產生l－氨基酸的細菌和產生l－氨基酸的方法

專利名稱：產生l－氨基酸的細菌和產生l－氨基酸的方法
技術領域：
本發明涉及在棒狀桿菌型細菌發酵期間，通過使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產生L-氨基酸的方法，所述L-氨基酸具體為L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-纈氨酸、L-丙氨酸和L-賴氨酸。
背景技術：
L-氨基酸如L-谷氨酸是通過使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產生的，且通常以利用棒狀桿菌型細菌的發酵方法以工業規模產生，棒狀桿菌型細菌包括具有產生L-氨基酸的能力的短桿菌屬(Brevibacterium)和棒桿菌屬(Corynebacterium)。為了改進棒狀桿菌型細菌的L-氨基酸生產力，已使用從自然界分離的菌株或其人工突變體(JP07-121228B，JP07-121228B，JP06-237779A，Adv Biochem Eng Biotechnol.2003；7959-112.J Biotechnol.2003 Sep 4；104(1-3)155-72.和WO95/34672)。
當需氧細菌(aerobic bacteria)，特別是棒狀桿菌型細菌，在限氧(oxygen-limited)條件下培養時，除目標物質(target substance)以外的有機酸如乳酸和乙酸作為副產物過量積累。這種積累抑制細菌的生長，并大大地降低發酵過程中細菌的生產力。此外，中和這些有機酸的過量的反荷離子(counterion)是必需的，這增加了生產成本。因此，希望創造出在培養過程中產生更少乙酸的菌株，如催化乙酸產生的酶的活性被減少或消除的菌株。
使用催化乙酸產生的酶的活性被減少或消除的菌株的發酵方法實例包括，使用乙酰磷酸轉移酶(pta)和乳酸脫氫酶(ldh)活性缺陷的大腸桿菌(Escherichia coli)來產生L-氨基酸(WO99/06532)，利用丙酮酸氧化酶(poxB)活性缺陷的腸細菌科(Enterobacteriaceae family)來產生L-氨基酸，和利用丙酮酸氧化酶(poxB)活性缺陷的腸桿菌科可來產生D-泛酸(D-panthotheic acid)(WO02/36797)。
已將乙酸激酶(ack)和乙酰磷酸轉移酶(pta)報導為參與棒狀桿菌型細菌中乙酸的同化作用(assimilation)的酶(Microbiology，1999 Feb；145(Pt2)503-13)。同樣，已報導了棒狀桿菌型細菌，其中產生乙酸的酶丙酮酸氧化酶(poxB)被破壞(EP1096013A)。
乙酰輔酶A水解酶是一種從乙酰輔酶A和水產生乙酸的酶(3.1.2.1)，且已公開了預測編碼谷氨酸棒桿菌的乙酰輔酶A水解酶的核苷酸序列(EP1108790A)。但是，還沒有關于該基因實際克隆和表達分析的報導；因此該基因的實際(actual)功能也還未確認。

發明內容
本發明的目的是提供棒狀桿菌型細菌，所述棒狀桿菌型細菌具有改進的、通過使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產生L-氨基酸的能力，并提供使用這種細菌有效地產生上述L-氨基酸的方法。
本發明的發明者進行了廣泛的研究以完成上述目的。結果，他們發現通過減少棒狀桿菌型細菌中乙酰輔酶A水解酶的活性，提高了產生L-氨基酸，尤其是L-谷氨酸、L-纈氨酸和L-丙氨酸的能力，并因此完成了本發明。
本發明的一個目的是提供具有產生L-氨基酸能力的棒狀桿菌型細菌，其中所述棒狀桿菌型細菌被修飾以使乙酰輔酶A水解酶活性減少，而且其中所述L-氨基酸是通過使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產生的一種或多種L-氨基酸。
本發明的另一個目的是提供如上所述的棒狀桿菌型細菌，其中通過在染色體的乙酰輔酶A水解酶基因的編碼區或表達調控區引入突變來減少所述乙酰輔酶A水解酶活性。
本發明的另一個目的是提供如上所述的棒狀桿菌型細菌，其中是通過破壞染色體乙酰輔酶A水解酶基因來減少所述乙酰輔酶A水解酶活性。
本發明的另一個目的是提供如上所述的棒狀桿菌型細菌，其中所述乙酰輔酶A水解酶選自下組(A)包含SEQ ID NO24所示氨基酸序列的蛋白質；和(B)包含SEQ ID NO24所示氨基酸序列的蛋白質，其中在所述蛋白質中取代、缺失、插入或添加一個或幾個氨基酸，且其中所述蛋白質具有乙酰輔酶A水解酶活性。
本發明的另一個目的是提供如上所述的棒狀桿菌型細菌，其中所述乙酰輔酶A水解酶基因選自下組(a)包含SEQ ID NO23的核苷酸1037到2542的基因；和(b)DNA，其能夠在嚴緊條件下與包含SEQ ID NO23的核苷酸1037至2542的多核苷酸或由所述多核苷酸制備的探針雜交，并編碼了具有乙酰輔酶A水解酶活性的蛋白。
本發明的另一個目的是提供如上所述的棒狀桿菌型細菌，其中所述棒狀桿菌型細菌被進一步地修飾，以提高谷氨酸脫氫酶活性。
本發明的另一個目的是提供如上所述的棒狀桿菌型細菌，其中所述L-氨基酸是一種或多種選自下組的L-氨基酸L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸和L-賴氨酸。
本發明的另一個目的是提供一種產生L-氨基酸的方法，包括在培養基中培養如上所述的棒狀桿菌型細菌；和從培養基中收集L-氨基酸，其中所述L-氨基酸是通過使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產生的一種或多種L-氨基酸。
本發明的另一個目的是提供如上所述的方法，其中所述L-氨基酸是一種或多種選自下組的L-氨基酸L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸和L-賴氨酸。
附圖簡述

圖1顯示了構建質粒pBS3的方法。
圖2顯示了構建質粒pBS4的方法。
圖3顯示了構建質粒pBS5T的方法。
圖4顯示了構建質粒pΔldh56-1的方法。
圖5顯示了構建質粒pBS4S::Δach的方法。
優選實施方案描述以下將對本發明的實施方案進行詳細地描述。
<1>具有通過使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產生L-氨基酸的能力的棒狀桿菌型細菌在本發明中，棒狀桿菌型細菌的實例包括常規的棒狀桿菌型細菌，也包括曾經被歸入短桿菌屬，但現在被歸入棒桿菌屬的細菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1991))，以及與棒桿菌屬細菌非常接近的(close)短桿菌屬細菌。這些棒狀桿菌型細菌的實例包括如下嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)烷醇棒桿菌(Corynebacterium alkanolyticum)美棒桿菌(Corynebacterium callunae)谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)百合花棒桿菌(Corynebacterium lilium)棲糖蜜棒桿菌(Corynebacterium melassecola)嗜熱產氨棒桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)(Corynebacteriumefficiens)力士棒桿菌(Corynebacterium herculis)二歧短桿菌(Brevibacterium divaricatum)黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)Brevibacterium immariophilum乳發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒桿菌)玫瑰色短桿菌(Brevibacterium roseum)解糖短桿菌(Brevibacterium saccharolyticum)生硫短桿菌(Brevibacterium thiogenitalis)產氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)白色短桿菌(Brevibacterium album)蠟狀短桿菌(Brevibacterium cerinum)嗜氨微桿菌(Microbacterium ammoniaphilum)棒狀桿菌型細菌的具體實例如下嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870醋谷棒桿菌ATCC15806烷醇棒桿菌ATCC21511美棒桿菌ATCC15991谷氨酸棒桿菌ATCC13020，ATCC13032，ATCC13060，ATCC13869百合花棒桿菌ATCC15990棲糖蜜棒桿菌ATCC17965
嗜熱產氨棒桿菌AJ12340(FERM BP-1539)力士棒桿菌ATCC13868二歧短桿菌ATCC14020黃色短桿菌ATCC13826，ATCC14067，AJ12418(FERM BP-2205)Brevibacterium immariophilum ATCC 14068乳發酵短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC13869玫瑰色短桿菌ATCC13825解糖短桿菌ATCC14066生硫短桿菌ATCC19240產氨短桿菌ATCC6871，ATCC6872白色短桿菌ATCC15111蠟狀短桿菌ATCC15112嗜氨微桿菌ATCC15354這些菌株可從美國典型培養物保藏中心(ATCC，地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，United States of America)獲得。即，給予每個菌株唯一的登記號，該登記號列于ATCC的目錄中。可以利用這個登記號定購菌株。根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)的規定，將AJ12340菌株于1989年10月27日保藏在通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(National Instituteof Bioscience and Human Technology，Agency of Industrial Science andTechnology，Ministry of International Trade and Industry(目前為，獨立行政法人產業技術綜合研究所特許微生物保藏中心(International Patent OrganismDepositary，National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，地3址Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-5466，Japan)，并給予登錄號FERM BP-1539。根據布達佩斯條約的規定，將AJ12418菌株于1989年1月5日保藏在通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所，并給予登錄號FERM BP-2205。
“通過使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產生的L-氨基酸”優選指具有衍生自丙酮酸的碳骨架的L-氨基酸。這類L-氨基酸的實例包括L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸和L-賴氨酸。如本文所用的，“通過使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產生L-氨基酸的能力”，指在培養基中培養本發明的棒狀桿菌型細菌時，導致在培養基中積累一種或多種上述L-氨基酸的能力。
產生L-氨基酸的能力可以是棒狀桿菌型細菌的野生型菌株的原始能力，或是通過培育被賦予的能力。此外，產生L-氨基酸的能力可以通過修飾被賦予，所述修飾導致乙酰輔酶A水解酶活性的減少，如后文所述。
