蛋白質多態性與冠心病的關聯的制作方法

專利名稱：蛋白質多態性與冠心病的關聯的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于鑒定提高的冠心病風險的方法以及適用于所述方法的探針、引物、多肽或多核苷酸。
背景技術：
在西方世界，心血管疾病是兩種性別的首要死亡原因，而冠心病(特別是冠狀動脈疾病)是心血管疾病的主要原因。絞痛(又稱為心絞痛)是心肌沒有接收到足夠氧時發生的暫時性胸痛或壓力感。當動脈變窄或被阻塞使得流向肌肉的血不能提高以滿足更多氧需求的時候，可發生局部缺血，引起疼痛(即絞痛)。
心絞痛通常由冠狀動脈疾病引起，但其也可由其他冠心病引起。并非每個局部缺血患者都經歷心絞痛。無絞痛的局部缺血稱為無癥狀心肌缺血。無癥狀心肌缺血的危險在于心臟組織經受損傷時患者不會注意。因此，對心臟的可能損傷通常直到最終引起心肌梗塞時才被患者或醫師識別。因此，非常需要用于識別血管和(特別是)冠狀動脈退化(下文中稱為冠心病)的診斷原則使(人們)能夠進行早期診斷并從而采取早期治療措施或預防措施。

發明內容
因此，本發明的目的為提供用于診斷和治療冠心病的改進的方法。
這通過鑒定個體中提高的冠心病風險的方法完成，其中在樣品中確定Kir6.2蛋白質位置23上非谷氨酸的其他氨基酸的存在和/或位置337上非纈氨酸的其他氨基酸的存在。
在下文中，核苷酸和氨基酸的標準縮寫(例如氨基酸的三字母或單字母密碼)等同于全長術語使用。
Kir6.2蛋白質序列中多態性的鑒定可用于預測提高的或正常的冠心病(優選冠狀動脈疾病和/或心絞痛)風險，所述多態性包含Kir6.2蛋白質中位置23上的氨基酸改變(特別是從谷氨酸到賴氨酸)和/或位置337上的氨基酸改變(特別是從纈氨酸到異亮氨酸)。其可用于例如1)基于測序目的蛋白質區域的方法(例如標準蛋白質降解、質譜法分析蛋白質序列片段)；2)基于使用針對目的區域的抗Kir6.2抗體的方法(例如ELISA)；3)基于使用例如人、動物、細菌或酵母細胞在體外測定中分析Kir6.2功能活性的方法。
本發明還涉及鑒定個體中提高的冠心病風險的方法，其中在樣品中確定Kir6.2基因的一個或兩個(優選兩個)等位基因核苷酸序列上存在變異化，所述變異在Kir6.2蛋白質中產生含有23位非谷氨酸的其他氨基酸和/或337位非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2多肽序列。
Kir6.2基因一個或兩個等位基因核苷酸序列上多態性的鑒定可用于預測正常個體中(優選糖尿病患者中)提高的冠心病(優選冠狀動脈疾病，更優選心絞痛)風險，所述多態性引起Kir6.2蛋白質中位置23上的氨基酸改變(特別是從谷氨酸到賴氨酸)和/或位置337上的氨基酸改變(特別是從纈氨酸到異亮氨酸)。其可用于例如1)基于測序目的核苷酸區域的方法(例如焦磷酸測序、使用放射性標記核苷酸或用熒光染料標記的核苷酸的測序方法、用質譜法分析序列片段)；2)基于核苷酸序列與目的區域雜交的方法(例如DNA微陣列)；3)基于分析目的核苷酸區域擴增產物的方法(例如TaqManTM分析)。
K+內向整流通道Kir6.2(KCNJ11或Bir)是胰島ATP敏感鉀通道(IKATP)的一個亞單位。Kir6.2基因已被繪制于染色體11p15.1，而Kir6.2蛋白質由390個氨基酸組成。由于其在葡萄糖刺激的胰島素分泌中的關鍵作用，Kir6.2被假定為涉及II型糖尿病發作的遺傳缺陷的候選基因(Yamada等(2001)Diabetes Metab Res Rev 17213-216)。
