專利名稱：在真核細胞中生產化合物的方法
技術領域：
本發明涉及重組DNA技術。特別地，本發明涉及用于在真核細胞中 生產化合物的方法，其中所述化合物存在于下述過氧化物酶體中，所述過 氧化物酶體能與細胞分泌途徑所涉及的細胞的膜結構融合，這使得所述化 合物可被釋放到細胞外。
背景技術：
蛋白通過真核細胞向培養基的分泌涉及蛋白轉運經過多個膜閉合的區 室，這構成了分泌途徑。首先，蛋白被轉移到內質網ER內腔。蛋白質在 膜的泡囊中從那兒轉運到Golgi復合體，并從Golgi復合體轉運到質膜。 分泌過程涉及多個歩驟，其中，含有被分泌蛋白的泡囊從供體膜上被剪下 來，定位到受體膜并與之融合。在這些歩驟中的每一個，需要若干種不同 蛋白(例如折疊蛋白的伴侶分子)的功能，以進行對蛋白的足夠熟化，包 括糖基化和二硫鍵形成。細胞外蛋白在ER的氧化環境中成熟，在該處它 們成為核心糖基化的，該糖基化過程隨后在Golgi復合體中完成。
已經進行了若干嘗試，企圖提高有絲真菌中蛋白的分泌。用于提高異 源蛋白分泌的常用手段是使用信號序列(見，例如，EP 0215 594)。如上 文所示的真核細胞中的傳統分泌途徑被改造為適應細胞外蛋白的成熟。細
胞內蛋白的成熟在具有特定伴侶分子和折疊蛋白的細胞質的還原環境中實 現。以工業設置對蛋白質(尤其是細胞內蛋白質)的生產仍是困難的忍 weu，因為分泌和下游加工的低效率導致低的蛋白產量(Hopkins TR. Physical and chemical cell disruption for the recovery of intracellular proteins. Bioprocess Technol. 1991 ;12:57-83.)
由于生產蛋白質的日益增長的工業重要性以及分泌和下游加工途徑的 低效率，人們仍然需要獲得用于在真核細胞中生產蛋白質的改進方法。本
發明提供了一種新穎的方法，用于高效率地生產蛋白質。
圖1展示了 A m'ger表達載體pGBFIN-32。 圖2展示了/ac^表達載體pGBK-20。
圖3展示了在用乙酰胺酶轉化過的對照A m'gw細胞中或者在用與 SKL序列融合的乙酰胺酶基因轉化過的A m'ga細胞中測量的乙酰胺酶活性。
圖4展示了在用乙酰胺酶轉化過的對照K /acto細胞中或者在用與 SKL序列融合的乙酰胺酶基因轉化過的《/^to細胞中測量的乙酰胺酶活 性。
圖5顯示了用GFP-SKL轉化過的A m'gw的過氧化物酶體。
圖6顯示了用GFP-SKL轉化過并且與油酸鈉(過氧化物酶體增殖的 介導物(mediator)) —起培養的A m'gw的過氧化物酶體。
圖7顯示了含有若千種經轉化A w/gw菌株的培養物上清液的SDS-PAGE凝膠，其展示了 GFP-SKL在上清液中的釋放。
圖8顯示了含有若干種經轉化A w/gw菌株的培養物上清液的Western 雜交印跡，其展示了 GFP-SKL在上清液中的釋放。
圖9顯示了表達GFP (圖C) 、 GFP-SKL (圖B)或GFP/Pmp22 (圖 A)的A m'ger菌株。
圖IO顯示了細胞的a-特異性溶解的程度，其作為乙酰胺酶(amdS) /ml培養物上清液的相對量展示。
圖11展示了 A w'ger表達載體pGBFIN-5。
圖12顯示了 IOL規模發酵中A m'ger中細胞外的GFP-SKL生產以及 生物物質濃度。
圖13顯示了 A m'gw中細胞內的GFP-SKL生產上的葡萄糖受限和氧 受限發酵條件之間的區別。
圖14顯示了具有C末端SKL的經分泌乙酰胺酶在培養物上清液中的 存在；方塊2和4展示了能分泌細胞內化合物的A m'ger宿主細胞中的具
有SKL的乙酰胺酶；方塊l和2展示了能分泌細胞內化合物的A m'gw宿 主細胞中的不具有SKL的乙酰胺酶。
圖15展示了培養物上清液中具有C末端SRL的經分泌乙酰胺酶的存在。
發明詳述
在第一個方面，本發明涉及一種真核細胞，其含有過氧化物酶體，所 述過氧化物酶體能與細胞分泌途徑所涉及的細胞的膜結構融合。以這種方 式，本發明提供了真核細胞的一種新能力，由此它們能將過氧化物酶體的 內含物釋放到細胞外。以這種方式，過去不能被真核細胞分泌的化合物現 在可有利地通過過氧化物酶體途徑釋放。
根據本發明，過氧化物酶體與細胞分泌途徑所涉及的細胞的膜結構的 融合等價于過氧化物酶體的膜與細胞分泌途徑所涉及的細胞的膜結構的融
合。融合指不同元件的合并，形成統一的整體此處一種元件是過氧化物
酶體的膜，另外的元件是來自細胞分泌途徑所涉及的細胞的膜結構的膜。 過氧化物酶體的脂雙層膜與分泌途徑的膜結構的脂雙層膜的融合在本文中 被理解為表示兩種脂雙層膜形成一種單一的、連續的脂雙層膜，其包圍著 過氧化物酶體和分泌途徑的膜結構的內含物。當過氧化物酶體脂雙層膜與 質膜融合形成單一的、連續的脂雙層膜的情況下，應當理解，新形成的單 一的膜將不包圍過氧化物酶體的內含物，而是過氧化物酶體的內含物將釋 放進細胞外環境。例如，如果過氧化物酶體與質膜的融合發生，過氧化物 酶體的內含物將直接輸出到細胞外。在另一個例子中，如果過氧化物酶體
與Golgi復合體和/或與ER的融合發生，過氧化物酶體內含物將轉移到 Golgi復合體和/或ER中，由此通過細胞的內在分泌途徑間接輸出到細胞 外。
過氧化物酶體(也稱作微體)被定義為單一膜限定的(single membrane-bound)細胞器，其涉及在真核細胞中普遍發現的多種代謝過程 (Sakaietal. Yeast 14, 1 175-1 187; 1998)。在真核細胞中，過氧化物酶體 通常不與細胞分泌途徑所涉及的細胞的膜結構融合，但其作為單一膜限定的細胞器被保持于胞質中。
在本發明的上下文中，細胞分泌途徑所涉及的細胞的膜結構可以是細 胞對多肽的分泌所涉及的任何膜結構。在本發明通篇中，短語"細胞分泌 途徑所涉及的細胞的膜結構"和術語"膜結構"可同義使用。優選地，細 胞分泌途徑所涉及的細胞的膜結構選自質膜、Golgi復合體和內質網
(ER)構成的組。Golgi復合體被定義為包括最少三種(順區、中區和反 區Golgi)不同的扁平膜限定區室(池，cistemae)構成，所述區室互相連 接，形成堆疊(Pfeffer SR, Constructing a Golgi complex. J Cell Biol. 2001 Dec 10;155(6):873-5)。
分泌途徑中膜融合的過程在所有真核物種中高度保守。根據本領域的 現有技術狀況，驅動膜融合的中央組分是被稱為SNARE (可溶N-乙基順 丁烯二酰亞胺-敏感因子聯接蛋白受體)的多肽。在供體(v-SNARE)和 受體(acceptor)膜(t-SNARE)上存在的互補性SNARE通過保守序列基 元(SNARE基元)區分。為介導膜融合，四種SNARE基元捆束起來，形 成平行的巻曲螺旋(coiled-coil)結構，其被稱為SNAREpin 。該 SNAREpin包含在受體膜結構上的至少一種錨定膜的SNARE，以及在供體 膜結構上的至少一種錨定膜的SNARE。含有一種或多種SNARE基元(例 如Sec9)的可溶性或膜限定的SNARE可補充SNAREpin的形成。 SNAREpin組件在供體受體膜結構中的排列可能是1: 3，但也可以是 2: 2 (Burri L, Lithgow T. A complete set of SNAREs in yeast Traffic. 2004 Jan;5(l):45-52)。
根據本發明，過氧化物酶體膜與細胞分泌途徑所涉及的細胞的膜結構 的融合可以以多種方法來實現，所述方法可單獨或組合使用。
本發明公開了為獲得過氧化物酶體與真核細胞的質膜(或分泌途徑 的另一種膜)的融合， 一種優選的選擇是將融合多肽或其一部分在過氧化 物酶體的表面暴露。根據本發明，融合多肽是供體膜結構與受體膜結構的 融合所涉及的多肽，其通常在供體膜結構的表面暴露。在表面暴露在本文 中被理解為表示在供體膜的細胞質側暴露，與內腔側相反。供體膜結構被 定義為能產生下述泡囊的膜結構，所述泡囊能與受體的膜結構融合。優選
地，供體和受體膜結構是分泌途徑的膜。更優選地，供體膜結構選自
Golgi復合體和ER構成的組。
典型地，融合多肽包含在供體膜結構(例如Gk)gi復合體或ER)的表 面暴露的部分以及跨膜結構域。在一種優選的實施方式中，融合多肽的通 常在供體膜結構的表面暴露的部分，即，表面暴露的結構域，被用于在過 氧化物酶體的表面暴露。
在一種優選的實施方式中，供體膜結構是Golgi復合體，即，融合多 肽是通常在Golgi復合體的泡囊表面表達，并且已知涉及Golgi泡囊與質 膜的融合的多肽。
優選的融合多肽是v-SNARE或v-SNARE多肽家族的多肽，如 vesicle-SNAREs, Jahn et al， Annu Rev. Biochem.(1999) 863-911 ;上文所述的 Burri et al.所述。通過與SEQ ID NO: 13的序列同一性，在下文中對優選 的v-SNARE進行了進一步定義。
在Golgi復合體的泡囊表面表達的若干種v-SNARE已被描述，例如， Sncl和Snc2 (上文所述的Burri et al.)。在ER表面表達的v-SNARE的例 子是Sec22和Ykt6 (上文所述的Bum et al.)。在本發明的一種優選的實 施方式中，使用v-SNARE Sncl或Snc2中的至少一種或其同源體。 Sncl/Snc2同源體的例子是本發明提供的爿印erg/〃船m'gw SncA多肽。
本發明包括本發明中關于其從特定對照物種(通常是酵母(S. c^eW^^))的來源所述的任何多肽的同源體的用途。因此，同源體(或 同源序列)被定義為來自與對照物種不同的另一物種的、與對照物種的多 肽發揮實質上相同的功能的多肽，雖然同源體可能具有與用于對照物種中 的名稱不同的名稱。典型地，此類同源體可能與對照物種的多肽具有至少 50%的同一性程度。此類同源體優選來自與按照本發明修飾的真核細胞相 同的真核物種。
為獲得融合多肽例如v-SNARE在過氧化物酶體表面的暴露，融合多 肽或其能與受體膜上的互補SNARE發生相互作用的至少一部分與過氧化 物酶體的膜-多肽或其一部分可操作地相連，優選地，與其融合。以這種方 式獲得包含融合多肽部分或組分以及過氧化物酶體膜-多肽部分或組分的嵌
合多肽。
過氧化物酶體膜-多肽或其一部分作為嵌合多肽的組分，優選能介導嵌 合多肽向過氧化物酶體膜的靶向，更優選地，過氧化物酶體膜多肽或其一 部分能將嵌合多肽錨定到過氧化物酶體膜。最優選地，嵌合多肽向過氧化 物酶體膜的錨定由過氧化物酶體膜多肽或其一部分通過將至少一個跨越膜 的跨膜片斷整合進過氧化物酶體膜來實現。優選地，整個嵌合多肽在過氧
化物酶體膜中的定位(localization)使得其作為膜-錨(membrane-anchor)
發揮作用，并且同時，在過氧化物酶體的(胞質)表面暴露嵌合多肽的融 合多肽部分。優選地，過氧化物酶體膜-多肽在N末端部分被修飾調整， 導致融合多肽盡可能接近過氧化物酶體膜的暴露，而不取消嵌合融合多肽 的過氧化物酶體靶向。
優選地，融合多肽(例如v-SNARE)的部分用作為嵌合多肽的組分， 所述嵌合多肽至少包含通常在供體膜結構(例如Golgi泡囊)表面暴露的 融合多肽的結構域。融合多肽的跨膜結構域在嵌合多肽中可部分不存在或 完全不存在。
適合用作為過氧化物酶體膜-錨的任何過氧化物酶體膜-多肽或其一部 分發揮作用適合用于與至少融合多肽的表面暴露結構域可操作地相連，優 選地，與其融合，只要能得到包含位于過氧化物酶體的胞質側(或表面) 的融合多肽部分的嵌合肽(以便能與細胞分泌途徑所涉及的細胞的膜結構 相互作用)。優選地，融合多肽部分位于嵌合多肽的N末端部分，因此， 優選地，過氧化物酶體膜多肽是下述多肽，所述多肽中，N末端天然在過 氧化物酶體胞質側暴露，或者，其具有至少一種跨膜片斷，該片斷的天然 定向使得該片斷的N末端朝向胞質。
優選的過氧化物酶體膜多肽的一個例子是過氧化物酶體膜多肽22 (Pmp22)或其同源體(Brosius U, Dehmel T， Gartner J. Two different targeting signals direct human peroxisomal membrane protein 22 to peroxisomes. J Biol Chem. 2002 Jan 4;277(l):774-84) 。 Pmp22同源體的一 個例子是本發明提供的A/ e/^'〃w w'gw Pmp22。 Brosius et al. (2002，前 文所述)已顯示，人和大鼠的Pmp22蛋白具有四個跨膜結構域(l個以N
到C末端的方向經過)以及2個獨立的過氧化物酶體靶向信號，所述信號 位于第一個和第二個跨膜結構域的N末端。根據一種優選的實施方式，
Pmp22多肽被用作為嵌合多肽組分的部分由此至少包含Pmp22的過氧化物 酶體跨膜結構域3和4，更優選地，Pmp22的4個過氧化物酶體跨膜結構 域。優選地，Pmp22多肽作為嵌合多肽組分的部分僅包含Pmp22的過氧化 物酶體跨膜結構域3和4以及包含N末端到跨膜結構域3的足夠的氨基 酸，以包括進功能性過氧化物酶體靶向信號。優選地，包括Brosiusetal.