為了賦予產生L-氨基酸的能力，可以使用培育棒狀桿菌型細菌所用的常規方法，例如創造代謝調節突變菌株，或創造目標物質的生物合成酶的活性增強的重組菌株(見“Amino Acid Fermentation”，Center for AcademicPublications Japan Co.，Ltd.，1st ed.Published on May 30，1986，p.77 to 100)。在這些方法中，可以單獨或組合使用引入代謝調節突變和增強目標物質生物合成酶的方法。此外，可以引入兩個或兩個以上的突變，且可以增強兩個或兩個以上的酶活性。
賦予產生L-谷氨酸的能力的實例是增強編碼L-谷氨酸生物合成酶的基因的表達。涉及L-谷氨酸生物合成的酶的實例包括谷氨酸脫氫酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶、烏頭酸水合酶、檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構酶、果糖二磷酸醛縮酶、果糖磷酸激酶和葡糖磷酸異構酶。
增強這些基因的表達可以通過以下方法完成，將含有所述基因的DNA插入適當的質粒，該質粒能夠在棒狀桿菌型細菌中自主復制，然后用所得質粒轉化細菌細胞；或通過同源重組、接合(conjugation)、轉座(transposition)等將所述基因整合到染色體上(EP0756007B，EP0332488A EP0771879A)；或在所述基因的啟動子區域引入突變(WO/0018935)，或以強啟動子取代。
當上述基因通過質粒引入或整合到染色體上時，用于表達這些基因的啟動子可以是任何啟動子，只要該啟動子能夠在棒狀桿菌型細菌中起作用。這類啟動子的實例包括lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、PS2啟動子和pL啟動子。也可以使用每個基因的天然(native)啟動子。
通過修飾以使檸檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因，和/或谷氨酸脫氫酶基因表達增強的微生物的實例包括，在JP2001-333769A(EP1078989A)、JP2000-106869A(EP955368A)、JP2000-189169A(EP952221A)和JP2001-333769A(EP1078989A)中所公開的微生物。
賦予產生L-谷氨酸的能力的修飾也包括減少或消除酶的活性，所述的酶催化除L-谷氨酸之外的化合物的合成，和從L-谷氨酸生物合成途徑分支。這類酶的實例包括異檸檬酸裂合酶、α-酮戊二酸脫氫酶、磷酸轉乙酰酶、乙酸激酶、乙酰羥酸合酶、乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase)、甲酸乙酰轉移酶(formate acetyltransferase)，乳酸脫氫酶和谷氨酸脫羧酶。
為了減少或消除上述酶的活性，可以在染色體上這些酶的基因處，引入導致酶活性減少或喪失的突變或缺失。這可以通過以下方法實現，例如，破壞染色體上編碼這些酶的基因，或修飾所述基因的表達控制序列如啟動子和/或Shine Dargarno(SD)序列。另外，可以通過引入導致氨基酸取代的錯義突變、產生終止密碼子的無義突變、或在編碼區添加或缺失一個或兩個核苷酸的移碼突變；或通過缺失該基因的一部分來減少或消除這些酶的活性(Journalof Biological Chemistry 2728611-8617(1997))。此外，可以通過如下方法減少或消除這些酶的活性構建編碼突變酶的基因，所述基因的編碼區缺失，并通過同源重組用所得基因取代染色體基因。α-酮戊二酸脫氫酶活性被減少的棒狀桿菌型細菌的實例包括在JP7-834672A和JP06-237779中公開的菌株。
此外，賦予產生L-谷氨酸的能力的方法實例包括修飾菌株以增強編碼yggB基因的基因表達，或修飾菌株以在YggB中引入突變的方法(NCgl 1221；NP_600492.Reports small-conductance...[gi19552490])(美國專利申請No.60/715131)。
也可以通過下方法賦予產生L-谷氨酸的能力篩選對有機酸類似物、呼吸抑制劑、或超氧化物產生物具有抗性的菌株，或篩選對細胞壁合成的抑制劑具有敏感性的菌株。這類方法的實例包括賦予對苯并吡喃酮(benzopirone)或萘醌(naphtoquinone)的抗性(JP56-1889A)，賦予對單氟乙酸(monofluoroaceticacid)的抗性(JP 50-113209A)，賦予對腺嘌呤和胸腺嘧啶的抗性(JP57-065198)，賦予對HOQNO的抗性(JP56-140895A)，賦予對α-酮丙二酸(α-ketomalonic acid)的抗性(JP57-2689A)，賦予對胍的抗性(JP56-35981A)，賦予對道諾霉素(daunomicin)的抗性(JP58-158192A)，以及賦予對青霉素的敏感性(JP04-88994A)。
這類細菌的具體實例包括下列菌株黃色短桿菌AJ3949(FERM BP-2632；JP 50-113209A)
谷氨酸棒桿菌AJ11628(FERM P-5736；JP57-065198A)黃色短桿菌AJ11355(FERM P-5007；JP56-1889A)谷氨酸棒桿菌AJ11355(FERM P-5020；JP56-1889A)黃色短桿菌AJ11217(FERM P-4318；JP57-2689A)谷氨酸棒桿菌AJ11218(FERM P-4319；JP57-2689A)黃色短桿菌AJ11564(FERM P-5472；JP56-140895A)黃色短桿菌AJ11439(FERM P-5136；JP56-35981A)谷氨酸棒桿菌H7684(FERM BP-3004；JP04-88994A)乳發酵短桿菌AJ11426(FERM P5123；JP56-048890A)谷氨酸棒桿菌AJ11440(FERM P5137；JP56-048890A)乳發酵短桿菌AJ11796(FERM P6402；JP58-158192A)賦予產生L-纈氨酸的能力的方法實例包括修飾菌株以增強編碼L-纈氨酸生物合成酶的基因的表達的方法。L-纈氨酸生物合成酶的實例包括由ilvBNC操縱子編碼的酶，即，由ilvBN編碼的乙酰羥酸合成酶和由ilvC編碼的異構還原酶(isomero-reductase)(WO00/50624)。ilvBNC操縱子受到L-纈氨酸、L-異亮氨酸和L-亮氨酸的任何組合的轉錄阻抑(transcriptional repression)，所以最好進行釋放稀釋(release attenuation)，以避免作為產物的L-纈氨酸的轉錄阻抑。
可以通過減少或消除至少一種酶的活性將產生L-纈氨酸的能力賦予棒狀桿菌型細菌，所述酶催化減少L-纈氨酸的產生量的反應。例如，可以通過減少催化異亮氨酸合成的蘇氨酸脫水酶的活性，或通過減少催化D-泛酸(D-panthothenate)合成的酶的活性賦予產生L-纈氨酸的能力(WO00/50624)。
也可以通過將對氨基酸類似物等的抗性賦予棒狀桿菌型細菌來賦予產生L-纈氨酸的能力。
例如，可以使用對于L-異亮氨酸和L-甲硫氨酸是營養缺陷的，并對D-核糖、嘌呤核糖核苷或嘧啶核糖核苷有抗性的產生L-纈氨酸的突變菌株(FERM P-1841，FERM P-29，JP-B-53-025034)，對聚酮化合物有抗性的產生L-纈氨酸的突變菌株(FERM P-1763，FERM P-1764；JP-B006-065314)，對L-纈氨酸有抗性，且對丙酮酸類似物如β-氟丙酮酸(β-fluoropyruvic acid)敏感的產生L-纈氨酸的突變菌株(FERM BP-3006，BP-3007，Patent 3006929)。
具有產生L-丙氨酸的能力的棒狀桿菌型細菌的實例包括H+-腺苷三磷酸酶(H+-ATPase)活性缺陷的棒狀桿菌型細菌(Appl Microbiol Biotechnol.2001Nov；57(4)534-40)，以及擴增的具有(amplified with)編碼天冬氨酸β-脫羧酶結構基因的棒狀桿菌型細菌(JP-A-7-163383)。
可以通過修飾棒狀桿菌型細菌以增強編碼L-精氨酸生物合成酶的基因的表達來賦予產生L-精氨酸的能力。L-精氨酸生物合成酶的實例包括N-乙酰谷氨酰磷酸還原酶(argC)、鳥氨酸乙酰轉移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鳥氨酸轉氨酶(argD)、鳥氨酸氨甲酰基轉移酶(argF)、精氨琥珀酸合成酶(argG)、精氨琥珀酸裂合酶(argH)和氨甲酰磷酸合成酶。這些精氨酸生物合成基因存在于Arg操縱子(argCJBDFRGH)上，且受到由argR編碼的精氨酸抑制劑(repressor)的調控(J Bacteriol.2002 Dec；184(23)6602-14)。因此，精氨酸抑制劑的破壞導致Arg操縱子表達的增加，因此增強產生L-精氨酸的酶的活性(US2002-0045223)。
賦予產生L-精氨酸的能力的另一種方法是，例如通過賦予對氨基酸類似物的抗性。棒狀桿菌型細菌的實例包括對2-噻唑丙氨酸(2-thiazolealanine)有抗性，并且對于L-組氨酸、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-甲硫氨酸或L-色氨酸營養缺陷的棒狀桿菌型細菌(JP-A-54-044096)；對酮丙二酸、氟丙二酸(fluoromalonic acid)或單氟乙酸有抗性的棒狀桿菌型細菌(JP-A-57-18989)；對精氨醇(argininol)有抗性的棒狀桿菌型細菌(JP-B-62-024075)；對x-胍有抗性的棒狀桿菌型細菌(x是脂肪酸或脂肪鏈衍生物)(JP-A-2-186995)；和對精氨酸氧肟酸(arginine hydroxamate)和6-氮尿嘧啶有抗性的棒狀桿菌型細菌(JP-A-57-150381)。
賦予產生L-谷氨酰胺的能力的方法實例是通過修飾棒狀桿菌型細菌來增強編碼L-谷氨酰胺生物合成酶的基因的表達。L-谷氨酰胺生物合成酶的實例包括谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脫氫酶(US2003-0003550)。
也可以通過減少或消除催化反應的酶的活性來賦予產生L-谷氨酰胺的能力，所述反應從L-谷氨酰胺生物合成途徑分支、且產生其它化合物。例如，可以通過減少谷氨酰胺酶的活性來賦予產生L-谷氨酰胺的能力(US2004-0152175)。
也可以通過賦予對L-氨基酸類似物的抗性來賦予產生L-谷氨酰胺的能力。這些方法的實例包括，賦予對于6-重氮-5-氧-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-norleucine)的抗性的方法(JP-A-3-232497)，賦予對于嘌呤類似物和/或甲硫氨酸亞砜(methionine sulfoxide)的抗性的方法(JP-A-61-202694)，賦予對于α-酮丙二酸的抗性的方法(JP-A-56-151495)，以及賦予對于含谷氨酸的肽的抗性的方法(JP-2-186994)。
產生L-谷氨酰胺的棒狀桿菌型細菌的具體實例包括以下菌株黃色短桿菌AJ11573(FERM P-5492，JP56-161495A)黃色短桿菌AJ11576(FERM BP-10381，JP56-161495A)黃色短桿菌AJ12212(FERM P-8123，JP61-202694A)黃色短桿菌AJ12418(FERM BP-2205，JP02-186994A)黃色短桿菌DH18(FERM P-11116，JP03-232497A)棲糖蜜棒桿菌DH344(FERM P-11117，JP3-232497A)谷氨酸棒桿菌AJ11574(FERM P-5493，JP56-151495A)賦予產生L-脯氨酸的能力的方法實例包括修飾棒狀桿菌型細菌以增強編碼L-脯氨酸生物合成酶的基因的表達的方法。L-脯氨酸生物合成酶的實例包括谷氨酸激酶、γ-谷氨酰磷酸還原酶(γ-glutamyl phosphate reductase)和脯氨酸-5-羧化物還原酶(pyroline-5-carboxylate reductase)(J Bacteriol.1996Aug；178(15)4412-9.)。
