體得到最終生物活性分子的生物化學機制和細胞機制的更深入理解。
在選擇細胞系作為表達系統的宿主之前，經常地不考慮影響規模化生產下游(在這種情況下，在細胞裂解之后)方向的因素。此外，能長期保持非常高密度培養的生物反應器系統的開發不能滿足較低成本地增加產量的增長需求。
本發明將利用最近可供利用的生物反應器技術。本發明的在生物反應器中生長細胞將允許大規模地生產能被本發明腺病毒載體感染的完全生物活性細胞。通過在低灌注速率下操作所述系統并施用不同方案來純化感染顆粒，本發明提供了容易規模化而生產大量高純度產品的純化策略。
PCT公開文本No.WO 98/00524、美國專利No.6,194,191、美國公開專利申請No.US-2002-0182723-A1和美國臨時專利申請No.60/406,591(2002年8月28日提交)描述了病毒生產方法，這些專利文獻特別地通過參考引入本文以了解關于培養、生產和純化重組病毒顆粒的技術。
本發明的某些實施方案涉及需要使用生物反應器生產腺病毒的方法。本文所用的“生物反應器”是指可用于培養細胞目的的任何設備。在生物反應器中培養本發明的細胞可允許大規模地生產能被本發明腺病毒載體感染的完全生物活性細胞。
生物反應器已經被廣泛地用于從懸浮和貼壁依賴型動物細胞培養物生產生物產物。最廣泛用于生產腺病毒載體的生產細胞是貼壁依賴型人胚腎細胞(293細胞)。待開發用于腺病毒載體生產的生物反應器應當具有高容積比培養表面區域的特征，以達到高生產者細胞密度和高病毒產率。攪拌槽生物反應器中微載體細胞培養提供了非常高的容積比培養表面區域并且已經用于生產病毒疫苗(Griffiths，1986)。而且，已經證實攪拌槽生物反應器可工業規模化。Corning-Costar生產的多板CellcubeTM..細胞培養系統也提供非常高的容積比培養表面區域。細胞生長在緊密立方體形狀的與外界隔絕密封在一起的培養板的雙面。與攪拌槽生物反應器不同，CellcubeTM..培養單元是一次性的。由于與一次性系統相關的降低資金花費、質量控制和質量保證成本，這在生產臨床產品的早期是非常期望的。為考慮不同系統提供的優點，評價了用于生產腺病毒的攪拌槽生物反應器和CellcubeTM..系統。
本發明某些實施方案需要使用Wave Bioreactor，尤其是用于無血清懸浮培養生產腺病毒的方法中。所述Wave Bioreactor是預先滅菌的一次性生物反應器系統，其可容易地用清潔室構型進行翻新而不需要昂貴的CIP和SIP處理設備。所述Wave Bioreactor可以是Wave Biotech20/50EH型。所述生物反應器可容納任何體積的培養基，但是在某些實施方案中，所述生物反應器是10L(5L工作體積)的生物反應器。在某些實施方案中，可調節所述生物反應器，使其在特定的速度和角度振動。在某些其它實施方案中，生物反應器可包括用于監測溶氧壓的設備，例如一次性溶氧壓(DOT)探針。生物反應器還可包括用于監測培養基中溫度的設備。另外的實施方案包括測定和調節培養pH的設備，例如可調節向培養基中遞送的CO2氣體百分率的氣體混合器。生物反應器可以是或不是一次性生物反應器。根據本發明的優選方面，Wave Bioreactor采用無血清培養基并且盡可能降低培養基中初始乳酸鹽濃度，因為高乳酸鹽濃度會抑制病毒產生。而且，由于葡萄糖限制性也可抑制病毒產生，所以應當維持充分的葡萄糖濃度。本文所用的“培養基”是指可促進細胞生長的任何物質。根據本發明的一個方面，宿主細胞在無血清培養基中生長。在本發明的另外實施方案中，宿主細胞在無蛋白質培養基中生長。無蛋白質培養基的一個實例是CD293。在本發明的具體實施方案中可支持宿主細胞生長的培養基的另外一個實例是DMEM+2％FBS。本領域技術人員應當理解可向培養基中添加多種組分和試劑以促進和控制細胞生長。例如，培養基中葡萄糖濃度可維持在特定水平。在本發明生產腺病毒的方法的一個實施方案中，葡萄糖濃度被維持在約0.5～約3.0gm葡萄糖/升。
1.貼壁依賴型培養對比非貼壁依賴型培養在本發明一些實施方案中，生產腺病毒的方法需要以貼壁依賴型培養方式培養宿主細胞，而另外的實施方案涉及非貼壁依賴型培養方式生產腺病毒的方法。動物和人細胞可通過兩種方式進行體外增殖作為非貼壁依賴型細胞自由地懸浮生長在整批培養物中，或作為需要貼附在固體基質上進行增殖的貼壁依賴型細胞(即單層類型細胞生長)。
來自連續建立的非貼壁依賴型或懸浮培養細胞物是最主要廣泛地用作大規模生產細胞和細胞產物的方法。基于微生物(細菌和酵母)發酵技術的大規模懸浮培養在生產哺乳動物細胞產物中具有明顯的優勢。所述方法操作相對簡單并能直接規模化。可在允許精確監測并控制溫度、溶氧和pH的反應器中提供均一的條件，并保證可得到培養物的代表性樣品。
然而，懸浮培養的細胞并非總能用于生產生物制品。懸浮培養仍然被認為具有潛在致瘤性，因此它們作為生產基底的用途限制了所得產物在人和畜牧中的應用(Petricciani，1985；Larsson，1987)。與貼壁依賴型培養相反，在懸浮培養中增殖的病毒有時可導致病毒標記物的快速變化，引起免疫原性降低(Bahnemann，1980)。最后，與懸浮培養的相同細胞系比較，當在貼壁依賴型培養物中增殖時，重組細胞系有時甚至能分泌相當高含量的產物(Nilsson and Mosbach，1987)。出于這些原因，在生產不同生物產品中廣泛采用不同類型的貼壁依賴型細胞。
2.懸浮培養的反應器和方法在本發明的選定實施方案中使用的生物反應器可以是攪拌槽生物反應器。已描述了在攪拌槽中哺乳動物培養物的大規模懸浮培養。連同發酵罐的設計一起，根據相關的微生物應用改裝生物反應器的儀器和控制裝置。然而，認識到對生長較慢的哺乳動物培養有更高的污染控制需求后，迅速實施了改進的無菌設計，提高了這些反應器的可依賴性。儀器和控制裝置基本上與在另外的發酵罐中發現的相同，并且包括攪拌、溫度、溶氧和pH控制裝置。可以購買用于在線和離線濁度(存在的顆粒的函數)測定、電容(存在的存活細胞的函數)、葡萄糖/乳酸鹽、碳酸鹽/碳酸氫鹽和二氧化碳的更先進的探針和自動分析儀。在本發明的一個實施方案中，自動分析儀是YSI-2700 SELECTTM分析儀。
由于兩種懸浮培養反應器-攪拌反應器和氣升式反應器的操作簡單并且耐用，因此被最廣泛用于工業中。攪拌反應器設計已被成功地用于8000升規模容量來生產干擾素(Phillips et al.，1985；Mizrahi，1983)。在高度與直徑比例為1∶1～3∶1的不銹鋼罐中培養細胞。基于槳葉盤或船螺旋槳方式，培養物通常用一個或多個攪拌器混合。已經描述了與槳葉相比提供較小剪切力的攪拌器系統。可直接或間接通過磁耦合驅動器來驅動攪拌。間接驅動可降低來自攪拌槳軸上密封物的微生物污染風險。
氣升式反應器，其開始時也針對微生物發酵描述過并且后來調整成適于哺乳動物培養，該反應器依靠氣流混合培養物并給混合物供氧。氣流進入反應器的升段并驅動循環。氣體在培養表面解離，引起無氣泡的密度較大的液體穿過下游到達反應器的降液段。這種設計的主要優點是簡單并且不需要機械混合。典型地，高度與直徑的比例為10∶1。氣升式反應器相對容易規模化，能大規模地遞送氣體并產生相對較低的剪切力。
以分批或補料分批方式操作大多數規模懸浮培養，因為它們能最為直接地操作和規模化。然而，基于恒化器或灌注理論的連續方法也可行。
分批方式是密閉系統，其中可見典型的生長特征。延遲期隨后是指數期、靜止期和衰落期。在這樣的系統中，由于營養物被消耗和代謝物積累，環境在連續變化。這使得分析影響細胞生長和產率的因素以及工藝的最優化成為一項復雜的作業。可通過控制關鍵營養物的供應延長生長周期來增加分批方法的生產率。由于不除去細胞、產物和廢產物，這樣的補料分批方法仍然是封閉系統。
在仍然封閉的系統中，可通過將細胞保留在多個設備(例如精網旋轉過濾器、中空纖維或平板膜過濾器、沉降管)實現通過培養物灌注新鮮培養基。旋轉過濾器培養可產生的細胞密度為約5×107個細胞/ml。真正的開放系統和最簡單的灌注方法是具有培養基流入和細胞以及產物流出的恒化器。在預定的恒定速率下將培養基供應到反應器中，所述預定的恒定速率能將培養物的稀釋速率維持在小于細胞最大特異性生長速率的數值(以防止沖洗掉反應器中的細胞團)。以相同速率除去含有細胞、細胞產物及副產物的培養流體。
在生產腺病毒的本發明某些實施方案中，將生物反應器設置成包括允許更換培養基的系統。例如，可將過濾器整合到生物反應器內以允許從消耗的培養基中分離細胞來促進更換培養基。在生產腺病毒的本發明一些實施方案中，在細胞生長的某一天開始進行培養基更換和灌注。例如，可在細胞生長的第3天開始培養基更換和灌注。過濾器可設在生物反應器的外部，或在生物反應器的內部。
在本發明一個實施方案中，過濾器是在生物反應器內部的漂浮平面過濾器。所述過濾器將細胞和消耗的培養基分隔開。在某些實施方案中，通過漂浮過濾器去除消耗的培養基。本發明的多種實施方案中可需要或不需要培養基的再循環。在一個實施方案中，采用波動將培養基灌注期間的過濾器阻塞最小化。可通過用于觸發新鮮培養基添加的負載細胞維持培養體積。本領域技術人員熟悉可用于灌注培養基的多種類型的過濾器，以及可用于將過濾器附著在生物反應器上并將其整合到細胞生長工藝中的多種方法。
3.非灌注型貼壁系統典型地，在小玻璃容器或塑料容器的底部增殖貼壁依賴型細胞培養物。經典和傳統技術中適于實驗室規模的受限制表面體積比，在細胞和細胞產物的大規模生產中制造了瓶頸。為了提供在小培養體積中提供可行的、較大的細胞生長表面的系統，已建議以下幾種技術轉瓶系統、疊板繁殖、螺旋膜瓶、中空纖維系統、填充床、板交換器系統和膜管狀軸(membrane tubing reel)。由于這些系統在性質上不均一，并有時基于多種工藝，它們遭受下述缺點-有限的規模化潛能、較難采集細胞樣品、有限的測定和控制關鍵工藝參數的潛能以及在整個培養中較難維持均一環境條件。
盡管有這些缺點，通常用于大規模貼壁依賴型細胞生產的方法是轉瓶。由于與大的、不同形狀的T型瓶沒差別，該系統的簡單性使得它非常可靠，并因此具有吸引力。有完全自動化的機器人可供利用，它們每天能處理幾千轉瓶，因此，消除了污染的風險和與原本需要的集中人工處理相關的不一致性。通過經常更換培養基，轉瓶培養可以達到接近0.5×106個細胞/cm2的細胞密度(相當于約109個細胞/瓶或幾乎107個細胞/ml培養基)。
4.微載體培養為了克服傳統貼壁依賴型培養方法的缺點，van Wezel(1967)建立了微載體培養系統的概念。在這種系統中，細胞在小的固體顆粒上增殖，所述小的固體顆粒通過緩慢的攪拌被懸浮在生長培養基中。細胞貼附在微載體上并在微載體表面上逐漸生長到匯集。實際上，這種大規模培養系統將貼壁依賴型培養由單盤法提高到將單層和懸浮培養結合在一起的單元法。因此，組合細胞生長需要的表面和均相懸浮培養的優點提高了產量。
微載體培養與大多數其它貼壁依賴型大規模培養方法相比的優勢體現在多方面。首先，微載體培養可提供高的表面積體積比(可通過改變載體濃度進行變化)，其導致高的細胞密度產率和得到高濃度細胞產物的潛能。當培養物以灌注反應器方式增殖時，細胞產率可高達1～2×107個細胞/ml。第二，細胞可以在一個單元處理容器中增殖而不采用許多小的低生產率容器(即培養瓶或盤)。這導致好得多的營養物利用并相當節省培養基。而且，在單一反應器中增殖可導致降低對設備空間的需求以及每個細胞需求的處理步驟的數量，因此降低勞動成本和污染的風險。第三，較好混合和均勻的微載體懸浮培養使得監測和控制環境條件(例如pH、pO2和培養基組分濃度)成為可能，因此導致細胞增殖和產物回收更具可重復性。第四，有可能采集代表性樣品用于顯微鏡觀察、化學試驗或計數。第五，由于微載體很快從懸浮物種沉降下來，故可以相對簡單地采用補料分批方法或收集細胞。第六，微載體上貼壁依賴性培養增殖的方式使得有可能利用這種系統進行其它細胞操作，例如不采用蛋白水解酶而進行細胞轉移、細胞共培養、向動物移植和采用保留微載體的玻璃水瓶、柱、流化床或中空纖維灌注培養物。第七，采用傳統的用于懸浮培養微生物和動物細胞的設備，可相對容易地使微載體培養規模化。
5.哺乳動物細胞的微囊化已顯示在培養哺乳動物細胞中特別有用的一種方法是微囊化。所述哺乳動物細胞被保留在半透水凝膠膜內。在細胞周圍形成多孔膜以允許營養物、氣體和代謝產物與膠囊周圍的大量培養基進行交換。已經開發了幾種溫和、快速并無毒的方法，其中所得的膜足夠多孔和結實而能在整個培養期維持細胞團生長。這些方法都基于可溶性藻酸鹽，其與含鈣溶液通過小滴接觸而凝膠化。Lim(1982，U.S.Pat.No.4,352,883，通過引用作為參考)描述了在約1％藻酸鈉溶液中濃縮地細胞，其被強迫通過小孔，形成小滴，并落入約1％氯化鈣溶液中。然后將所述小滴拋到在離子地結合到藻酸鹽表面的聚氨基酸層中。最后通過在螯合劑中處理小滴除去鈣離子而重新液化所述藻酸鹽。其它方法采用待滴入藻酸鹽溶液中的鈣溶液中的細胞，因此形成中空藻酸鹽球。相似的方法包括將殼聚糖溶液中的細胞滴入藻酸鹽，也形成中空球。