(2002，前文所述)定義的N末端到跨膜結構域3的至少15、 12、 10、 8 或7個氨基酸。
適用于與至少融合多肽的表面暴露結構域可操作地相連(優選地，與 其融合)的其它合適的過氧化物酶體膜蛋白(或其適合用作為過氧化物酶 體膜錨發揮作用的部分)包括但不限于，例如，PMP34、 PMP47、 PMP70、 PEX3、 PEXll、 PEX14禾卩PEX22 (綜述見Eckert JH and Erdmann R., Peroxisome biogenesis. Rev Physiol Biochem Pharmacol. 2003; 147:75-121)。
優選地，Pmp22和另外的過氧化物酶體膜蛋白在N末端部分按前文所 述經過修飾調整。所述修飾調整包括至少第一個甲硫氨酸的缺失。在N末 端部分的修飾調整還可包含N末端1至50，例如48的氨基酸的缺失，優 選地，N末端l至35，例如，33的氨基酸的缺失，更優選地，N末端l至 20，例如，18的氨基酸的缺失。優選地，對過氧化物酶體膜蛋白的N末端 加以修飾調整，使得至少15、 12、 8、 7、 5或3個氨基酸保留為N末端到 第一個(以N到C末端的方向)跨膜結構域，其天然定向使得片斷的N 末端朝向胞質。優選地，對過氧化物酶體膜蛋白的N末端的修飾調整不會 使得過氧化物酶體耙向需要的氨基酸序列被缺失或破壞。
根據一種優選的實施方式，在供體膜結構的表面暴露的v-SNARE (例 如Sncl、 Snc2或SncA)的結構域與過氧化物酶體膜多肽Pmp22可操作地 相連(或融合)，以用v-SNARE (例如Sncl、 Snc2或SncA)的相應部分 改裝(decorate)過氧化物酶體。更優選地，使用SncA的表面暴露結構 域。進一步更優選地，嵌合多肽具有根據SEQIDNO: 24的氨基酸序列。 技術人員將知道如何按照從針對SEQ ID NO: 24所述的同樣的原則從來自 其它生物的Pmp22多肽直向同源體和v-SNARE直向同源體構建嵌合多
在本發明的一種實施方式中，融合多肽在過氧化物酶體表面的暴露由 細胞受體膜結構(例如，Glogi復合體的質膜)處的補充性 (complementing)融合多肽的過量表達來進行。"補充性融合多肽"根據 本發明是協助供體膜結構(例如Glogi復合體或ER的泡囊)與受體膜結 構(例如Golgi復合體的質膜)融合所涉及的多肽。
補充性融合多肽優選是靶-SNARE或t-SNARE (Jahn et al., Annu. Rev. Biochem. 863-91 1 (1999))。優選的t-SNARE多肽例如Ssol或Sso2，或 其同源體(定位于質膜)或Sed5或其同源體(定位于Golgi復合體)(如 前文所述的Brosius et al.)。其它優選的補充性融合多肽是Sec9 (涉及在 質膜的融合)或Bosl、 Gosl、 Betl或其同源體(涉及在Golgi復合體的融 合)(如前文所述的Brosius etal.)。
根據一種優選的實施方式，融合多肽和補充性融合多肽被暴露或以化 學計量的量過量表達，這意味著融合多肽和補充性融合多肽之間的多肽相 互作用盡可能接近于生理比例或天然化學計量(如前文所述的Brosius et al.)。化學計量共暴露預計能進一步協助過氧化物酶體與受體膜結構(例 如質膜)的融合。該化學計量共表達優選通過使用基本相同拷貝數的相同 的表達盒來獲得。優選地，t-sNARE基因的內源拷貝保留不變，使得從內 源拷貝獲得的t-SNARE的量對于與分泌途徑的天然泡囊的融合來說是可利 用的。
根據本發明的一種實施方式，真核細胞含有能與細胞的質膜以及 Golgi復合體融合的過氧化物酶體。
根據一種優選的實施方式，所有選出的融合多肽以及可選的補充性融 合多肽，以及將被表達的過氧化物酶體膜多肽對于選用的真核宿主細胞來 說是天然的。
本發明還包括對根據本發明的真核細胞的改進，使得真核細胞能滿足 根據本發明的具有提高的效率的活性。
例如，過氧化物酶體向質膜的耙向以及隨后的膜融合可通過使用 Golgi來源的泡囊的耙向機制來增強。修飾可允許該機制對過氧化物酶體 有效。
修飾該機制以對過氧化物酶體有效的例子是對Sec4或其同源體進行工
程改造，使得其與過氧化物酶體可操作地相連。這將導致過氧化物酶體向
質膜(胞質外(exocyst))中分泌復合物的靶向，此外，將增加 SNAPEpin的形成，以增強過氧化物酶體與質膜融合的效率。通常，Sec4 在GDP可溶狀態和GRP結合分泌泡囊膜聯接狀態之間循環。已表明 (Ossig et al 1995. EMBO Journal 3645-3653.)，永久性聯接的Sec4是具有 生物活性的，Sec4的膜聯接通常通過對兩個C末端半胱氨酸殘基進行櫳牛 兒基櫳牛兒基化來獲得。為允許Sec4向過氧化物酶體膜的永久聯接，Sec4 的兩個C末端半胱氨酸殘基可被缺失或被不同的氨基酸取代，包含過氧化 物酶體膜多肽或其一部分的嵌合多肽可被工程改造為與已描述過的包含融 合多肽和過氧化物酶體膜多肽的嵌合多肽類似。
此外，過氧化物酶體與細胞分泌途徑所涉及的細胞的膜結構的融合可 通過下述方法提高制造對與融合多肽的相互作用更敏感的補充性融合多 肽。這可以以下文所述的多種方法來進行。
融合多肽以及可選地，補充性融合多肽的組成性活性突變體可被制 備，并且(過量)暴露于過氧化物酶體以及可選地，受體膜結構(例如質 膜)的表面。組成性活性突變體的例子是補充性融合多肽(優選地，t-SNARE，更優選地，Ssol或其同源體)的去磷酸化的突變體(Marash M， Gerst JE. t-SNARE dephosphorylation promotes SNARE assembly and exocytosis in yeast. EMBO J. 2001 Feb 1 ;20(3):411 -21)。
還可能通過本領域技術人員已知的技術對SNARE的調控子基因加以 失活。此類調控子例如是v-SNARE主體(master) (VSM-1或其同源 體)，其與磷酸化的Ssol結合，對Ssol的閉合的、失活的構象加以穩定 (Marash M, Gerst JE. Mol Biol Cell. 2003 Aug;14 (8):3114-25)。
還可能對已知能活化SNARE相互作用的酶過量表達。優選地，神經 酰胺活化的磷酸酶蛋白(CAPP)或其同源體過量表達(FishbeinJD,Dobrowsky RT， Bielawska A, Garrett S, Hannun YA. Ceramide-mediated growth inhibition and CAPP are conserved in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 1993 May 5;268(13):9255-61)。
還可能以使得過氧化物酶體的內穩態受到影響的方式對真核細胞加以 修飾。此類修飾可包括，提高過氧化物酶體生物發生的速率和/或降低過氧 化物酶體降解的速率，這是較之根據本發明的真核細胞來源的親本細胞的 過氧化物酶體生物發生和/或降解而言的。
根據一種更優選的實施方式，己通過下述方法對真核細胞進行了遺傳 修飾(WO 00/71579所述)
(a) 對涉及過氧化物酶體生物發生的基因過量表達，所述基因例如 pexll和/或pex3或其同源體，和/或
(b) 對過氧化物酶體降解涉及的基因負調，所述基因例如vpsl5禾口/ 或pddl和/或APG或其同源體。
pex3和pexll多肽在過氧化物酶體生物發生中的作用已被描述 (Baerends RJ, et al Yeast. 1997 Dec;13(15):1449-63 and WO 00/71579)。 Apg和Vpsl5多肽在過氧化物酶體降解中的作用也已被描述(Wang CW et al. J Biol Chem. 2001 Aug 10;276(32):30442-51 and Hutchins MU, et al. J Cell Sci. 1999 Nov; 112 (Pt22):4079-87)。
或者，或與上述方法組合，含有能與細胞分泌途徑所涉及的細胞的膜 結構融合的過氧化物酶體的真核細胞可通過使用合適的篩選方法進行經典 菌株改進來獲得。優選的篩選方法使用模型多肽，例如GFP在細胞過氧化 物酶體中的表達來進行，優選地，使用促進模型蛋白的過氧化物酶體定位 的信號，按照下文所述測量模型多肽在細胞外的存在。GFP在細胞外的存 在可通過但不限于熒光和/或western雜交印跡來測定。
本發明的真核細胞可被遺傳修飾，以獲得較之野生型細胞展示出更低 的蛋白表達和/或分泌的表型。此類表型可通過對蛋白表達的轉錄調控子的 缺失和/或修飾和/或失活來獲得。此類轉錄調控子例如prtT。用于通過調 節prtT降低蛋白酶表達的技術描述于US2004/0191864A1中。
對將按照本發明修飾的宿主細胞的選擇將在很大程度上取決于編碼感興趣多肽的核酸序列的來源或者取決于將生產的代謝產物的同一性。優選 地，真核細胞是哺乳動物、昆蟲、植物、真菌或藻類細胞。優選的哺乳動
物細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS細胞、293細胞、PerC6細 胞和雜交瘤細胞。優選的昆蟲細胞包括Sf9和Sf21細胞及其衍生物。更優 選地，真核細胞是真菌細胞，即酵母細胞，例如K/acfe或X ceMv&'M或 //^m"eww/a ; o(y附o^ /w！或尸/c/n'a/ ^ton'51，或有絲真菌細胞。根據一禾中最tfe 選的實施方式，真核細胞是有絲真菌細胞。
"有絲真菌"包括Eumycota和Oomycota亞門的所有有絲形式(如前 文Hawksworth et al.， 1995所定義)。有絲真菌的特征在于幾丁質、纖維 素、葡聚糖、脫乙酰幾丁質、甘露聚糖和其它復雜多糖構成的菌絲體壁。 營養生長通過菌絲延長進行，碳代謝是專性需氧的。有絲真菌菌株包括但 不限于，Jcre淤ow'w附、v45/ erg/〃M 、 v4wreo6as7V/,Mm 、 CV7ptoc0cc船、 /^//Z (XS7.(i/m附 、Fwsfln.wm 、//wm/co/a 、MagwopoWAe 、Mwcor 、
P/rowyces1 、 /Sc/ /zo/ /^〃mw 、 Zh/arom_yc&s" 、 77 e環oosci^ 、 77n'e/aWa 、 7b(ypoc/a<i/wm禾口 7>/c//ocferma白勺菌株。
優選的有絲真菌細胞屬于Jwerg/〃M、 Pe"/c/〃z'wm或rn'c/wflfew7a屬的 禾中， 最優選地，y4^erg77/^ "/ger 、 爿s/ ^g/〃w-S" sq/ae 、 y^/ ergZ〃m51
cA^TOgewwm的禾中。
公眾可以從大量培養集合物，例如American Type Culture Collection (ATCC)、 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) 、 Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS)禾口 Agricultural Research Service Patent Culture Collection 、 Northern Regional Research Center (NRRL)容易地獲得若干種有絲真菌菌株j^ ergz7/^ m'ger CBS 513.88、 j印erg/〃w o/^zae ATCC 20423、 IFO 4177、 ATCC 1011、 ATCC 9576、 ATCC14488-14491 、 ATCC 11601、 ATCC12892、尸.c/ o^。ge聽m CBS 455.95、 尸em'c/〃/wm c"r/wwm ATCC 38065、 尸ew/c/〃/wm c/ ^ysogewwm P2、 ^4cre歸w'國cA，ogew畫ATCC 36225或ATCC 48272、 7V/c/zoJe環a
"eye/ ATCC 26921或ATCC 56765或ATCC 26921 、爿^ wg/〃w sq/Vze ATCC11906、 C7 o^o^o"'"附/w^:"owmse ATCC44006及其衍生物。
多肽
在第二個方面，本發明涉及用于制備第一個方面的真核細胞的新穎的 多肽。特別地，本發明提供了如上文定義的融合多肽、嵌合多肽(其中， 融合多肽與過氧化物酶體膜多肽可操作地相連)、過氧化物酶體膜多肽和 補充性融合多肽。
在一種實施方式中，本發明提供了展示出v-SNARE功能的多肽，所 述多肽選自下述組，所述組由(a)具有根據SEQ ID NO: 13的氨基酸序 列的多肽；(b)具有展示出與SEQ ID NO: 13的氨基酸序列至少85%同 一性，優選至少90。/。，更優選至少93%，進一步更優選至少95%，進一步 更優選至少97%，進一步更優選至少98%，進一步更優選至少99%同一性 的氨基酸序列的多肽；以及(c) (a)或(b)定義的多肽的功能片段構 成。
在另一種實施方式中，本發明提供了選自下述組的過氧化物酶體膜多 肽，所述組由(a)具有根據SEQIDNO: 16的氨基酸序列的多肽；(b) 具有展示出與SEQIDNO: 16的氨基酸序列至少85%同一性，優選至少 90%，更優選至少93%，進一步更優選至少95%,進一歩更優選至少 97%，進一步更優選至少98%，進一步更優選至少99%同一性的氨基酸序 列的多肽；以及(c) (a)或(b)定義的多肽的功能片段構成。
在又一種實施方式中，本發明提供了一種嵌合多肽，其適合用于獲得 下述氨基酸序列在過氧化物酶體表面的暴露，所述氨基酸序列對應于在供 體膜結構表面暴露的融合多肽的氨基酸序列，其中，所述嵌合多肽包含與 過氧化物酶體膜多肽或其一部分可操作地相連的融合多肽或其一部分。
優選地，嵌合多肽的融合多肽組分包含v-SNARE多肽的從其N末端 到第一個(最N末端的)跨膜結構域的氨基酸。更優選地，融合多肽組分 包含選自下述組的氨基酸序列，所述組由(a)對應于SEQ ID NO: 13的 l至95位的序列和(b)展示出與(a)定義的序列具有至少50%，優選至
少60%，更優選至少70%，進一步更優選至少80%，最優選至少90%同一 性程度的同源序列構成。
還優選地，嵌合多肽的過氧化物酶體膜蛋白組分包含選自下述組的氨 基酸序列，所述組由(a)對應于SEQIDNO: 16的2至224位的序列， 優選地，對應于3或4或5或6或7或8或9或10或11或12或13或14 或15或16或17或18或19或20或21或22或23或24或25或26或27 或28或29或30或31或32或33或34或35或36或37或38或39或40 位至224位，和(b)展示出與(a)定義的序列具有至少50%，優選至少 60%，更優選至少70%，進一步更優選至少80%，最優選至少90%同一性 程度的同源序列構成。
更優選地，嵌合多肽具有根據SEQIDNO: 24的氨基酸序列。 因此本發明的一種優選的嵌合多肽包含(a)在分泌途徑供體膜胞質 表面暴露的融合多肽結構域；以及(b)靶向過氧化物酶體膜并與過氧化 物酶體膜相連的結構域；其中，結構域(a)和(b)可操作地相連，并且 其中，嵌合多肽在包含過氧化物酶體的宿主細胞中的表達賦予過氧化物酶 體與宿主細胞分泌途徑受體膜融合的能力。優選地，結構域(a)和(b)
存在于單一的開放讀碼框中，其中，結構域(a)較之結構域(b)與多肽 的N末端更為接近。優選地，結構域(a)來自v-SNARE。更優選地，結 構域(a)包含來自v-SNARE的從N末端跨越至v-SNARE的第一個跨膜 結構域或包括該第一個跨膜結構域在內的片段。在根據本發明的一種優選 的嵌合多肽中，結構域(a)中的片段包含對應于SEQ ID NO: 13的1至 95位的序列或展示出與SEQ ID NO: 13具有至少50%,優選至少60%， 更優選至少70%，進一步更優選至少80%，最優選至少90%同一性程度的 同源序列。該片段可跨越v-SNARE的N末端直到第一個跨膜結構域的氨 基酸的至少70%， 80%， 90%或95%。