也可以通過減少或消除催化反應的酶的活性賦予產生L-脯氨酸的能力，所述反應從L-脯氨酸生物合成途徑分支、并產生其它化合物。例如，可以通過減少鳥氨酸轉氨酶(ornithine-aminotransferase)的活性來賦予產生L-脯氨酸的能力(J Bacteriol.1996 Aug；178(15)4412-9.)。
同時，因為L-精氨酸、L-谷氨酰胺和L-脯氨酸含有L-谷氨酸作為碳骨架，所以可以通過擴增編碼酶的基因賦予產生這些氨基酸的能力，所述酶在上述產生L-谷氨酸的細菌中，催化導致從L-谷氨酸產生上述每種L-氨基酸的反應。
此外，由于L-丙氨酸是通過L-天冬氨酸的β-脫羧合成的，所以可以通過修飾產生L-天冬氨酸的細菌以使乙酰輔酶A水解酶活性減少來獲得產生L-丙氨酸的細菌。
通過育種賦予或增強L-賴氨酸生產力可以通過引入一個或多個下列的突變來進行。這樣的人工突變體如下所示對于S-(2-氨乙基)-半胱氨酸(在下文中稱為“AEC”)具有抗性的突變體；生長需要氨基酸例如L-高絲氨酸的突變體(參見日本專利公布號4828078和566499)；對于AEC具有抗性且需要氨基酸例如L-亮氨酸、L-高絲氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸等的突變體(參見美國專利3,708,395和3,825,472)；對于DL-氨基己內酰胺、氨基月桂基內酰胺(aminolauryllactam)、天冬氨酸類似物、磺胺類藥、醌型化合物和N-月桂基亮氨酸(N-lauroylleucine)具有抗性的產生L-賴氨酸的突變體，和對于草酰乙酸脫羧酶或呼吸系統酶抑制劑具有抗性的產生L-賴氨酸的突變體(參見日本專利Laid-Open編號5053588，5031093，52102498，539394，5386089，559783，559759，5632995和5639778，日本專利公布號5343591和531833)；需要肌醇或乙酸的產生L-賴氨酸的突變體(見日本專利Laid-Open編號559784和568692)；對于氟丙酮酸或對34℃或更高的溫度敏感的生產L-賴氨酸的突變體(見日本專利LaidOpen編號5386090)；對于乙二醇具有抗性的短桿菌和棒桿菌的產生L-賴氨酸的突變體(見美國專利4,411,997)。
賦予產生L-賴氨酸的能力的方法實例是增強編碼L-賴氨酸生物合成酶的基因的表達。參與了L-賴氨酸生物合成的酶的實例包括，但不限于二氨基庚二酸途徑酶，如二氫吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase)基因(dapA)、天冬氨酸激酶基因(lysC)、二氫吡啶二羧酸還原酶(dihydrodipicolinatedreductase)基因(dapB)、二氨基庚二酸脫羧酶基因(lysA)、二氨基庚二酸脫氫酶基因(ddh)(上述所有；國際公布號96/40934)、磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因(ppc)(日本專利申請Laid-Open編號60-87788)、天冬氨酸轉氨酶基因(aspC)(日本專利公布號6-102028)、二氨基庚二酸差向異構酶基因(dapF)(日本專利申請Laid-Open編號2003-135066)和天冬氨酸半醛脫氫酶(aspartate semialdehydedehydrogenease)基因(asd)(國際公布號00/61723)；和氨基己二酸途徑酶，如同型烏頭酸水合酶(homoaconitate hydratase)基因(日本專利申請Laid-Open編號2000-157276)。
此外，本發明的細菌可具有減少的催化反應的酶的活性，或者可使所述酶具有缺陷，所述反應通過從L-賴氨酸生物合成途徑分支，生成除L-賴氨酸之外的產物。催化反應的酶包括高絲氨酸脫氫酶和賴氨酸脫羧酶，所述反應通過從L-賴氨酸生物合成途徑分支生成除L-賴氨酸之外的產物。這些酶的活性減少的菌株在WO95/23864和WO96/178930中有所描述。
<2>減少乙酰輔酶A水解酶活性的修飾如上所述本發明的棒狀桿菌型細菌具有產生L-氨基酸的能力，所述L-氨基酸是通過使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產生的，且經過修飾以使乙酰輔酶A水解酶(EC 3.1.2.1)活性減少。
本發明的棒狀桿菌型細菌可以通過以下方法獲得，修飾上述的具有通過使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產生L-氨基酸的能力的棒狀桿菌型細菌，以使乙酰輔酶A水解酶活性減少。培育本發明的棒狀桿菌型細菌時，賦予細菌產生L-氨基酸的能力，或修飾細菌以使乙酰輔酶A水解酶活性減少，可以以任何順序進行。
“乙酰輔酶A水解酶(ACH)活性”指催化從乙酰輔酶A和水產生乙酸的活性。“修飾以使乙酰輔酶A水解酶活性減少”的含義是乙酰輔酶A水解酶活性低于未修飾的菌株，包括野生型棒狀桿菌型細菌。與未修飾的菌株相比，每單位細胞重量的ACH活性優選減少到50％或以下，更優選30％或以下，還更優選10％或以下。在此，作為對照的野生型棒狀桿菌型細菌包括，例如，乳發酵短桿菌2256菌株(ATCC 13869)或谷氨酸棒桿菌ATCC 13032；(被用作對照的)未修飾的菌株包括乳發酵短桿菌Δldh菌株。乙酰輔酶A水解酶活性可以根據Gergely，J.等的方法測量(Gergely，J.，Hele，P.&Ramkrishnan，C.V.(1952)J.Biol.Chem.198p323-334)。“減少”包括活性完全消失的情況。優選的是，本發明的棒狀桿菌型細菌具有的乙酰輔酶A水解酶活性比野生型或未修飾的菌株低，且引起的L-氨基酸積累比野生型或未修飾的菌株高。
ACH的實例包括含有SEQ ID NO24所示氨基酸序列的蛋白質，和包含SEQ ID NO24所示氨基酸序列，其中在一個或多個位置取代、缺失、插入或添加一個或多個氨基酸，但保留了ACH活性的蛋白質。盡管此處所指的“幾個”氨基酸殘基的數量可能依據蛋白質氨基酸殘基的三維結構中的位置或種類而不同，但可以優選為2到20個，更優選2到10個，特別優選2到5個。在保留ACH活性的同時，ACH基因編碼的蛋白質與SEQ ID NO24所示氨基酸序列的同源性優選不低于80％，更優選不低于90％，還更優選不低于95％，特別優選不低于97％。這些ACH同源物中的氨基酸取代優選為保守取代，包括以ser或thr取代ala，以gln、his或lys取代arg，以glu、gln、lys、his或asp取代asn，以asn、glu或gln取代asp，以ser或ala取代cys，以asn、glu、lys、his、asp或arg取代gln，以gly、asn、gin、lys或asp取代glu，以pro取代gly，以asn、lys、gln、arg或tyr取代his，以leu、met、val或phe取代ile，以ile、met、val或phe取代leu，以asn、glu、gln、his或arg取代lys，以ile、leu、val或phe取代met，以trp、tyr、met、ile或leu取代phe，以thr或ala取代ser，以ser或ala取代thr，以phe或tyr取代trp，以his、phe或trp取代tyr和以met、ile或leu取代val。
“修飾以使乙酰輔酶A水解酶活性減少”包括每個細胞中乙酰輔酶A水解酶分子數量減少的情況，和每分子輔酶A水解酶活性減少的情況。具體地說，這些修飾可以通過以下方法完成，例如，破壞染色體上編碼乙酰輔酶A水解酶的基因，或修飾表達調控序列，如啟動子和/或Shine-Dalgarno(SD)序列。染色體上的乙酰輔酶A水解酶基因包括，例如，包含SEQ ID NO23的核苷酸1037到2542的DNA。此外，乙酰輔酶A水解酶基因包括，例如，通過使用引物SEQ ID 7和8用PCR方法可獲得的DNA。另外，染色體上的乙酰輔酶A水解酶基因可以是在嚴緊條件下能夠與SEQ ID No.23的核苷酸1037到2542或可由所述核苷酸制備的探針雜交的DNA，只要其編碼具有乙酰輔酶A水解酶活性的蛋白質。“嚴緊條件”指這樣的條件，在該條件下，形成所謂的特異性雜交，而不形成所謂的非特異性的雜交。盡管難以用數值清晰地說明這些條件，但這些條件的實例包括，在60℃，并在對應于1×SSC，0.1％SDS，優選0.1×SSC，0.1％SDS的鹽濃度，進行一次，優選兩次或三次洗滌。
可以通過合成基于谷氨酸棒桿菌的核苷酸序列(例如，SEQ ID No.23，NCgl2480 of Gen Bank登錄號NC 003450(NC 003450的2729376到2730884的互補鏈))的合成寡核苷酸，并使用谷氨酸棒桿菌的染色體DNA作為模板進行PCR來克隆乙酰輔酶A水解酶基因(在下文中稱為“ach基因”)。另外，源自棒狀桿菌型細菌如乳發酵短桿菌的另一個核苷酸序列也是可用的。可以由棒狀桿菌型細菌作為DNA供體，通過例如Saito和Miura的方法(H.Saitoand K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)，“BiotechnologyExperiments Handbook”，ed.By The Society for Biotechnology Japan，p.97 to 98，Baifukan，1992)制備染色體DNA。
由此制備的ach基因或其部分可用于破壞染色體ach基因。另外，用于破壞染色體ach基因的ach基因也可以是具有足夠同源性以導致與目標棒狀桿菌型細菌染色體上的ach基因同源重組的基因(例如，具有SEQ ID NO23的核苷酸1037到2542的基因)。這里，足夠引起同源重組的同源性優選80％或以上，更優選90％或以上，還更優選95％或以上，特別優選97％或以上。此外，在嚴緊條件下可以與上述基因雜交的DNA也可以被用于基因破壞。
可通過如下方法破壞ach基因，例如，制備“缺失型ach基因”，其中ach基因的部分序列缺失，以至于不產生功能正常的乙酰輔酶A水解酶，用含有此缺失型ach基因的DNA轉化棒狀桿菌型細菌，以導致缺失型ach基因和染色體上ach基因之間的重組。這種利用同源重組進行基因置換的基因破壞已經被建立，并包括使用線性DNA的方法，或使用含溫度敏感性復制起點的質粒的方法(美國專利6,303,383或JP-A-05-007491)。利用同源重組進行基因置換的基因破壞也可以通過使用在棒狀桿菌型細菌中無法復制的質粒來進行。優選使用在棒狀桿菌型細菌中無法復制，但在埃希氏菌屬細菌(Escherichiabacteria)中能夠復制的質粒。這種質粒的實例包括pHSG299(Takara Bio)和pHSG399(Takara Bio)。
可以用缺失型ach基因，例如，通過使用sacB(Schafer，A.et al.，Gene 145(1994)69-73)的同源重組來替換染色體ach基因。sacB基因編碼果聚糖蔗糖酶，且用于有效地選擇菌株，在所述菌株中染色體目標基因被突變基因所取代，并將載體部分從染色體中消除(cured)。
首先，可以通過以下方法制備重組質粒在具有溫度敏感性復制起點的質粒中，插入缺失型(突變體)ach基因、sacB基因和選擇標記，如氯霉素抗性基因。將所得質粒引入棒狀桿菌型細菌的宿主菌株。當果聚糖蔗糖酶在棒狀桿菌型細菌的細胞中表達時，由蔗糖轉化產生的果聚糖對于細菌是致死的，因此該細菌無法在含有蔗糖的培養基中生長。所以，通過在含有蔗糖的平板中培養，可選擇菌株，所述菌株中在質粒的突變體ach基因和染色體ach基因之間發生取代，并由此將質粒的其他部分從細胞中消除。
sacB基因的實例包括下列枯草芽孢桿菌(Bacillus subillus)sacB GenBank登錄號X02730(SEQ IDNO19)解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliqufaciens)sacB GenBank登錄號X52988運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)sacB GenBank登錄號L33402嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)surB GenBank登錄號U34874Lactobacillus sanfranciscensisfrfA GenBank登錄號AJ508391