微囊化細胞能容易地在攪拌槽反應器中增殖，并且在小珠尺寸在150～1500mum直徑的范圍內時，采用精目篩容易地將細胞保留在灌注反應器中。膠囊體積與培養基總體積的比例可密集維持在1∶2～1∶10。膠囊內細胞密度可高達108，培養物中有效細胞密度是1～5×107。
微囊化超過其它方法的優點包括可防止來自起泡和攪拌的剪切力的有害作用、能夠容易地保留小珠以便采用灌注系統、相對直接地規模化和能夠將小珠用于移植。
本發明包括本身是貼壁依賴型的細胞。例如293細胞是貼壁依賴型，并且當懸浮生長時，所述細胞將互相貼附并成團生長，最終隨細胞達到使得核心細胞不能被培養條件所維持的尺寸時，每個團塊內核中的細胞將窒息死亡。因此，為了有效地利用這些細胞產生大量腺病毒，需要有大規模培養貼壁依賴型細胞的有效方法。
6.灌注型貼壁系統本發明地某些實施方案中涉及包括采用灌注型貼壁系統地腺病毒生產方法。灌注是指以穩定速率通過生理營養液中的細胞群或在其上流動的連續流。它意味著保留細胞在所述培養單元內，而與采用取出的培養基來清洗出細胞的連續流動培養(即恒化器)相反。自從這個世紀開始，灌注的想法已經是公知的，并被用于保持小片組織存活來用于擴大的顯微鏡觀察。所述技術開始是模擬體內細胞周圍環境，其中連續向細胞供應血液、淋巴或其它體液。無灌注時，培養物中的細胞經歷供料和饑餓的交替期，因此限制了它們的生長和代謝潛能的全部表達。
灌注培養的目前用途響應于高密度(即0.1～5×108個細胞/ml)生長細胞的挑戰。為了升高密度超過2～4×106個細胞/ml，必須用新鮮供應物持續地置換所述培養基，以彌補營養缺乏并除去有毒的產物。灌注允許更好地控制培養環境(pH、pO2、營養物水平等等)，并且是顯著提高培養物內表面積在細胞貼壁中的應用的方法。
采用無紡織物床基質開發灌注型填充床反應器提供了維持灌注培養物的密度超過108個細胞/ml床體積的方法(CelliGenTM.，New BrunswickScientific，Edison，N.J.；Wang et al.，1992；Wang et al.，1993；Wang et al.，1994)。簡要地說，這種反應器包含改進的反應器，用于培養貼壁依賴型和非貼壁依賴型細胞。所述反應器被設計成帶有提供內部再循環裝置的填充床。優選地，將纖維基質載體置于反應容器內的籃子中。所述籃子的頂部和底部有孔，可允許培養基流過所述籃子。特別設計的葉輪可提供纖維基質通過纖維基質占有的空間進行培養基再循環，以保證均一性地供應營養物并除去廢物。這同時保證了將可忽略量的總細胞團懸浮在培養基中。籃子和再循環的組合還提供了含氧培養基進行無泡流動經過纖維基質。所述纖維基質是“孔”徑為10毫微米(.mu.m)～100毫微米的無紡織物，提供較大的內部體積，孔體積相當于單個細胞體積的1～20倍。
對比其它的培養系統，這種方法提供幾個顯著的優點。采用纖維基質載體，使細胞免于來自攪拌和起泡的機械應力。通過籃子的自由培養基流動給細胞提供最優化調節水平的氧、pH和營養物。可連續從培養物中除去產物，收集的產物中不含有細胞，并且可在能方便后來純化步驟的低蛋白質培養基中生產。而且，這種反應器系統的獨特設計提供了規模化反應器的更容易方法。目前，體積可達到30升。100升和300升款式正在開發中，理論計算可支持高達1000升的反應器。WO 94/17178(Aug.4，1994，Freedman et al.)中詳細解釋了這種技術，其全部內容通過引用作為參考。
CellcubeTM(Corning-Costar)模塊(module)提供大的苯乙烯表面區域用于貼附在基底上的細胞固定和生長。其被整個包裹的滅菌一次性設備中，該設備具有一系列平行培養盤，它們連接起來而在相鄰的盤之間產生薄的密封層流空間。
CellcubeTM模塊具有彼此對角相反的進口和出口，可幫助調節培養基流動。在生長的初始幾天，通常在開始接種后通過系統內含有的培養基來滿足培養條件。開始接種和開始灌注培養基之間的時間量取決于接種體中細胞密度和細胞生長速率。循環培養基中營養物濃度的測量值是培養物狀態的良好指示劑。當建立操作程序時，可能有必要在多種不同灌注速率下監測營養物組成以測定最經濟和最多產的操作參數。
所述系統內的細胞達到高于傳統培養系統中的溶液密度(細胞/ml)。許多典型使用的基礎培養基被設計成支持1～2×106個細胞/ml/天。典型的CellcubeTM具有85,000cm2的表面積，模塊內含有約6L培養基。培養容器中細胞密度通常超過107個細胞/mL。在匯合時，每天需要2～4個反應器體積的培養基。
培養物生產階段的定時和參數取決于具體細胞系的類型和用途。許多培養物在生產中需要不同于培養物生長階段需要的培養基。在傳統培養中，從一個階段轉變成另一個階段可能需要多個清洗步驟。然而，CellcubeTM系統采用灌注系統。這樣的系統的好處之一是能提供各個操作階段之間的溫和轉變。灌注系統不需要為了除去生長培養基中的血清組分而進行的傳統清洗步驟。
7.無血清懸浮培養在具體實施方案中，如上所述由貼壁依賴型293細胞培養物(293A細胞)生產用于基因治療的腺病毒載體。腺病毒的規模化生產受到293A細胞的貼壁依賴性的限制。為了方便大規模生產并滿足對腺病毒載體的進一步需求，已顯著努力開發可能規模化的替代生產方法。方法包括將293A細胞進行微載體培養和使得293A生產細胞適應于懸浮培養。
上面已經描述了微載體培養技術。這種技術依靠將生產細胞貼附在微載體的表面上，所述微載體通過機械攪拌懸浮在培養基中。對細胞貼壁的需求可能對微載體培養的規模化產生一些局限性。
在本發明的一些實施方案中，用于腺病毒生產方法中的培養基是無血清培養基。在本發明的另外實施方案中，培養基是無蛋白質培養基。如前所述，本發明的某些實施方案包括使用生物反應器。可使所述生物反應器適應于細胞的無血清懸浮培養。系統中可以包括或不包括用培養基交換進行培養基過濾。
D.病毒感染本發明涉及包括用腺病毒感染宿主細胞來生產腺病毒的方法。典型地，在生理條件下將病毒簡單地暴露于允許吸收病毒的適當宿主細胞中。本領域技術人員熟悉寬范圍的可用于開始病毒感染的技術。
在一個實施例中，為了產生治療上重要的載體，本發明運用腺病毒感染細胞。典型地，在生理條件下將病毒簡單地暴露于允許吸收病毒的適當宿主細胞。腺病毒只是舉例說明的，通過如下所述，本發明方法可方便地用于另外的病毒載體。
1.腺病毒由于腺病毒的中等大小的DNA基因組、容易操縱、高滴度、寬的靶細胞范圍和高感染力，腺病毒特別適合用作基因轉移載體。該約36kb的病毒基因組以100～200堿基對(bp)反向末端重復序列(ITR)為界，其中含有病毒DNA復制和包裝需要的順式作用元件。根據病毒DNA復制的起始劃分含有不同轉錄單元的早期(E)和晚期(L)區基因組。
E1區(E1A和E1B)編碼負責調節病毒基因組和少數細胞基因轉錄的蛋白質。E2區(E2A和E2B)的表達導致合成用于病毒DNA復制的蛋白質。這些蛋白質參與DNA復制、晚期基因表達和宿主細胞關閉(Renan，1990)。晚期基因(L1、L2、L3、L4和L5)的產物，包括多數病毒殼體蛋白質，僅僅在由主要晚期啟動子(MLP)產生的單個初級轉錄物的顯著加工后被表達。所述MLP(位于16.8個圖距單位)在感染晚期特別有效，并且由這個啟動子引發的所有mRNA具有5’三聯前導(TL)序列，使它們成為用于翻譯的偏好mRNA。
為了將腺病毒最優化用于基因治療，有必要將負載能力最大化以使得可包含大片段DNA。還非常需要降低某些腺病毒產物相關的毒性和免疫反應。大量腺病毒基因組的消除，以及通過輔助病毒和/或輔助細胞反式提供缺失基因產物，允許向載體中插入大量外源DNA。這種策略還將導致腺病毒基因產物的毒性和免疫原性降低。
由于病毒DNA復制需要的所有順式元件位于線性病毒基因組的任一末端的反向末端重復序列(ITR)(100～200bp)中，因此有可能大量置換DNA。含有ITR’s的質粒可在非缺陷型腺病毒存在下復制(Hay et al.，1984)。因此，在腺病毒載體中包含這些元件應當允許復制。
此外，病毒殼體化的包裝信號位于所述病毒基因組的左末端的194～385bp(0.5～1.1個圖距單位)之間(Hearing et al.，1987)。這種信號模擬噬菌體λDNA中的蛋白質識別位點，其中靠近左末端、但在粘性末端序列以外的特定序列介導DNA向頭結構中的插入所需的蛋白質的結合。Ad的E1取代型載體已經證實，病毒基因組左末端的450bp(0～1.25個圖距單位)片段可指導293細胞的包裝(Levrero et al.，1991)。
先前已經顯示腺病毒基因組的某些區可引入哺乳動物細胞的基因組中并表達由此編碼的基因。這些細胞系能支持腺病毒載體的復制，所述腺病毒載體缺乏由所述細胞系編碼的腺病毒功能。還報道了通過“輔助”載體例如野生型病毒或條件缺陷型突變體互補復制缺陷型腺病毒載體。
復制缺陷型腺病毒載體可被輔助病毒反式補充。然而，僅僅這一種發現并不允許復制缺陷型載體的分離，因為提供復制功能所需的輔助病毒的存在將污染任何制備物。因此，需要能向復制缺陷型載體復制和/或包裝施加特異性的另外元件。如本發明提供的那種元件來源于腺病毒的包裝功能。
已經顯示腺病毒的包裝信號位于常規腺病毒圖譜的左末端(Tibbetts，1977)。后來的研究顯示，在基因組的E1A(194～358bp)區內有缺失的突變體即使在補充早期(E1A)功能的細胞系中也生長較差(Hearing and Shenk，1983)。當補償的腺病毒DNA(0～353bp)被重組到突變體的右末端時，病毒被正常包裝。進一步的突變分析鑒定到了Ad5基因組左末端內的短的、重復的、位置依賴型元件。已發現所述重復的一個拷貝如果存在于基因組的任一末端足夠用于有效包裝，但是當向Ad5DNA分子的內部方向移動時結果不是這樣(Hearing et al.，1987)。
通過采用包裝信號的突變形式，有可能產生以不同效率包裝的輔助病毒。典型地，突變是點突變或缺失。當低效率包裝的輔助病毒生長在輔助細胞中時，病毒被包裝，盡管與野生型病毒相比速率下降，因此允許輔助病毒的增殖。然而，當這些輔助病毒與含有野生型包裝信號的病毒一起生長在細胞中時，所述野生型包裝信號優先于突變形式而得到識別。假定包裝因子的量有限，含有野生型信號的病毒與輔助病毒相比被選擇性包裝。如果所述偏好足夠大，應當能得到接近均勻的原種。
2.逆轉錄病毒雖然腺病毒感染細胞用于產生治療上重要的載體是本發明的優選實施方案，預計本發明可采用逆轉錄病毒感染細胞用于產生這樣的載體。所述逆轉錄病毒是一組單鏈RNA病毒，其特征在于能在感染的細胞內通過逆轉錄將它們的RNA轉變成雙鏈DNA(Coffin，1990)。然后將所得的DNA穩定地整合到細胞染色體中作為前病毒，并指導病毒蛋白質的合成。所述整合導致病毒基因序列保留在受體細胞及其后代中。所述逆轉錄病毒基因組包含3個基因-gag、pol和env-分別編碼殼體蛋白質、聚合酶和封裝組分。在gag基因上游發現的序列(稱為Y)，用作包裝基因組進入病毒粒子的信號。兩個長末端重復(LTR)序列位于病毒基因組的5’和3’末端。這些包含強啟動子和增強子序列，并且還是整合到宿主細胞基因組中所需要的(Coffin，1990)。
為了構建逆轉錄病毒載體，將編碼啟動子的核酸插入到病毒基因組中代替某些病毒序列，以生產復制缺陷型病毒。為了產生病毒粒子，構建包含gag、pol和env基因但不含有LTR和Y組分的包裝細胞系(Mann etal.，1983)。當含有人cDNA的重組質粒與逆轉錄病毒LTR和Y序列一起被導入到這種細胞系中(例如通過磷酸鈣沉淀)時，所述Y序列允許重組質粒的RNA轉錄物被包裝到病毒顆粒中，然后被分泌到培養基中(Nicolasand Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann et al.，1983)。然后收集含有重組逆轉錄病毒的培養基，任選地濃縮，并用于基因轉移。逆轉錄病毒載體能感染寬范圍的多種細胞類型。然而，整合和穩定的表達需要宿主細胞的分裂(Paskind et al.，1975)。
基于通過向病毒包膜化學性添加半乳糖殘基進行逆轉錄病毒的化學修飾，近來開發了設計成允許特異性靶向逆轉錄病毒載體的新方法。這種修飾可允許通過脫唾液酸糖蛋白受體特異性感染細胞(例如肝細胞)，假如這是所希望的話。
設計了重組逆轉錄病毒靶向的不同方法，其中采用了抗逆轉錄病毒包膜蛋白和抗特異性細胞受體的生物素化抗體。所述抗體通過采用鏈霉抗生物素蛋白與生物素組分相耦聯(Roux et al.，1989)。采用抗主要組織相容性復合物I類抗原和II類抗原的抗體，用親嗜性病毒體外證明了對多種具有那些表面抗原的人細胞的感染(Roux et al.，1989)。