在根據本發明的一種優選的嵌合多肽中，結構域(b)包含跨膜結構 域和將該結構域靶向至過氧化物酶體膜的序列。優選地，最接近結構域 (a)的跨膜結構域N末端朝向胞質定位。優選地，結構域(b)包含來自 過氧化物酶體膜蛋白的序列。更優選地，結構域(b)來自下述過氧化物
酶體膜多肽，所述多肽的N末端天然暴露于過氧化物酶體的胞質側，或者 所述多肽具有至少一個其N末端朝向胞質的跨膜結構域。最優選地，結構
域(b)來自下述過氧化物酶體膜多肽，其N末端已被從最N末端的跨膜 結構域(具有朝向胞質的其N末端)去除了多達至少IO個氨基酸。結構 域(b)可取自下述過氧化物酶體膜多肽，所述過氧化物酶體膜多肽選自 Pmp22、 Pmp34、 Pmp47、 Pmp70、 Pex3、 Pexll、 Pexl4禾口 Pex22。在一禾中 優選的實施方式中，根據本發明的嵌合蛋白結構域(b)是對應于SEQID NO: 16的2至224位的序列，優選地，對應于3或4或5或6或7或8或 9或10或11或12或13或14或15或16或17或18或19或20或21或22 或23或24或25或26或27或28或29或30或31或32或33或34或35 或36或37或38或39或40位至224位，或展示出與SEQ ID NO: 16具 有至少50%，優選至少60%，更優選至少70%，進一步更優選至少80%， 最優選至少90%同一性程度的同源序列。最優選地，嵌合蛋白具有根據 SEQIDNO: 24的氨基酸序列。
就本發明的目的而言，兩條氨基酸序列間的同一性程度指兩條序列鍵 相同氨基酸的百分比。首先，使用Basic Local Alignment Search Tool
(BLAST)算法來檢索同源多肽序列，該算法被描述于Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)中。用以開展BLAST分析的軟件可以通過國 家生物技術信息中心 (National Center for Biotechnology Information ， http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)為公眾所獲得。BLAST算法的參數W、 B和 E確定了比對的敏感性和速度。BLAST程序缺省使用的字長度(word length, W)為3， BLOSUM62分數矩陣(見Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989))比對(B)為50，期望值
(expectation, E)為10， M=5， N=-4。
接著，使用CLUSTALW比對算法(Higgins D. et al (1994). Nucleic Acids Res. 22:4673-4680)對同源序列的同一性程度(按上文定義的)進行
測定，其中使用下述參數缺口大小5，缺口開放11，缺口延伸1， 錯配-15，字長3。
多核苷酸
在第三個方面，本發明涉及多核苷酸，其包含編碼第二個方面任何多 肽的核酸序列。
本發明包括下述核酸序列，其編碼如上文定義的融合多肽、嵌合多肽 (其中，融合多肽與過氧化物酶體膜多肽可操作地相連)、過氧化物酶體 膜多肽和補充性融合多肽。
選出將根據本發明被修飾的真核細胞后，可以確定融合多肽、作為過 氧化物酶體膜錨發揮作用的多肽以及可選地，補充性融合多肽的身份(來 源)。例如，編碼第二個方面的多肽的核酸序列的來源可取決于選出的真 核細胞的身份。優選地，編碼第二個方面的多肽的核酸序列對于將按照本 發明修飾的真核細胞來說是內源的。
本發明還提供了一種核酸構建體，其包含編碼按照上文定義的多肽的 核酸序列，其與指導合適宿主中多肽表達的一種或多種控制序列可操作地 相連。
表達應被理解為包括對多肽的生產中涉及的任何步驟，其包括但不限 于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾。
"核酸構建體"在本文中被定義為單鏈或雙鏈的核酸分子，其是從天 然存在的基因分離出的，或己經過修飾以含有以自然界中不存在的方式組 合及并置的核酸片斷。當核酸構建體含有編碼序列表達所需的所有控制序 列時，術語核酸構建體與術語表達盒同義。
術語"控制序列"在本文中被定義為包括對于多肽表達來說必須或有 利的所有組分。每種控制序列可以是編碼多肽的核酸序列天然的或外源 的。此類控制序列包括但不限于，啟動子、引導序列、最優翻譯起始序列
(如Kozak， 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870所述)、聚腺苷化序列、 前肽(propeptide)序列、轉錄終止子。就最小程度而言，控制序列包括 啟動子以及轉錄和翻譯終止信號。
術語"可操作地相連"在本文中被定義為下述構象，其中，控制序列 以相對于DNA序列的編碼序列的下述位置被合適地放置，所述位置使得 控制序列能指導多肽的表達。
控制序列可以是合適的啟動子序列，其在細胞中顯示出轉錄活性，包 括突變的、截短的和雜交的啟動子，其可從編碼對細胞來說同源(天然) 或異源(外源)的細胞外或細胞內多肽的基因獲得。
啟動子可以是與將表達的編碼序列天然相連的啟動子。啟動子還可以 是對將表達的編碼序列來說外源的組成型或可誘導啟動子。用于哺乳動物
的合適的啟動子的例子在例如Sambrook and Russell (2001 ) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York中有所描述。用于酵母中的 合適的啟動子的例子是例如糖分解啟動子。
可使用的優選的可誘導啟動子的例子是淀粉可誘導、銅可誘導、油酸 可誘導啟動子。
根據另一種優選的實施方式，如果基因必須在本發明的宿主細胞中過 量表達，例如CAPP，那么使用強的可誘導啟動子，例如Am'ger的葡糖 淀粉酶啟動子或A o^yzfle的TAKA淀粉酶啟動子。
控制序列還可以是合適的轉錄終止子序列，這是能被有絲真菌細胞識 別用來終止轉錄的序列。終止子序列與編碼多肽的核酸序列的3'末端可操 作地連接。在細胞中具有功能的任何終止子可用于本發明。
優選用于有絲真菌細胞的終止子可從編碼TAKA-淀粉酶、 Am'gw葡糖淀粉酶、A mVMfl"5鄰氨基苯甲酸鹽/酯合酶、A m'ger alpha葡 糖苷酶、trpC基因和F^an'Mm ac"/wrMm胰蛋白酶類似蛋白酶的基因獲 得。
控制序列還可以是合適的引導序列，這是mRNA的非翻譯區域，其對 于通過有絲真菌細胞的翻譯來說是重要的。引導序列與編碼多肽的核酸序 列的5'末端可操作地連接。在細胞中具有功能的任何引導序列都可用于本 發明。
優選用于有絲真核細胞的引導序列可從編碼Ao^zae TAKA-淀粉酶和 A "/^/a朋丙糖磷酸酯異構酶和A m'gw葡糖淀粉酶的基因獲得。
控制序列還可以是聚腺苷化序列，這是與核酸序列3'末端可操作地相 連，并且當被轉錄時能被有絲真菌細胞作為信號識別以向經轉錄mRNA加
上聚腺苷殘基的序列。在細胞中起作用的任何聚腺苷化序列都可用于本發 明。
優選用于有絲真核細胞的聚腺苷化序列從編碼Ao^yz"e TAKA-淀粉 酶、A"&er葡糖淀粉酶、A mV/w/a朋鄰氨基苯甲酸鹽/酯合酶、Fw^m'wm 胰蛋白酶類似蛋白酶和Aalpha葡糖苷酶的基因獲得。
控制序列還可以是前肽編碼區域，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸 序列。得到的多肽已知為前酶或前多肽(在某些情況下，酶原)。
核酸構建體可與載體或表達載體相同或在其中克隆。
重組表達載體可以是能方便地經歷重組DNA過程并能導致編碼融合 多肽(或補充性融合多肽)的核酸序列表達的任何載體(例如質粒或病 毒)。典型地，對載體的選擇將取決于載體與載體將被引入的真核細胞之 間的兼容性。載體可以是線性的或閉合環狀的質粒。載體可以是自主復制 載體，即作為其復制不依賴染色體復制的染色體外主體存在，例如，質 粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。自主保持的克隆載體可包 含AMAl-序歹U (見，例如Aleksenko and Clutterbuck (1997)， Fungal Genet Biol. 21 : 373-397)。
或者，載體可以是下述載體，當其被引入細胞時，其整合進基因組， 與其已整合進的染色體一起復制。整合型載體可在宿主細胞的染色體中隨 機整合或在預定耙位點整合。
在本發明的一種優選的實施方式中，整合型載體包含下述DNA片 段，該片段與宿主細胞基因組中預定靶基因座中的、用于將克隆載體整合 到預定基因座上的DNA序列同源。為促進定位整合，優選在轉化宿主細 胞之前對載體進行線性化。線性化優選進行至如下程度使得克隆載體的 至少一端，但優選地，任意一端側翼有與靶基因座同源的序列。靶基因座 側翼的同源序列的長度取決于宿主細胞的身份。對真菌而言，該長度優選 為至少30 bp，優選地，至少50 bp，進一步優選地，至少0.1 kb，進一步 優選地，至少0.2 kb，更優選地，至少0.5 kb，進一步更優選地，至少1 kb，最優選地，至少2 kb。優選地，載體中與靶基因座同源的DNA序列 是從高度表達的基因座獲得的，這意味著，其是從能在宿主細胞中高水平 表達的基因獲得的。能高水平表達的基因，即，高度表達的基因在本文中
被定義為其mRNA占細胞總mRNA的至少0.5% (w/w)的基因，例如， 在誘導條件下的；或者其基因產物占細胞總蛋白的至少1% (w/w)的基 因，(如EP 357 127所述)。大量優選的高度表達的真菌基因的例子是 來自A^wg/仏'或7Wc力o&mz的淀粉酶、葡糖淀粉酶、醇脫氫酶、木聚糖 酶、磷酸甘油醛脫氫酶或纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)基因。用于 這些目的的最優選的高度表達的基因是葡糖淀粉酶基因(優選A 葡 糖淀粉酶基因)、A w7zM TAKA-淀粉酶基因、A 基因、 7Wc/ ^/emm reew/ cM基因。這種類型的表達載體高度適用于在本發明的 真核細胞中過量表達給定的基因，例如CAPP，或融合多肽或補充性融合 多肽的野生型或組成性活性突變體(ssol)。
或者，可通過使用與基因核酸序列互補的核苷酸序列進行已建立起來 的反義技術，來對基因修飾或失活。更具體地，可通過引入與核酸序列互 補的核苷酸序列(其可在細胞中轉錄，并且能與細胞中產生的mRNA雜 交)來降低或去除有絲真菌細胞對基因的表達。在允許互補反義核苷酸序 列與mRNA雜交的條件下，翻譯出的蛋白質的量由此減少或消失。表達反 義RNA的例子展示于Appl Environ Microbiol. 2000 Feb;66(2):775-82.
(Characterization of a foldase, protein disulfide isomerase A, in the protein secretory pathway of Aspergillus niger. Ngiam C, Jeenes DJ, Punt PJ， Van Den Hondel CA, Archer DB)或(Zrenner R, Willmitzer L, Sonnewald U. Analysis of the expression of potato uridinediphosphate-glucose pyrophosphorylase and its inhibition by antisense RNA. Planta. (1993);190(2):247- 52.)中。
此外，可通過RNA干擾(RNAi)技術(FEMS Microb. Lett. 237 (2004): 317-324)來獲得對基因的修飾、負調或失活。在該方法中，核苷 酸序列(其表達待受到影響的)的同樣的正義或反義部分被依次克隆，中 間是核苷酸間隔，并且插入到表達載體中。此種分子轉錄后，小的(21-23) 核苷酸片段的形成將導致待受影響的mRNA的定位降解。對特定mRNA 的去除可進行至多種不同的程度。WO2005/05672A1和/或 WO2005/026356A1描述的RNA干擾技術可用于對基因的負調、修飾或失
活。
如果必須被失活的宿主的基因是VSM1，優選通過下述方法來進行
按照EP 635 574所述的技術，設計出失活載體，將載體靶向到將被失活的 基因的基因座上。
編碼融合(可選地，補充性融合)多肽的核酸序列的超過一個拷貝可 被插入到宿主細胞中，以增加對基因產物的生產。這可以優選通過整合進 DNA序列的基因組拷貝來進行，更優選地，通過將DNA序列的整合靶向 到高度表達的基因座(優選地，葡糖淀粉酶或淀粉酶基因座)來進行。或 者，或者，這可以通過將可擴增的選擇標記基因加入核酸序列來進行，其 中可通過在合適的選擇試劑存在的情況下培養所述細胞來對含有選擇標記 基因的擴增拷貝以及由此核酸序列的額外拷貝的細胞加以選擇。為進一步 增多將被過量表達的DNA序列的拷貝數，可以使用W098/46772所述的 基因轉化技術。這種類型的表達載體還高度適用于在本發明的宿主細胞中 過量表達給定的基因，例如CAPP。
用于有絲真菌細胞的選擇標記可選自包括但不限于am^/S (乙酰胺
酶)、wgB (鳥氨酸氨甲酰基轉移酶)、Mr (草丁膦轉移酶)、/^gB (潮霉素磷酸轉移酶)、"/"D (硝酸還原酶)、p,G (乳清酸核苷-5'-磷 酸脫羧酶)、sC (硫酸腺苷轉移酶)和^ C (鄰氨基苯甲酸鹽/酯合酶) 基因以及來自其它物種的等同物的組。用于A^erg///^細胞的優選者是A mV/w/朋s或A 。^zae的awc/S (EP 635574 Bl、 WO 97/06261)禾卩pyrG基 因，以及iS^eptow^c" Z^groscop/cMS的6tzr基因。更4尤選地，使用am^S基 因，進一步更優選地，使用來自A w/^/朋s或A 07zae的amdS基因。最 優選的選擇標記基因是與A m'(iM/a朋gp(iA啟云力子融合的A mV/w/a朋a附(iS 編碼序列(EP 635574 Bl中公開的)。來自其它有絲真菌的a/m/S基因也 可使用(WO 97/06261)。來自^reptoa〃ote/c/n^/n'"^^tom^的We基因也 可使用，如 Cassettes of the Streptoalloteichus hindustanus ble gene for transformation of lower and higher eukaryotes to phleomycin resistance. Drocourt D, Calmels T, Reynes JP, Baron M, Tiraby G. Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11 ;18(13):4009所述。
用于將上述元件連接起來構建本發明的重組表達載體的方法是本領域
技術人員公知的(見，例如上文所述的Sambrooketal., 1989)。
載體系統可以是單個載體或質粒，或兩個或多個載體或質粒，它們一 起含有將被引入到有絲真菌細胞中的總DNA或轉座子。載體優選含有一 種或多種選擇標記，其允許對經轉化的細胞進行容易的選擇。選擇標記是 下述基因，其產物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、針對營養 缺陷型的原營養型等。
使用通常己知的技術來將表達載體或核酸構建體引入細胞。其可能涉 及由以本身已知的手段進行的原生質體形成、對原生質體的轉化以及細胞 壁重建構成的方法。用于轉化^^^&7/^細胞的合適方法見￡ 238 023和 Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470- 1474所述。用于轉化Fw^n^m的種的合適的方法由Malardier et. al., 1989， Gene 78 : 147156或WO 96/00787所述。可應用其它方法，例如使用 基因槍(biolistic)轉化的方法，如Biolistic transformation of the obligate plant pathogenic fungus, Erysiphe graminis f.sp. hordei. Christiansen SK, Knudsen S, Giese H. Curr Genet. 1995 Dec; 29(l):100-2所述。然后針對過氧 化物酶體與細胞分泌途徑所涉及的細胞的膜結構(例如質膜)融合的能力 對選出的經轉化細胞加以分析。