Kir6.2的若干蛋白質、基因組多核苷酸序列和編碼多核苷酸序列為本領域知識水平公知。例如，若干個人蛋白質/基因組DNA/編碼序列可從NCBI(國家生物技術信息中心；國家醫學圖書館，38A樓，Bethesda，MD20894，USA；www.ncbi.nhm.nih.gov)數據庫以登錄號XP006398(Seq.IDNo.3)、(Seq.ID No.5)(蛋白質序列)XM006398(Seq.ID No.4)、(Seq.ID No.6)(編碼序列)公開獲得。一個基因組Kir6.2序列可從以NCBI登錄號NT 009307(人類染色體11基因組連續序列；大小8665930 bp)公布的基因組連續序列公開獲得。mRNA/編碼/基因組Kir6.2序列的比對可使用下列因特網鏈接公開獲得http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？SendTo＝on&db＝nucleotide&dispmax＝1&extrafeat＝-1&list_uids＝NT_009307.12&showndispmax＝1&view＝graph&_from＝5656500&_to＝565 9500&_sfrom＝5657000&_font＝default&_llen＝60&_slen＝4000。
如可從這樣的比對獲得的那樣，從位置5656500到5659500的序列串(SEQ ID No.13)包含基因組Kir6.2基因座。如圖2和圖3所示，不同的Kir6.2序列在蛋白質序列位置23和/或337以及編碼序列的相應位置上(分別為67/68/69和1009/1010/1011)不同。由于編碼序列由基因組DNA的轉錄產物產生，就位置5657106/107/108和5657478/79/80而言的基因組序列的若干個不同變體也一定存在。
術語Kir6.2是指Kir6.2蛋白質和核酸。術語蛋白質包含多肽和由多于一條多態性鏈組成的蛋白質，例如通過已知鍵(例如S-S橋)相互連接形成一個蛋白質單元的多肽。術語Kir6.2蛋白質可指任何Kir6.2蛋白質或多肽或其功能性片段。Kir6.2片段可以是例如比Kir6.2蛋白質或具有根據SEQID 1到8或13之一序列的核酸短的任何Kir6.2蛋白質或核酸。Kir6.2片段優選為Kir6.2的功能性片段。Kir6.2蛋白質的功能性片段為具有至少一種Kir6.2功能(見例如上文)的蛋白質片段。Kir6.2功能性核酸是例如編碼Kir6.2蛋白質或其功能性片段的Kir6.2核酸片段，或其能夠與Kir6.2核酸特異性雜交。
術語蛋白質序列、氨基酸序列和多肽序列在本申請上下文中同義使用。
令人驚奇的是，發明者的研究揭示Kir6.2多肽位置23的最常見變體為Glu(谷氨酸，E)。另外，他們揭示位置337的最常見變體為Val(纈氨酸，V)。因此，在本申請范圍內將各個位置上的這些氨基酸視為Kir6.2“野生型”。因此，如果在本申請上下文中涉及氨基酸序列中的改變或突變或較不常見變體，是指從該“野生型”位置23和/或337的野生型氨基酸衍生。
根據SEQ ID No.1(NCBI登錄號D50582；見圖1A)和2(NCBI登錄號D50582；見圖1B)的序列代表多肽序列位置23和337(分別為編碼序列的位置67/68/69或位置1009/1010/1011和基因組序列的位置5657106/07/08和5657478/79/80)的Kir6.2野生型。序列SEQ ID No.3(NCBI登錄號XP006398；圖2A)、SEQ ID No.4(NCBI登錄號XM006398，圖2B)來自NCBI數據庫，另一方面，新序列SEQ ID No.5和SEQ ID No.6在多肽序列的位置23或位置337各含有一個較不常見的氨基酸(以及核苷酸序列分別在位置67或位置1009的序列變異)。新序列SEQ ID No.7(圖4A)和8(圖4B)在氨基酸鏈的位置23和337均含有較不常見的變體氨基酸序列位置23的賴氨酸(編碼序列位置67/68/69為AAG)和位置337的異亮氨酸(編碼序列位置1009/1010/1011為ATC)。
單核苷酸多態性性(SNP)代表在單一核苷酸位置含有改變的給定核苷酸序列的變體；SNP為本領域公知的。
一些單核苷酸多態性(SNP)已在Kir6.2基因中得到鑒定，其導致翻譯蛋白質中氨基酸發生改變，例如E23K(蛋白質位置23從谷氨酸交換為賴氨酸)、L270V(位置270從亮氨酸改變為纈氨酸)和V377I。
在最近的研究中，Kir6.2變體E23K與高加索人種群中II型糖尿病連鎖(Hani等(1998)Diabetologia 411511-1515)。