3.其它病毒載體其它病毒載體可用作本發明的表達構建物。還可使用來源于病毒例如牛痘病毒(Ridgeway，1988；Baichwal and Sugden，1986；Coupar et al.，1988)、腺伴隨病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal and Sugden，1986；Hermonat and Muzycska，1984)、皰疹病毒和慢病毒之類載體的載體。這些病毒提供將基因轉移到多種哺乳動物細胞中的幾個特征。
4.基因轉移方法為了建立本發明的輔助細胞系，以及建立隨其使用的重組腺病毒載體，必須向細胞遞送多種基因(即DNA)構建物。實現這一目標的一個方法是采用感染性病毒顆粒進行病毒轉導，例如通過采用本發明的腺病毒載體進行轉化。作為替代，可使用逆轉錄病毒或牛乳頭瘤病毒，這兩種病毒均允許用感興趣基因永久性轉化宿主細胞。在另外情形下，待轉移的核酸是無感染性的，即不包含在有感染性的病毒顆粒中。這種基因物質必須依靠非病毒方法轉移。
用于向培養的哺乳動物細胞中轉移表達構建物的幾個非病毒方法還可用于本發明。這些方法包括磷酸鈣沉淀法(Graham and Van Der Eb，1973；Chen and Okayama，1987；Rippe et al.，1990)、DEAE-葡聚糖(Gopal，1985)、電穿孔(Tur-Kaspa et al.，1986；Potter et al.，1984)、直接顯微注射法(Harland and Weintraub，1985)、負載DNA的脂質體(Nicolauand Sene，1982；Fraley et al.，1979)、細胞超聲處理(Fechheimer et al.，1987)、采用高速發射微彈的基因轟擊(Yang et al.，1990)，和受體介導的轉染(Wu and Wu，1987；Wu and Wu，1988)。
一旦構建物已被遞送到細胞內，編碼治療基因的核酸可被定位在不同的位點并且表達。在某些實施方案中，所述編碼治療基因的核酸可被穩定地整合到細胞的基因組中。這種整合可通過同源重組(基因置換)在關聯位置和方位進行，或者其可被隨機、非特異定位方式整合(基因增補)。在又進一步的實施方案中，核酸可作為DNA的單獨、附加體片段穩定地維持在細胞中。這樣的核酸片段或“附加體”編碼足以允許獨立于宿主細胞周期或與宿主細胞周期同步地維持并復制的序列。表達構建物如何被遞送到細胞內以及在細胞的何處保留核酸將取決于所用的表達構建物的類型。
在本發明的一個實施方案中，所述表達構建物可簡單地由裸重組DNA或質粒組成。構建物的轉移可通過上述物理地或化學地滲透細胞膜的任何方法進行。這尤其適用于體外轉移。然而，其也可適用于體內。Dubensky et al.(1984)將CaPO4沉淀形式的多瘤病毒DNA成功地注射到成年和新生小鼠的肝臟和脾臟，證實了活性病毒復制和急性感染。Benvenistyand Neshif(1986)還證實了直接腹膜內注射CaPO4沉淀的質粒導致轉染基因的表達。預想編碼CAM的DNA也可以以相似方式在體內轉移并表達CAM。
用于向細胞內轉移裸DNA表達構建物的本發明另外一個實施方案可包括粒子轟擊。這個方法依靠將DNA包被的微彈加速到高速，使它們穿破細胞膜并進入細胞而不殺死它們的能力(Klein et al.，1987)。已經開發了幾種用于加速小顆粒的裝置。一種這樣的裝置依靠高壓放電產生交替提供原動力的電流(Yang et al.，1990)。所用的微彈由生物惰性物質例如鎢珠或金珠組成。
在本發明的進一步實施方案中，表達構建物可被包裹在脂質體中。脂質體是特征在于磷脂雙層膜和內部含水介質的多孔結構。多層脂質體具有多個由含水介質分開的脂質層。當磷脂懸浮在過量的水溶液中，它們就自發形成。在形成密閉結構之前，脂質組分經過自重排，在脂質雙層之間包封水以及溶解的溶質(Ghosh and Bachhawat，1991)。
脂質體介導的核酸遞送和外源DNA的體外表達已經是非常成功的。采用β-內酰胺酶基因，Wong et al.(1980)證實了在培養的雞胚細胞、HeLa和肝癌細胞中進行脂質體介導的核酸遞送和外源DNA表達的可行性。Nicolau et al.(1987)成功地完成了在大鼠中靜脈內注射后脂質體介導的基因轉移。還包括多種涉及“脂質轉染(lipofection)”技術的商業方法。
在本發明的某些實施方案中，脂質體可與仙臺病毒(HVJ)復合。這已顯示可推動與細胞膜的融合并促進脂質體包裹的DNA進入細胞(Kanedaet al.，1989)。在另外的實施方案中，脂質體可與非組蛋白染色體核蛋白(HMG-1)配合或與其結合使用(Kato et al.，1991)。在進一步實施方案中，脂質體可與HVJ和HMG-1配合或與其結合使用。由于這樣的表達構建物已經成功地用于體外和體內的核酸轉移和表達，它們適用于本發明。
其它的可用于向細胞中遞送編碼治療基因的核酸的表達構建物是受體介導的遞送介體。在幾乎所有的真核細胞中利用了通過受體介導的內吞作用的大分子的選擇性吸收。由于多種受體的細胞類型特異性分布，所述遞送的特異性可以很高(Wu and Wu，1993)。
受體介導的基因靶向介體通常由兩種組分組成細胞受體特異性配體和DNA結合劑。幾種配體已用于受體介導的基因轉移。最廣泛表征的配體是脫唾液酸血清類粘蛋白(ASOR)(Wu and Wu，1987)和轉移(Wagner et al.，1990)。近來，識別與ASOR相同的受體的合成擬糖蛋白(neoglycoprotein)已經被用作基因遞送的介體(Ferkol et al.，1993；Perales et al.，1994)，表皮生長因子(EGF)也已用于向鱗狀細胞癌細胞中遞送基因(Myers，EPO 0273085)。
在另外的實施方案中，遞送介體可包含配體和脂質體。例如，Nicolauet al.(1987)應用了摻入到脂質體中的乳糖苷神經酰胺，一種以半乳糖為末端的脫唾液酸神經節苷脂，并觀察到肝細胞對胰島素基因的攝入增加。因此，通過任何數量的含有或不含有脂質體的受體-配體系統，將編碼治療基因的核酸特異性遞送到例如前列腺細胞、上皮細胞或腫瘤細胞的細胞類型中是可行的。例如，人前列腺特異性抗原(Watt et al.，1986)可用作前列腺組織中介導核酸遞送的受體。
在本發明的某些實施方案中，進行宿主細胞感染的溫度是37℃。然而，在另外的實施方案中，感染溫度是小于37℃的溫度。這是基于本發明人有關感染溫度小于37℃。提供最佳腺病毒產量這一發現的。因此，例如，所述溫度可以是32.1℃、32.2℃、32.3℃、32.4℃、32.5℃、32.6℃、32.7℃、32.8℃、32.9℃、33.0℃、33.1℃、33.2℃、33.3℃、33.4℃、33.5℃、33.6℃、33.7℃、33.8℃、33.9℃、34.0℃、34.1℃、34.2℃、34.3℃、34.4℃、34.5℃、34.6℃、34.7℃、34.8℃、34.9℃、35.0℃、35.1℃、35.2℃、35.3℃、35.4℃、35.5℃、35.6℃、35.7℃、35.8℃、35.9℃、36.0℃、36.1℃、36.2℃、36.3℃、36.4℃、36.5℃、36.6℃、36.7℃、36.8℃和36.9℃以及任何范圍的可由此衍生的溫度或溫度增加。本領域技術人員公知的任何方法可用于測量細胞培養基中的溫度。本領域技術人員將熟悉寬范圍的可用于測量培養基溫度的方法。
例如，一種測量溫度的便利方式是采用實時數字設備測量培養箱內的溫度。進行之前，可采用示蹤溫度校準設備校準所述數字設備以核實數字設備的精確性。
在本發明的某些實施方案中，生產腺病毒的方法可包括通過用新鮮培養基和腺病毒稀釋宿主細胞來開始病毒感染。這避免了在感染之前進行單獨的培養基更換步驟的必要性。本發明預計任何稀釋量的宿主細胞可用于本發明。在某些實施方案中，用新鮮培養基將宿主細胞稀釋10倍。本發明還預計加入任何量的病毒以啟動感染。然而，在本發明的某些實施方案中，通過添加50vp/個宿主細胞開始病毒感染。
本發明的實施方案還涵蓋使病毒感染持續任何時程。然而，在某些實施方案中，允許病毒感染持續4天。在本發明的另一個實施方案中，允許宿主細胞的生長發生在一個生物反應器中，宿主細胞的感染在另一個生物反應器中進行。
本文將使用術語“腺病毒制備物”描述采用腺病毒開始感染后的反應混合物。腺病毒制備物可包括已經經過裂解的宿主細胞、細胞碎片、腺病毒、培養基和在感染期間存在于反應混合物中的任何其它組分。所述腺病毒制備物可包括完整的宿主細胞，這取決于允許感染進行多長時間。一些或所有宿主細胞可能已經經過細胞裂解，并將病毒顆粒釋放到周圍培養基中。本發明預計，在所述生產腺病毒的方法的實施方案中，腺病毒分離將發生在感染后的任何時間并采用本領域技術人員公知的任何方法。例如，在本發明的一個實施方案中，從腺病毒制備物中分離腺病毒發生在病毒感染結束后4天時。
E.病毒載體工程1.病毒載體在具體實施方案中，預計重組腺病毒可用于遞送表達構建物。“重組腺病毒”、“腺病毒載體”或“腺病毒表達載體”是指包括含有腺病毒序列的那些構建物，所述腺病毒序列足以(a)支持所述構建物的包裝和(b)最終表達克隆到其中的組織或細胞特異性構建物。所述重組腺病毒可編碼重組基因。因此，重組腺病毒可包括任何包含腺病毒序列的工程化載體。
本發明的腺病毒表達載體包含基因工程化形式的腺病毒。認為所述腺病毒載體的性質不是成功實施本發明的關鍵。腺病毒可以是并不公知的血清型和/或A～F亞組種的任何類型。為了得到用于本發明的一種腺病毒載體，C亞組的腺病毒5型是優選的原材料。這是因為腺病毒5型是人腺病毒，對其已知曉大量生物化學信息和遺傳信息，并且它在歷史上已用于采用腺病毒作為載體的大多數構建物。
腺病毒基因轉移的優點包括能感染較寬范圍的細胞類型(包括不分裂細胞)大小適中的基因組、操作簡單、強感染力以及它們能生長成高滴度(Wilson，1996)。而且，宿主細胞的腺病毒感染不會導致染色體整合，因為腺病毒DNA可以以附加體的方式復制，不具有其它病毒載體相關的潛在遺傳毒性。腺病毒還是結構穩定的(Marienfeld et al，1999)，廣泛擴增后沒有檢測到基因組重排(Parks et al，1997；Bett et al，1993)。
腺病毒生長和操縱是本領域技術人員公知的，并在體內外顯示出很廣的宿主范圍(美國專利5,670,488、美國專利5,932,210、美國專利5,824,544)。這種病毒可以高滴度獲得，例如每毫升109～1011個噬菌斑形成單位，并且它們感染力很強。腺病毒的生活周期不需要整合到宿主細胞基因組中。通過腺病毒載體遞送的外源基因是附加體，因此對宿主細胞的遺傳毒性低。
雖然基于腺病毒的載體提供幾個超過其它載體系統的獨特優點，但是它們通常受到載體免疫原性、插入重組基因的尺寸約束、低水平復制、低水平轉基因表達的限制。采用腺病毒載體的主要關心問題是在包裝細胞系的載體產生期間或在個體的基因療法治療期間產生復制型病毒。復制型病毒的產生可能給患者帶來無意的病毒感染以及病理后果的嚴重威脅。
本發明的某些實施方案涉及生產腺病毒的方法，其中涉及復制缺陷型腺病毒。Armentano et al.描述了復制缺陷型腺病毒載體的制備，據稱其可消除不經意產生復制型腺病毒的可能性(美國專利5,824,544)。復制缺陷型腺病毒方法包括E1區的缺失和蛋白質IX基因的重新定位，其中所述載體表達異源的哺乳動物基因。
產生用作基因轉移載體的腺病毒的一般方法是缺失E1基因(E1-)，該基因涉及E2、E3和E4啟動子的誘導(Graham and Prevec，1995)。隨后，可將治療基因重組插入而代替E1基因，其中E1啟動子或異源啟動子驅動治療基因的表達。然后所述E1-、復制缺陷型病毒在反式提供E1多肽的“輔助”細胞系(例如人胚腎細胞系293)中增殖。作為替代，E3區、部分E4區或兩者都可缺失，其中將處于真核細胞中可操作的啟動子控制下的異源核酸序列插入到用于基因轉移的腺病毒基因組中(美國專利5,670,488、美國專利5,932,210)。
2.編碼治療基因的病毒載體在某些實施方案中，本發明可包括生產腺病毒的方法，其中所述腺病毒是編碼重組基因的重組腺病毒。可將所述重組基因可操作地連接到啟動子上。在某些另外的實施方案中，所述重組基因是治療基因。本發明可采用在疾病或遺傳病癥的治療中具有治療價值或潛在治療價值的任何基因。本領域技術人員熟悉寬范圍的已被確認的這種基因。
基因治療通常包括將治療基因導入細胞中，也稱為轉基因，所述轉基因的表達導致疾病或遺傳病癥的改善或治療。所涉及的治療基因可以是編碼蛋白質、結構RNA或酶促RNA、抑制產物例如反義RNA或DNA或任何其它的基因產物的那些治療基因。表達是指這種基因產物的產生或這種基因產物的產生引起的效果。因此，增強的表達包括任何治療基因的產量增多或那種產物在決定細胞、組織、器官或有機體狀態方面的作用加大。通過腺病毒載體遞送治療基因包括被稱為細胞轉導的過程。本文所用的轉導被定義為通過腺病毒或相關載體向細胞中導入治療基因、轉基因或轉基因構建物。