Acetobacter xylinuslsxA GenBank登錄號AB034152Gluconacetobacter diazotrophicuslsdA GenBank登錄號L41732可以通過常規方法進行轉化。例如，可以使用以氯化鈣處理受體細胞從而增加DNA通透性的方法，其已被報導用于大腸桿菌(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))，以及使用由生長細胞制備的感受態細胞以引入DNA的方法，其以被報導用于枯草芽孢桿菌(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.andYoung，F.E.，Gene，1，153(1977))。除了這些方法之外，可以使用將重組DNA引入到原生質體-樣或原生質球-樣(protoplast-or spheroplast-like)受體細胞中的方法，其已被報導可用于枯草芽孢桿菌、放線菌類(actinomytetes)和酵母(Chang，S.and Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，.A.Hicks，J.B.and Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci.USA，75，1929(1978))。此外，棒狀桿菌型細菌的轉化還可以通過電脈沖法進行(Sugimoto et al.，JP2-207791A)。
用于棒狀桿菌型細菌的溫度敏感性質粒的實例包括p48K和pSFKT2(EP1038966)、pHSC4(法國專利Laid-open公布號2667875，1992和JP5-7491A)、pBS5T等等。在棒狀桿菌型細菌中，這些質粒可以在至少為25℃的溫度自主復制，但不能在37℃的溫度自主復制。含有pHSC4的AJ12571菌株依據布達佩斯條約的規定于1991年8月26日保藏在通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(National Institute of Bioscience and Human Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of International Trade andIndustry)(目前為獨立行政法人產業技術綜合研究所特許微生物保藏中心(International Patent Organism Depositary，National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology)，其地址為Tsukuba Central 6，1-1，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-5466，Japan)，并給予保藏號FERMBP-3524。
在溫度敏感性復制起點不起作用的溫度(例如25℃)培養轉化的菌株，以獲得已引入所述質粒的菌株。然后，在高溫下培養轉化體以消除溫度敏感性質粒，并涂布在含抗生素藥物如卡那霉素的平板培養基上。雖然消除了所述質粒的菌株不能在含這種抗生素藥物的平板上生長，但其中染色體ach基因用突變的ach基因取代的少數菌株能夠生長并作為菌落出現。
在這種將含突變ach基因的重組DNA整合到染色體DNA的菌株中，重組DNA導致了與原來存在于染色體上的ach基因的重組，并將染色體ach基因與突變ach基因的融合基因插入到染色體，以使重組DNA的其它部分(載體區段、溫度敏感性復制起點和藥物抗性標記)存在于融合基因之間。然后，為了在染色體DNA上只留下突變的ach基因，將一個拷貝的ach基因連同載體區段(包括溫度敏感性復制起點和藥物抗性標記)從染色體DNA消除。在這種情況下，正常ach基因被留在染色體DNA上，并將突變的ach基因從染色體DNA中消除，或者相反，將突變的ach基因留在染色體DNA上，并將正常的ach基因從染色體DNA中消除。然后，可以通過使用PCR、Southern雜交等選擇在染色體上只留下突變ach基因的菌株。
減少乙酰輔酶A水解酶活性也可以通過修飾表達調控序列，如啟動子、Shine-Dalgarno(SD)序列、操縱子、終止子或衰減子(attenuator)來實現。染色體上的表達調控序列可以通過基因分析軟件如Genetix，通過用于表達分析的載體如啟動子搜索載體(promoter-searching vector)，以及通過已知的信息，如Genbank數據庫鑒定。例如，減少乙酰輔酶A水解酶活性的突變實例包括，修飾乙酰輔酶A水解酶基因的啟動子區以使其效力減少的突變，和破壞乙酰輔酶A水解酶基因啟動子區共有序列的突變。可以通過使用不能在宿主細胞中進行復制的溫度敏感性質粒或自殺載體(suicide vector)來引入這些突變。
減少乙酰輔酶A水解酶活性也可以通過以下方法完成在染色體上乙酰輔酶A水解酶基因的編碼區引入氨基酸取代(錯義突變)；引入終止密碼子(無義突變)；通過添加或缺失一個或兩個核苷酸引入移碼突變；或缺失基因的一部分(Journal of Biologial Chemistry 2728611-8617(1997))。
減少乙酰輔酶A水解酶活性的實例還包括如下方法用紫外線照射或用在常規突變處理中使用的致突變源(mutagen)如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和亞硝酸處理棒狀桿菌型細菌，以選擇乙酰輔酶A水解活性減少的菌株(“Amino Acid Fermentation”，Center for Academic Publications Japan Co.，Ltd.，1st ed.Published on May 30，1986，p.77至100)。
同時，本發明中優選使用被進一步修飾以使谷氨酸脫氫酶(以下稱為“GDH”)活性增強的菌株。
為使具有產生L-氨基酸的能力、且經修飾以減少ACH活性的棒狀桿菌型細菌中的GDH活性得到擴增，將編碼GDH的基因片段連接到可在棒狀桿菌型細菌中起作用的載體，優選連接到多拷貝型載體上以制備重組DNA，再用得到的DNA轉化棒狀桿菌型細菌。由于轉化體細胞中編碼GDH的基因拷貝數增加，GDH活性得到擴增。
編碼GDH的基因可以源自棒狀桿菌型細菌或可源自其他生物體如大腸桿菌。
已經鑒定了編碼棒狀桿菌型細菌的GDH的基因(gdh基因)的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO25Molecular Microbiology(1992)6(3)，317-326 1999，NC_003450的2194739..2196082的互補鏈)，所以gdh基因可以使用基于所述核苷酸序列設計的引物和棒狀桿菌型細菌的染色體DNA作為模板通過PCR獲得(PCR聚合酶鏈式反應；White，T.J.et al.；Trends Genet.5，185(1989))。編碼其他微生物的GDH的基因也可以以相同方式獲得。
<3>使用本發明的棒狀桿菌型細菌產生L-氨基酸可通過在培養基中培養如上所述得到的棒狀桿菌型細菌以產生所述L-氨基酸，并導致所述L-氨基酸的積累，和從培養基中收集所述L-氨基酸，從而有效地產生使用丙酮酸作為中間物產生的L-氨基酸。
為了使用本發明的棒狀桿菌型細菌產生這些L-氨基酸，可以通過常規方法用普通培養基進行培養，所述普通培養基含有碳源、氮源、無機鹽和(如果需要的話，)痕量的有機營養物，如氨基酸和維生素。可以使用合成培養基或天然培養基。培養基中使用的碳源和氮源可以是任何種類的，只要它們能夠被本發明中菌株所利用。
碳源的實例包括糖類，如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和糖蜜。此外，有機酸類如檸檬酸和蘋果酸，和醇類如乙醇，可以單獨使用或與其他碳源組合使用。
氮源的實例包括氨，銨鹽如硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨和乙酸銨，以及硝酸鹽。
可以痕量存在的有機營養物的實例包括氨基酸、維生素、脂肪酸和核酸，并可以使用含有這些營養物的蛋白胨(peptone)、酪蛋白氨基酸、酵母提取物和大豆蛋白水解物。在使用其生長需要氨基酸等的營養缺陷型突變菌株的情況下，優選補充所需的營養物。
無機鹽的實例包括磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽和錳鹽。
在需氧條件下在20到45℃的發酵溫度、同時將pH調整為5到9進行培養。如果培養過程中pH降低，可以在培養基中加入碳酸鈣或堿，如氨氣來中和。大約10到120小時的培養導致可觀量的L-氨基酸的積累。
培養完成后，通過公知的回收方法從培養基中收集L-氨基酸。例如，將細胞從培養液中去除后，通過濃縮和結晶來收集L-氨基酸。
實施例在下文中，通過下列非限制性實施例更加具體地解釋本發明。
實施例1<1>構建攜帶sacB基因的破壞載體(A)構建pBS3使用枯草芽孢桿菌的染色體DNA作為模板，和SEQ ID NOS1和2的寡核苷酸作為引物，通過PCR獲得了sacB基因(SEQ ID NO19)。使用LA taq(由TaKaRa制造)如下進行PCR在94℃貯熱(heat retention)5分鐘的一個循環；和94℃變性30秒、49℃退火30秒和72℃延伸2分鐘的25個循環。用常規方法純化所得PCR產物，然后用BglII和BamHI消化并平端化。將所述片段插入到已用AvaII消化且平端化的pHSG299中。所得DNA用于轉化大腸桿菌JM109(由TAKARA BIO INC.制造)的感受態細胞。然后，將轉化的細菌細胞涂布到含25μg/ml卡那霉素(以下縮寫為″Km″)的LB瓊脂培養基上，溫育一夜。此后，分離單菌落作為轉化體。從所得轉化體中提取質粒，并將具有目的PCR產物的插入物的質粒命名為pBS3。圖1顯示了構建pBS3的方法。
(B)構建pBS4S使用不引起氨基酸取代的交換(cross-over)PCR通過核苷酸取代來修飾pBS3上卡那霉素抗性基因中的SmaI識別位點，從而使pBS3不被內切酶(endnuclease)SmaI切斷。首先，使用pBS3作為模板和SEQ ID NOS3和4的合成DNA作為引物進行PCR，以由此獲得卡那霉素抗性基因的N末端片段。另一方面，為了獲得卡那霉素抗性基因的C末端片段，使用pBS3作為模板和SEQ ID NOS5和6的合成DNA作為引物進行PCR。使用PyrobestDNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)如下進行PCR以獲得目標PCR產物在98℃貯熱5分鐘的一個循環；以及98℃變性10秒、57℃退火30秒、72℃延伸1分鐘的25個循環。SEQ ID NOS4和5彼此部分互補，且不包含SmaI識別位點。然后，為了獲得不含SmaI識別位點的突變卡那霉素抗性基因的全長片段，將上述N末端和C末端基因產物以基本上等摩爾量混合在一起。使用所述基因產物作為模板和SEQ ID NOS3和6的合成DNA作為引物進行PCR，以獲得SmaI位點修飾的卡那霉素抗性基因片段。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)如下進行PCR以獲得目標PCR產物在98℃貯熱5分鐘的一個循環；以及98℃變性10秒、57℃退火30秒、72℃延伸1.5分鐘的25個循環。
用常規方法純化PCR產物，然后用BanII消化，然后插入到pBS3的上述BanII識別位點中。將所得質粒用于轉化大腸桿菌JM109的感受態細胞(可由Takara Bio得到)。即，將轉化的細菌細胞涂布到含有25μg/ml卡那霉素的LB瓊脂培養基上，并溫育一夜。此后，選擇出現的菌落作為轉化體。從所得轉化體中分離質粒，并將具有目的PCR產物的插入物的質粒命名為pBS4S。圖2顯示了構建pBS4S的方法。
(C)構建pBS5T通過利用BamHI和SmaI消化棒狀桿菌型細菌中的溫度敏感性復制起點和平端化，將其從pHSC4(JP-A-5-7491)中切除，并插入pBS4S的平端化的NdeI位點。使用所得DNA轉化大腸桿菌JM109的感受態細胞(由TAKARABIO INC.制造)，并涂布到含有25μg/ml Km的LB瓊脂培養基上，然后培養過夜。然后，分離單菌落作為轉化體。從所得轉化體中提取質粒，并將具有目的PCR產物的插入物的質粒命名為pBS5T。圖3顯示了構建pBS5T的方法。