然而，到目前為止，沒有獲得關于Kir6.2變體在患有心血管病癥的人中臨床效應的數據。令人驚奇的是，發明者的研究第一次鑒定了Kir6.2蛋白質氨基酸序列中位置23和/或337上突變的存在與冠心病素因的密切關系。
通過分析人DNA或Kir6.2蛋白質檢測Kir6.2基因中遺傳多態性[特別是Kir6.2-23-KK(在Kir6.2基因兩個等位基因上相應位置作為多態性結果在蛋白質位置23具有賴氨酸(K)的Kir6.2變體)和Kir6.2-337-II(在Kir6.2基因兩個等位基因上相應位置作為多態性結果在蛋白質位置337具有異亮氨酸(I)的Kir6.2變體)]可用作例如(a)預防治療(特別是糖尿病患者中)冠心病(特別是冠狀動脈疾病并且尤其是心絞痛)的遺傳標記；(b)用于適應藥物劑量的遺傳標記；(c)用于藥物篩選建立適應的遺傳標記和(d)在階段/臨床研究中用于患者選擇的遺傳標記。
通過能夠進行冠心病素因的早期鑒定，本發明的方法能夠在諸如絞痛癥狀或對心臟組織損傷發生之前對患者進行早期預防或治療對一個或兩個上述氨基酸改變或它們在mRNA或基因組水平上的潛在核苷酸的鑒定給予治療醫師明確的指示，以篩選對冠心組織或血管已經持續的損傷或甚至在損傷和/或疼痛發生前開出預防性藥物處方。
另外，所述氨基酸改變和冠心病發病之間令人驚奇的關聯通過與未顯示所述Kir6.2氨基酸改變的冠心病患者相比暗示需要更高劑量的某些藥物或指出某些/不同類型藥物療法的必要性，能夠更為有效地治療冠心病。因此，本發明的另一實施方案涉及調適用于治療和/或預防冠心病的藥物劑量的方法，其中確定個體樣品中Kir6.2的存在，所述Kir6.2含有a)Kir6.2蛋白質位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非纈氨酸氨基酸，b)Kir6.2基因一個或兩個等位基因上核苷酸序列的變異，其產生Kir6.2蛋白質位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非纈氨酸，或c)Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II。
本發明的另一實施方案還涉及選擇應答冠心病藥物個體的方法，其中確定個體樣品中Kir6.2的存在，所述Kir6.2含有a) Kir6.2蛋白質位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非纈氨酸氨基酸，b)Kir6.2基因一個或兩個等位基因上核苷酸序列的變異，其產生Kir6.2蛋白質位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非纈氨酸氨基酸，或c)Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II。
選擇個體優選地涉及糖尿病患者藥物優選用于預防或治療冠狀動脈疾病，且最優選用于心絞痛的藥物。優選的，位置23的氨基酸改變為從谷氨酸到賴氨酸和/或位置337的氨基酸改變為從纈氨酸到異亮氨酸。樣品優選為分離的蛋白質或核酸、生物樣品(如組織學樣品)、細胞提取物或組織提取物或細胞。
用于治療或預防冠心病或心絞痛的大范圍藥物為本領域技術水平公知。
由于本研究第一次鑒定了Kir6.2涉及冠心病潛在的或相關的過程，本發明另一方面涉及使用Kir6.2用于鑒定適用于治療和/或預防冠心病的藥物。
術語“藥物”是指能夠用于治療或預防個體疾病狀態的任何物質或物質的組合。物質可以是任何生物的或化學的物質或天然產物的提取物，其可以是純化的、部分純化的、合成的或通過生物化學或分子生物學方法制備的。
被認為在預防或治療本發明不同方面含義的冠心病中有用或有活性的藥物可以是任何物質或物質的組合，所述物質或物質的組合對Kir6.2的功能之一或細胞中Kir6.2(蛋白質或核酸)的量或Kir6.2的表達有影響。