目前，許多試驗、創新、臨床前研究和臨床試驗在研究采用腺病毒作用基因遞送載體。例如，正在開發用于以下疾病的基于腺病毒基因遞送的基因治療肝病(Han et al.，1999)、精神病(Lesch，1999)、神經病(Hermens and Verhaagen，1998)、冠心病(Feldman et al.，1996)、肌肉疾病(Petrof，1998)、和多種癌癥例如結腸直腸癌(Dorai et al.，1999)、膀胱癌(Irie et al.，1999)、前列腺癌(Mincheff et al.，2000)、頭頸癌(Blackwellet al.，1999)、乳腺癌(Stewart et al.，1999)、肺癌(Batra et al.，1999)和卵巢癌(Vanderkwaak et al.，1999)。
腺病毒載體編碼的特定治療基因不是限制性的，并且包括用于多種治療和研究目的的那些，以及可用于跟蹤轉基因表達和腺病毒及腺病毒載體轉導功效的報告基因和報告基因系統及構建物。因此，例如，下面是可采用本發明的組合物和方法來提高其表達的可能基因類型發育基因(例如粘附分子、細胞周期蛋白激酶抑制劑、Wnt家族成員、Pax家族成員、翼狀-螺旋家族成員、Hox家族成員、細胞因子/淋巴因子及其受體、生長因子或分化因子及其受體、神經遞質及其受體)、癌基因(例如ABLI、BLC1、BCL6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3和YES)、腫瘤抑制基因(例如APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NF1、NF2、RB1、TP53和WT1)、酶(例如ACP去飽和酶和羥化酶(hycroxylases)、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、ATP酶、醇脫氫酶(alcohol dehycrpgenases)、淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、過氧化氫酶、纖維素酶、環加氧酶、脫羧酶、糊精酶、酯酶、DNA和RNA聚合酶、透明質酸合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、GTP酶、解旋酶、半纖維素酶、透明質酸酶、整合酶、轉化酶、異構酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂加氧酶、裂解酶、溶菌酶、果膠酯酶、過氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶(peptidease)、普魯蘭酶(pullanase)、重組酶、逆轉錄酶、拓撲異構酶、木聚糖酶)、報告基因(例如綠色熒光蛋白及其多種顏色變體、熒光素酶、CAT報告系統、β-半乳糖苷酶等等)、血液衍生物、激素、淋巴因子(包括白細胞介素)、干擾素、TNF、生長因子、神經遞質或其前體或合成酶、營養因子(例如BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5等等)、脫輔基脂蛋白(例如ApoAI、ApoAIV、ApoE等等)、肌養蛋白或小肌養蛋白(minidystrophic)、腫瘤抑制基因(例如p53、Rb、Rap1A、DCC、k-rev等等)、編碼參與凝血的因子的基因(例如因子VII、VIII、IX等等)、自殺基因(例如胸苷激酶)、胞嘧啶脫氨酶、或者所有或部分天然或人工免疫球蛋白(Fab、ScFv等等)。治療基因的另外實例包括fus、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、ADP(腺病毒死亡蛋白)。
治療基因還可以是反義基因或序列，所述反義基因或序列在靶細胞中的表達使得能控制細胞基因的表達或細胞mRNA的轉錄，例如核酶。例如，這些序列可在靶細胞中被轉錄成與細胞mRNA互補的RNA。所述治療基因還可以是編碼能在人中產生免疫反應的抗原肽的基因。在這個具體實施方案中，因此本發明使得生產疫苗成為可能，所述疫苗能使人被免疫，尤其是對抗微生物和病毒。
腫瘤抑制癌基因起到抑制細胞過量增殖的作用。這些基因的失活破壞它們的抑制活性，導致不受調節的增殖。下面描述腫瘤抑制基因p53、p16和C-CAM。
目前，p53被認為是腫瘤抑制基因。已經在許多通過化學致癌作用、紫外輻射和幾種病毒(包括SV40)轉化的細胞中發現高水平的突變體p53。所述p53基因在人的多種腫瘤中常常是突變失活的靶標，并且已經證實是常見的人癌癥中的最頻繁突變的基因。它在超過50％的人NSCLC中以及多種其它腫瘤中有突變(Hollstein et al.，1991)。
P53基因編碼393個氨基酸的phophoprotein，該蛋白可與宿主蛋白質例如大-T抗原和E1B形成配合體。在正常組織和細胞中發現了所述蛋白質，但是與轉化的細胞或腫瘤組織相比，其濃度是微小的。有趣地是，野生型p53似乎在調節細胞生長和分化中是很重要的。已經顯示，在一些情況下，野生型p53的過表達在人腫瘤細胞系中是抗增殖的。因此，p53可用作細胞生長的負性調節劑(Weinberg，1991)，并且可直接抑制不受控制的細胞生長或間接激活抑制這種生長的基因。因此，缺少野生型p53或野生型p53失活可有助于轉化。然而，一些研究顯示，突變體p53的存在可能是完全表達基因轉化潛能所需要的。
野生型p53被認為是多種細胞類型的重要生長調節劑。錯義突變對于p53基因是常見的，并且是癌基因轉化能力所必需的。點突變促使的單個基因變化可產生癌基因p53。然而，與其它的癌基因不同，已知p53點突變發生在至少30個不同的密碼子內，通常引起顯性等位基因，導致細胞表型變化而不降低至純合狀態。此外，許多這些顯性負等位基因似乎在有機體中被耐受，并在種系中傳遞。多種突變等位基因似乎涵蓋從極小地功能不良到強滲透的顯性負等位基因(Weinberg，1991)。
Casey及同事已報道，編碼野生型p53的DNA向兩種人乳腺癌細胞系的轉染恢復了這種細胞中的生長抑制控制(Casey et al.，1991)。還證實了野生型p53而不是突變型p53向人肺癌細胞系中的轉染有相似作用(Takahasi et al.，1992)。p53似乎比突變基因更占支配地位，當將突變基因轉染到細胞內時，p53將選擇對抗增殖。轉染的p53的正常表達對具有內源野生型p53的正常細胞無毒害作用。因此，這樣的構建物可能被正常細胞吸收而無副作用。因此建議采用野生型p53表達構建物治療p53相關癌癥，將會降低惡性細胞的數量或其生長速率。此外，近來的研究暗示一些p53野生型腫瘤也對外源性p53表達的作用敏感。
細胞周期蛋白依賴型激酶或CDK’s觸發真核細胞周期的主要轉變。一種CDK，即細胞周期蛋白依賴型激酶4(CDK4)，調節通過G.sub.1階段的進程。這種酶的活性可能是在晚期G1磷酸化Rb。CDK4的活性受到激活性亞單元D型細胞周期蛋白、以及通過抑制性亞單元例如p16INK4的控制，后者已在生物化學上表征為特異性結合CDK4并抑制CDK4、因此可調節Rb磷酸化的蛋白質(Serrano et al.，1993；Serrano et al.，1995)。由于p16INK4蛋白質是CDK4抑制劑(Serrano，1993)，缺失這個基因可增強CDK4的活性，導致Rb蛋白質的過磷酸化。已知P16也能調節CDK6的功能。
p16INK4屬于最近被描述為CDK抑制蛋白質的類型，其中還包括p16B、p21.sup.WAF1、CIP1、SDI1和p27KIP1。所述p16INK4基因作圖到9p21處，一個在許多腫瘤類型中經常被缺失的染色體區。人腫瘤細胞系中經常發生p16INK4基因的純合和突變。這個事實表明p16INK4基因是腫瘤抑制基因。然而，由于觀察到原代未培養腫瘤中p16INK4基因改變的頻率比培養細胞系低，這種解釋已受到挑戰(Caldas et al.，1994；Cheng et al.，1994；Hussussian et al.，1994；Kamb et al.，1994a；Kamb et al.，1994b；Mori et al.，1994；Okamoto et al.，1994；Nobori et al.，1995；Orlow et al.，1994；Arap etal.，1995)。通過質粒表達載體的轉染恢復野生型pl6.sup.INK4功能降低了一些人癌細胞系的集落形成(Okamoto，1994；Arap，1995)。
實際上所有上皮細胞都表達C-CAM(Odin and Obrink，1987)。C-CAM的表觀分子量為105KD，其最初通過與中和細胞聚集的特異性抗體的反應而從大鼠肝細胞的細胞質膜中分離出來(Obrink，1991)。近來的研究顯示，C-CAM在結構上屬于免疫球蛋白(Ig)超家族，并且其序列與癌胚抗原(CEA)具有高度同源性(Lin and Guidotti，1989)。采用桿狀病毒表達系統，Cheung et al.(1993a、1993b和1993c)證明了C-CAM的第一個Ig區對細胞粘附活性是至關重要的。
已知細胞粘附分子，或CAM參與調節組織發育和細胞分化的分子相互作用的復雜網絡(Edelman，1985)。近來資料顯示幾種腫瘤的瘤形成中可能涉及CAM異常表達；例如E-cadherin(所述E-cadherin主要在表皮細胞中表達)的表達降低，并與幾種類型的腫瘤的發展有關(Edelmanand Crossih，1991；Frixen et al.，1991；Bussemakers et al.，1992；Matsuraet al.，1992；Umbas et al.，1992)。此外，Giancotti and Ruoslahti(1990)證明了通過基因轉移增加α5β1整合素表達可降低中國倉鼠卵巢細胞體內致瘤性。現在C-CAM已顯示能在體內外抑制腫瘤生長。
可用于本發明的其它腫瘤抑制基因包括BRCA1、BRCA2、zac1、p73、MMAC-1、ATM、HIC-1、DPC-4、FHIT、NF2、APC、DCC、PTEN、ING1、NOEY1、NOEY2、PML、OVCA1、MADR2、WT1、53BP2和IRF-1。可用于本發明的其它基因包括Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p57 P27/p16融合物、p21/p27融合物、抗血栓形成基因(例如COX-1、TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、血管形成中涉及的基因(例如VEGF、FGF、血小板反應蛋白、BAI-1、GDAIF或它們的受體)和MCC。相似地，凋亡誘導劑例如Bax、Bak、Bcl-X.s、Bik、Bid、Harakiri、Ad E1B、Bad和ICE-CED3蛋白酶也可用于本發明。
在某些實施方案中，腺病毒包含外源基因構建物mda-7基因。MDA-7是另一個公認的腫瘤抑制基因，并且顯示能抑制p53野生型、p53-null和p53-突變型癌細胞的生長。此外，在p53-null細胞中觀察到的凋亡相關Bax基因的上調顯示，MDA-7能采用p53非依賴性機制誘導癌細胞的破壞。
研究顯示，升高MDA-7表達能在體外抑制癌細胞生長，并選擇性誘導人乳腺癌細胞凋亡以及抑制裸鼠中的腫瘤生長(Jiang et al.，1996 and Suet al.，1998)。Jiang et al.(1996)報道了有關MDA-7是各種來源的癌細胞的強效生長抑制基因，這些來源包括乳腺、中樞神經系統、子宮頸、結腸、前列腺和結締組織。采用集落抑制分析證明了MDA-7的升高表達可增強對人宮頸癌(HeLa)、人乳腺癌(MCF-7和T47D)、結腸癌(LS174T和SW480)、鼻咽癌(HONE-1)、前列腺癌(DU-145)、黑色素瘤(HO-1和C8161)、多形性成膠質細胞瘤(GBM-18和T98G)和骨肉瘤(Saos-2)的生長抑制。正常細胞中的MDA-7過表達(HMECs、HBL-100和CREF-Trans6)顯示了有限的生長抑制，表明MDA-7轉基因作用在正常細胞中不明顯。總的來說，這些數據顯示在癌細胞中MDA-7的升高表達造成的體外生長抑制比正常細胞中更有效。S uet al.(1998)報道了MDA-7抑制癌細胞生長的機制的相關研究。該研究報道，如通過細胞周期分析和TUNEL分析所檢測的，在乳腺癌細胞系MCF-7和T47D中MDA-7的異常表達誘導凋亡，而對正常HBL-100細胞沒有影響。對腺病毒MDA-7(“Ad-MDA-7”)感染細胞的細胞裂解物進行的Western印跡分析顯示出凋亡刺激蛋白BAX上調。Ad-MDA-7感染僅僅在MCF-7和T47D細胞中升高BAX蛋白水平，但是不升高正常HBL-100細胞或HMEC細胞的BAX蛋白水平。這些數據引導研究者評價離體Ad-MDA-7轉導對MCF-7腫瘤細胞的異種移植腫瘤發生的影響。離體轉導導致抑制了腫瘤異種移植模型中的腫瘤形成和發展。這些特征顯示MDA-7作為PKR誘導物，從而作為誘導的免疫反應的增強劑而具有廣泛的治療、預測和診斷潛能。