對細胞是否獲得了過氧化物酶體與細胞分泌途徑所涉及的細胞的膜結 構融合的能力進行分析的若干種方法是可獲得的。
根據一種實施方式，使用過氧化物酶體特異性標簽(用于過氧化物酶 體與細胞分泌途徑所涉及的細胞的膜結構的融合的可視化)，在電子或熒
光顯微鏡下研究細胞的形態。過氧化物酶體特異性標簽的例子是
*硫解酶標簽，如Simon M, Binder M, Adam G, Hartig A， Ruis H Control of peroxisome proliferation in Saccharomyces cerevisiae by ADR1 , SNF1 (CAT1 ， CCR1 ) and SNF4 (CAT3). Yeast. 1992 Apr;8(4):303-9所述，或
* GFP標簽，如Monosov EZ, Wenzel TJ， Luers GH， Heyman JA, Subramani S Labeling of peroxisomes with green fluorescent protein in
living P. pastoris cells. J Histochem Cytochem. 1996 Jun;44(6):581 -9
所述，或
*過氧化氫酶標簽，如Kunce CM, Trelease RN， Turley RB. Purification and biosynthesis of cottonseed (Gossypium hirsutum L) catalase. Biochem J. 1988 Apr 1 ;251 (1》147-55所述。
根據另一種實施方式，通過在細胞的過氧化物酶體中表達模型多肽并 測量培養基中模型多肽的存在來監測過氧化物酶體與細胞分泌途徑所涉及 的細胞的膜結構的融合，優選地，使用促進模型多肽的過氧化物酶體定位 的信號。優選的模型多肽是綠色熒光蛋白(GFP)，因為其在發酵培養基 中的存在可通過熒光顯現，并可通過western雜交印跡來監測。其它模型 多肽可以是具有酶活性的細胞內蛋白質，其與過氧化物酶體定位信號可操 作地相連，例如乙酰胺酶，或天然的過氧化物酶體定位蛋白，例如過氧化 氫酶、阿馬多里酶(amadoriase)或硫解酶。
優選地，第一個方面的真核細胞展示出下述程度的過氧化物酶體融合 效率，所述程度為產生的多肽總量中的至少10%在培養期間在給定的時 間點分泌進培養基，更優選地，產生的多肽中的至少40%分泌進培養基， 進一步更優選地，產生的多肽中的至少60%分泌進培養基，進一步更優選 地，產生的多肽中的至少70%分泌進培養基，進一歩更優選地，產生的多 肽中的至少80%分泌進培養基，最優選地，產生的多肽中的至少90%分泌 進培養基。產生的多肽的總量被定義為培養基中存在的多肽的量，其 中，培養基被定義為由生物物質部分和培養基的部分構成的。分泌的多肽 的量可用模型多肽來估計。該模型多肽可以是下述綠色熒光蛋白 (GFP)，其具有經工程改造的促進過氧化物酶體定位的信號(例如PTS-1)(例如GFP-SKL)，這在下文中有定義。培養基的部分中GFP-SKL的 濃度可用本領域技術人員已知的技術來測定(例如熒光測量、吸光度測 量、Western雜交印跡)。使用測定出的模型多肽的濃度，分泌的模型多 肽的部分可被計算為產生的模型多肽的總量的百分比。
生產感興趣的化合物
本發明還涉及一種方法，其用于在第一個方面的真核細胞中生產感興 趣的化合物，其中，所述化合物存在于細胞的過氧化物酶體中。所述方法 包括如下步驟
(a) 在給定的培養基中，在有益于感興趣的化合物表達的條件下， 培養第一個方面的真核細胞，以及
(b) 可選地，對感興趣的化合物進行純化。 根據一種優選的實施方式，從培養基中回收感興趣的化合物，可選
地，對其進行純化。
根據另一種優選的實施方式，感興趣的化合物是多肽。
更優選地，第一個方面的真核細胞額外包含下述核酸構建體或表達載 體，其包含編碼感興趣的多肽的核酸序列，該序列與編碼下述信號的核酸 序列可操作地相連，所述信號能促進感興趣的多肽的過氧化物酶體定位。
促進過氧化物酶體定位的信號可以是任何信號，只要其允許相連的多 肽在過氧化物酶體中的定位和/或積累。
優選地，促進過氧化物酶體定位的信號選自如下物質構成的組
(a) —種三肽，其中，N至C末端方向上的第一個氨基酸是A、 C、 H、 K、 N、 P、 S或T， N至C末端方向上的第二個氨基酸是H、 K、 N、 Q、 R或S， N至C末端方向上的第三個氨基酸是A、 F、 I、 L、 M或V， 以及
(b )定義為如下所示的肽(R/K) (L/V/I/Q) XX (L/V/I/H/Q) (L/S/G/A/K)X(H/Q)(L/A/F)，其中X可以是任何氨基酸。
更優選地，(a)中定義的三肽也被稱為PTS-1，其作為將在過氧化物 酶體中生產的多肽的C末端延伸存在。因此，編碼促進過氧化物酶體定位 的信號的DNA序列被克隆于編碼感興趣的多肽的DNA序列下游，并與其 可操作地相連。
根據一種優選的實施方式，(a)中定義的三肽是[PAS]-[HKR]-[L]的 變體，如/" w7/co prediction of the peroxisomal proteome in fungi, plants and animals. Olof Emanuelsson, Ame Elofsson, Gunnar von Heijne and Susana Cristo' bal. J. Mol. Biol. (2003) 330, 443-456所述。根據一種更為優選的實施方式，(a)中定義的三肽是SKL或PRL。
根據另一種優選的實施方式，(a)中定義的三肽PTS-1的前面有允 許該三肽序列被移除，或者允許該三肽序列與該三肽序列之前的序列一起 從感興趣的多肽的C末端被移除(一旦多肽分泌到細胞外)的序列。此類 序列可以例如是合適的序列特異性蛋白酶或肽酶的識別序列。
(b)中定義的肽還被稱為PTS2信號(Swinkels， B et al 1991. EMBO Journal 3255-3262; Petriv O.I. et al 2004. The Journal of molecular Biology 119-134)。優選地，它們存在于多肽的N末端部分。
如果感興趣的多肽已經含有促進過氧化物酶體定位的信號，優選地， 該天然信號被用于促進過氧化物酶體定位。或者，人們可以選擇用不同的 信號來置換掉促進過氧化物酶體定位的天然信號。或者，人們可以選擇用 編碼前文所定義的促進過氧化物酶體定位的序列的DNA序列之一來置換 促進過氧化物酶體定位的天然DNA序列。
在一種實施方式中，本發明涉及對過氧化物酶體中存在的感興趣的蛋 白進行的分階段(phased)細胞外生產。在第一個階段，感興趣的多肽在 過氧化物酶體中積累，在第二個階段，通過向培養基中加入特定誘導劑來 誘導驅動本發明嵌合多肽(可選地，補充性融合多肽)表達的可誘導的啟 動子，其進而將導致過氧化物酶體與細胞分泌途徑所涉及的細胞的受體膜 結構的融合。這將導致對感興趣的多肽的細胞外生產。
或者，分階段生產的其它類型是可能的首先，生產感興趣的多肽， 然后誘導過氧化物酶體增殖，最后一步，誘導過氧化物酶體與細胞分泌途 徑所涉及的細胞的受體膜結構融合。
多肽可以是對宿主細胞來說天然或異源的任何多肽。術語"異源多 肽"在本文中被定義為給定的細胞天然不生產的多肽。術語"多肽"在本 文中不用來指特定長度的被編碼產品，因此其包括肽、寡肽和蛋白。
第一個方面的真核細胞高度適合用于生產需要還原環境用于突變的多 肽，例如，細胞內多肽。因此，根據一種優選的實施方式，感興趣的多肽 是細胞內多肽。因此，使用第一個方面的真核細胞的本發明的方法是能以 工業規模在培養基中生產細胞內多肽的第一個方法。
優選的多肽是過氧化物酶體中天然生產的酶，例如阿馬多里酶
(amadoriase)、過氧化氫酶、酰基-CoA氧化酶、亞油酸鹽/酯異構酶、反 式-2-烯酰基-ACP還原酶、單端孢霉烯3-0-乙酰轉移酶、醇脫氫酶、肉堿 消旋酶、D-扁桃酸鹽/酯脫氫酶、烯酰基CoA水合酶、果糖基胺氧氧化還 原酶、2-羥基庚-2,4-二烯-l，7-二酸鹽/酯異構酶、NADP-依賴型蘋果酸鹽/酯 脫氫酶、氧化還原酶、醌還原酶。所有這些酶都含有C末端SKL序列。
其它細胞內的酶是神經酰胺酶、環氧化物水解酶、氨肽酶、酰基轉移 酶、醛縮酶、羥化酶、氨肽酶。
在另一種實施方式中，多肽是抗體或其一部分、抗原、凝血因子、細 胞外酶、激素或激素變體、受體或其一部分、調控蛋白、結構蛋白、報道 蛋白或轉運蛋白。
根據另一種優選的實施方式，將被生產的多肽是重組的已用包含下 述DNA序列的表達構建體或核酸構建體轉化過第一個方面的真核細胞， 所述DNA序列能促進過氧化物酶體定位，并且與編碼將被生產的多肽的 DNA序列可操作地相連。
本發明因此有利地允許對多肽進行細胞外生產，這在細胞的正常分泌 途徑中會遭遇困難。例如，生產的感興趣的多肽是細胞外多肽，其可能不 含超過20個半胱氨酸，不含超過IO個的半胱氨酸，不含超過6個半胱氨 酸或者不含超過2個半胱氨酸。此類多肽可能是宿主細胞天然的或異源 的。這些多肽優選對于宿主細胞來說是重組的。此類多肽的例子是下述這 些來自A^erg///^ ;^oem'd的草酸鹽/酯脫羧酶，其不含半胱氨酸，
(APOXD，在WO 9842827-A2中有所描述)；來自J^ergWi^ m'ger的曲 霉蛋白酶(aspergillopepsin) II，其不含半胱氦酸(The gene and deduced protein sequences of the zymogen of Ape，7/船m'ger acid proteinase A, Inoue et al" J Biol Chem. 1991 Oct 15; 266(29): 19484-19489);來自丄e^/ww"/fl me;dca船的分泌的酸性磷酸酶2，其不含半胱氨酸(Ser/Thr-rich repetitive motifs as targets for phosphoglycan modifications in Leishmania mexicana secreted add phosphatase, Wiese et al., EMBO J. 1995 Mar 15; 14(6): 1067-1074);來自Sc/ero"w'a w/erarionwi的非天冬氨酸蛋白酶，其不含半胱氨
酸(Regulation of acpl， encoding a non-aspartyl acid protease expressed during pathogenesis of sc/m^or騰，Poussereau et al.， Microbiology. 2001
Mar;147(Pt 3):717-726);來自A^ergz7/^ m'gw的木聚糖酶A，其含1個半 胱氨酸(專利申請WO 200068396-A2中描述的xynA);來自Mws m^cw/w的硫酰胺酶(sulphamidase)，其含有2個半胱氨酸(Gene encoding the mouse sulphamidase: cDNA cloning, structure, and chromosomal mapping, Costanzi et al., Mamm Genome. 2000 Jun;ll (6):436-439)。感興趣 的多肽還可以是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素 酶、幾丁質酶、角質酶、脫氧核糖核酸酶、環糊精糖基轉移酶、酯酶、 alpha-半乳糖苷酶、beta-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、alpha-葡糖苷酶、beta-葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶、水解酶、轉化酶、異構酶、漆酶、連接酶、 脂肪酶、脂加氧酶、裂合酶、甘露糖苷酶、變構酶(mutanase)、氧化 鎂、加氧酶、氧化還原酶、果膠酶、過氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚 氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、轉移酶、轉谷氨酰胺酶或木聚糖酶。編碼 感興趣的多肽的核酸可以從任何原核、真核或其它來源獲得。就木發明的 目的而言，術語"從……獲得"在本文中與給定的來源一起使用時將表 示，多肽是通過該來源或通過已插入了來自該來源的基因的細胞生產的。
本發明的方法有利地允許在培養過程終點，生產出至少0.01 g/1的多 肽。優選地，生產出至少0.05 g/1的多肽，進一步更優選地，至少0.5/1， 最優選地，至少lg/1。
根據另一種優選的實施方式，感興趣的化合物是代謝產物。優選的代 謝產物是，紫杉醇，類異戊二烯(包括類胡蘿卜素)，青霉素，頭孢菌素 (包括生物堿)、斯達汀(包括洛伐他汀)和抗氧化劑。根據第一種優選 的實施方式，第一個方面的宿主細胞被用于生產內源過氧化物酶體代謝產 物。內源過氧化物酶體代謝產物的例子是異丁酸、異戊酸和a-甲基丁酸。 根據第二種優選的實施方式，使用第一個方面的真核細胞作為宿主細胞來 生產代謝產物，其中所述真核細胞額外包含含有下述核酸序列的核酸構建 體或表達載體，所述序列編碼代謝產物合成過程所涉及的酶，并且與編碼 下述信號的核酸序列可操作地相連，所述信號能促進代謝產物合成過程所
涉及的酶的過氧化物酶體定位。促進過氧化物酶體定位的信號可以是任何 信號，只要其允許前文所述的、過氧化物酶體中相關多肽的定位和/或積 累。代謝產物合成過程所涉及的酶的例子是下述這些
-類胡蘿卜素合成八氫番茄紅素-^胡蘿卜素合酶CrtYB和CrtE、
crtl、 crtY、 crtB禾口 crtZ。
-紫杉醇生物合成紫杉垸13 Q!-羥化酶和紫杉二烯合酶。 -青霉素合成酰基轉移酶。 -頭孢菌素合成擴環酶。
-生物堿合成S)-去甲烏藥堿(Norcoclaurine)合酶(NCS) -斯達汀聚酮(polyketide)合酶香葉醇10-羥化酶。 根據又一種實施方式，本發明涉及對過氧化物酶體中存在的代謝產物 的細胞外分階段生產。在第一個階段，代謝產物在過氧化物酶體中積累， 在第二個階段，通過向培養基中加入特定誘導劑來誘導驅動本發明嵌合多 肽(可選地，補充性融合多肽)表達的可誘導的啟動子，其進而將導致過 氧化物酶體與細胞分泌途徑所涉及的細胞的受體膜結構的融合。這將導致 對感代謝產物的細胞外生產。
或者，分階段生產的其它類型是可能的首先，生產代謝產物，然后 誘導過氧化物酶體增殖，最后一步，誘導過氧化物酶體與細胞分泌途徑所 涉及的細胞的受體膜結構融合。
培養條件
使用本領域已知的方法，在適合用于生產感興趣的化合物的營養培養 基中培養第一個方面的宿主細胞。例如，可通過在合適的培養基中、允許 感興趣的化合物被表達和/或分離的條件下進行搖瓶培養、實驗室或工業發 酵罐中的小規模或大規模的發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發 酵)來培養細胞。培養發生于包含碳源和氮源以及無機鹽的合適的營養培 養基中，使用本領域已知的方法來進行(見，例如Bennett, J. W. and LaSure, L.，eds" More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA， 1991)。合適的培養基可從商業供貨商處獲得，或者使用公開的組合物
(例如，American Type Culture Collection目錄中的)來制備。
本發明還提供了一種改進的生產方法，用于生產感興趣的化合物。根 據第一種優選的實施方式，在培養基中培養第一個方面的宿主細胞，其 中，向培養基中進料合適量的氧，以保持培養物處于氧受限的條件下。更 優選地，氧受限的培養條件在下述培養基中進行，其中，在培養期間的至 少一部分，所有營養物都以過量提供。進一步更優選地，在培養期間的至 少一部分意味著培養期間的一半，更優選地，培養期間的2/3，進一步更 優選地，培養期間的4/5，進一步更優選地，培養期間的5/6，最優選地， 整個培養期間。