為此，物質可以調節Kir6.2的任何功能(例如上述功能)。物質可例如通過直接相互作用和干擾Kir6.2多肽/蛋白質或其片段調節Kir6.2蛋白活性。物質還可在例如轉錄(起始、延伸、加工等)、轉錄物穩定性、翻譯水平調節Kir6.2表達。此外。其可以調節Kir6.2的翻譯后修飾、蛋白質折疊等。物質可直接或間接(間接是指通過(正或負)干預影響Kir6.2功能/蛋白質活性/表達等的天然信號傳導級聯)行使上述效應。
本發明的另一實施方案涉及篩選適用于治療和/或預防冠心病的藥物的方法，包括步驟為a.提供含有Kir6.2的兩個樣品；b.將一個樣品與潛在的藥物接觸；c.測定存在或不存在潛在藥物時的Kir6.2活性或Kir6.2結構；d.比較存在和不存在潛在藥物時的Kir6.2活性。
還可以將存在可能藥物物質時的活性或結構(即Kir6.2蛋白質的折疊)與野生型Kir6.2蛋白質的活性或結構相比較。
優選的，樣品含有或為分離的Kir6.2蛋白質或蛋白質片段或分離的Kir6.2核酸或核酸片段。
在本發明上下文中，關于“分離的蛋白質”、“分離的核酸”等的術語“分離的”是指從天然來源純化的蛋白質/核酸以及重組的蛋白質/核酸(當然其也可是純化的)。
由于鑒定與冠心病相關聯的Kir6.2中氨基酸改變非常可能影響冠心病治療和/或預防，用于上述用途或方法之一的Kir6.2可以是例如a)Kir6.2蛋白質或其片段，其在Kir6.2蛋白質中含有位置23上的非谷氨酸氨基酸和/或位置337上的非纈氨酸氨基酸；b)Kir6.2核酸或其片段，其在Kir6.2基因的一個或兩個等位基因核苷酸序列中含有變異，所述變異產生Kir6.2蛋白質中位置23上的非谷氨酸氨基酸和/或位置337上的非纈氨酸氨基酸；或c)Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II。
可通過篩選潛在藥物能夠修復Kir6.2的蛋白質功能和/或折疊的能力鑒定用于治療和/或預防冠心病的藥物活性物質，所述Kir6.2相對于野生型蛋白質含有一個或兩個所述氨基酸改變。
藥物篩選方法和體系，尤其是使用分離的蛋白質或蛋白質片段、表達所述蛋白質的細胞等以高通量形式使用的藥物篩選方法和體系為本領域技術水平公知的。
合適的分析方法或分析體系、用于測量確定的靶分子活性或濃度的所謂測定法、在本發明上下文中作為潛在藥物化合物效應參數的Kir6.2(所謂的靶標，主要是蛋白質或核酸)的活性或折疊為本領域技術水平公知。測定可以是例如使用分離的或部分分離的組分的生物化學分析方法或系統，其中可檢測潛在藥物化合物的效應，所述組分在確定的空間和時間中匯總為反應混合物。測定的另一實例包括生物化學分析方法或系統，其中靶分子的活性和可能影響該活性的效應可在細胞內確定。
測定為監測生物學過程的任何類型的分析方法或系統。代表生理學代謝途徑和病理學條件的分子級聯和機制在細胞或生物化學(體外)系統中被適當地復制。因此可根據潛在藥物化合物干預或調節這些級聯或機制的能力確定其藥物學活性。
為了用于藥物篩選(特別是新藥物化合物的高通量篩選)，測定需要是可重復的并優選還是可規模化和穩定的。測定優選適用于高通量篩選能夠調節所研究靶分子活性的化學物質。測定的類型取決于使用的靶分子(例如多肽或多核苷酸)類型和“讀出”(即參數)，根據所述參數確定靶分子活性(見下文)。
不同類型的這類測定通常為本領域技術水平公知并可從供應商處購得。
用于不同目的的合適測定法包括放射性同位素或熒光測定法，例如用于測量標記成員與未標記成員間相互作用(例如標記的蛋白質受體與它們的未標記配體間的相互作用)的熒光偏振測定法(例如由Panvera商業提供的那些)或Packard BioScience(HTRF；ALPHAScreenTM)更多的實例包括基于細胞的測定法，其中細胞系穩定(可誘導的或非可誘導的；染色體或附加體的)或瞬時表達目的重組蛋白質。這些測定法包括例如報告基因測定法，其中根據報道酶的活性測量某啟動子或信號轉導級聯成員的信號轉導途徑的調節，所述酶的表達處于所述某啟動子的控制下。對于該類型的測定法，必須構建含有處于確定啟動子控制下的報道基因的重組細胞系，所述啟動子自身被研究或其被研究的信號級聯所調節。合適的報道酶通常為本領域技術水平公知并包括螢火蟲熒光素酶、海腎(renilla)熒光素酶(例如可從Packard reagents商購的)、β-半乳糖苷酶。合適的細胞系依賴于測定的目的，但包括大多數容易轉染并容易培養的細胞系，例如HeLA、COS、CHO、NIH-3T3等。