多種酶基因也被視為治療基因。特別適合表達的基因包括被認為在對象哺乳動物靶細胞中的表達低于正常水平的那些基因。特別適用的基因產物的實例包括氨基甲酰合成酶I型、鳥氨酸氨甲酰轉移酶、精氨基琥珀酸合成酶、精氨基琥珀酸裂解酶和精氨酸酶。其它理想的基因產物包括延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羥化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受體、膽色素原脫氨酶、因子VIII、因子IX、胱硫醚β-合酶、支鏈酮酸脫羧酶、白蛋白、異戊酰-CoA脫氫酶、丙酰CoA羧化酶、甲基丙二酰CoA歧化酶、戊二酰CoA脫氫酶、胰島素、β-葡萄糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脫羧酶(還稱為P蛋白)、H-蛋白、T-蛋白、Menkes病銅轉運ATP酶和Wilson病銅轉運ATP酶。基因產物的另一些實例包括胞嘧啶脫氨酶、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶、苯丙氨酸羥化酶、葡萄糖腦苷脂酶、鞘磷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、HSV胸苷激酶和人胸苷激酶。激素是另外一類可用于本文所述載體的基因。其中包括生長激素、催乳素、胎盤催乳素、黃體生成素、促卵泡激素、絨毛膜促性腺激素、促甲狀腺素、瘦蛋白、促腎上腺皮質激素(ACTH)、血管緊張素I和II、β-內啡肽、β-黑素細胞刺激素(β-MSH)、膽囊收縮素、內皮素I、甘丙肽、腸抑胃肽(GIP)、胰高血糖素、胰島素、促脂解素、神經垂體素運載蛋白、生長抑素、降鈣素、降鈣素基因相關肽(CGRP)、β-降鈣素基因相關肽、惡性腫瘤因子的高血鈣(hypercalcemia of malignancyfactor)(1～40)、甲狀旁腺激素相關蛋白(107～109)(PTH-rP)、甲狀旁腺激素相關蛋白(107～111)(PTH-rP)、胰高血糖素樣肽(GLP-1)、胰抑制素、胰多肽、YY肽、PHM、促胰液素、血管活性腸肽(VIP)、催產素、加壓素(AVP)、加壓催產素、腦啡肽酰胺(enkephalinamide)、metorphinamide、α-黑素細胞刺激素(α-MSH)、心鈉素(5～28)(ANF)、支鏈淀粉、淀粉樣蛋白P組分(SAP-1)、促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)、生長激素釋放因子(GHRH)、黃體生成素釋放激素(LHRH)、神經肽Y、K物質(神經激肽A)、P物質、或促甲狀腺激素釋放激素(TRH)。可用于插入本發明的載體內的其它類基因包括白細胞介素和細胞因子。白細胞介素1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF和G-CSF。
可采用本發明病毒載體的疾病實例包括但不限于腺苷脫氨酶缺乏癥、血友病B中人凝血因子缺乏癥以及囊性纖維化，其中涉及置換囊性纖維化傳導調控物基因。本發明包含的載體還可通過轉移編碼血管生成抑制劑或細胞周期抑制劑的基因而用于治療過度增生病癥例如類風濕性關節炎或再狹窄。前藥活化劑例如HSV-TK基因的轉移還可用于治療過度增生病癥，包括癌癥。
3.反義構建物癌基因例如ras、myc、neu、raf、erb、src、fms、jun、trk、ret、gsp、hst、bcl和abl也是合適的靶標。然而，為了治療目的，這些癌基因將以反義核酸形式表達，以便抑制癌基因的表達。術語“反義核酸”意指與編碼癌基因的DNA和RNA的堿基序列補充的寡核苷酸。當反義寡核苷酸被導入靶細胞中時，其特異性地與其靶核酸結合并干擾轉錄、RNA加工、轉運和/或轉譯。用寡核苷酸靶向雙鏈(ds)DNA導致形成三螺旋，靶向RNA將導致形成雙螺旋。
可將反義構建物設計成與啟動子以及基因的其它控制區、外顯子、內含子或甚至外顯子-內含子邊界相結合。可采用反義RNA構建物或編碼這種反義RNA的DNA來體外或體內(例如宿主動物包括人受試者在內)抑制宿主細胞內的基因轉錄或轉譯，或二者。包含“補充核苷酸”的核酸序列是能根據標準Watson-Crick配對原則進行堿基配對的那些。也就是說，較大的嘌呤可與較小的嘧啶進行堿基配對，僅僅形成鳥嘌呤與胞嘧啶的配對(G:C)以及腺嘌呤與胸腺嘧啶的配對(A:T，在DNA情形下)，或腺嘌呤與尿嘧啶的配對(A:U，在RNA情形下)。
本文所用的術語“補充”或“反義序列”指在其全長上基本互補并具有非常少的堿基錯配的核酸序列。例如，當長度為15個堿基的核酸序列在13或14位處具有互補核苷酸而僅僅只有一個或兩個錯配時，它可被稱為補充。自然地，“完全補充”的核酸序列是指全長完全補充并且沒有堿基錯配的核酸序列。
雖然所有或部分的基因序列可被用于反義構建的情形下，但是，在統計上，任何17個堿基長的序列應當在人基因組中僅僅出現一次，因此，足以指定獨特的靶序列。雖然較短的低聚物更容易制備并增加體內可接近性，但是許多其它因素參與確定雜交特異性。隨長度增加，寡核苷酸與其補充靶的結合親和度和序列特異性都增加。預計可采用8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個堿基對的寡核苷酸。簡單地通過體外測試構建物以確定是否內源性基因的功能受到影響或具有互補序列的相關基因的表達受影響，可以容易地確定給定的反義核酸在靶向相應的宿主細胞基因時是否有效。
在某些實施方案中，可能希望采用包含其它元件的反義構建物，例如，包含C-5丙炔嘧啶的那些。已經顯示含有尿苷和胞苷的C-5丙炔類似物的寡核苷酸以高親和性與RNA結合并且作為基因表達的強效反義抑制劑(Wagner et al.，1993)。
作為靶向反義遞送的替代，可采用被靶向的核酶。術語“核酶”是指基于RNA的酶，其能靶向并切開癌基因DNA和RNA中的特定堿基序列。核酶可以以摻入核酶序列的RNA寡核苷酸形式直接被靶向到細胞中，或作為編碼所需核酶RNA的表達構建物形式導入細胞中。可以以反義核酸所述大致相同的方式使用和應用核酶。
4.疫苗的抗原其它的治療基因可包括編碼抗原例如病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原或寄生蟲抗原的基因。病毒包括小核糖核酸病毒、冠狀病毒、披膜病毒、黃病毒(flavirvirus)、彈狀病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼病毒、沙粒病毒(arenvirus)、呼腸孤病毒、逆轉錄病毒、乳多空病毒、細小病毒、皰疹病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒(hepadnavirus)和海綿狀病毒。優選的病毒靶包括流感病毒、單純皰疹病毒1和2、麻疹病毒、天花病毒、脊髓灰質炎病毒或HIV。病原體包括錐蟲、絳蟲、蛔蟲、蠕蟲。而且，腫瘤標記物例如胚胎抗原或前列腺特異性抗原也可以以這種方式進行靶向。優選的實例包括HIV env蛋白質和乙型肝炎表面抗原。出于疫苗接種目的施用本發明的載體要求載體相關抗原是充分無免疫原性，以便能長期表達轉基因，針對該轉基因希望得到強的免疫反應。優選地，僅需不經常地對個體接種疫苗，例如每年或每兩年一次并且提供對感染原的長期免疫保護。
5.控制區為了使病毒載體能實現編碼治療基因的轉錄物的表達，編碼所述治療基因的多核苷酸將受啟動子和多腺苷酸化信號的轉錄控制。因此，本發明的某些實施方案包括生產腺病毒的方法，其中所述腺病毒包含編碼與啟動子可操作連接的外源基因構建物的腺病毒載體。“啟動子”是指被宿主細胞的合成機制或所導入的合成機制所識別的啟動基因特異性轉錄所需要的DNA序列。多腺苷酸化信號是指被宿主細胞的合成機制或所導入的合成機制所識別的、指導將一系列核苷酸添加到mRNA轉錄物的末端來適當地加工轉錄物并將其從細胞核內轉運到細胞質中進行轉譯的DNA序列。短語“可操作地連接”、“在控制下”和“在轉錄控制下”是指所述啟動子相對于該多核苷酸處于正確位置而控制RNA聚合酶的啟動和多核苷酸的表達。
本文所用的術語啟動子是指一類聚集在RNA聚合酶II起始位點周圍的轉錄控制組件。對于啟動子是怎樣被組織起來的許多思考源于對幾種病毒啟動子的分析，包括用于HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期轉錄單元的那些啟動子。這些研究被更多近期的工作所擴展，已顯示啟動子由離散的功能組件組成，每個模塊由約7～20bp的DNA組成，并且含有轉錄激活物或阻遏蛋白的一個或多個識別位點。
各個啟動子中至少一個組件起到決定RNA合成的起始位點的作用。其最好的已知實例是TATA盒，但是在一些缺少TATA盒的啟動子中，例如哺乳動物末端脫氧核苷酸轉移酶基因啟動子和SV40晚期基因啟動子中，與起始位點重疊的離散元件自身幫助固定起始位置。
另外的啟動子元件調節轉錄起始的頻率。典型地，這些元件位于開始位點上游的30～110bp區，盡管近來許多啟動子已顯示在開始位點的下游也同樣包含功能元件。啟動子元件之間的間距經常是靈活的，從而當元件彼此相對地反轉或移動時仍保留啟動子功能。在tk啟動子中，啟動子元件之間的間距可增加到50bp，之后活性才開始下降。根據啟動子地不同，似乎各元件可協同地或獨立地激活轉錄。
用于控制治療基因表達的特定啟動子并不被認為是至關重要的，只要其能在靶細胞中表達該多核苷酸即可。所述啟動子可以是組織特異性啟動子或誘導型啟動子。可采用的啟動子實例包括SV40 EI、RSV LTR、β-肌動蛋白、CMV-IE、腺病毒主要晚期、多瘤病毒F9-1、α-胚胎蛋白啟動子、egr-1或酪氨酸酶啟動子。本領域技術人員熟悉可得到的可用于控制治療基因表達的啟動子選擇范圍。因此，在靶向人細胞時，優選將多核苷酸編碼區安置在能在人細胞中得到表達地的啟動子附近并處于其控制之下。一般而言，這樣的啟動子可包括人或病毒啟動子。表2提供了啟動子列表。
表2


所述啟動子可以是組成型啟動子、誘導型啟動子或組織特異性啟動子。誘導型啟動子是除非存在誘導物質，否則是無活性或展示低活性的啟動子。可包括在本發明部分中的啟動子的一些實例包括但不限于MT II、MMTV、膠原酶、溶基質素、SV40、鼠MX基因、α-2-巨球蛋白、MHCI類基因h-2kb、HSP70、增殖蛋白、腫瘤壞死因子或促甲狀腺激素α基因。表3顯示相關的誘導物。應當理解，任何誘導型啟動子可用于本發明的實踐中，并且所有這樣的啟動子將落入本發明權利要求的精神和范圍中。“內源性”或“組成型”啟動子是一種天然地與基因或序列相關的啟動子，可通過分離位于編碼片段和/或外顯子上游的5’非編碼序列得到。
表3

在多種實施方案中，人巨細胞病毒(CMV)立即早期基因啟動子、SV40早期啟動子和Rous肉瘤病毒長末端重復序列可用于高水平表達感興趣的多核苷酸。假如表達水平足夠產生生長抑制作用，則還可采用本領域公知的可實現多核苷酸表達的其它病毒或哺乳動物細胞或噬菌體啟動子。
通過使用具有熟知性質的啟動子，可將轉染后多核苷酸的表達水平和模式最優化。例如，選擇在特定細胞中具有活性的啟動子，例如酪氨酸酶(黑色素瘤)、α-甲胎蛋白和白蛋白(肝腫瘤)、CC10(肺腫瘤)和前列腺特異性抗原(前列腺腫瘤)啟動子允許治療基因的組織特異性表達。
最初增強子是以能增加位于同一DNA分子上遠端位置處的啟動子轉錄的基因元件形式被發現的。在原核轉錄調控的經典研究中，很少有這種能長距離起作用的先例。后來的工作顯示，具有增強子活性的DNA區更像啟動子那樣被組織起來。也就是說，它們由許多單個元件組成，各個元件結合一個或多個轉錄蛋白。
增強子與啟動子之間的基本區別是操作性。總體上增強子區必須能在一定距離內刺激轉錄；而啟動子區或其組成元件無需如此。另一方面，啟動子必須具有一個或多個能指導在特定位點和特定方向上啟動RNA合成的元件，而增強子缺乏這樣的特異性。啟動子和增強子常常是重疊并且毗鄰的，經常表面上看來具有非常相似的組件組織。