實施例2<構建ldh-破壞的菌株>
(A)克隆破壞乳酸脫氫酶基因的片段使用基于谷氨酸棒桿菌ATCC13032菌株(SEQ ID NO21GenBank數據庫登錄號NC_003450)的乳酸脫氫酶基因(以下縮寫為“ldh基因”)的核苷酸序列設計的合成DNA通過交換PCR得到含有源自缺失了ORF的乳發酵短桿菌2256菌株的ldh基因的基因片段。具體來說，使用乳發酵短桿菌2256菌株的染色體DNA作為模板和SEQ ID NOS7和8的合成DNA作為引物通過常規方法進行PCR，以獲得ldh基因的N末端片段。另一方面，為了獲得ldh基因的C末端片段，使用乳發酵短桿菌2256菌株的染色體DNA作為模板和SEQ ID NOS9和10的合成DNA作為引物，通過常規方法進行PCR。SEQ IDNOS8和9彼此互補，且被設計以導致ldh基因的ORF全部序列的缺失。
然后，為了獲得缺失內部序列的ldh基因片段，將ldh的N末端和C末端基因產物以基本上等摩爾量混合，且使用所述混合物作為模板和SEQ IDNOS11和12的合成DNA作為引物，通過常規方法進行PCR。在以常規方式純化PCR產物之后，用SalI消化PCR產物。其后，將該PCR產物插入上述pBS4S的SalI位點。用所得DNA轉化大腸桿菌感受態細胞(由TAKARABIO INC.制造)，并涂布到含有100μM IPTG、40μg/ml X-Gal和25μg/ml Km的LB瓊脂培養基上，然后過夜培養。其后分離單菌落作為轉化體。從所得轉化體中提取質粒，并將具有目的PCR產物的插入物的質粒命名為pΔldh56-1。圖4顯示了所述質粒的構建方法。
(B)制備ldh-破壞的菌株由于上述(A)中所制備的pΔldh56-1不含有使其能夠在棒狀桿菌型細菌中自主復制的區域，當以此質粒轉化棒狀桿菌型細菌時，通過同源重組將所述質粒整合入染色體的轉化體菌株所出現的頻率極低。因此，使用含有高濃度pΔldh56-1質粒的溶液通過電脈沖法轉化乳發酵短桿菌2256菌株，然后涂布到含有25μg/ml卡那霉素的CM-Dex瓊脂培養基(5g/L葡萄糖、10g/L聚胨、10g/L酵母提取物、1g/L KH2PO4、0.4g/L MgSO4·7H2O、0.01g/L FeSO4·7H2O、0.01g/L MnSO4·7H2O、3g/L尿素和1.2g/L大豆水解物，和pH 7.5(KOH))上，在31.5℃培養約30小時。出現在此培養基上的菌落是這樣的菌株，其中在質粒的ldh基因片段和乳發酵短桿菌2256菌株的染色體上的ldh基因之間發生了同源重組，并將卡那霉素抗性基因和源自質粒的SacB基因插入該染色體。
然后，在不含卡那霉素的CM-Dex液體培養基中，于31.5℃將這些第一次重組體(first recombinant)培養一夜。在適當的稀釋后，將重組體涂布到含蔗糖10％的Dex-S10瓊脂培養基(10g/L蔗糖、10g/L聚胨、10g/L酵母提取物、1g/L KH2PO4、0.4g/L MgSO4·7H2O、0.01g/L FeSO4·7H2O、0.01g/LMnSO4·4H2O、3g/L尿素、1.2g/L大豆水解物和10μg/L生物素，和pH 7.5(KOH))上并在31.5℃培養約30小時。結果，獲得約50個菌株，其中通過二次重組消除sacB基因，且成為蔗糖非敏感性的。
由此獲得的菌株包括染色體ldh基因被源自pΔldh56-1的突變型取代的菌株，以及保留了染色體野生型ldh基因的菌株。通過將在Dex-S10瓊脂培養基上培養獲得的細胞進行直接PCR(direct PCR)，容易地檢查ldh基因是突變型還是野生型。使用PCR擴增的引物(SEQ ID NOS7和10)分析ldh基因，選擇其PCR產物小于野生型ldh基因的菌株作為ldh破壞的菌株，并被命名為2256Δ(ldh)菌株，所述野生型ldh基因是使用野生型2256菌株的染色體DNA作為模板擴增的。所得菌株被用作親本菌株用于制備下述ach基因破壞的菌株。
當發酵在厭氧條件下進行時，積累相當大量的乳酸作為副產品，所以乳酸脫氫酶活性缺乏是優選的(JP 11-206385；J Mol Microbio Biotechnol.2004；7(4)182-96.)。然而，L-谷氨酸通常在乳酸脫氫酶不起作用的有氧條件下產生，并且無需在乙酰輔酶A水解酶基因破壞的菌株中破壞ldh基因而用于產生L-谷氨酸。
實施例3<構建乙酰輔酶A水解酶破壞的菌株>
(A)克隆用于破壞乙酰輔酶A水解酶基因的片段使用基于谷氨酸棒桿菌ATCC13032(SEQ ID NO23GenBank數據庫登錄號NC 003450)乙酰輔酶A水解酶基因(以下該基因縮寫為“ach”)的核苷酸序列設計的合成DNA，通過交換PCR獲得含有ach基因的基因片段，所述ach基因源自缺失ORF的乳發酵短桿菌2256菌株。具體來說，使用乳發酵短桿菌2256菌株的染色體DNA作為模板和SEQ ID NOS13和14的合成DNA作為引物通過常規方法進行PCR，以獲得ach基因的C末端片段。另一方面，為了獲得N末端片段，使用乳發酵短桿菌2256菌株的染色體DNA作為模板和SEQ ID NOS15和16的合成DNA作為引物通過常規方法進行PCR。SEQID NOS14和15彼此部分互補。利用KOD-plus(由TOYOBO Co.，LTD.制造)進行PCR反應。在進行了94℃貯熱2分鐘的一個循環之后，將如下步驟重復30個循環在94℃變性10秒、55℃退火30秒、68℃延伸50秒。然后，為了獲得缺失內部序列的ach基因片段，將ach基因的N末端片段和C末端片段以基本上等摩爾量混合在一起。使用所述混合產物作為模板和SEQ ID NOS17和18的合成DNA作為引物通過常規方法進行PCR。用KOD-plus(由TOYOBO Co.，LTD.制造)進行PCR反應。進行了在94℃保持(retention)2分鐘的一個循環之后，將如下步驟重復30個循環94℃變性10秒、55℃退火30秒、68℃延伸90秒。在通過常規方式純化擴增的PCR產物之后，用XbaI消化PCR產物，并將其插入到上述實施例1(B)中所構建的pBS4S的XbaI位點中。用所得DNA轉化大腸桿菌JM 109的感受態細胞(由TAKARA BIO INC.制造)，并涂布到含有100μM IPTG、40μg/ml X-Gal和25μg/ml Km的LB瓊脂培養基中，然后培養一夜。此后，分離白色單菌落作為轉化體。從所得轉化體中提取質粒，并將具有目的PCR產物的插入物的質粒命名為pBS4S::Δach。圖5顯示了構建pBS4S::Δach的方法。
(B)制備ach破壞的菌株由于上述(A)中所制備的pBS4S::Δach不含使其能夠在棒狀桿菌型細菌的細胞中自主復制的區域，當以該質粒轉化棒狀桿菌型細菌時，通過同源重組將所述質粒并入其染色體的菌株作為轉化體出現的頻率極低。因此，使用含有高濃度pBS4S::Δach質粒的溶液通過電脈沖法轉化乳發酵短桿菌2256Δ(ldh)菌株，并涂布到含有25μg/ml卡那霉素的CM-Dex瓊脂培養基上，在31.5℃培養約30小時。出現在此培養基上的菌株是這樣的菌株，其中在質粒的缺失型(deletion-type)ach基因片段和乳發酵短桿菌2256Δ(ldh)菌株的染色體上的ach基因之間發生了同源重組，并將卡那霉素抗性基因和源自質粒的SacB基因插入染色體中。
然后，在不含卡那霉素的CM-Dex液體培養基中，于31.5℃將這些第一次重組體培養一夜。在適當的稀釋后，將重組體涂布到含蔗糖10％的Dex-S10瓊脂培養基上，并在31.5℃培養約30小時。結果，獲得約50個菌株，其中通過二次重組從染色體消除sacB基因，且成為蔗糖非敏感性的。
由此獲得的菌株包括染色體ach基因被源自pBS4S::Δach的突變型取代的菌株，以及保留了染色體野生型ach基因的菌株。通過將在Dex-S10瓊脂培養基上培養獲得的細胞進行直接PCR，容易地確定ach基因是突變型還是野生型。使用引物(SEQ ID NOS13和16)分析ach基因后，對于野生型ach基因擴增2.9kb的DNA片段和對于突變型ach基因擴增1.4kb的DNA片段。作為通過上述方法分析蔗糖非敏感性菌株的結果，選擇出只含有突變型ach基因的菌株，并將從2256Δ(ldh)獲得的ach破壞的菌株命名為2256Δ(ldh，ach)菌株。
實施例4<利用ach破壞的菌株產生L-谷氨酸>
(1)評價ach破壞的菌株的產生L-谷氨酸的能力如下在S型釜(S-type jar)中培養乳發酵短桿菌2256Δ(ldh)菌株和2256Δ(ldh，ach)菌株用于產生L-谷氨酸。將各一環(loop)在CMDex瓊脂平板上培養的2256Δ(ldh)菌株和2256Δ(ldh，ach)菌株接種到300ml的種子培養基(seed medium)(每1L純化水(purified water)中60g葡萄糖、1.54g H3PO4、1.45g KOH、0.9g MgSO4·7H2O、0.01g FeSO4·7H2O、670μg VB1·HCl、40μg生物素、1.54g大豆水解物、0.28g DL-甲硫氨酸和0.1ml AZ-20R(用氨水調節至pH 7.2))，以1/1vvm通氣培養直到殘糖被完全消耗，同時控制pH為7.2(NH3)，溫度為31.5℃，且PL＞0。
將30ml培養液接種到270ml主培養基(main culture medium)(每1L純化水中80g葡萄糖、3.46g KH2PO4、1g MgSO4·7H2O、0.01g FeSO4·7H2O、0.01g MnSO4·4-5H2O、230μg VB1·HCl、0.35g大豆水解物、和0.2ml AZ-20R(用氨調節至pH 7.3))中，在1/1vvm通氣條件下培養，同時控制溫度為31.5℃，pH為7.3，且PL＞0。在殘糖被完全消耗之前，加入70至80ml料液(feedsolution)，培養液由每1L純化水500g葡萄糖和0.2ml AZ-20R組成，并繼續培養到殘糖完全被消耗。
結束培養之后，對培養液進行適當的稀釋后，在Biotech Analyzer AS210(由Asahi Kasei Corporation制造)中分析培養液中所積累的L-谷氨酸(Glu)的量。表1顯示了結果。
表1 通過ach缺陷型菌株產生L-谷氨酸


與2256Δ(ldh)菌株(親本菌株)相比，2256Δ(ldh，ach)菌株在產率上顯示約2％的改進。此外，作為L-谷氨酸前體的α-酮戊二酸(α-KG)的積累量改進了約三倍。此結果顯示，減少或消除ACH活性在L-谷氨酸的產生中是有效的。
實施例5<通過ach缺陷型菌株產生L-丙氨酸和L-纈氨酸>
(1)評價ach缺陷型菌株的培養如下在S型釜中培養乳發酵短桿菌2256Δ(ldh)菌株和2256Δ(ldh，ach)菌株用于產生L-丙氨酸和L-纈氨酸。將各一環在CMDex瓊脂平板上培養的2256Δ(ldh)菌株和2256Δ(ldh，ach)菌株，接種到300ml種子培養基(每1L純化水60g葡萄糖、1.54g H3PO4、1.45g KOH、0.9g MgSO4·7H2O、0.01gFeSO4·7H2O、670μg VB1·HCl、40μg生物素、1.54g大豆水解物、0.28g DL-甲硫氨酸和0.1ml AZ-20R(用氨水調節至pH 7.2))中，并以1/1vvm通氣培養直到殘糖完全消耗，同時用氨控制pH為7.2，溫度為31.5℃，且PL＞0。
將30ml培養液接種到270ml主培養基(每1L純化水80g葡萄糖、3.46g KH2PO4、1g MgSO4·7H2O、0.01g FeSO4·7H2O、0.01g MnSO4·4-5H2O、230μg VB1·HCl、0.35g大豆水解物和0.2ml AZ-20R(用氨調節至pH 7.3))中，并在1/1vvm通氣條件下培養，同時控制溫度為31.5℃，pH為7.3，且PL＞0。在殘糖被完全消耗之前，加入70至80ml料液，所述料液由每1L純化水500g葡萄糖和0.2ml AZ-20R組成，并繼續培養直到殘糖被完全消耗。
完全培養之后，對培養液進行適當的稀釋后，用Amino Acid AnalyzerL8500(由Hitachi，Ltd.制造)分析培養液中所積累的L-丙氨酸(Ala)和L-纈氨酸(Val)的量。表2顯示了結果。