測量細胞內離子水平的測定法包括例如FLIPR(熒光成像板讀數器，可從Molecular Devices商購)測定法，其中氬激光器光源與冷CCD照相機組合使得能夠平行測量384孔板中細胞(例如神經元細胞或其他細胞(例如重組或天然表達某些離子通道的細胞))內的瞬間離子信號(例如Ca2+等)。FLIPR測定法使得能夠使用某些熒光染料(例如Fluo-3、Fluo-4)監測細胞內鈣，或使用BCECF或BCPCF或特定FLIPR測定試劑盒監測細胞內pH，或使用例如DiBAC或特定FLIPR測定試劑盒檢測膜電位改變，或監測膜極性化。可使用本領域技術水平公知的其他染料監測其他細胞內離子，如鋅或鈉。其他類型的測定法和其他類型的讀出器通常為本領域技術人員公知。
為了確定離子通道活性如Kir6.2(其控制細胞內的離子濃度并因此可以用于測量細胞內的離子濃度)活性，可使用如膜電位敏感測定法和染料，例如DiBAC或基于FLIPR技術的Molecular Devices的膜電位測定試劑盒；使用FLIPR技術測量線粒體膜極化的JC-1染料；離子敏感染料等。基于膜片鉗的測定法或基于原子吸收光譜的銣離子流出測量特別適用于確定細胞內鉀濃度等。其他的自動設備和用于探測細胞內某些變化和狀態的設備為本領域技術人員公知并包括例如ACUMEN bioscience的Acumen檢測器(允許三維重建適當標記物質分布的基于熒光的激光掃描讀數器)。其他類型的測定法和其他類型的“讀出器”為本領域技術水平公知。
就上述篩選方法或用途而言，優選Kir6.2蛋白質包含或具有根據SEQID No.3、5或7的序列。還優選根據上述方法或用途的蛋白質片段包含或具有根據SEQ ID No.3、5或7的序列。根據上述篩選方法的核酸優選包含或具有根據SEQ ID No.4、6或8的序列。根據所述篩選方法的核酸片段優選包含或具有根據SEQ ID No.4、6或8的序列。
非常可能Kir6.2位置23上野生型變體谷氨酸和/或位置337上野生型變體纈氨酸的所有的氨基酸改變影響冠心病的素因。因此，野生型的氨基酸改變基本上可以是任何類型。優選位置23和/或337的氨基酸改變涉及分別具有與野生型氨基酸Glu23和Val337性質不同的氨基酸摻入。因此，優選將非極性或堿性氨基酸置于位置23代替酸性谷氨酸。甚至更優選堿性氨基酸，特別是賴氨酸(Lys，K)。至于在野生型多肽中帶有非極性氨基酸纈氨酸(Val，V)的位置337，優選將帶有比纈氨酸側鏈更大側鏈的非極性氨基酸、堿性或酸性氨基酸置于位置337。在本發明的范圍內，更優選將帶有比纈氨酸側鏈更大側鏈的非極性氨基酸置于位置337。上述方法的最優選的實施方案包括Kir6.2的位置23帶有賴氨酸和/或Kir6.2的位置337帶有異亮氨酸的變體。
由于遺傳密碼的不穩定，存在若干種可能的引起上述氨基酸改變的核苷酸改變。遺傳密碼是公知的(作為參考，還參閱Alberts等MolecularBiology of the Cell，第三版)。就多肽中氨基酸位置23而言，可由根據SEQ.ID No.1的編碼序列位置67/68/69的一個或多個突變引起從谷氨酸到其他氨基酸的改變。就氨基酸位置337而言，可由根據SEQ.ID No.1的DNA序列位置1009或1010的一個或兩個突變引起從纈氨酸到其他氨基酸的改變。由于，如上所述，某些類型的氨基酸改變是優選的，關于核苷酸序列優選的也是引起所述優選氨基酸改變的那些核苷酸改變。更優選的為引起E23K(多肽序列位置23從谷氨酸變為賴氨酸)和/或V337I改變(位置337從纈氨酸變為異亮氨酸；也參閱圖7)的核苷酸改變。最優選的SNP為G67A(編碼序列位置67從G變為A)和/或G1009A(編碼序列位置1009從G變為A)。優選的實施方案還包括影響Kir6.2蛋白質中位置23和/或337氨基酸序列的基因組序列內的相應核苷酸改變。