此外，任何啟動子/增強子組合(按照真核啟動子數據庫(EPDB))還可用于驅動特定構建物的表達。采用T3、T7或SP6細胞質表達系統是另外一種可能的實施方案。如果以遞送復合物部分或作為附加的基因表達載體形式提供適當的細菌噬菌體聚合酶，真核細胞可支持某些噬菌體啟動子的細胞質轉錄。
當采用cDNA插入物時，典型地希望包含多腺苷酸化信號以實現所述基因轉錄物的適當多聚腺苷酸化。并不認為所述多腺苷酸化信號的性質對于成功實施本發明來說至關重要，并且可以采用任何這樣的序列。已發現來自SV40、牛生長激素和單純皰疹病毒胸苷激酶基因的這種多腺苷酸化信號在多種靶細胞中功能良好。
F.分離腺病毒的方法腺病毒感染導致被感染細胞的裂解。腺病毒感染的裂解特征允許兩種不同模式的病毒分離和生產。一種是在細胞裂解之前收獲感染的細胞。另一種模式是在生產的病毒將細胞完全裂解后收集病毒的上清液。對于后一種模式，為了實現完全細胞裂解，需要較長的培養時間。這種病毒感染后培養時間延長引起了對有復制能力的腺病毒(RCA)產生的可能性增加的高度關注，對于當前的第一代腺病毒載體(E1缺失型載體)尤其如此。因此，在本發明的某些實施方案中，生產腺病毒的方法包括收獲宿主細胞，然后裂解所述宿主細胞。表4列舉了用于細胞收獲后裂解細胞的最常規方法。
表4

1.去污劑在本發明的某些實施方案中，生產腺病毒的方法包括用去污劑裂解宿主細胞來分離腺病毒。細胞被細胞膜約束。為了釋放細胞組分，需要打開細胞。根據本發明，可完成這個過程的最有利方法是采用去污劑溶解細胞膜。去污劑是具有脂肪族或芳香族性質的非極性末端和可帶電荷或不帶電荷的極性末端的兩性分子。去污劑比脂質更親水，因此水溶性比脂質更大。它們允許水不溶性的化合物分散在含水培養基中并用于分離和純化天然形式的蛋白質。
本發明可采用任何能裂解宿主細胞的去污劑。本領域技術人員熟悉寬范圍的可用于裂解細胞的去污劑。去污劑可以是變性的或非變性的。前者可以是陰離子型的例如十二烷基硫酸鈉或陽離子型的例如乙基三甲基溴化銨。這些去污劑完全破壞細胞膜并通過打斷蛋白質-蛋白質相互作用使蛋白質變性。非變性去污劑可被分成非陰離子型去污劑例如TritonX-100、膽汁鹽例如膽酸鹽以及兩性離子去污劑例如CHAPS。兩性離子型去污劑在相同分子中包含陽離子和陰離子基團，通過相同分子或相鄰分子的負電荷來中和正電荷。
變性劑例如SDS作為單體結合蛋白質，該反應平衡驅動直到飽和。因此，單體的游離濃度決定需要的去污劑濃度。SDS結合是同性的，即一個SDS分子的結合將增強另一個分子與該蛋白質結合的可能性，并且將蛋白質改變成桿狀，其長度與其分子量成比例。
非陰離子型去污劑例如TritonX-100不與天然構型結合，它們也不具有協同結合機制。這些去污劑具有不滲透到水溶性蛋白質內的剛性和大的極性部分。它們結合蛋白質疏水部分。TritonX-100和其它聚氧乙烯非陰離子型去污劑難于打開蛋白質-蛋白質相互作用，并且可引起蛋白質的人工聚集。然而，這些去污劑破壞蛋白質-脂質相互作用但是很溫和，并能維持蛋白質的天然形式和功能性。
可嘗試多種方法去除去污劑。對以單體形式存在的去污劑進行透析的效果較好。對于容易聚集成膠束的去污劑進行透析有時效率較低，這是由于膠束太大而不能通過透析所致。可采用離子交換層析避開這個問題。將所述被破壞的蛋白質溶液施加到離子交換層析柱上，然后用無去污劑的緩沖液清洗所述層析柱。由于緩沖液與去污劑溶液的平衡而可除去去污劑。作為替代，可將蛋白質溶液通過密度梯度。蛋白質沉淀通過梯度時，去污劑將因為化學勢而去除。
通常一種去污劑不足以溶解和分析細胞中發現的所有蛋白質。可將蛋白質溶解在一種去污劑中，隨后置于另一種適當的去污劑中來分析蛋白質。應當將第一步中形成的蛋白質去污劑膠束與純的去污劑膠束分開。當將它們添加到過量的去污劑超過用于分析時，蛋白質與兩種去污劑形成膠束。可用離子交換或凝膠過濾層析、透析或浮力密度型分離完成去污劑-蛋白質膠束的分離。
a.TritonX-去污劑這一類去污劑(TritonX-100、X114和NP-40)具有相同的基本特征，但是它們的特異性疏水-親水性質不同。所有這些非均質去污劑具有連在芳香環上的8-碳支鏈。這部分分子導致了去污劑疏水性質的大部分。TritonX-100去污劑用于在非變性條件下溶解膜蛋白質。用于溶解蛋白質的去污劑的選擇將取決于待溶解蛋白質的疏水性質。疏水性蛋白質需要疏水性去污劑來有效溶解它們。
TritonX-100和NP-40在結構和疏水性上非常相似，并可在大多數應用中進行互換，所述應用包括細胞裂解、脫脂蛋白質解離以及膜蛋白質和脂質溶解。通常使用2mg去污劑1mg膜蛋白質或10mg去污劑溶解1mg脂質膜。TritonX-114用于從親水性蛋白質中分離疏水性蛋白質。
b.Brij去污劑這些去污劑與TritonX去污劑結構相似，因為它們具有長度可變的連接在疏水性鏈上的聚氧乙烯鏈。然而，與TritonX去污劑不同，Brij去污劑不具有芳香環并且碳鏈長度是可變的。采用透析較難將所述Brij去污劑從溶液中除去，但是可被去除去污劑的膠除去。Brij58與TritonX100的疏水性/親水性特征最相似。Brij35是HPLC應用中經常使用的去污劑。
c.可透析(Dializable)非離子型去污劑η-辛基-β-D-葡萄糖苷(辛基吡喃葡萄糖苷)和η-辛基-β-D-硫代葡萄糖苷(辛基吡喃硫代葡萄糖苷、OTG)是容易從溶液中透析的非變性非離子型去污劑。這些去污劑可用于溶解膜蛋白質并且在280nm處具有低UV吸收。辛基葡萄糖苷的CMC高達23～25mM，并且已經以1.1～1.2％的濃度用于溶解膜蛋白質。
辛基硫代葡萄糖苷首先是以提供辛基葡萄糖苷的替代方式合成的。辛基葡萄糖苷生產成本高，并且由于可被β-葡萄糖苷酶水解，所以具有一些固有的生物系統問題。
d.Tween去污劑Tween去污劑是非變性、非離子型去污劑。它們是脂肪酸的聚氧乙烯脫水山梨醇酯。Tween20去污劑和Tween80去污劑在生物化學應用中用作封閉劑，通常被添加到蛋白質溶液中以防止與疏水性物質例如塑料或硝酸纖維素的非特異性結合。它們在ELISA和印跡應用中已被用作封閉劑。通常，這些去污劑以濃度0.01～1.0％使用，以防止與疏水性物質進行非特異性結合。
Tween20和其它的非離子型去污劑已顯示可從硝酸纖維素的表面除去一些蛋白質。Tween80已用于溶解膜蛋白質，防止蛋白質與多孔塑料組織培養板的非特異性結合，并用于降低ELISA中血清蛋白質和生物素化蛋白質A與聚苯乙烯板的非特異性結合。
這些去污劑之間的區別在于脂肪酸鏈的長度不同。Tween80來源于具有C18鏈的油酸，而Tween20來源于具有C12鏈的月桂酸。較長的脂肪酸鏈使得Tween80去污劑的親水性比Tween20去污劑更小。這兩種去污劑的水溶性非常好。
所述Tween去污劑較難通過透析從溶液中除去，但是可通過去除去污劑的凝膠將Tween20除去。這些去污劑中存在的聚氧乙烯鏈使得它們氧化(過氧化物形成)，這一點與TritonX和Brij系列去污劑一致。
e.兩性離子型去污劑兩性離子型去污劑，CHAPS，是膽酸的磺基三甲銨乙內酯衍生物。當蛋白質活性重要時，這種兩性離子型去污劑可用于溶解膜蛋白質。這種去污劑在較廣的pH范圍(pH2～12)內有用，并且由于CMC(8～10mM)較高而容易通過透析從溶液中除去。這種去污劑在280nm處具有低吸收，當需要在此波長下監測蛋白質時可使用這種去污劑。CHAPS與BCA蛋白質分析相兼容，并可通過去除去污劑的凝膠從溶液中除去。蛋白質可在CHAPS存在下被碘化。
CHAPS已被成功用于溶解內在膜蛋白質和受體，并維持蛋白質的功能能力。當將細胞色素P-450溶解在TritonX-100或膽酸鈉中時，將形成聚集體。
2.非去污劑方法盡管不是優選的，但可結合本發明的其它優選方面使用多種非去污劑方法a.冷凍-融化這種方法被廣泛用作溫和和有效的裂解細胞技術。例如，通常將細胞快速冷凍在干冰/乙醇浴中直到完全冷凍，然后轉移到37℃浴中直到完全融化。這種循環反復進行數次以達到完全裂解細胞。
b.超聲處理已發現高頻率超聲振動可用于破壞細胞。通過超聲波破碎細胞的方法還沒有被完全理解，但是已知當懸浮物經受超聲振動時產生高的瞬間壓力。這種技術的主要缺點在于產生相當大量的熱。為了將熱能最小化，采用特殊設計的玻璃容器來容納細胞懸浮物。這樣的設計允許所述懸浮物從超聲探針到容器外側進行循環，在此該容器受到冷卻，因為瓶子被懸浮在冰中。
c.高壓擠出這是經常使用的用于破碎微生物細胞的方法。French細胞壓碎器施用10.4×107Pa(16,000p.s.i.)的壓力來破碎細胞。這些設備由通過針形閥裝置朝外開口的不銹鋼室組成。將細胞懸浮物置于所述室中，其中針形閥處于密閉位置。將所述室倒轉后，打開閥并推進活塞以擠出室中的任何氣體。閥門處于密閉位置時，室恢復到其原始位置，置于基于活塞的固定上并且通過水壓在活塞上施用所需的壓力。當達到壓力時針形閥部分打開，稍微釋放壓力，并隨細胞膨脹而爆發。將閥保持在打開狀態同時維持壓力，使得破碎細胞成細流流出，可收集所述細胞。
d.固體剪切法在直徑500nm的玻璃珠存在下，在Mickle振蕩器中強力(300～3000次/分鐘)振蕩懸浮物可實現用研磨劑進行的機械剪切。這種方法可導致細胞器的損傷。更受控制的方法是采用Hughes壓碎器，其中用活塞迫使大部分細胞與研磨劑一起深度冷凍細胞糊或在壓力室中通過直徑0.25mm的槽。可采用最高5.5×107Pa(8000p.s.i.)的壓力裂解細菌制備物。
e.液體剪切法這些方法采用攪拌機，所述攪拌機采用高速往返或轉動刀片，使用往返運動的活塞和球狀物的勻漿器以及采用高速通過小直徑管或高速碰撞兩種流體細流的微流體化儀或碰撞射流。攪拌機的刀片傾斜成不同的角度以允許有效混合。通常在幾秒的短暫高速爆發下操作勻漿器以將局部熱最小化。這些技術通常不適用于微生物細胞，但是甚至非常溫和的液體剪切通常足以破壞動物細胞。
f.低滲/高滲法將細胞暴露于含有較低(低滲)或較高(高滲)溶質濃度的溶液中。溶質濃度的不同引起滲透壓梯度。在低滲環境中水向細胞內的流動引起細胞膨脹和破裂。在高滲環境中水流出細胞引起細胞皺縮和隨后的破裂。
G.濃縮和過濾方法本發明包括生產腺病毒的方法，其中包括分離腺病毒。從宿主細胞分離腺病毒的方法包括本領域技術人員公知的任何方法。例如，這些方法可包括澄清化、濃縮和滲濾。純化方法中的一個步驟可包括澄清化細胞裂解物以從細胞裂解物中除去大顆粒物質，尤其是細胞成分。采用深層過濾器或切向流過濾可實現裂解物的澄清化。在本發明的一個實施方案中，濃縮所述細胞裂解物。濃縮粗制細胞裂解物可包括本領域技術人員公知的任何步驟。例如，可通過深層過濾器濃縮粗細胞裂解物，所述深層過濾器由相對無吸附性的物質(例如聚酯樹脂、沙、硅藻土、膠體、凝膠等等)的填充柱組成。在切向流過濾(TFF)中，裂解物溶液流過膜表面，該膜表面促使溶質從膜表面向本體溶液中的反向擴散。膜通常安裝再多種類型的過濾裝置種，包括明渠板和框架、中空纖維和細管。
澄清化和預過濾細胞裂解物后，可濃縮所得的病毒上清液，并可通過滲濾更換緩沖液。可通過穿過標稱截留分子量為100～300K的超濾膜的切向流過濾濃縮病毒上清液。超濾是采用半透膜通過分子大小、形狀和/或電荷進行分離的加壓改進傳遞方法。其將溶劑與多種大小的溶質分開，而與溶質分子的大小無關。超濾是溫和的、有效的，并且可同時用于溶液的濃縮和除鹽。超濾膜通常具有兩個不同的層孔直徑為10～400埃的薄的(0.1～1.5μm)、密集外層和逐漸增大空間的開口亞結構，其能很大程度地朝超濾膜的滲透面開放。因此，能通過外層孔的任何種類可自由地通過膜。為了最大程度地截留溶質，選擇標稱截留分子量明顯低于待截留種類的膜。在大分子濃縮中，所述膜富集需要的生物物質的含量并提供除去了截留物質的濾液。用溶劑傳遞性除去微溶質。隨截留溶質的濃度增加，超濾速率下降。
本發明的一些實施方案包括更換粗制細胞裂解物的緩沖液。包括采用超濾過濾器的緩沖液更換或滲濾是一種理想的，用于除去和更換鹽、糖、非水溶劑、將游離物質與結合物質分開、除去低分子量物質、或快速改變離子和pH環境的方法。以等于超濾速率的速率下向被超濾的溶液中添加溶劑可最有效地除去微溶質。這樣以恒定體積從溶液中洗去小物質，由此純化截留的物質。
H.除去核酸污染物腺病毒生產方法的某些實施方案包括降低粗制細胞裂解物中污染核酸的濃度。本發明采用核酸酶除去污染核酸。示例性核酸酶包括Benzonase、Pulmozyme或本領域通常使用的任何其它DNA酶或RNA酶。
例如Benzonase之類的酶降解核酸并沒有蛋白水解活性。Benzonase快速水解核酸的能力使得該酶可理想地用于降低細胞裂解物粘度。眾所周知核酸可粘附到細胞來源的顆粒例如病毒上。由于凝聚、顆粒尺寸變化或顆粒電荷變化，這種粘附可干擾分離，導致采用給定的純化方案時僅回收到很少或沒有產物。Benzonase非常適合在純化期間降低核酸負載，因此消除干擾并提高產率。