"以過量提供"表示在培養期間，所有營養物都以足夠避免對本發 明宿主細胞的生長造成限制的量提供。明顯地，營養物不應以會導致抑制 或毒性效果的量提供。
向培養基中進料合適量的氧，以將培養物保持在氧受限的條件下。因 此，在本發明的上下文中，合適量的氧被定義為能實現在培養期間氧受 限的氧的量。為將培養基保持為氧受限，進料到培養基中的氧的量不應超 過被宿主細胞消耗的氧的量。換句話說，OTR應當與OUR基本相同。 OTR (氧轉移速率)被定義為氧從氣相轉移至培養基液相的速率。OTR以 每單位時間的氧量(例如摩爾/h)表示。可從進入培養設備的氧的量和在 氣體出口測量的氧的量之間的差異來方便地測定OTR。 OUR (氧吸收速 率)被定義為宿主細胞消耗進料至培養基中的氧的速率。"基本相同"表 示，OTR與OUR相同，偏差為正負5%。優選地，OTR盡可能的高， 即，被例如培養設備構造和/或氣體進料中的氧濃度所允許的高，前提條件 是宿主細胞能立刻消耗氧。但是，對于本領域技術人員來說，明顯還可能 在OTR低于可達到的最大OTR的氧受限條件下(例如，OTR最大值的80 或90%)開展培養過程。
在OTR與OUR基本相同的情況下，典型地，培養基中的溶解氧濃度 將是恒定的，如果氧受限控制培養，溶解氧將為零或接近零。用于測定培 養過程中是否存在氧受限的一種方便的方法是檢驗攪拌速度的輕微降低 (例如5%)對OTR的影響。如果OTR也降低，那么確實存在氧受限。
如果OTR未降低并且/或者僅溶解氧的濃度降低，那么不存在氧受限。另
一種替代性方法是測定營養物進料的增加對OTR的影響。如果營養物進 料的增加不伴隨OTR的增加，那么存在氧受限。
根據第二種優選的實施方式，對第一個方面的宿主細胞的培養包括在
培養過程期間改變培養基的pH，以實現分階段的對感興趣的化合物的細 胞外生產。典型地，可在有益于宿主細胞和感興趣的化合物的任何pH下 來進行對第一個方面的宿主細胞的培養。分階段細胞外生產可增加該方法 的總產量。在第一個階段，在最有益于第一個方面的宿主細胞的pH下， 感興趣的化合物在過氧化物酶體中積累。在第二個階段，改變培養基的 pH。更優選地，在對第一個方面的宿主細胞進行的培養的第一個和第二個 階段之間的過渡階段中，以線性過程改變pH。對第一個方面的宿主細胞 的培養過程的總持續時間通過下述等式定義Tc = a + t + b，其中
Tc=以小時計的培養過程的總持續時間，
a=以小時計的第一個培養階段的持續時間，
t=以小時計的過渡階段的持續時間，
b=以小時計的第二個培養階段的持續時間。
根據另一種更優選的實施方式，該等式滿足下述條件 97《Tc = a + t + b《240，其中 72《a《120， 1《t《24， 24《b《96
進一步更優選地，該等式滿足下述條件
128《Tc = a + t + b《216，其中 72《a《96， 8《t《24， 48《b《96
又進一步更優選地，該等式滿足下述條件
160《Tc = a + t + b《216，其中 72《a《96，16《t《24， 72《b《96
最優選地，該等式滿足下述條件 Tc = a + t + b《192，其中 a《72， t《24， b《96
優選地，第一個階段，在4.5至6.0之間的pH范圍內對宿主細胞加以 培養，在第二個階段，在5.5至7.0的范圍內培養。最優選地，第一個階 段，在pH6.0對宿主細胞加以培養，第二個階段，pH6,7。
根據第三種優選的實施方式，對第一個方面的宿主細胞的培養包括在 培養過程期間對培養基溫度的改變，以實現分階段的對感興趣的化合物的 細胞外生產。典型地，可在有益于宿主細胞和感興趣的化合物的任何溫度 下來進行對第一個方面的宿主細胞的培養。分階段細胞外生產可增加該方 法的總產量。在第一個階段，在最有益于第一個方面的宿主細胞的溫度 下，感興趣的化合物在過氧化物酶體中積累。在第二個階段，改變培養基 的溫度。優選地，第一個階段，在30。C至37。C范圍內的溫度下對宿主細 胞進行培養，第二個階段，在34。C和38。C范圍內的溫度下培養。最優選 地，第一個階段在30。C對宿主細胞進行培養，第二個階段，36°C。
或者，以及根據一種進一步更優選的實施方式，對第一個方面的宿主 細胞的培養在下述條件下進行
*其中，在培養期間的至少一部分，向培養基中進料合適量的氧， 以保持培養物處于氧受限的條件下，和/或
*其中，在培養過程期間改變培養基的pH，以實現分階段的對感興 趣的化合物的細胞外生產，和/或
其中，在培養過程期間改變培養基的溫度，以實現分階段的對感 興趣的化合物的細胞外生產，和/或
*其中，第一個方面的宿主細胞是A^e/^7/w的種，最優選地，
A; erg77/as1 的菌株。
最優選地，對第一個方面的宿主細胞的培養在下述條件下進行
*其中，在培養期間的至少一部分，向培養基中進料合適量的氧，
以保持培養物處于氧受限的條件下，和/或 其中，在培養過程期間改變培養基的pH，以實現分階段的對感興
趣的化合物的細胞外生產，其中，上述總培養時間的等式滿足下
述條件Tc = a + t + b《168，其中a《72， t《24， b《96，
以及其中，第一個階段的pH為6.0，第二個階段的pH為6.7，禾口/ 或
*其中，在培養過程期間改變培養基的溫度，以實現分階段的對感 興趣的化合物的細胞外生產，以及其中，第一個階段的溫度為 30°C，第二個階段的溫度為36°C，和/或
*其中，第一個方面的宿主細胞是A^erg///^的種，最優選地， A/ erg77/Ms 的菌株。
可針對將被生產的有興趣的化合物和所選用的真核細胞對培養基加以 改造。
根據一種優選的實施方式，培養基包含神經酰胺活化的磷酸酶蛋白 (CAPP)的激活劑。該磷酸酶已知能通過對t-SNARE進行去磷酸化從而 激活SNARE相互作用(Marash M, Gerst JE :t- SNARE dephosphorylation promotes SNARE assembly and exocytosis in yeast. EMBO J. 2001 Feb 1 ;20(3):41 1-21) 。 CAPP的激活劑的一個例子是神經酰胺，例如二氫-C2 神經酰胺或另一種C2-神經酰胺(Calbiochem， SIGMA)。優選地，在培養 開始時，在培養基中存在1至100 ^M神經酰胺。更優選地，在培養開始 時，在培養基中存在5至50 pM神經酰胺。進一步更優選地，在培養開始 時，在培養基中存在大約10 ^M神經酰胺。根據一種最優選的實施方式， 在整個培養過程中，對神經酰胺的濃度加以監測，以將其保持為上述的 值。如果需要的話，可在培養過程中持續加入新鮮的神經酰胺。
根據另一種優選的實施方式，培養基包含能誘導過氧化物酶體增殖的 物質，例如通過正常定位于過氧化物酶體中的至少一種酶代謝產生的物 質，優選地，脂肪酸，更優選地，油酸，這如以前所述(Yasuyoshi Sakai
et al， Regulation of Peroxisomal Proteins and Organelle Proliferation by Multiple Carbon Sources in the Methylotrophic Yeast, Candida boidinii. Yeast 14， 1175-1 187 (1998))。按照之前所述，脂肪酸也可用于獲得過氧化物酶 體的增殖(Intrasuksri U, et al, Mechanisms of peroxisome proliferation by perfluorooctanoic acid and endogenous fatty acids. Gen Pharmacol. 1998 Aug;31 (2):187-97.)。能誘導過氧化物酶體增殖的物質的量被定義為培養 基中可獲得的碳的百分比(例如，培養基的碳源由10%的過氧化物酶體增 殖誘導物質+ 90%葡萄糖構成)。優選地，能誘導過氧化物酶體增殖的物 質的量在培養基碳源的0.1%至100%的范圍內。更優選地，能誘導過氧化 物酶體增殖的物質的量在培養基碳源的1%至50%的范圍內。進一步更優 選地，能誘導過氧化物酶體增殖的物質的量在培養基碳源的2%至40%的 范圍內。進一步更優選地，能誘導過氧化物酶體增殖的物質的量在培養基 碳源的3%至30%的范圍內。進一步更優選地，能誘導過氧化物酶體增殖 的物質的量在培養基碳源的4%至25%的范圍內。進一步更優選地，能誘 導過氧化物酶體增殖的物質的量在培養基碳源的5%至20%的范圍內。進 一步更優選地，能誘導過氧化物酶體增殖的物質的量在培養基碳源的6% 至18%的范圍內。進一步更優選地，能誘導過氧化物酶體增殖的物質的量 在培養基碳源的7%至15%的范圍內。進一步更優選地，能誘導過氧化物 酶體增殖的物質的量在培養基碳源的8%至13%的范圍內。進一歩更優選 地，能誘導過氧化物酶體增殖的物質的量在培養基碳源的9%至12%的范 圍內。最優選地，能誘導過氧化物酶體增殖的物質的量等于培養基碳源的 10%。根據一種最優選的實施方式，能誘導過氧化物酶體增殖的物質是油 酸鈉和/或油酸，培養基中存在的油酸鈉和/或油酸的量等于培養基碳源的 10%。
根據一種更優選的實施方式，培養基包含CAPP的激活劑和能誘導過 氧化物酶體的物質，它們都以前文段落所述的優選的量存在。
可通過本領域已知的方法，從培養基中分離出得到的感興趣的化合 物。例如，可通過傳統方法，包括但不限于，離心、過濾、萃取、噴霧干 燥、蒸發或沉淀，從培養基分離出感興趣的化合物。然后可通過本領域巳 知的大量方法對經分離的多肽加以進一步純化，所述方法包括但不限于， 色譜(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和尺寸排除)、電泳方法
(例如制備等電聚焦)、差異溶解度(例如硫酸銨沉淀)或萃取(見，例
如Protein Purification, J. -C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989)。
感興趣的化合物在過氧化物酶體中的積累
在另一個方面，本發明提供了一種方法，用于在宿主細胞中生產以及 可選地，分離多肽，優選地，在有絲真菌細胞中進行，其中所述宿主細胞 包含核酸構建體或表達構建體，所述構建體包含能促進過氧化物酶體定位 的DNA序列，該序列與編碼將被生產的多肽的DNA序列可操作地相連。 在另一個方面，本發明提供了一種方法，用于在宿主細胞中生產以及可選 地，分離代謝產物，優選地，在有絲真菌細胞中進行，其中所述宿主細胞 包含核酸構建體或表達構建體，所述構建體包含能促進過氧化物酶體定位 的DNA序列，該序列與編碼代謝產物合成過程所涉及的酶的DNA序列可 操作地相連。所有這些元件都已在前文中定義。在最后這兩個方面，所述 宿主細胞的過氧化物酶體的內穩態優選按前文所定義的那樣被影響。在最 后這兩個方面，培養基優選包含前文定義的能誘導過氧化物酶體的物質。 在最后這兩個方面，隨后可從細胞裂解物的過氧化物酶體回收感興趣的化 合物。對感興趣的化合物的回收優選按照已有的描述來進行(Visualization and purification of yeast peroxisomes. Erdmann R, Gould SJ. Methods Enzymol. 2002;351:365-81)。在最后這兩個方面，所述宿主細胞的培養條件(氧受 限和/或培養基的pH值和/或培養基的溫度)優選按本說明書前文所定義。
本發明還將由下述實施例加以描述，所述實施例不應被理解為限制本 發明的范圍。
實施例1
實施例1使用C末端SKL標簽將乙酰胺酶(amdS)蛋白靶向到 J，rg/腸m'ggr禾口 A7"vvgr函vcw /acto的過氧化物酉每體
使用的Aspergillus niger菌株(CBS 513.88)和K.lactis菌株(CBS 685.97 )都已被保藏。在這些菌株中，使用如Molecular Cloning: A Laboratoy Manual, Sambrook et al.， New York: Cold Spring Harbour Press, 1989所述的經典分子生物學技術，對若干種基因加以過量表達，并且按照 下文所述測定被編碼的蛋白的活性。
1.1克隆具有或不具有SKL標簽的A. niger乙酰胺酶基因以及在A. niger和K.lactis中的表達
在PCR反應中，來自CBS 513.88的基因組DNA被用作為模板，使用 SEQIDNO: l禾BSEQIDNO: 2，得到SEQ ID NO: 4所示的編碼序列。 此外，在PCR反應中，來自CBS 513.88的基因組DNA被用作為模板，使 用SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 3，得到SEQ ID NO: 5所示的編碼序 列。所有PCR反應、cDNA合成、連接以及轉化都按照上文所述的 Molecular Cloning所述來進行。按照廠商說明書，用Pacl和Ascl對得到的 PCR片段(SEQIDNO: 4禾Q SEQ ID NO: 5)進行切割，將其各自連接進 用Pacl、 Ascl線性化過的圖1所示的A. niger表達載體，得到兩個構建 體，其中，每種乙酰胺酶基因(具有和不具有SKL的)被放置于glaA啟 動子的控制下。表達載體被用于轉化A.niger。
此外，來自CBS 513.88的基因組DNA被用作為模板，使用SEQ ID NO: 6禾B SEQ ID NO: 7，得到SEQ ID NO: 9所示的編碼序列。此外， 來自CBS 513.88的基因組DNA被用作為模板，使用SEQ ID NO: 6和 SEQIDNO: 8，得到SEQIDNO: 10所示的編碼序列。按照廠商說明 書，用Pacl和Ascl對得到的PCR片段(SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10)進行切割，將其各自連接進用Pacl、 Ascl線性化過的圖2所示的K. lactis表達載體，得到兩個構建體，其中，每種A. niger乙酰胺酶基因(具 有和不具有SKL的；分別為SEQIDNO: 9和SEQ ID NO: 10)被放置于 lac4啟動子的控制下。表達載體被用于轉化K. lactis。
將得到的質粒分別轉化進A. niger CBS 513.88或K. lactis CBS 685.97。對A. niger的轉化按照(Kelly JM, Hynes MJ Transformation ofAspergillus niger by the amdS gene of Aspergillus nidulans. EMBO J. 1985 Feb;4(2):475-9)來進行，對K. lactis的轉化按照(Sreekrishna K, Webster TD, Dickson RC， Transformation of Kluyveromyces lactis with the kanamycin (G418) resistance gene of Tn903. Gene. 1984 Apr;28(l):73畫81 )來進行。
1.2對A. niger和K.lactis轉化子的培養以及對細胞內乙酰胺酶活性的
測定