表2 通過ach缺陷型菌株產生Ala和Vla

2256Δ(ldh，ach)顯示L-丙氨酸積累量的約2.2倍的改進，和L-纈氨酸積累量的約四倍的改進。此結果顯示，減少或消除ACH活性在L-纈氨酸和L-丙氨酸的產生中是有效的。
工業適用性根據本發明，改進了L-氨基酸的發酵產量(fermentation yield)，所述L-氨基酸是通過使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產生的。
序列表<110>味之素株式會社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>L-氨基酸生產細菌和一種生產L-氨基酸的方法<130>C537-C5225<150>JP2004-340187<151>2004-11-25<160>26<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1cgggatcctt tttaacccat caca 24<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2gaagatcttc aaaaggttag gaatacggt29<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>引物
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<220>
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<223>引物<400>16ggtcatgtgc atggttttct cattgc 26<210>17<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>17ggcctctaga cctgcaccga tcaggatgag tgg 33<210>18<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>18gcgctctaga ctcaacaaga gcacgcgcag tcacc 35<210>19<211>2014
<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌<220>
<221>CDS<222>(464)..(1882)<223>
<400>19gatccttttt aacccatcac atatacctgc cgttcactat tatttagtga aatgagatat 60tatgatattt tctgaattgt gattaaaaag gcaactttat gcccatgcaa cagaaactat120aaaaaataca gagaatgaaa agaaacagat agatttttta gttctttagg cccgtagtct180gcaaatcctt ttatgatttt ctatcaaaca aaagaggaaa atagaccagt tgcaatccaa240acgagagtct aatagaatga ggtcgaaaag taaatcgcgc gggtttgtta ctgataaagc300aggcaagacc taaaatgtgt aaagggcaaa gtgtatactt tggcgtcacc ccttacatat360tttaggtctt tttttattgt gcgtaactaa cttgccatct tcaaacagga gggctggaag420aagcagaccg ctaacacagt acataaaaaa ggagacatga acg atg aac atc aaa 475Met Asn Ile Lys1aag ttt gca aaa caa gca aca gta tta acc ttt act acc gca ctg ctg 523Lys Phe Ala Lys Gln Ala Thr Val Leu Thr Phe Thr Thr Ala Leu Leu5 10 15 20gca gga ggc gca act caa gcg ttt gcg aaa gaa acg aac caa aag cca 571Ala Gly Gly Ala Thr Gln Ala Phe Ala Lys Glu Thr Asn Gln Lys Pro25 30 35tat aag gaa aca tac ggc att tcc cat att aca cgc cat gat atg ctg 619Tyr Lys Glu Thr Tyr Gly Ile Ser His Ile Thr Arg His Asp Met Leu40 45 50caa atc cct gaa cag caa aaa aat gaa aaa tat caa gtt cct gaa ttc 667Gln Ile Pro Glu Gln Gln Lys Asn Glu Lys Tyr Gln Val Pro Glu Phe55 60 65gat tcg tcc aca att aaa aat atc tct tct gca aaa ggc ctg gac gtt 715Asp Ser Ser Thr Ile Lys Asn Ile Ser Ser Ala Lys Gly Leu Asp Val70 75 80tgg gac agc tgg cca tta caa aac gct gac ggc act gtc gca aac tat 763Trp Asp Ser Trp Pro Leu Gln Asn Ala Asp Gly Thr Val Ala Asn Tyr85 90 95 100cac ggc tac cac atc gtc ttt gca tta gcc gga gat cct aaa aat gcg 811His Gly Tyr His Ile Val Phe Ala Leu Ala Gly Asp Pro Lys Asn Ala105 110 115gat gac aca tcg att tac atg ttc tat caa aaa gtc ggc gaa act tct 859Asp Asp Thr Ser Ile Tyr Met Phe Tyr Gln Lys Val Gly Glu Thr Ser120 125 130att gac agc tgg aaa aac gct ggc cgc gtc ttt aaa gac agc gac aaa 907Ile Asp Ser Trp Lys Asn Ala Gly Arg Val Phe Lys Asp Ser Asp Lys135 140 145ttc gat gca aat gat tct atc cta aaa gac caa aca caa gaa tgg tca 955Phe Asp Ala Asn Asp Ser Ile Leu Lys Asp Gln Thr Gln Glu Trp Ser150 155 160ggt tca gcc aca ttt aca tct gac gga aaa atc cgt tta ttc tac act 1003Gly Ser Ala Thr Phe Thr Ser Asp Gly Lys Ile Arg Leu Phe Tyr Thr165 170 175 180gat ttc tcc ggt aaa cat tac ggc aaa caa aca ctg aca act gca caa 1051Asp Phe Ser Gly Lys His Tyr Gly Lys Gln Thr Leu Thr Thr Ala Gln185 190 195gtt aac gta tca gca tca gac agc tct ttg aac atc aac ggt gta gag 1099Val Asn Val Ser Ala Ser Asp Ser Ser Leu Asn Ile Asn Gly Val Glu200 205 210
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<400>20Met Asn Ile Lys Lys Phe Ala Lys Gln Ala Thr Val Leu Thr Phe Thr1 5 10 15Thr Ala Leu Leu Ala Gly Gly Ala Thr Gln Ala Phe Ala Lys Glu Thr20 25 30Asn Gln Lys Pro Tyr Lys Glu Thr Tyr Gly Ile Ser His Ile Thr Arg35 40 45His Asp Met Leu Gln Ile Pro Glu Gln Gln Lys Asn Glu Lys Tyr Gln50 55 60Val Pro Glu Phe Asp Ser Ser Thr Ile Lys Asn Ile Ser Ser Ala Lys65 70 75 80Gly Leu Asp Val Trp Asp Ser Trp Pro Leu Gln Asn Ala Asp Gly Thr85 90 95Val Ala Asn Tyr His Gly Tyr His Ile Val Phe Ala Leu Ala Gly Asp100 105 110Pro Lys Asn Ala Asp Asp Thr Ser Ile Tyr Met Phe Tyr Gln Lys Val115 120 125Gly Glu Thr Ser Ile Asp Ser Trp Lys Asn Ala Gly Arg Val Phe Lys130 135 140Asp Ser Asp Lys Phe Asp Ala Asn Asp Ser Ile Leu Lys Asp Gln Thr145 150 155 160Gln Glu Trp Ser Gly Ser Ala Thr Phe Thr Ser Asp Gly Lys Ile Arg165 170 175Leu Phe Tyr Thr Asp Phe Ser Gly Lys His Tyr Gly Lys Gln Thr Leu180 185 190Thr Thr Ala Gln Val Asn Val Ser Ala Ser Asp Ser Ser Leu Asn Ile195 200 205Asn Gly Val Glu Asp Tyr Lys Ser Ile Phe Asp Gly Asp Gly Lys Thr210 215 220Tyr Gln Asn Val Gln Gln Phe Ile Asp Glu Gly Asn Tyr Ser Ser Gly225 230 235 240Asp Asn His Thr Leu Arg Asp Pro His Tyr Val Glu Asp Lys Gly His245 250 255Lys Tyr Leu Val Phe Glu Ala Asn Thr Gly Thr Glu Asp Gly Tyr Gln260 265 270Gly Glu Glu Ser Leu Phe Asn Lys Ala Tyr Tyr Gly Lys Ser Thr Ser275 280 285Phe Phe Arg Gln Glu Ser Gln Lys Leu Leu Gln Ser Asp Lys Lys Arg290 295 300Thr Ala Glu Leu Ala Asn Gly Ala Leu Gly Met Ile Glu Leu Asn Asp305 310 315 320Asp Tyr Thr Leu Lys Lys Val Met Lys Pro Leu Ile Ala Ser Asn Thr325 330 335Val Thr Asp Glu Ile Glu Arg Ala Asn Val Phe Lys Met Asn Gly Lys340 345 350Trp Tyr Leu Phe Thr Asp Ser Arg Gly Ser Lys Met Thr Ile Asp Gly355 360 365Ile Thr Ser Asn Asp Ile Tyr Met Leu Gly Tyr Val Ser Asn Ser Leu370 375 380Thr Gly Pro Tyr Lys Pro Leu Asn Lys Thr Gly Leu Val Leu Lys Met385 390 395 400Asp Leu Asp Pro Asn Asp Val Thr Phe Thr Tyr Ser His Phe Ala Val405 410 415Pro Gln Ala Lys Gly Asn Asn Val Val Ile Thr Ser Tyr Met Thr Asn420 425 430Arg Gly Phe Tyr Ala Asp Lys Gln Ser Thr Phe Ala Pro Ser Phe Leu435 440 445