像所有的核酸內切酶一樣，Benzonase水解特定核苷酸之間的內部磷酸二酯鍵。消化完全時，溶液中存在的所有游離核酸被降至2～4個堿基長度的寡核苷酸。
I.大小分配純化根據本發明的一個方面，已發現大小分配純化技術可用于提供足夠純度的腺病毒制備物，所述足夠純度的腺病毒制備物可被治療性地施用而不需要另外的純化步驟例如層析以及先前認為必要的其它方法。不希望被本發明的任何特定理論約束，相信在無血清培養基的懸浮細胞培養中處理病毒宿主細胞的步驟能得到污染物負載降低的病毒顆粒產物。而且，污染物的大小和性質能使它們容易地通過簡單的大小分配純化步驟而從病毒顆粒中分離。
膜過濾是生物處理領域熟知的技術。膜被定義為側向尺寸明顯大于其厚度的結構，通過所述膜可在多種驅動力下進行傳質。雖然許多過濾器可被認為是膜，但是過濾器還包括側向尺寸通常不大于其高度100倍，并且其分離功能主要通過其高度來捕獲物質或顆粒的材料。用于表征膜的最常見的參數落入3個普通類別。它們是轉運性質、孔(幾何的)特征和表面(或主要指化學的)性質。然而，轉運性質主要取決于孔和表面特征。雖然膜分離可以比其它分離方法更慢并且體積處理更小，但其效力使得它成為回收小量有價值產物的優選方法。
可采用多種方式設計膜過濾系統使得具有不同的過濾性能。設計標準包括死端(攪拌或不攪拌)或錯流模式；完全或部分地回收進料混合物、通過泵施加外部跨膜壓力、惰性氣體覆蓋或設備滲透面的排空(evacuation)；和平板(或單層或多層)、中空纖維束或管狀膜的用途。優選的大小分配分離方法采用大小分配膜可以是透析或其它相似的膜，正如本領域一般技術人員公知的。可用于本發明大小分配膜過濾的適當的透析膜材料包括那些市售類型，例如由聚醚砜、聚碳酸酯、尼龍、聚丙烯等等生產的那些。這些透析膜材料的供應商包括例如Akzo-Nobel、Millipore，Inc.、Poretics，Inc.和Pall Corp.。孔徑小于0.08微米的大小分配膜可用于實施本發明，并且孔徑小于0.05微米和小于0.02微米并且大于0.001微米的那些是特別優選的。這樣的膜能夠允許合乎需要的病毒顆粒通過而截留不需要的污染物。
根據本發明的一個方面，已發現切向流過濾(TFF)單元，也被稱為“錯流過濾”，特別優選用于實施本發明。切向流過濾是一種壓力驅動的分離方法，其中流體沿著膜表面切向泵入。施加的壓力迫使部分包含污染物的流體通過膜以達到濾出物尺寸。太大以致于不能通過膜孔的顆粒和大分子被截留在上游側。常規的流動過濾(NFF)技術將截留的組分阻塞在膜表面，與其相反，切向流過濾通過流體的流動將截留的組分清除掉。
基于被分離組分的大小來劃分TFF。膜孔徑等級典型地以微米值給出，表示大于所述等級的顆粒將被膜截留。另一方面，標稱分子量限制(NMWL)是指征，表示大多數分子量大于該NMWL的溶解大分子和一些分子量小于NMWL的分子將被膜截留。組分的形狀、其變形的能力以及其與溶液中其它組分的相互作用都影響截留。不同的膜制造商采用不同的標準來確定膜類的NMWL等級，但是一般技術人員應當能憑借經驗確定適當的等級。
超濾是最廣泛應用的TFF形式之一，用于降蛋白質與緩沖液成分分開，進行緩沖液更換、脫鹽或濃縮，而且還可用于病毒過濾。用于病毒過濾的典型NMWL等級為100kD～500kD或最高0.05～0.08微米。
滲濾是可組合任何其它類分離方法以提高產率或純度而進行的TFF方法。在滲濾期間，將緩沖液導入再循環罐中，同時將過濾物從單元操作中除去。在產物處于滯留物內的過程中，滲濾將成分從產物池中沖洗到濾液中，因此更換緩沖液并降低不需要物質的濃度。當產物在過濾物中時，滲濾將其從膜上沖洗到收集容器中。
在TFF單元操作中，采用泵來產生通過兩個膜表面之間的通道供料流流量。在流體每次流經膜表面期間，施加的壓力迫使部分流體通過膜并進入濾液流。結果形成從通道中心的稀疏條件到膜表面的更濃縮壁條件的供料濃度梯度。在逐漸增多的流體通過過濾物側時，還沿供料通道長度從進口到出口(滯留物)方向形成濃度梯度。沿膜長度的供料流引起從供料到通道滯留末端的壓力下降。膜濾液側的流量典型地較低并且很少受到限制，所以濾液側沿膜長度的壓力接近恒定。
膜可由多種材料制成，在流動特征和化學兼容性方面提供替代物。適用的材料包括纖維素、聚醚砜和本領域公知的其它材料，并且聚醚砜是特別優選的。典型的聚醚砜膜易于吸附蛋白質以及其它的生物組分，導致膜污染以及流量降低。一些膜被親水地改性以便對污垢更有耐受性，例如Biomax(Millipore)。
本領域技術人員應當承認，多種類型的TFF模塊對實施本發明有用。有用的TFF模塊包括但不限于平板模塊(也稱為盒)、螺旋狀纏繞模塊和中空纖維模塊。在平板模塊中，具有或不具有分離篩交替層的膜層堆積在一起，然后密封包裝。供料流體在該堆積塊的一個末端被泵入交替通道內，濾液通過膜進入濾液通道。平板模塊通常具有高的堆積密度(膜表面積/地面空間面積)，允許線性縮放，并且一些提供開放或湍流促進通道的選擇。
螺旋狀纏繞模塊包括膜和圍繞中空中央核心的分離篩的交替層。將供料流泵入一個末端并沿柱體軸流動。濾出物通過膜并在核心處盤旋，在此將其除去。所述分離篩增加流路中的湍流，導致模塊的效能高于中空纖維。螺旋纏繞的一個缺點是由于供料流路長度(柱體長度)或濾液流路長度(柱體寬度)必須在刻度內變化，所以不能線性規模化。
中空纖維模塊由一束直徑狹窄(典型地為0.1到2.0mm)的膜管組成。在中空纖維模塊中，將原料流泵入所述管的內腔(內部)并且過濾物通過膜到達殼側，在殼側將其除去。由于供料流路非常開闊，甚至在適中的錯流速率下也能產生低剪切力。
對于任何給定的模塊，一般技術人員可容易地最優化關鍵的工藝參數。這些參數包括錯流速率、跨膜壓力(TMP)、過濾物控制、膜面積和滲濾設計。錯流速率取決于選擇的模塊。一般而言，在相等的TMP下，較高的錯流速率得到較高的流量，并增加沿膜的清除作用以及降低向膜表面方向的濃度梯度。許多TFF應用采用錯流和壓力設定點并且濾液部受控制、不受限制地流出模塊。這是最簡單的操作類型，但是在一些情形下，可能希望采用通過用回流閥簡單地調整壓力不能實現的某些類型的濾液控制。確定處理流量和待處理的總體積后選擇膜面積，這還取決于處理時間。
根據本發明的一個方面，采用板框TFF系統，其中各個300KD、500KD或1000KD聚砜膜的表面積為1.1ft2。錯流速率為900mL/ft2/分鐘，跨膜壓力為約7psi。濾液的速率不受主動控制，并且采用恒定體積法進行滲濾。
本發明提供生產純化的腺病毒組合物的方法，其中避免了對包括層析純化步驟的多次純化步驟的需求。然而，如果需要，可實施另外的純化步驟，包括本領域公知的那些。這樣的方法包括美國專利No.6,194,191中教導的那些，其內容通過引用作為參考，包括密度梯度離心；包括尺寸排阻色譜、離子交換色譜、高效液相色譜(HPLC)等的層析法。
J.藥物配方在某些實施方案中，本發明包括生產腺病毒的方法，其包括將所述腺病毒置于藥學可接受的組合物中。本發明還包括通過本文公開的方法之一制備的腺病毒組合物，其中所述組合物是藥學可接受的組合物。
當根據上述方法純化時，可通過多種方式施用本發明的病毒顆粒，包括體外、離體或體內的方式。因此，以適于目的應用的藥物組合物形式制備該復合物將比較合乎需要。通常這要求制備基本上不含熱原、以及任何可對人或動物有害的其它雜質的藥物組合物。可能還希望使用適當的鹽和緩沖劑以使復合物穩定并允許復合物被靶細胞吸收。
短語“藥學可接受的組合物”指當適當地施用給動物或人時，不產生副反應、過敏反應或其它不利反應的分子實體和組合物。本文所用的“藥學可接受的組合物”包括任何和所有的溶劑、分散介質、包衣劑、抗菌藥和抗真菌藥、等滲劑和吸收延遲劑等等。這樣的介質和藥劑作為藥物活性物質的應用是本領域熟知的。除了與活性組分不相容的任何常規介質或藥劑外，預計它可在治療組合物中使用。補充性活性成分還可加入到所述組合物中。此外，所述組合物可包括補充性無活性成分。例如，用作漱口液的組合物可包含食用香料，或所述組合物可包含使得制劑定時釋放的補充成分。
本發明的含水組合物包括溶解或分散在藥學可接受的載體或含水介質中的有效量的表達盒。這樣的組合物還指接種體。含水組合物的實例包括靜脈內施用的配方或局部應用的配方。
可在適當混合表面活性劑(例如羥丙基纖維素)的水中制備游離堿或藥理學可接受鹽形式的活性化合物的溶液。還可在甘油、液體聚乙二醇、及其混合物和油中制備分散體。在一般儲存和使用條件下，這些制備物含有防腐劑以防止微生物生長。
本發明的病毒顆粒可包括用于治療方案包括向人施用的經典藥物制備物。可通過任何常規途徑施用本發明的治療組合物，只要通過所述途徑可達到靶組織即可。這包括口服、鼻腔、口腔、直腸、陰道或局部施用。作為替代，可通過同位(orthotopic)、皮內、皮下、肌肉內、腹膜內或靜脈內注射施用。這樣的組合物通常地作為藥學可接受的組合物施用，所述藥學可接受的組合物包括生理上可接受的載體、緩沖劑或其它賦形劑。對于抗腫瘤應用，預期直接腫瘤內注射、注射切除的腫瘤床、局部(即淋巴)或整體施用。還希望可通過導管向例如腫瘤或腫瘤部位的疾病部位進行數小時或數天的連續灌注。
可方便地以液體溶液或懸浮物形式施用本發明的治療和預防性組合物；還可以制備在局部使用前適于溶解或懸浮在液體中的固體形式。為了這樣目的的典型組合物包括藥物可接受的載體。例如，該組合物可以每ml磷酸緩沖鹽水中包含10mg、25mg、50mg或最高約100mg人血清白蛋白。另外的藥學可接受的載體包括水溶液、無毒賦形劑(包括鹽、防腐劑、緩沖液)等等。非水溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有機酯例如油酸乙酯。水性載體包括水、醇溶液/水溶液、鹽溶液、胃腸外賦形劑例如氯化鈉、Ringer′s右旋葡萄糖等等。防腐劑包括抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體。根據公知的參數調整藥物組合物中各種成分的pH和精確濃度。
口服配方包括通常采用的賦形劑，例如藥用級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等等。這些組合物采用溶液形式例如漱口劑和漱口水、懸液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋配方和/或粉末。在某些確定的實施方案中，口服藥物組合物將包含惰性稀釋劑和/或可吸收食用的載體、和/或可將它們裝入硬和/或軟殼明膠膠囊內、和/或壓制成片劑、和/或直接將它們摻入飲食的食物中。對于口服治療施用，活性化合物可與賦形劑合并和/或以可吸收的片劑、口含片、含片、膠囊、酏劑、懸劑、糖漿劑、圓片和/或等等形式施用。這樣的組合物和/或制備物應當包含至少0.1％的活性化合物。當然，所述組合物和/或制備物的百分率可變化和/或可便利地為約2到約75％的單元重量，和/或優選25到60％。這樣的治療上有用的組合物中活性化合物的量是能得到適當劑量的量。
片劑、錠劑、丸劑、膠囊和/或等等還可包含以下組分黏合劑，例如黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉和/或明膠；賦形劑，例如磷酸氫鈣；崩解劑例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸和/或等等；潤滑劑例如硬脂酸鎂；和/或甜味劑，例如可添加蔗糖、乳糖和/或糖精，和/或調味劑，例如薄荷糖、冬青油、和/或櫻桃香精。當劑量單位形式是膠囊時，除了上述類型的物質外，其還可包含液體載體。多種其它的物質可作為包衣劑存在和/或另外改變劑量單位的物理形式。例如可用紫膠、糖和/或兩者同時對片劑、丸劑、和/或膠囊進行包衣。酏劑的糖漿可包含活性化合物蔗糖作為甜味劑，對羥基苯甲酸甲酯和/或對羥基苯甲酸丙酯作為防腐劑，染料和/或調味劑例如櫻桃和/或橙子調味劑。
對于口服施用，本發明的表達盒可與賦形劑合并，并且以不可吸收的漱口劑和潔齒劑形式使用。可將所需量的活性成分摻入適當溶劑例如硼酸鈉溶液(德肯氏液)中制備漱口劑。作為替代，活性成分可被摻入含有硼酸鈉、甘油和碳酸氫鉀的抗菌洗液中。該活性成分還可分散在潔齒劑中，包括凝膠、糊劑、粉末和漿。可將治療有效量的活性組分添加到糊狀潔齒劑中，所述糊狀潔齒劑可包含水、粘合劑、磨料、香味劑、發泡劑和保濕劑。
本發明的組合物可以中性或鹽形式配制。藥學可接受的鹽包括酸加成鹽(用蛋白質的游離氨基形成)和與無機酸例如鹽酸或磷酸、或有機酸例如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等等形成的那些。與游離羧基形成的鹽還可來源于無機堿例如氫氧化鈉、鉀、銨、鈣或氫氧化鐵，以及有機堿例如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等等。