通過PCR來檢查A. niger轉化子中表達盒的存在。將選出的轉化子在 30°C和250 rpm下培養五天，這在500 ml帶擋板錐形搖瓶中的100 ml下 述培養基中進行，所述培養基為150 g/1麥芽糖、60 g/1大豆胨、1 g/1 Na2HP04、 15 g/1 (NH4)2S04、 1 g/1 MgS04'4H20、 0.08 g/1 Tween 80、 0.02 g Basildon、 20 g碼啉乙磺酸(MES) 、 1 g L-精氨酸。收獲細胞，通過在液 氮下碾磨進行破碎。通過將25 mg經碾磨的生物物質懸浮于0.5 ml磷酸緩 沖過的D20中(氘水，Cambridge Isoteope Laboratories,氖pD 7.0)，來 獲得細胞裂解物。隨后加入0.5mlD2O中的10mg/ml底物(丙酰胺)，在 37。C溫育4天，并離心(終濃度為5 mg/ml底物禾卩25 mg/mL提取物)。 對參照細胞CBS 513.88和經轉化細胞中乙酰胺酶活性的測量按照廠商說明 書通過核磁共振來進行(圖3)。在Bruker DRX-600 (運行于600 MHz的 質子頻率以及300 K的探針溫度下)上記錄1H NMR譜。使用5 mm三共 振探針和自保護(self-shielded)梯度。獲得所有對照化合物的& NMR 譜，表明涉及的所有的化合物都具有獨特的NMR信號，基于此它們能被 鑒定和定量(未示出)。為對每種相關化合物都產生完美的對照譜，在 D20中制備每種化合物的10 mg/ml的貯液。通過稱量底物或對照化合物， 以及加入D20，制備出濃度為10 mg/ml的貯液。從這些貯液中取500 ]Ld， 與500 /il 0.5 M的磷酸鹽緩沖液(pH 6.96) (KH2P04/K2HP04)混合。隨 后在27°C， D20中，于600 MHz收集每種化合物(即，丙烯酰胺、丙烯 酸、乙酰胺、乙酸、丙酰胺和丙酸)的1HNMR譜(D20中，終濃度5 mg/ml的底物或對照化合物)。針對每種化合物，鑒定出不與其它化合物 導致的信號重疊的獨特的化學位移。此外，檢測每種對照的純度，證實了
可能污染物不存在。
化合物具有下述特征信號
丙烯酰胺(目錄號8.00830, lot 4202056， Merck NJ USA) : 5.82 (dd, Hb, J = 10.3 Hz, 1 .2 Hz), 6.22 (dd， He, J = 17.2 Hz, 1 .2 Hz)， 6.28 (d， Ha， J = 10.3 Hz)， 6.31 (d, Ha, J = 10.3 Hz) ppm。
丙烯酸(目錄號14,723-0, lot S17163-034，Aldrich，Wl USA) : 5.65 (dd, Hb, J = 10.4 Hz， 1.6 Hz), 6.01 (dd， He, J = 17.4 Hz， 1.6 Hz)， 6.1 1 (d, CH2=CH， 3J = 10.3 Hz), 6.14 (d， CH2=CH, 3J = 10.3 Hz)。
乙酰胺(目錄號12,263-7, lotl6813BA-453, Aldrich, Wl USA) : 1 .99 (s, CH3)ppm。
乙酸(目錄號1 .00063, lot K31668363， Merck NJ USA) : 1 .90 (s， CH3) ppm。
丙酰胺(目錄號14,393-6, lot 25009JB-413,Aldrich，Wl USA) : l.lO(t, CH3), 2.27 (q, CH2) ppm。
丙酸(目錄號P-1386, lot 083 K3404, Sigma, St Louis, Mo USA): 1 .09 (t, CH3), 2.37 (q, CH2) ppm。
在100 ml YEPD (酵母提取物10 g/l、蛋白胨20 g/l、糊精20 g/1) 中，于30°C、 250 rpm下，在帶擋板的500 ml錐形搖瓶中對得到的K. lactis轉化子(通過PCR檢查的)進行3天的培養。收獲細胞，通過在液 氮中碾磨進行破碎。通過將經碾磨的生物物質重新溶解于20 mM磷酸鈉緩 沖液(pH 7.4) 、 1 mM EDTA、 2 mM DTT以及蛋白酶抑制劑(由Roche 完成，目錄號1873580)中來獲得細胞提取物。按照Skouloubris et al., Molecular Microbiology (2001 ) 40(3), 596-609所述，在對照K. lactis細胞以 及經轉化的細胞中測定乙酰胺酶活性(圖4)。
如圖3和4清楚地顯示，C末端SKL標簽的加入(其促進乙酰胺酶蛋 白的過氧化物酶體定位)增加了 A. niger和K. lactis中的細胞內乙酰胺酶 活性。
實施例2向發酵培養基中加入油酸鹽以增加過氧化物酶體的增殖
通過用油酸鈉(目錄號26125， Riedel-de Haen， Hannover, Germany)和 Tween-40 (目錄號93775, Fluka， Buchs， Switzerland)補充培養基，來介導 每個細胞中過氧化物酶體數量的增加以及由此導致的A. niger過氧化物酶 體儲備體積(storage volume)的增加。使用具有經工程改造的C末端SKL 標簽的綠色熒光蛋白(GFP) (Chalfie, M et al., Science (1994) 263(5148): 802-805)，通過熒光顯微方法來展示過氧化物酶體的增加數量。C末端 SKL標簽被工程改造為廣泛使用的、能被很好表征的GFP基因，這是按照 實施例1所述使用PCR方法實現的。將得到的GFP-SKL基因克隆進A. niger表達載體，使用實施例1所述的方法將其轉化至A. niger CBS 513.88。
在最小程度富集Aspergillus培養基(MEAM ，在專利申請WO 98/46772中描述過)中，于30°C和250 rpm，使用軌道振蕩器在搖瓶中， 對獲得的過量表達具有連接SKL的C末端的GFP的A. mger菌株進行培 養。48小時的預培養后，收獲菌絲體，洗滌，隨后將其轉移至補充有 0.18% (w/v)油酸鈉和0.02% (w/v) Tween-40的新鮮培養基(MEAM) 中。在沒有補充油酸鈉和Tween-40的MEAM中對對照培養物加以培養。 26小時的培養后，使用Zeiss熒光顯微鏡，用藍光激發(490 nm)分析樣 品。代表性樣品用于使用Fujicolor800ASA彩色膠片進行的熒光顯影。
從圖5可以觀察到，在不包含油酸鈉和Tween-40的培養基中對過量表 達GFP-SKL的菌株的培養導致每個細胞的過氧化物酶體極少。如圖6清 楚展示，在補充有油酸鈉和Tween-40的發酵培養基中培養同樣的細胞， 就能誘導過氧化物酶體增殖，導致每個細胞的過氧化物酶體數量增加。
實施例3通過過氧化物酶體與質膜的融合使過氧化物酶體內含物(GFP-SKL) 釋放到細胞外 3.1在過氧化物酶體表面上克隆和表達融合多肽
將沒有跨膜結構域的A. niger v-SNARE ScnA (其基因組、cDNA和蛋 白質序列分別示為SEQ ID NO: 11、 12和13)與過氧化物酶體膜蛋白22 (Pmp22)(其基因組、cDNA和蛋白質序列分別示為SEQ ID NO: 14、
15和16)融合。在PCR反應中，來自CBS 513.88的基因組DNA被用作 為模板，使用SEQ ID NO: 17禾B SEQ ID NO: 18，得到編碼SEQ ID NO: 19。此外，在PCR反應中，來自CBS 513.88的基因組DNA被用作 為模板，使用SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 21，得到編碼SEQ ID NO: 22。隨后，在PCR反應中，SEQ ID NO: 19和SEQIDNO: 22被用 作為模板，使用SEQ ID NO: 17和SEQIDNO: 21，得到SEQ ID NO: 23。按照廠商說明書，用Pacl和Ascl對得到的PCR片段(SEQ ID NO: 23)進行消化，將其連接進用Pacl、 Ascl線性化過的圖1所示的A. niger 表達載體。這產生了下述構建體，其中，編碼具有過氧化物酶體膜錨的融 合多肽(SncA/Pmp-22)的基因被放置于glaA啟動子的控制下。該基因的 表達產生了包含過氧化物酶體膜錨的嵌合蛋白，如SEQ ID NO: 24所示。 SncA/Pmp-22表達載體與GFP-SKL表達載體一起用于共轉化A. niger。所 有PCR反應、連接以及轉化都按照上文所述的Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., New York: Cold Spring Harbor Press, 1989所述使用經典分子生物學技術來進行。
3.2培養共轉化子用于分析過氧化物酶體內含物的釋放 使用PCR，對前文段落獲得的過量表達GFP-SKL和SncA/Pmp-22的 A. mger菌株的若干克隆進行選擇，選出含有每種基因的單拷貝的克隆。 在含或不含10 MM C2-神經酰胺(N-乙酰基-D-鞘氨醇目錄號A7191, Sigma, St. Louis Missouri USA)的MEAM緩沖過的培養基(在專利申請 WO 98/46772中詳細描述過)中，于30°C和250 rpm，使用軌道振蕩器在 搖瓶中，對選出的克隆進行培養。含有單基因拷貝的過量表達GFP-SKL 的菌株(實施例2中描述的構建)以及空宿主菌株(CBS513.88)被用作 對照。在24和48小時的時間點取樣。通過離心來澄清上清液樣品，通過 經0.45拜過濾器(目錄號4614, Pall, Ann Arbor, Mo USA)進行超濾將其 與殘余的細胞殘骸分開。
3.3對過氧化物酶體內含物向細胞外的釋放進行SDS-PAGE分析；對 作為釋放促進劑的C2-神經酰胺的分析
通過SDS-PAGE對來自3.2的上清液樣品進行分析。按照廠商說明 書，使用NuPAGE Novex高效預鑄凝膠(pre-cast gel) (4-12% Bis-Tris梯 度凝膠，Invitrogen, Paisley, UK)來進行SDS-PAGE。按照廠商說明書，將 樣品(20 Ad)與2.0 /zl還原劑和6.0 /il樣品緩沖液混合，隨后在上樣到凝 膠上之前，在70°C加熱10分鐘。電泳之后，按照廠商說明書，使用 Simply Blue Safe染料(Invitrogen, Paisley, UK)對凝膠染色。
在圖7中，可清楚觀察到GFP-SKL向細胞外的釋放。通過54kD處的 內源條帶觀察到的，所有樣品含有等量的內源蛋白。相反，第4、 5、 6和 7道含有比第1、 2和3道明顯更多的GFP-SKL。此外，還顯示，C2-神經 酰胺還誘導過氧化物酶體內含物(即GFP-SKL)向細胞外的釋放；第5和 7道(MEAM+C2-神經酰胺)分別比第4和6道含有更多的GFP-SKL。
3.4對過氧化物酶體內含物向細胞外的釋放進行Western雜交印跡分 析；對作為釋放促進劑的C2-神經酰胺的分析
通過Western雜交印跡對來自3.2的上清液樣品進行分析。按照與3.3 相同的方法進行SDS-PAGE，按照廠商說明書，使用XCeII II Blot Module (Invitrogen, Paisley, UK)來進行Western雜交印跡。電泳之后，在30伏 特，在預先切割的硝酸纖維素膜(Invitrogen)上對NuPage凝膠進行印跡 雜交。在Tris緩沖鹽水(TBS, 20 mM Tris-HCI pH 7.4, 0.9% w/v NaCl;目 錄號T5912, Sigma) +2%脫脂奶中，室溫(rT)下對雜交印跡進行1小 時的封閉。將商業上可獲得的抗GFP抗體(anti-GFP ， Eurogentec, Belgium,目錄號MMS-118P)稀釋至1/10,000，將雜交印跡與該抗體溫 育1小時。。隨后，用MilliQ水和TBS + 0.2。/。脫脂奶對雜交印跡洗三次， 每次5分鐘。洗滌之后，將雜交印跡與山羊抗兔過氧化物酶(目錄號 31460， Pierce Rock Ford Illinois USA)的1/5000稀釋液一起在室溫下溫 育。再洗雜交印跡，用檢測液(ECL直接核酸標記和檢測系統，
Amersham biosciences, Buckinghamshire, UK)浸泡。最后，將雜交印跡暴 露給AGFA Curix Blue HC-S plus膠片(AGFA Mortsel， Belgium)。
在圖8中，可觀察到GFP-SKL向細胞外的釋放。在第5、 6、 7和8道 中存在有GFP-SKL。相反，在第3、 4禾H 9、 10道中不存在細胞外GFP-SKL。
3.5對A. niger培養物的a-特異性裂解的分析
為展示出3.1-3.4所述的過氧化物酶體內含物被觀察到的釋放不是a-特 異性裂解介導的，通過對培養物上清液中細胞內乙酰胺酶(amdS)的活性 加以測量來測定培養物的裂解程度。乙酰胺酶測量按照Skouloubris et al., Molecular Microbiology (2001) 40 (3)， 596-609來進行。將10 /xl來自培養物 的上清液加入到磷酸EDTA緩沖液(PEB, 100 mM磷酸鈉，pH 7.4, 10 mM EDTA)中的100 mM乙酰胺(目錄號A0500, Sigma Missouri USA)中。 37°C溫育90分鐘之后，加入400 /xl苯酚硝普(目錄號P6994, Sigma Missouri USA)和400 /xl堿性次氯酸鹽溶液(0.2%,目錄號A1727, Sigma Missouri USA)并混合。將混合物在55°C溫育6分鐘。隨后，按照廠商說 明書，在Ultraspec 2000 UV/VIS Spectrophotometer ( Pharmacia Biotech, Sweden)中于635 nm測量吸光度。從標準曲線來計算樣品中amdS的量， 其被指定為相對單位/ml培養物上清液。
結果示于圖10中，可清楚觀察到，24小時的培養之后，培養物上清 液中不存在amdS活性，這表明沒有發生裂解。48小時的培養之后，所有 樣品含有等量的amdS活性，這表明所有培養物中的裂解程度都是相同 的。這些結果清楚顯示，在3.1至3.4中的培養物上清液中觀察到的GFP-SKL 的存在由過氧化物酶體內含物向細胞外的積極釋放引起，而非由對細 胞的a-特異性裂解引起。
實施例4 Pmp22可被用于改裝具有重組(多)肽的過氧化物酶體
為證實Pmp22可用作為過氧化物酶體膜錨，構建嵌合基因，其中綠色 熒光蛋白(GFP)與Pmp22的N末端融合，并在A. niger中表達。熒光顯 微揭示了強烈的綠色球形細胞內微體。
4.1克隆和表達GFP/Pmp22嵌合構建體
將SEQ ID NO: 25和26示出的GFP與過氧化物酶體膜蛋白22 (Pmp22)(示為SEQIDNO: 14、 15和16)融合。
在PCR反應中，GFP DNA (SEQ ID NO: 25)被用作為模板，使用 SEQ ID NO: 27禾n SEQ ID NO: 28，得到SEQ ID NO: 29。此外，在 PCR反應中，來自CBS 513.88的基因組DNA被用作為模板，使用SEQ ID NO: 30禾B SEQIDNO: 31，得到編碼SEQIDNO: 32。隨后，在PCR 反應中，SEQ ID NO: 29和SEQIDNO: 32被用作為模板，使用SEQ ID NO: 27禾口 SEQ ID NO: 31，得到SEQ ID NO: 33。按照廠商說明書，用 Pacl和Ascl對得到的PCR片段(SEQ ID NO: 33)進行消化，將其連接 進用Pacl、 Ascl線性化過的圖1所示的A. niger表達載體。這產生了下述 構建體，其中，編碼具有過氧化物酶體膜錨的GFP (GFP/Pmp-22)的基因 被放置于glaA啟動子的控制下。該基因的表達產生了包含過氧化物酶體膜 錨的GFP，如SEQ ID NO: 34所示。GFP/Pmp-22表達載體被用于轉化A. niger。所有PCR反應、連接以及轉化都按照上文所述的Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., New York: Cold Spring Harbor Press, 1989所述使用經典分子生物學技術來進行。
在最小程度富集Aspergillus培養基(MEAM ，在專利申請WO 98/46772中描述過)中，于30。C和250 rpm，使用軌道振蕩器在搖瓶中， 對獲得的過量表達GFP/Pmp-22的A. niger菌株進行培養。使用相同培養 條件，對過量表達有或沒有連接SKL的C末端的GFP的對照培養物加以 培養。18小時的培養后，使用Zeiss熒光顯微鏡，用藍光激發(490 nm) 分析樣品。代表性樣品用于使用Fujicolor 800ASA彩色膠片進行的熒光顯 影。