Leu Asn Ile Lys Gly Lys Lys Thr Ser Val Val Lys Asp Ser Ile Leu450 455 460Glu Gln Gly Gln Leu Thr Val Asn Lys465 470<210>21<211>2820<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>CDS<222>(898)..(1851)<223>
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tgg aac cgc gtg atc ggc tcc gga act gtc ctg gac tcc gct cga ttc1377Trp Asn Arg Val Ile Gly Ser Gly Thr Val Leu Asp Ser Ala Arg Phe145 150 155 160cgc tac atg ctg ggc gaa ctc tac gaa gtg gca cca agc tcc gtc cac1425Arg Tyr Met Leu Gly Glu Leu Tyr Glu Val Ala Pro Ser Ser Val His165 170 175gcc tac atc atc ggc gaa cac ggc gac act gaa ctt cca gtc ctg tcc1473Ala Tyr Ile Ile Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Leu Pro Val Leu Ser180 185 190tcc gcg acc atc gca ggc gta tcg ctt agc cga atg ctg gac aaa gac1521Ser Ala Thr Ile Ala Gly Val Ser Leu Ser Arg Met Leu Asp Lys Asp195 200 205cca gag ctt gag ggc cgt cta gag aaa att ttc gaa gac acc cgc gac1569Pro Glu Leu Glu Gly Arg Leu Glu Lys Ile Phe Glu Asp Thr Arg Asp210 215 220gct gcc tat cac att atc gac gcc aag ggc tcc act tcc tac ggc atc1617Ala Ala Tyr His Ile Ile Asp Ala Lys Gly Ser Thr Ser Tyr Gly Ile225 230 235 240ggc atg ggt ctt gct cgc atc acc cgc gca atc ctg cag aac caa gac1665Gly Met Gly Leu Ala Arg Ile Thr Arg Ala Ile Leu Gln Asn Gln Asp245 250 255gtt gca gtc cca gtc tct gca ctg ctc cac ggt gaa tac ggt gag gaa1713Val Ala Val Pro Val Ser Ala Leu Leu His Gly Glu Tyr Gly Glu Glu260 265 270gac atc tac atc ggc acc cca gct gtg gtg aac cgc cga ggc atc cgc1761Asp Ile Tyr Ile Gly Thr Pro Ala Val Val Asn Arg Arg Gly Ile Arg275 280 285cgc gtt gtc gaa cta gaa atc acc gac cac gag atg gaa cgc ttc aag1809Arg Val Val Glu Leu Glu Ile Thr Asp His Glu Met Glu Arg Phe Lys290 295 300cat tcc gca aat acc ctg cgc gaa att cag aag cag ttc ttc taa1854His Ser Ala Asn Thr Leu Arg Glu Ile Gln Lys Gln Phe Phe305 310 315atctttggcg cctagttggc gacgcaagtg tttcattgga acacttgcgc tgccaacttt 1914ttggtttacg ggcacaatga aactgttgga tggaatttag agtgtttgta gcttaaggag 1974ctcaaatgaa tgagtttgac caggacattc tccaggagat caagactgaa ctcgacgagt 2034taattctaga acttgatgag gtgacacaaa ctcacagcga ggccatcggg caggtctccc 2094caacccatta cgttggtgcc cgcaacctca tgcattacgc gcatcttcgc accaaagacc 2154tccgtggcct gcagcaacgc ctctcctctg tgggagctac ccgcttgact accaccgaac 2214cagcagtgca ggcccgcctc aaggccgccc gcaatgttat cggagctttc gcaggtgaag 2274gcccacttta tccaccctca gatgtcgtcg atgccttcga agatgccgat gagattctcg 2334acgagcacgc cgaaattctc cttggcgaac ccctaccgga tactccatcc tgcatcatgg 2394tcaccctgcc caccgaagcc gccaccgaca ttgaacttgt ccgtggcttc gccaaaagcg 2454gcatgaatct agctcgcatc aactgtgcac acgacgatga aaccgtctgg aagcagatga 2514tcgacaacgt ccacaccgtt gcagaagaag ttggccggga aatccgcgtc agcatggacc 2574tcgccggacc aaaagtacgc accggcgaaa tcgccccagg cgcagaagta ggtcgcgcac 2634gagtaacccg cgacgaaacc ggaaaagtac tgacgcccgc aaaactgtgg atcaccgccc 2694acggctccga accagtccca gcccccgaaa gcctgcccgg tcgccccgct ctgccgattg 2754aagtcacccc agaatggttc gacaaactag aaatcggcag cgtcatcaac gtcccagaca 2814cccgcg 2820<210>22<211>318<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>22Met Gly Ser Lys Met Lys Glu Thr Val Gly Asn Lys Ile Val Leu Ile
1 5 10 15Gly Ala Gly Asp Val Gly Val Ala Tyr Ala Tyr Ala Leu Ile Asn Gln20 25 30Gly Met Ala Asp His Leu Ala Ile Ile Asp Ile Asp Glu Lys Lys Leu35 40 45Glu Gly Asn Val Met Asp Leu Asn His Gly Val Val Trp Ala Asp Ser50 55 60Arg Thr Arg Val Thr Lys Gly Thr Tyr Ala Asp Cys Glu Asp Ala Ala65 70 75 80Met Val Val Ile Cys Ala Gly Ala Ala Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg85 90 95Leu Gln Leu Val Asp Lys Asn Val Lys Ile Met Lys Ser Ile Val Gly100 105 110Asp Val Met Asp Ser Gly Phe Asp Gly Ile Phe Leu Val Ala Ser Asn115 120 125Pro Val Asp Ile Leu Thr Tyr Ala Val Trp Lys Phe Ser Gly Leu Glu130 135 140Trp Asn Arg Val Ile Gly Ser Gly Thr Val Leu Asp Ser Ala Arg Phe145 150 155 160Arg Tyr Met Leu Gly Glu Leu Tyr Glu Val Ala Pro Ser Ser Val His165 170 175Ala Tyr Ile Ile Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Leu Pro Val Leu Ser180 185 190Ser Ala Thr Ile Ala Gly Val Ser Leu Ser Arg Met Leu Asp Lys Asp195 200 205Pro Glu Leu Glu Gly Arg Leu Glu Lys Ile Phe Glu Asp Thr Arg Asp210 215 220Ala Ala Tyr His Ile Ile Asp Ala Lys Gly Ser Thr Ser Tyr Gly Ile225 230 235 240Gly Met Gly Leu Ala Arg Ile Thr Arg Ala Ile Leu Gln Asn Gln Asp245 250 255Val Ala Val Pro Val Ser Ala Leu Leu His Gly Glu Tyr Gly Glu Glu260 265 270Asp Ile Tyr Ile Gly Thr Pro Ala Val Val Asn Arg Arg Gly Ile Arg275 280 285Arg Val Val Glu Leu Glu Ile Thr Asp His Glu Met Glu Arg Phe Lys290 295 300His Ser Ala Asn Thr Leu Arg Glu Ile Gln Lys Gln Phe Phe305 310 315<210>23<211>3600<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