在本發明中還可使用溶液和/或噴霧劑、皮下注射、氣霧劑和/或吸入劑進行給藥。一個實例是噴霧劑，用于施用于呼吸消化道。噴霧劑是等滲的和/或輕微緩沖以維持pH為5.5～6.5。此外，如果需要，可將抗微生物防腐劑、與眼科制備物中使用的那些相似和/或適當的藥物穩定劑加入配方中。適于其它施用方式的另外配方包括陰道或直腸栓劑和/或子宮托。其它局部施用類型的配方包括例如霜、栓劑、油膏或藥膏。
基于期望目標來確定治療劑的有效量，例如(i)抑制腫瘤細胞增殖，(ii)消除或殺死腫瘤細胞，(iii)接種疫苗，或(iv)基因轉移用于長期表達治療基因。術語“單位劑量”是指適用于對象的物理上離散的單位，結合其施用，即適當的途徑和治療方案，每一單位包含如上所述經計算將產生所需反應的預定量的治療組合物。待施用的量，根據治療次數和單位劑量，將取決于待治療的對象、所述對象的狀態和所需的結果。希望采用多次基因治療方案，對于腺病毒尤其如此。
在本發明的某些實施方案中，編碼腫瘤抑制基因的腺病毒載體被用于治療癌癥患者。用于癌癥基因治療的腺病毒載體的典型量是103-1015PFU/劑量，(103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015)，其中所述劑量可分成在實體瘤內不同部位的幾次注射。治療方案還包括在3～10周的時間周期內施用幾個循環的基因轉移載體。從幾個月到幾年時間內長期施用載體對于連續治療作用可能是必要的。
本發明的另外一個實施方案中，編碼治療基因的腺病毒載體可用于對人或其它哺乳動物進行接種。典型地，對產生期望作用有效的病毒的量，在這種情形下是接種，可施用給人或哺乳動物以實現長期表達轉基因以及形成強的宿主免疫反應。預計采用一系列注射，例如初次注射后接著兩次加強注射，將足以誘導長期的免疫反應。根據所需的結果，典型的劑量為106～1015PFU/注射。低劑量的抗原通常誘導強的細胞介導反應，而高劑量的抗原通常誘導抗體介導的免疫反應。治療組合物的精確量還取決于從業者的判斷，并且對每個個體而言是獨特的。
實施例納入下面的實施例以證明本發明的優選實施方案。本領域技術人員應當理解，隨后實施例中公開的技術代表本發明人發明的技術在本發明的實踐中功能良好，因此可被看成構成其實施的優選模式。然而，根據本發明內容，本領域技術人員應當理解，對公開的具體實施方案可進行許多改變，仍然可得到相像或相似的結果而不脫離本發明的精神和范圍。
實施例1根據這個實施例，根據圖1描述的生產和純化過程，采用裝有YSI-2700 SELECTTM生物化學分析儀的10L(5L工作體積)WaveBioreactor20/50EH(Wave Biotech，LLC)，用培養基灌注進行細胞培養和腺病毒載體生產。圖3描述灌注Wave生物反應器(10)，其包含含有細胞培養基(14)的膨脹塑料袋(12)，和內部平面灌注過濾器(16)以隔開細胞和消耗培養基。通過進料泵(22)從進料袋(18)將培養基供應到生物反應器中，通過漂浮濾器(16)將消耗的培養基用收集泵回收到收集袋(20)。控制器(26)控制所述泵和生物反應器(10)的功能。不需要進行培養基再循環，因此這種方式的培養基灌注對于培養物中的細胞非常溫和。在灌注期間，波動作用使過濾器阻塞最小化。通過用于引發新鮮培養基添加的負載小室來維持灌注期間的培養體積。將根據美國專利No.6,194,191的方法適應于無血清懸浮培養的HEK293(人表皮胚腎細胞)以4.8×105個細胞/ml進行接種，并允許其在無蛋白質的CD293培養基(InvitrogenTM)中生長到1.2×106個細胞/ml。在培養的第3天，在細胞濃度為1.7×106個細胞/ml時開始灌注培養基。在第6天，細胞濃度指數地增加到約1×107個細胞/ml，并且細胞存活率維持在90％以上。圖4和圖5顯示培養期間細胞生長的存活率和營養物/代謝物濃度。
擺動速率設置在10，并且擺動角度設置在11。通過調整氣體混合器遞送的CO2氣體百分率來維持培養物pH。采用Wave BiotechTM提供的一次性溶氧壓(DOT)探針監測培養基中DOT。
當細胞濃度達到1×107個細胞/ml時，用新鮮CD293培養基將細胞培養物稀釋10倍以補充營養物，并且將潛在有毒性的代謝物稀釋到WaveBiotechTM生物反應器中(無灌注濾器)。然后用腺病毒載體(AdCMVp53)在MOI為50vp/細胞下感染所述細胞。AdCMVp53是基因工程化、非復制型的人5型腺病毒，其在巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子的控制下表達人野生型p53蛋白質。感染允許進行2天。在感染后的第2天收集培養物。然后采用裝有500KD Biomax膜盒的Pellicon 2微型系統對病毒收集物進行TFF濃縮并用Benzonase酶處理。
采用陰離子交換HPLC法測量腺病毒載體產量。發現生物反應器中腺病毒載體的濃度是1.1×1011vp/ml，病毒產量為1.1×1016vp，細胞特異性載體生產力為126,000vp/細胞。
實施例2根據這個實施例，采用裝有500KD Biomax膜盒的Pellicon 2微型系統對實施例1中的產物進行采用切向流過濾(TFF)膜的滲濾。在采用pH8的500mM Tris緩沖液滲濾之前采用Pellicon 2微型系統將澄清的收集物濃縮20倍。通過恒定體積法進行滲濾。當濾出物透出膜時，新鮮的滲濾緩沖液被持續添加到系統中。下面表5列舉了采用100L生產規模進行的研究。培養基中缺乏胎牛血清使得采用TFF膜分配滲濾作為高回收率的病毒純化方法是可行的。
表5

下面表6描述了通過無蛋白質懸浮方法生產的2種病毒載體產物的感染率(PFU/vp比率)。通過OD260分析測定病毒顆粒濃度并且通過TCID50分析測定感染單位(IU)濃度。這證實了通過無蛋白質懸浮方法生產的病毒與那些來自含有血清的生產方法的病毒一樣具有感染力。
表6

將上面表6描述的各個滲濾產物以及采用傳統柱層析純化的病毒制備物進行SDS-PAGE分析，以測定污染物的存在。圖2描述的結果顯示即使起初的HPLC分析證明純度較好，滲濾純化的病毒制備物中仍然存在雜質。
將所得的純化病毒產物與通過采用層析純化的傳統方法制備的病毒制備物進行比較。SDS-PAGE分析顯示柱純化的病毒仍然顯著更純。雖然通過HPLC分析支持了通過大小分配實現了顯著的純化，但是SDS-PAGE分析顯示仍有雜質存在。
圖6顯示了對比由Wave生物反應器方法生產的基因表達產物與由CellCube生物反應器生產的那些的進一步試驗。在感染力和活性方面，通過實施Wave懸浮方法生產的病毒與通過CellCube方法生產病毒具有可比性。
在生產純化的病毒制備物中，采用無血清懸浮培養基中懸浮培養物的wave生物反應器以及切向流過濾的組合提供了提高的可規模化和病毒產率。
根據本公開內容，可實施和制備本文公開的和請求保護的所有方法和組合物而無需過度試驗。雖然根據優選的實施方案描述了本發明的組合物和方法，但是對本領域技術人員顯而易見的是，可對所述方法和組合物以及本文描述的方法的步驟或步驟順序進行改動而不脫離本發明的概念、精神和范圍。更具體而言，顯而易見可采用化學上和生理上相關的某些藥劑代替本文描述的藥劑而得到相同的或相似的結果。所有這樣的相似替代和改動對于本領域技術人員是顯而易見的，并被認為包括在本發明所附權利要求限定的精神、范圍和概念內。
參考文獻下面的參考文獻被本文特別引用作為參考，在一定程度上它們提供了示例性程序或對本文闡明的那些另外詳細補充。
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權利要求
1.一種從含病毒的組合物中除去污染物的方法，所述方法包括得到包含選定病毒和不需要的污染物的含水組合物，和采用具有分配孔的大小分配膜使所述含水組合物經過大小分配純化，以除去污染物并由此提供純化的病毒組合物，其中所述分配孔可截留病毒并允許污染物從那里通過。
2.權利要求1的方法，其中所述病毒是腺病毒、慢病毒、腺伴隨病毒、逆轉錄病毒或皰疹病毒。
3.一種生產純化的腺病毒組合物的方法，所述方法包括a)宿主細胞在培養基中生長；b)向所述宿主細胞提供營養物；c)用腺病毒感染所述宿主細胞；d)裂解所述宿主細胞以提供包含腺病毒的細胞裂解物；和e)采用大小分配膜通過大小分配純化法從所述裂解物中純化腺病毒，以提供純化的腺病毒組合物。
4.權利要求1或3的方法，其中所述大小分配膜是透析膜。
5.權利要求1或3的膜，其中所述大小分配膜是多孔過濾器。
6.權利要求1或3的方法，其中所述大小分配膜在切向流過濾裝置中。
7.權利要求1或3的方法，其中所述大小分配膜的孔徑小于約0.08微米。
8.權利要求5的方法，其中所述大小分配膜的孔徑小于約0.08微米并且大于約0.0001微米。
9.權利要求5的方法，其中所述大小分配膜的孔徑小于約0.05微米并且大于約0.0001微米。
10.權利要求5的方法，其中所述大小分配膜的孔徑小于約0.02微米并且大于約0.0001微米。
11.權利要求5的方法，其中所述大小分配膜的孔徑小于約0.01微米并且大于約0.0001微米。
12.權利要求1或3的方法，其中不采用離子交換層析法，將所述病毒純化至藥學可接受的等級。
13.權利要求1或3的方法，其中所述培養基是無血清培養基并且所述宿主細胞能在無血清培養基中生長。
14.權利要求13的方法，其中已通過逐步減少生長培養基中胎牛血清含量而使所述宿主細胞適應于在無血清培養基中生長。
15.權利要求3的方法，其中所述宿主細胞是293細胞。
16.權利要求3的方法，其中通過以下方法進行裂解步驟，所述方法包括低滲溶液、高滲溶液、碰撞射流、微流體化、固體剪切、去污劑、液體剪切、高壓擠出、自溶或超聲處理。
17.權利要求16的方法，其中通過去污劑裂解來裂解所述細胞。
18.權利要求16的方法，其中通過去污劑Thesit、NP-40、Tween-20、Brij-58、Triton X-100或辛基葡萄糖苷裂解所述細胞。
19.權利要求17的方法，其中所述去污劑以約1％(w/v)的濃度存在于裂解溶液中。
20.權利要求3的方法，其中所述宿主細胞至少部分時間生長在灌注室、生物反應器、柔性床平臺中或通過補料分批培養。
21.權利要求1的方法，其中所述純化的腺病毒組合物的純度為每1毫升劑量中污染DNA少于10毫微克。
22.權利要求3的方法，其中所述腺病毒包含編碼外源基因構建物的腺病毒載體。
23.權利要求21的方法，其中所述基因構建物可操作地連接啟動子。
24.權利要求23的方法，其中所述啟動子是SV40 IE、RSV LTR、β-肌動蛋白、CMV IE、腺病毒主要晚期、多瘤病毒(polyoma)F9-1、或酪氨酸酶。
25.權利要求22的方法，其中所述外源基因構建物編碼治療基因。
26.權利要求22的方法，其中所述治療基因編碼反義ras、反義myc、反義raf、反義erb、反義src、反義fms、反義jun、反義trk、反義ret、反義gsp、反義hst、反義bcl、反義abl、Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶或p53。
27.權利要求22的方法，其中所述治療基因編碼p53。
28.權利要求22的方法，其中所述腺病毒是非復制型腺病毒。
29.權利要求22的方法，其中所述腺病毒缺少至少部分的E1區。
30.權利要求22的方法，其中所述腺病毒缺少至少部分的E1A區和/或E1B區。
31.權利要求22的方法，其中所述宿主細胞能進行互補復制。
32.權利要求22的方法，其中用含有葡萄糖的培養基以提供大于0.5g/L葡萄糖濃度的速率灌注所述細胞。
33.權利要求22的方法，其中用含有葡萄糖的培養基以提供約0.7g/L～1.7g/L葡萄糖濃度的速率灌注所述細胞。
34.權利要求1或3的方法，其中用Benzonas或Pulmozym處理所述細胞裂解物。
35.權利要求1或3的方法，其中所述細胞作為細胞懸浮培養物生長。
36.權利要求1或3的方法，其中所述細胞作為貼壁依賴型培養物生長。
37.權利要求3的方法，其中從單個培養制備物中得到至少5×1015個病毒顆粒。
38.權利要求37的方法，其中得到至少1×1016個病毒顆粒。
39.根據權利要求1-38中任一項的方法生產的純化的腺病毒組合物。
全文摘要
本發明涉及生產腺病毒組合物的改進方法，其中宿主細胞生長在生物反應器中并通過大小分配純化法來純化，以提供純化的腺病毒組合物。
文檔編號C12Q1/68GK101080488SQ200580042334
公開日2007年11月28日 申請日期2005年7月22日 優先權日2004年11月3日
發明者哈伊·范, 張書園, 彼得·克拉克 申請人:因特羅根治療公司