如可從圖9A觀察到的，過量表達GFP/Pmp22嵌合蛋白的A. niger顯 示出與過量表達GFP-SKL的A. niger (圖9B)(其中，GFP-SKL通過C 末端的SKL耙向至過氧化物酶體)相同的強烈的綠色球形細胞內微體點狀 圖案。相反，過量表達野生型GFP (即沒有C末端SKL)的A. niger在細 胞的整個胞質中都顯示普通的綠色熒光(圖9C)。
組合結果清楚顯示，Pmp-22可用作為過氧化物酶體膜錨，以改裝具有 本發明所述重組(多)肽例如GFP或融合肽的過氧化物酶體。
實施例5使用用融合多肽改裝過的過氧化物酶體來構建能分泌細胞內化
合物的A w/g^宿主細胞 5.1在A m'ger宿主細胞的過氧化物酶體表面上克隆和表達融合多肽 將沒有跨膜結構域的A "/gwv-SNARE ScnA (其基因組、cDNA和蛋 白質序列分別示為SEQ ID NO: 11、 12和13)與過氧化物酶體膜蛋白22
(Pmp22)(其基因組、cDNA和蛋白質序列分別示為SEQ ID NO: 14、 15和16)融合。在PCR反應中，來自CBS 513.88的基因組DNA被用作 為模板，使用SEQ ID NO: 18禾B SEQ ID NO: 35，得到編碼SEQ ID NO: 36。此外，在PCR反應中，來自CBS 513.88的基因組DNA被用作 為模板，使用SEQ ID NO: 20禾卩SEQ ID NO: 37，得到編碼SEQ ID NO: 38。隨后，在PCR反應中，SEQ ID NO: 36和SEQIDNO: 38被用 作為模板，使用SEQ ID NO: 35和SEQ ID NO: 37，得到SEQ ID NO: 39。按照廠商說明書，用Pacl和Acl對得到的PCR片段(SEQ ID NO: 39)進行消化，將其連接進用尸acl、 Jscl線性化過的圖ll所示的A m'ga 表達載體(pGBFIN-5)。這產生了下述構建體，其中，編碼具有過氧化物 酶體膜錨的融合多肽(SncA/Pmp-22)的基因被放置于glaA啟動子的控制 下。該基因的表達產生了包含過氧化物酶體膜錨的嵌合蛋白，如SEQ ID NO: 40所示(SncA/Pmp22蛋白)。SncA/Pmp-22表達載體被用于轉化過 量表達GFP-SKL的A CBS 513.88 (如實施例2所述)。通過PCR，
針對表達構建體SncA/Pmp-22和GFP-SKL的存在對得到的A m'ger轉化子 進行分析。按照實施例3.2和3.3所述，通過培養和SDS-PAGE對包含這
兩種表達構建體的若干種克隆進行分析，分析針對過氧化物酶體內含物的 釋放進行。在實施例6和7中對表現最好的克隆進行進一步分析。所有
PCR反應、連接以及轉化都按照上文所述的Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al" New York: Cold Spring Harbor Press, 1989所述使用經典分子生物學技術來進行。
5.2對能分泌細胞內化合物的A m'gw宿主細胞進行加工處理 將前文段落獲得的、并在實施例6和7中進一步分析的表現最好的克 隆被選用來進行GFP-SKL表達的加工處理。得到的能分泌細胞內化合物 的A m'gw宿主細胞在實施例8和9中被用作為能分泌細胞內化合物的通 用A r宿主o
在MEAM緩沖過的培養基(在專利申請WO 98/46772中詳細描述 過)中，于30。C和250 rpm，使用軌道振蕩器在搖瓶中，對選出的克隆進 行培養。將該克隆的培養物涂布到含有PDA培養基(Difco， France)的平 板上，以便在自發的重組事件中丟失GFP-SKL表達載體。針對GFP-SKL 的表達，使用UV-發光在Geldoc 2000系統(Bio-Rad， Italy)上于315 nm 處，對總共IOO，OOO個菌落進行分析。展示出最少的GFP表達的菌落被用 于另一輪培養和涂布。兩輪選擇之后，具有最小的GFP-SKL表達的科隆 被選出。PCR展示出，該菌株仍然含有SncA/Pmp22表達載體，同時保留 有GFP-SKL表達盒的至少一個拷貝。得到的能分泌細胞內化合物的A 宿主細胞在實施例8和9中被用作為能分泌細胞內化合物的通用A m'ggr宿主o
實施例6 以10L規模的發酵罐來進行細胞外GFP-SKL生產 菌株
按照實施例5.1所述構建出過量表達GFP-SKL以及SncA/Pmp22的A m'gerCBS513.88。將菌株的孢子貯藏于-80。C (5 x 107個可見孢子/管)
接種程序將一個孢子管的內含物加入到帶擋板的2L搖瓶(20 g/L酵母提取物、 20 g/L葡萄糖，pH 6.8 (用KOH) ， 300 mL培養基，在121°C蒸汽滅菌 20分鐘)中的預培養培養基中。該預培養物在30°C和220 rpm下被培養 40小時。
補料分批發酵
使用本領域已知的程序(W093/37179中描述的)，在包含碳和氮源 以及無機鹽的合適的營養培養基中進行培養。所用的生長條件如下所示 過程中的pH在培養的最初72個小時被控制為6.0，之后24小時內逐步增 加至6.7，保持為這個值。溫度被控制為30°C。工作體積為10 L，總發酵 時間為192小時。對培養基的受控進料施加氧受限條件。遵循指數曲線 (速率增加為0.025 h—4的通過攪拌來控制氧吸收速率。將含有葡萄糖的 進料調節至在培養基中保持超過10 g/L的葡萄糖濃度。必要的時候停止。 使用分光光度分析，針對GFP-SKL對上清液樣品進行分析。使用200 pi 樣品，在室溫下，用490 nm處的激發、510nm處的發射、495 nm處的截 止點(cut-off)、自動獲取(gain automatic)禾Q 61000 M-1cm"的488 nm 處的摩爾消光系數來測量相對熒光。用于熒光測量的樣品被稀釋于含有5 mM Na2EDTA的5 mM Tris HC1緩沖液(pH 8.0)中。將濾出物稀釋2至 640倍，這取決于預期的eGFP濃度。
如圖12所示，在培養的最初72小時(pH 6.0)，生物物質濃度迅速 增加，然后直到發酵終點都保持幾乎恒定，這是由于對培養基的連續進料 導致的稀釋效果造成的。在該時間段內(最初72小時)，細胞外僅發現 了非常低的GFP-SKL水平(大約0.25 g/L) 。 pH從6.0變為6.7之后(在 第72至第96小時間實現)，細胞外GFP-SKL濃度持續增加，直到發酵 終點，在192小時達到3.3 g/L的值。這清楚表明，使用上述過程條件，在 10 L規模的補料分批培養過程中以超過3.0 g/L的產率生產出了 GFP-SKL。
實施例7在葡萄糖受限和氧受限條件下采用相同培養情況來進行細胞內
GFP-SKL生產
菌株
按照實施例5.1所述構建出過量表達GFP-SKL以及SncA/Pmp22的A "&wCBS513.88。將菌株的孢子貯藏于-80。C (5 x 107個可見孢子/管)
接種程序
將一個孢子管的內含物加入到帶擋板的2L搖瓶(20 g/L酵母提取物、 20 g/L葡萄糖，pH 6.8 (用KOH) ， 300 mL培養基，在121°C蒸汽滅菌 20分鐘)中的預培養培養基中。該預培養物在30°C和220 rpm下被培養 40小時。
補料分批發酵
使用本領域己知的程序(W093/37179中描述的)，在包含碳和氮源 以及無機鹽的合適的營養培養基中進行培養。
所用的生長條件如下所示過程中的pH被控制為5.5，溫度被控制為 30°C。工作體積為10 L，總發酵時間為144小時。氣流為1 vvm (每分鐘 每體積培養基的空氣體積)。對于葡萄糖受限的培養物，應用速率增加為 0.025 h-'的指數補料曲線。對于氧受限的培養物，遵循速率增加為0.025 h-1的指數曲線通過攪拌來控制氧吸收速率。將含有葡萄糖的進料調節至在 培養基中保持超過10g/L的葡萄糖濃度。必要的時候停止。取樣，制備不 含細胞的提取物。按照實施例6所述的方法，針對GFP-SKL對樣品進行 分析。
如圖13所示，氧受限條件下，細胞內GFP-SKL的生產要比葡萄糖受 限條件下高得多。在發酵終點(144小時)，使用氧受限條件時，細胞內 的GFP-SKL生產較之葡萄糖受限的條件為大約20倍高。該具體例子清楚 表明，在10 L規模的補料分批培養過程中，氧受限條件對于GFP-SKL的 過氧化物酶體/細胞內積累來說是有好處的。
實施例8通過過氧化物酶體與質膜的融合使過氧化物酶體內含物(乙酰
胺酶)釋放到細胞外 8.1 A m'ger乙酰胺酶的克隆和表達
使用A m'gw乙酰胺酶AmdS (其基因組、cDNA和蛋白質序列分別示 為SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43)。在PCR反應 中，來自CBS 513.88的基因組DNA被用作為模板，使用SEQ ID NO: 44 和SEQ ID NO: 45，得到編碼SEQ ID NO: 46。按照廠商說明書，用 和Acl對得到的PCR片段(SEQ ID NO: 46)進行消化，將其連接 進用ftzcl、 Acl線性化過的圖1所示的A m'ger表達載體。這產生了下述 構建體，其中，編碼j. m'gw乙酰胺酶的基因被放置于glaA啟動子的控制 下。
此外，在PCR反應中，來自CBS 513.88的基因組DNA被用作為模 板，使用SEQ ID NO: 44禾卩SEQ ID NO: 47，得到編碼SEQ ID NO: 48。按照廠商說明書，用Pacl和Acl對得到的PCR片段(SEQ ID NO: 48)進行消化，將其連接進用尸acl、 Acl線性化過的圖1所示的A m'ger 表達載體(pGBFIN-5)。這產生了下述構建體，其中，編碼具有經工程改 造的C末端SKL尾巴的A m'ger乙酰胺酶的基因被放置于glaA啟動子的 控制下。該構建體的表達產生SEQ ID NO: 49所示的多肽。所有PCR反 應、連接以及轉化都按照上文所述的Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., New York: Cold Spring Harbor Press, 1989所述使用 經典分子生物學技術來進行。
得到的編碼具有或不具有C末端SKL的A m'gw乙酰胺酶的表達構建 體被用于轉化來自實施例5.2的能分泌細胞內化合物的通用A m'ger宿主和 CBS 513.88。針對SncA/Pmp22表達構建體以及乙酰胺酶構建體的存在， SncA/Pmp22表達構建體以及乙酰胺酶-SKL構建體的存在，分別通過PCR 對轉化子進行分析。選出的克隆在實施例8.3中被進一步分析。
8.2對A m'^z/a朋乙酰胺酶的克隆和表達
對該實驗而言，使用公知的A "/^fe朋乙酰胺酶基因(Tilburn et al, 1983, Gene 26:205-221)，其基因組、cDNA和蛋白質序列分別示為SEQ ID NO: 50、 SEQ ID NO: 51禾卩SEQ ID NO: 52。在PCR反應中，來自含 有A m'甴/"朋AmdS (描述于EP13211523中)的表達載體的質粒DNA被
用作為模板，使用SEQID NO: 53和SEQID NO: 54，得到編碼SEQ ID NO: 55。按照廠商說明書，用尸"cl和Acl對得到的PCR片段(SEQID NO: 55)進行消化，將其連接進用尸acl、 Acl線性化過的圖1所示的A m'gw表達載體。這產生了下述構建體，其中，編碼A mWw/a朋乙酰胺酶的 基因被放置于glaA啟動子的控制下。
此外，在PCR反應中，來自含有A AmdS (描述于
EP13211523中)的表達載體的質粒DNA被用作為模板，使用SEQ ID NO: 53和SEQ ID NO: 56，得到編碼SEQ ID NO: 57。按照廠商說明 書，用ftzcl和Acl對得到的PCR片段(SEQ ID NO: 57)進行消化，將 其連接進用尸flcl、 Acl線性化過的圖1所示的A m'gw表達載體。這產生 了下述構建體，其中，編碼具有經工程改造的C末端SKL尾巴的A m'^/a朋乙酰胺酶的基因被放置于glaA啟動子的控制下。該構建體的表達 產生SEQ ID NO: 58所示的多肽。所有PCR反應、連接以及轉化都按照 上文所述白勺Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., New York: Cold Spring Harbor Press, 1989所述使用經典分子生物學技術來進 行。得到的編碼具有或不具有C末端SKL的A m'^z/a朋乙酰胺酶的表達 構建體被用于轉化來自實施例5.2的能分泌細胞內化合物的通用A "/ger宿 主和CBS 513.88。針對SncA/Pmp22表達構建體以及乙酰胺酶構建體的存 在，SncA/Pmp22表達構建體以及乙酰胺酶-SKL構建體的存在，分別通過 PCR對轉化子進行分析。選出的克隆在實施例8.3中被進一步分析。
8.3培養來自實施例8.1和8.2的轉化子，用于分析細胞內乙酰胺酶的
釋放
將具有或不具有SKL的A m'gw AmdS以及具有或不具有SKL的A m'甴/a朋AmdS轉化進能分泌細胞內化合物的通用A m'ger宿主(實施例 5.2中構建的)和CBS 513.88 (作為陰性對照)。使用PCR選出含有乙酰 胺酶表達盒單個拷貝的轉化子。在MEAM緩沖過的培養基(在專利申請 WO 98/46772中詳細描述過)中，于30。C和250 rpm，使用軌道振蕩器在 搖瓶中，對8種類型的克隆進行培養。在培養開始之后120和144小時的 時間點，取上清液樣品。通過離心來澄清上清液樣品，通過經0.45/mi過 濾器(目錄號4614, Pall, Ann Arbor， Mo USA)進行超濾將其與殘余的細胞 殘骸分開。在實施例8.4中針對乙酰胺酶活性對上清液樣品進行分析。
8.4乙酰胺酶試驗
通過測量樣品中的游離氨，針對乙酰胺酶活性對來自8.3的上清液樣 品進行分析。游離氨是乙酰胺酶活性的指標(如Skouloubris et al., Molecular Microbiology (2001 ) 40(3), 596-609所述)。CBS 513.88的所有
選出并分析為經轉化的克隆沒有產生可檢測到的游離氨(數據未示出)。 在圖14中，展示了通過實施例5.2的菌株的四種類型的轉化子產生的游離 氨。如圖14清楚所示，含有C末端SKL延伸(即靶向過氧化物酶體)的 構建體較之不含C末端SKL延伸的構建體產生更高的細胞外乙酰胺酶活 性。這種更高的乙酰胺酶活性是過氧化物酶體內含物的釋放導致的。在圖 14中，當將方塊2 (具有SKL的A w/ger乙酰胺酶)和4 (具有SKL的A mV/M/fl朋乙酰胺酶)與對應的方塊1 (不具有SKL的A 乙酰胺酶) 和3 (不具有SKL的A mV/M/fl,w乙酰胺酶)進行比較時，可以清楚地觀察 到具有和不具有SKL的分泌到細胞外的乙酰胺酶之間的差異；在具有 SKL的乙酰胺酶的上清液中，存在多得多的乙酰胺酶活性。
實施例9通過過氧化物酶體與質膜的融合使過氧化物酶體內含物(阿馬
多里酶)釋放到細胞外 9.1 A m'ggr阿馬多里酶-SRL的克隆和表達
使用A m'ger阿馬多里酶-SRL (其基因組、cDNA和蛋白質序列分別 示為SEQ ID NO: 59、 SEQ ID NO: 60和SEQ ID NO: 61)。在PCR反 應中，來自CBS 513.88的基因組DNA被用作為模板，使用SEQ ID NO: 62和SEQ ID NO: 63，得到編碼SEQ ID NO: 64。按照廠商說明書，用 Pad和Acl對得到的PCR片段(SEQ ID NO: 64)進行消化，將其連接 進用戶flcl、 Jwl線性化過的圖ll所示的A m'gw表達載體。這產生了下述 構建體，其中，編碼阿馬多里酶的基因被放置于glaA啟動子的控制下。按
照廠商說明書，用PflCl和乂Kl對得到的質粒DNA進行消化，將其連接進
用&cl、 ^ cl線性化過的圖1所示的A w&w表達載體。所有PCR反應、 連接以及轉化都按照上文所述的Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., New York: Cold Spring Harbor Press, 1989所述使用經典分 子生物學技術來進行。得到的編碼A w扭r阿馬多里酶-SRL的表達構建體 被用于轉化來自實施例5.2的能分泌細胞內化合物的通用A m'gw宿主和 CBS 513.88 (作為陰性對照)。針對SncA/Pmp22表達構建體以及阿馬多 里酶-SRL構建體的存在，分別通過PCR對轉化子進行分析。選出的克隆 在實施例9.2中被進一步分析。