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gct gca ggt cgc ctg tcc tac gac ggc tac atc atg cag tcc ggc gtg 1840Ala Ala Gly Arg Leu Ser Tyr Asp Gly Tyr Ile Met Gln Ser Gly Val255 260 265ggc aac gtg cca aac gcg gtg atg gca ggc ctg ctg gaa tcc aag ttt 1888Gly Asn Val Pro Asn Ala Val Met Ala Gly Leu Leu Glu Ser Lys Phe270 275 280gag aac atc cag gcc tac acc gaa gtt atc cag gac ggc atg gtg gac 1936Glu Asn Ile Gln Ala Tyr Thr Glu Val Ile Gln Asp Gly Met Val Asp285 290 295 300ctc atc gac gcc ggc aag atg acc gtt gca tcc gca act tcc ttc tcc 1984Leu Ile Asp Ala Gly Lys Met Thr Val Ala Ser Ala Thr Ser Phe Ser305 310 315ctg tct cct gag tac gca gag aag atg aac aac gag gct aag cgt tac 2032Leu Ser Pro Glu Tyr Ala Glu Lys Met Asn Asn Glu Ala Lys Arg Tyr320 325 330cgc gag tcc att atc ctg cgc cca cag cag atc tct aac cac cca gag 2080Arg Glu Ser Ile Ile Leu Arg Pro Gln Gln Ile Ser Asn His Pro Glu335 340 345gtc atc cgc cgc gtt ggc ctg atc gcc acc aac ggt ctc atc gag gct 2128Val Ile Arg Arg Val Gly Leu Ile Ala Thr Asn Gly Leu Ile Glu Ala350 355 360gac att tac ggc aac gtc aac tcc acc aac gtt tct ggc tcc cgc gtc 2176Asp Ile Tyr Gly Asn Val Asn Ser Thr Asn Val Ser Gly Ser Arg Val365 370 375 380atg aac ggc atc ggc ggc tcc ggc gac ttc acc cgt aac ggc tac atc 2224Met Asn Gly Ile Gly Gly Ser Gly Asp Phe Thr Arg Asn Gly Tyr Ile385 390 395tcc agc ttc atc acc cct tca gag gca aag ggc ggc gca atc tct gcg 2272Ser Ser Phe Ile Thr Pro Ser Glu Ala Lys Gly Gly Ala Ile Ser Ala400 405 410atc gtt cct ttc gca tcc cac atc gac cac acc gag cac gat gtc atg 2320Ile Val Pro Phe Ala Ser His Ile Asp His Thr Glu His Asp Val Met415 420 425gtt gtt atc tct gag tac ggt tac gca gac ctt cgt ggt ctg gct cca 2368Val Val Ile Ser Glu Tyr Gly Tyr Ala Asp Leu Arg Gly Leu Ala Pro430 435 440cgt gag cgc gtt gcc aag atg atc ggc ctg gct cac cct gat tac cgc 2416Arg Glu Arg Val Ala Lys Met Ile Gly Leu Ala His Pro Asp Tyr Arg445 450 455 460cca ctg ctc gag gag tac tac gct cgc gca acc tcc ggt gac aac aag 2464Pro Leu Leu Glu Glu Tyr Tyr Ala Arg Ala Thr Ser Gly Asp Asn Lys465 470 475tac atg cag acc cct cat gat ctt gca acc gcg ttt gat ttc cac atc 2512Tyr Met Gln Thr Pro His Asp Leu Ala Thr Ala Phe Asp Phe His Ile480 485 490aac ctg gct aag aac ggc tcc atg aag gca taa gttttttctt ggtttagaaa2565Asn Leu Ala Lys Asn Gly Ser Met Lys Ala495 500ccgccgcctc gacaacattt cgaggcggcg gtttctttta ttacctgggt tttgagcgtt2625aaattagacc aggtcaggct agtgtttggt agctaattga gggcgatttt aataaggccg2685gtgccatgta ctaatatggt ctgagttggg cctatagctc agttggtaga gctacggact2745tttaatccgc aggtcttggg ttcgagtccc aatgggccca catcttaagt acccctgttt2805tggagaatgc tccgagccag gggtactttt cttttcctca cacacagtag ctgctgagaa2865aaatgaagac cttttgttag gttgggagta tgaccaaccc atacgaggcc ttcataccgc2925tcaagcatcg tacggggatt gaacccgagc acaccttttg ggaatgggaa aacaaaaggg2985ttcacattgc aaggagacgt cgagaagcgc ccgtccgcgt tatcgtggtg catgggctag3045gcacccatag tggcgccctc tggcccctcg tcgcggccat tgagggcgcg gacctcgccg3105cgatcgacct gcctaaaact ccgctttacg acgattggct gcgcctttta gaatctttca3165
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<221>CDS<222>(573)..(1913)<223>
<400>25gctagcctcg ggagctctag gagattgtga aaaacgggtc aaatttctcc gatgcagcgc 60ctataaaagt cgtaccaatt ccatttgagg gtgctcaagt gtggccaggt tatataacca120gtcagtcaac tggtctcatt cgctggtcgg atgaatttaa ttaaagaaga gacttcatgc180agttaccgcg cgttttggcg atacacaatt gataaaccta aagaaatttt caaacaattt240taattctttg tggtcatatc tgtgcgacac tgccataatt gaacgtgagc atttaccagc300ctaaatgccc gcagtgagtt aagtctcaaa gcaagaagtt gctctttagg gcatccgtag360tttaaaacta ttaaccgtta ggtatgacaa gccggttgat gtgaacgcag tttttaaaag420tttcaggatc agatttttca caggcatttt gctccagcaa acgcctagga tgtacatggt480gccctcaatg ggaaccacca acatcactaa atggcccaga tacacacttt aaaatcgtgc540gcgcatgcag ccgagatggg aacgaggaaa tc atg aca gtt gat gag cag gtc 593Met Thr Val Asp Glu Gln Val1 5tct aac tat tac gac atg ctt ctg aag cgc aat gct ggc gag cct gaa 641Ser Asn Tyr Tyr Asp Met Leu Leu Lys Arg Asn Ala Gly Glu Pro Glu10 15 20ttt cac cag gca gtg gca gag gtt ttg gaa tct ttg aag atc gtc ctg 689Phe His Gln Ala Val Ala Glu Val Leu Glu Ser Leu Lys Ile Val Leu25 30 35gaa aag gac cct cat tac gct gat tac ggt ctc atc cag cgc ctg tgc 737Glu Lys Asp Pro His Tyr Ala Asp Tyr Gly Leu Ile Gln Arg Leu Cys40 45 50 55gag cct gag cgt cag ctc atc ttc cgt gtg cct tgg gtt gat gac cag 785Glu Pro Glu Arg Gln Leu Ile Phe Arg Val Pro Trp Val Asp Asp Gln60 65 70ggc cag gtc cac gtc aac cgt ggt ttc cgc gtg cag ttc aac tct gca 833
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1.具有產生L-氨基酸的能力的棒狀桿菌型細菌，其中所述棒狀桿菌型細菌被修飾使得乙酰輔酶A水解酶活性減少，并且其中所述L-氨基酸是通過使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產生的一種或多種L-氨基酸。
2.根據權利要求1的棒狀桿菌型細菌，其中通過將突變引入染色體乙酰輔酶A水解酶基因的編碼區或表達調控區來減少所述乙酰輔酶A水解酶活性。
3.根據權利要求1的棒狀桿菌型細菌，其中通過破壞染色體乙酰輔酶A水解酶基因來減少所述乙酰輔酶A水解酶活性。
4.根據權利要求1至3中任一項的棒狀桿菌型細菌，其中所述乙酰輔酶A水解酶選自下組(A)包含SEQ ID NO24所示氨基酸序列的蛋白質；和(B)包含SEQ ID NO24所示氨基酸序列的蛋白質，其中在所述蛋白質中取代、缺失、插入、或添加了一個或幾個氨基酸，并且其中所述蛋白質具有乙酰輔酶A水解酶的活性。
5.根據權利要求1至3中任一項的棒狀桿菌型細菌，其中所述乙酰輔酶A水解酶基因選自下組(a)包含SEQ ID NO23的核苷酸1037至2542的基因；和(b)DNA，其能夠在嚴緊條件下與包含SEQ ID NO23的核苷酸1037至2542的多核苷酸或由所述多核苷酸制備的探針雜交，并編碼具有乙酰輔酶A水解酶活性的蛋白。
6.根據權利要求1至5中任一項的棒狀桿菌型細菌，其中所述棒狀桿菌型細菌被進一步修飾以提高谷氨酸脫氫酶活性。
7.根據權利要求1至6中任一項的棒狀桿菌型細菌，其中所述L-氨基酸是一種或多種選自下組的L-氨基酸L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸和L-纈氨酸。
8.產生L-氨基酸的方法，其包括在培養基中培養根據權利要求1至7中任一項的棒狀桿菌型細菌；和從培養基中收集L-氨基酸，且其中所述L-氨基酸是一種或多種經由丙酮酸為中間物產生的L-氨基酸。
9.根據權利要求8的方法，其中所述L-氨基酸是一種或多種選自下組的氨基酸L-谷氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸和L-賴氨酸。
全文摘要
本發明描述了具有產生L－氨基酸的能力且被修飾使得乙酰輔酶A水解酶活性減少的棒狀桿菌型細菌。該細菌被用于產生通過使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產生的L－氨基酸，如L－谷氨酸、L－精氨酸、L－谷氨酰胺、L－脯氨酸、L－丙氨酸、L－纈氨酸和L－賴氨酸。
文檔編號C12P13/06GK101065484SQ20058004047
公開日2007年10月31日 申請日期2005年11月25日 優先權日2004年11月25日
發明者福井啟太, 中村純, 児島宏之 申請人:味之素株式會社