9.2培養來自實施例9.1的轉化子，用于分析細胞內阿馬多里酶的釋放 將A m'gw阿馬多里酶-SRL轉化進來自實施例5.2的能分泌細胞內化 合物的通用A剛'gw宿主和CBS 513.88 (作為陰性對照)。使用PCR選出 含有阿馬多里表達盒單個拷貝的轉化子。對2種類型的轉化子(實施例 5.2的A m'ger和CBS 513.88，每種都包含阿馬多里酶-SRL)的代表性克 隆進行選擇，并在MEAM緩沖過的培養基(在專利申請WO 98/46772中 詳細描述過)中，于30°C和250 rpm，使用軌道振蕩器在搖瓶中對它們進 行培養。在培養開始之后96小時的時間點，取上清液樣品。通過離心來 澄清上清液樣品，通過經0.45 過濾器(目錄號4614, Pali, Ann Arbor, Mo USA)進行超濾將其與殘余的細胞殘骸分開。在實施例9.3中針對阿馬 多里活性對上清液樣品進行分析。
9.3阿馬多里酶試驗
通過酶試驗來分析來自9.2的上清液樣品。阿馬多里酶活性試驗如 Monnier VM et al, J Biol Chem. 1997 Feb 7;272(6):3437- 43所述。用果糖基 丙胺(Monnier教授友情提供)作為底物，通過與鄰苯二胺的顯色反應測 量得到的葡糖醛酮的釋放來監測酶活性。該試驗基于對120分鐘反應時間 之后形成的葡糖醛酮的終點測量。反應混合物含有20 mM磷酸鈉(pH 7.4) 、 10 mM OPD、 10 mM果糖基丙胺以及來自實施例9.3的上清液樣
品，最終體積為1 ml。在37。C溫育2小時后，測量320 nm處的吸光度。 結果展示于圖15中。結果清楚地顯示，較之用阿馬多里酶-SRL基因轉化 過的對照菌株CBS 513.88，來自實施例5.2的能分泌細胞內化合物的通用 A "/gw宿主在培養基中能產生至少三倍多的阿馬多里酶-SRL。
實施例10過氧化物酶體代謝產物的增加的排出 進行實驗，以證實來自實施例5.2的能分泌細胞內化合物的通用A 宿主較之陰性對照菌株CBS513.88展示出增加的對過氧化物酶體代 謝產物的分泌。
按照實施例6所述，培養來自實施例5.2的能分泌細胞內化合物的通 用A w'ger宿主和CBS513.88。在培養開始之后138小時的時間點，取上 清液樣品。通過離心來澄清上清液樣品，通過經0.45 pm過濾器(目錄號 4614，Pall, Ann Arbor, Mo USA)進行超濾將其與殘余的細胞殘骸分開。隨 后，通過1HNMR，針對過氧化物酶體的beta氧化代謝產物(David E Metzler, Biochemistry, 2nd edition, Academic Press 2001) X寸豐羊品進行分析。
用4 N HC1將2 ml上清液酸化至pH 2，用4 ml氯仿進行萃取。從澄 清的氯仿層(離心之后)萃取回3 ml進入2 ml水(用0.01 N NaOH調節 為pH7.5)中。離心之后，取1.5ml水層，凍干，重新溶解進0.5 ml D20
(気zK ， Cambridge Isotope Laboratories )。 在 600 MHZ ， 在Bruker Avance 600核磁疑上測量1H NMR。通過二維NMR測量法，將展示出濃 度以2的因子增加的化合物鑒定為帶支鏈脂肪酸異丁酸(a)、異戊酸
(b)和a-甲基丁酸(c)。已知它們來自對帶支鏈異異脂肪酸和ante-異脂 肪酸的beta氧化(分別針對a+b禾n c的)(David E Metzler, Biochemistry, 2nd edition, Academic Press 2001 )。
對這些酸之間的定量比較通過將它們在NMR譜中的特征性甲基共振
(對a來說，1.114 ppm，對b來說，0.928，對c來說，0.885禾B 1.089 ppm)加以整合來進行。對所有三種代謝產物而言，對于來自實施例5.2 的能分泌細胞內化合物的通用A m'gw宿主，測量到了較之陰性對照菌株 CBS 513.88而言的以2為因子的增加。結果清楚顯示，來自實施例5.2的
能分泌細胞內化合物的通用A 宿主可被用作為宿主菌株，用于對感
興趣的過氧化物酶體代謝產物進行細胞外生產。
本文描述和要求保護的本發明不限于本文公開的具體實施方式
的范 圍，因為這些實施方式僅用于闡述本發明的若干方面。任何等同的實施方 式都在本發明的范圍之內。事實上，除了本文所展示和描述的之外，本領 域技術人員可從前述說明書明顯獲得對本發明的多種改變。此類改變也在 所附權利要求的范圍內。在有沖突的情況下，以本文的公開內容為準，包 括定義。
權利要求
1.一種真核細胞，其含有過氧化物酶體，所述過氧化物酶體能與細胞分泌途徑所涉及的細胞的膜結構融合。
2. 如權利要求1所述的真核細胞，其中，所述細胞分泌途徑所涉及的 細胞的膜結構選自質膜、Golgi復合體和內質網構成的組。
3. 如權利要求1或2所述的真核細胞，其中，融合多肽或其一部分在 所述過氧化物酶體的表面暴露。
4. 如權利要求3所述的真核細胞，其中，所述融合多肽的一部分暴 露，其通常在供體膜結構的表面暴露。
5. 如權利要求3或4所述的真核細胞，其中，所述融合多肽或其一部 分與過氧化物酶體膜多肽或其一部分融合或可操作地相連。
6. 如權利要求5所述的真核細胞，其中，所述過氧化物酶體膜多肽的 所述部分包含至少一個跨膜結構域。
7. 如權利要求3至7中任意一項所述的真核細胞，其中，所述融合多 肽為v-SNARE。
8. 如權利要求7所述的真核細胞，其中，所述v-SNARE是Sncl、 Sn2 或其同源體，優選地，SncA。
9. 如權利要求5或6所述的真核細胞，其中，所述過氧化物酶體膜多 肽是Pmp22或其同源體。
10. 如前述任意一項權利要求所述的真核細胞，其中，補充性融合多 肽或其一部分在受體膜結構上過量表達。
11. 如權利要求IO所述的真核細胞，其中，所述受體膜結構是質膜。
12. 如權利要求10或11所述的真核細胞，其中，所述補充性融合多 肽是t-SNARE。
13. 如權利要求3至12中任意一項所述的真核細胞，其中，所述細胞 胞含下述核酸構建體，所述核酸構建體包含編碼與過氧化物酶體膜多肽或 其一部分可操作地相連的融合多肽或其一部分的核酸序列。
14. 如權利要求13所述的真核細胞，其中，所述核酸構建體包含編碼具有根據SEQIDNO: 24的氨基酸序列的嵌合多肽的核酸序列，優選地， 根據SEQIDNO: 23的核酸序列。
15. 如前述任意一項權利要求所述的真核細胞，其中，所述細胞還包 含下述核酸構建體或表達載體，所述核酸構建體或表達載體包含編碼感興 趣的多肽的DNA序列，所述DNA序列與能促進所述感興趣的多肽的過氧 化物酶體定位的DNA序列可操作地相連。
16. 如權利要求15所述的真核細胞，其中，所述能促進過氧化物酶體 定位的信號是選自如下物質構成的組的氨基酸序列(a) —種三肽，其 中，N至C末端方向上的第一個氨基酸是A、 C、 H、 K、 N、 P、 S或T， N至C末端方向上的第二個氨基酸是H、 K、 N、 Q、 R或S， N至C末端 方向上的第三個氨基酸是A、 F、 I、 L、 M或V，以及(b)定義為如下所 示的肽(R/K)(L/V/I/Q)XX(L/V/I/H/Q)(L/S/G/A/K)X(H/Q)(L/A/F)，其中 X可以是任何氨基酸。
17. 如前述任意一項權利要求所述的真核細胞，其中，所述真核細胞 是哺乳動物、昆蟲、植物、真菌或藻類細胞。
18. 如權利要求17所述的真核細胞，其中，所述真菌細胞是酵母細 胞，優選地，K/acto或》S. c度由'ae。
19. 如權利要求17所述的真核細胞，其中，所述真菌細胞是有絲真菌 細胞，優選地，屬于爿印erg/〃Ms、尸ew/c/肌w附或7Wc/ ocferma屬的種的細 胞。
20. 如權利要求19所述的真核細胞，其中，所述有絲真菌細胞屬于或<formula>formula see original document page 3</formula>附的禾中。
21. —種方法，用于在根據權利要求1至20中任意一項所述的真核細 胞中生產感興趣的多肽，其中，所述感興趣的多肽存在于所述細胞的過氧 化物酶體中，所述方法包括在給定的培養基中培養所述真核細胞，以及可 選地，純化所述多肽。
22. 如權利要求21所述的方法，其中，所述培養基包含CAPP的激活 劑，優選地，神經酰胺，和/或能誘導過氧化物酶體增殖的物質，例如油酸 鹽/酯。
23. 如權利要求21或22所述的方法，其中，生產至少0.01 g/1的所述 感興趣的多肽。
24. —種方法，用于在根據權利要求1至20中任意一項所述的真核細 胞中生產代謝產物，其中，所述代謝產物存在于所述細胞的過氧化物酶體 中，所述方法包括在給定的培養基中培養所述真核細胞，以及可選地，純 化所述代謝產物。
25. 如權利要求24所述的方法，用于生產代謝產物，其中，所述真核 細胞還包含下述核酸構建體或表達載體，所述核酸構建體或表達載體包含 編碼所述代謝產物合成過程所涉及的酶的DNA序列，所述DNA序列與能 促進所述酶的過氧化物酶體定位的DNA序列可操作地相連。
26. 如權利要求21至25中任意一項所述的方法，用于在真核細胞中 生產感興趣的化合物，其中，培養所述真核細胞，將適當量的氧進料至培 養物以保持所述培養物處于氧受限的條件下。
27. 如權利要求21至26中任意一項所述的方法，用于在真核細胞中 生產感興趣的化合物，其中，在所述培養過程中改變所述培養基的pH。
28. 如權利要求21至27中任意一項所述的方法，用于在真核細胞中 生產感興趣的化合物，其中，所述培養過程的總持續時間為192小時，其 由以下階段構成* 72小時的第一個階段，其中，所述培養基的pH為6.0，* 24小時的過渡階段，其中，所述培養基的pH以線性過程從6.0變 為6.7，以及* 96小時的第二個階段，其中，所述培養基的pH為6.7。
29. 如權利要求21至28中任意一項所述的方法，用于在真核細胞中 生產感興趣的化合物，在所述培養過程中改變所述培養基的溫度。
30. 如權利要求21至29中任意一項所述的方法，用于在真核細胞中 生產感興趣的化合物，其中，所述培養基的溫度在所述培養過程中從30°C 變為36°C。
31. 如權利要求26至30中任意一項所述的方法，用于在真核細胞中 生產感興趣的化合物，其中，所述真核細胞是有絲真菌，優選地，屬于爿^e/^'〃Ms的禾中，更優選地，爿5perg/〃iw w〖ger菌株。
32. 展示出v-SNARE功能的多肽，其選自下述組，所述組由(a)具 有根據SEQIDNO: 13的氨基酸序列的多肽；(b)具有展示出與SEQID NO: 13的氨基酸序列至少85%同一性，優選至少90%，更優選至少 93%，進一步更優選至少95%，進一步更優選至少97%，進一步更優選至 少98%，進一步更優選至少99%的氨基酸序列的多肽；以及(c) (a)或(b)定義的多肽的功能片段構成。
33. 選自下述組的過氧化物酶體膜多肽，所述組由(a)具有根據SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的多肽；(b)具有展示出與SEQ ID NO: 16的 氨基酸序列至少85%同一性，優選至少90%，更優選至少93%，進一步更 優選至少95%，進一步更優選至少97%，進一步更優選至少98%，進一步 更優選至少99%的氨基酸序列的多肽；以及(c) (a)或(b)定義的多 肽的功能片段構成。
34. 嵌合多肽，其適合用于實現下述氨基酸序列在過氧化物酶體表面 的暴露，所述氨基酸序列對應于在供體膜結構表面暴露的融合多肽的氨基 酸序列，其中，所述嵌合多肽包含與過氧化物酶體膜多肽或其一部分可操 作地相連的融合多肽或其一部分。
35. 嵌合多肽，其包含(a) 在分泌途徑供體膜胞質表面暴露的融合多肽的結構域；以及(b) 靶向過氧化物酶體膜并與過氧化物酶體膜相連的結構域；其中，結構域(a)和(b)可操作地相連，并且其中，所述嵌合多肽 在包含過氧化物酶體的宿主細胞中的表達賦予所述過氧化物酶體與所述宿 主細胞分泌途徑受體膜融合的能力。
36. 如權利要求35所述的嵌合多肽，其中，結構域(a)和(b)存在 于單個的開放讀碼框中，其中，結構域(a)較之結構域(b)與所述多肽 的N末端更為接近。
37. 如權利要求35或36所述的嵌合多肽，其中，結構域(a)來自v-SNARE。
38. 如權利要求37所述的嵌合多肽，其中，結構域(a)包含來自v-SNARE的從N末端跨越至v-SNARE的第一個跨膜結構域或包括該第一個 跨膜結構域在內的片段。
39. 如權利要求38所述的嵌合多肽，其中，結構域(a)中的片段包含 對應于SEQIDNO: 13的l至95位的序列或展示出與SEQIDNO: 13具 有至少50%，優選至少60%，更優選至少70%，進一步更優選至少80%， 最優選至少90%同一性程度的同源序列。
40. 如權利要求38或39所述的嵌合多肽，其中，所述片段跨越v-SNARE的N末端直到第一個跨膜結構域的氨基酸的至少70%，優選 80%，更優選90%，最優選95%。
41. 如權利要求35-40中任意一項所述的嵌合多肽，其中，結構域 (b)包含跨膜結構域和將所述結構域靶向至所述過氧化物酶體膜的序列。
42. 如權利要求41所述的嵌合多肽，其中，最接近結構域(a)的跨膜 結構域N末端朝向胞質定向。
43. 如權利要求42或43所述的嵌合多肽，其中，結構域(b)包含來 自過氧化物酶體膜蛋白的序列。
44. 如權利要求43所述的嵌合多肽，其中，結構域(b)來自下述過 氧化物酶體膜多肽，所述多肽的N末端天然暴露給所述過氧化物酶體的胞 質側，或者所述多肽具有至少一個其N末端朝向胞質的跨膜結構域。
45. 如權利要求44所述的嵌合多肽，其中，結構域(b)來自下述過 氧化物酶體膜多肽，所述多肽的N末端已被從最N末端的跨膜結構域去除 了多達至少IO個氨基酸，所述最N末端的跨膜結構域具有朝向胞質的其 N末端。
46. 如權利要求45所述的嵌合多肽，其中，結構域(b)來自下述過 氧化物酶體膜多肽，所述過氧化物酶體膜多肽選自Pmp22、 Pmp34、 Pmp47、 Pmp70、 Pex3、 Pexll、 Pexl4禾卩Pex22。
47. 如權利要求46所述的嵌合蛋白，其中，結構域(b)是對應于 SEQIDNO: 16的2至224位的序列，優選地，對應于3或4或5或6或 7或8或9或10或ll或12或13或14或15或16或17或18或19或20 或21或22或23或24或25或26或27或28或29或30或31或32或33 或34或35或36或37或38或39或40位至224位，或展示出與SEQ ID NO: 16具有至少50%，優選至少60%,更優選至少70%,進一步更優選 至少80%，最優選至少90%同一性程度的同源序列。
48. 如權利要求47所述的嵌合蛋白，其具有根據SEQ ID NO: 24的氨 基酸序列。
49. 編碼如權利要求35-48中任意一項定義的嵌合蛋白的核苷酸序列。
50. 表達構建體，其包含權利要求49定義的核苷酸序列，所述核苷酸 序列與啟動子可操作地連接。
全文摘要
本發明涉及含有過氧化物酶體的真核細胞，所述過氧化物酶體能與細胞分泌途徑所涉及的細胞的膜結構融合。以這種方式，真核細胞能將過氧化物酶體的內含物釋放到細胞外。本發明還涉及一種方法，用于在所述真核細胞中生產感興趣的化合物，其中，感興趣的化合物存在于細胞的過氧化物酶體中。所述感興趣的化合物將通過促進過氧化物酶體定位的信號在過氧化物酶體中積累。優選的宿主細胞是有絲真菌細胞。
文檔編號C12N15/62GK101180396SQ200580035370
公開日2008年5月14日 申請日期2005年10月13日 優先權日2004年10月15日
發明者帕那吉帝斯·薩拉帝諾普羅斯, 彼得呂斯·約翰尼斯·費瑞德瑞克·漢福特·頓, 科尼利斯·瑪麗亞·雅各布斯·沙吉, 約翰尼斯·翰德里克·溫德·德 申請人:帝斯曼知識產權資產管理有限公司