根據本發明不同方面優選的實施方案，個體為糖尿病患者；更優選糖尿病為II型糖尿病(糖尿病diabetes mullitus)。還優選冠心病為心絞痛。
位置23的氨基酸改變為從谷氨酸到賴氨酸和/或位置337的氨基酸改變為從纈氨酸到異亮氨酸是有利的。樣品優選為分離的蛋白質或核酸、組織學樣品、細胞提取物或組織提取物或細胞。還優選樣品從人體中分離。
本發明另一優選的實施方案涉及上述方法之一，其中確定樣品中Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II的存在。樣品可以是例如生物學(如組織學)樣品、細胞提取物或組織提取物或細胞，并且樣品還優選從人體中分離。
生物材料和生物樣品包括例如細胞、組織和器官(例如腦、血、肝、脾、腎、心、血管等)制品或部分，優選來自脊椎動物，更優選來自哺乳動物包括人。還包括來自細胞培養物的細胞，優選包括來自多細胞生物和組織(如HeLA、CHO、COS、SF9或3T3)或單細胞生物如酵母(例如裂殖酵母(s.pombe)或釀酒酵母(s.cerevisiae))細胞的真核細胞培養物，或原核細胞培養物，優選畢赤酵母(Pichia)或大腸桿菌。來自組織的細胞和樣品可通過公知的技術獲得，例如抽血、組織穿刺或外科技術。重組分子的制備和從細胞或組織中純化天然存在分子如DNA或蛋白質，以及細胞或組織提取物的制備為本領域技術人員公知(參閱例如下文所列標準文獻)。
氨基酸改變的存在可例如通過分析個體基因組DNA確定。合適的技術為本領域公知并包括例如不同的PCR技術、芯片雜交、狹線/斑點或Southern印跡。
PCR(聚合酶鏈式反應)為能夠特異擴增序列串的體外技術，所述序列串在其5’和3’鄰近處有已知序列的核苷酸串。為了擴增給定序列，待擴增序列5’區域的序列已知便足夠了。在該情況下，應首先產生待擴增多核苷酸的片段(這可通過已知技術如用限制性內切酶消化完成)。然后通過連接酶(例如可從不同供貨商處購得的T4 DNA連接酶)將已知序列的DNA分子(接頭)偶聯到產生的多核苷酸片段3’端。因此產生的序列被兩個已知序列包圍——已知的5’序列和3’已知接頭序列，使能夠通過PCR特異擴增(在該情況下為接頭介導的PCR＂ImPCR＂)。
為了擴增選擇的序列，使用短的單鏈DNA分子(引物)，其與組成待擴增多核苷酸序列的序列串互補。多核苷酸模板可以是DNA或RNA。然后將引物與標準單鏈模板退火并在確定和公知的條件下通過特異酶——所謂的聚合酶(識別DNA作為模板并產生互補DNA多核苷酸的DNA聚合酶或識別RNA作為模板并產生互補DNA多核苷酸的反轉錄酶)延伸，從而產生與模板鏈序列互補的新DNA鏈。通過選擇確定序列在確定溫度和確定時間間隔下周期性重復的溫育步驟，產生變性/退火/聚合步驟的序列，其最后引起目的多核苷酸的指數式擴增。為了能夠應用必須的退火溫度而不破壞聚合酶，使用良好耐受高達95℃和更高溫度的熱穩定酶，例如Taq-DNA聚合酶(來自嗜熱水生菌(thermus aquaticus)的DNA聚合酶)、PFU等，二者均可從不同的供應商處購得。合適的聚合酶選擇取決于使用目的(例如用于通過PCR克隆時，優選選擇有校對能力的聚合酶如PFU)并屬于本領域技術人員能力范圍之內。
典型的PCR反應包含多核苷酸模板(例如0.01到20ng)、兩種合適的引物(濃度例如各0.2到2μM)、dNTP(濃度例如各200μM)、1到2mMMgCl2和1到10單位熱穩定聚合酶如Taq。典型的組分和緩沖液是本領域技術人員所熟知的并通常可通過商業供貨商獲得。
合適的引物可通過根據公知方案的化學合成產生。這類引物也可通過不同的供應商如MWG Biotech等商業獲得。
DNA和RNA模板以及cDNA模板可通過公知的標準操作(參閱例如下文標準文獻)產生并且還可從如Promega和Stratagene等商業供應商處購得。
含有基因組DNA(和/或RNA和/或蛋白質)的生物樣品的制備方法為本領域公知。作為參考參閱例如Sambrook等，或Current Protocols inMolecular Biology或Protein Science。
根據本發明優選的實施方案，通過包括或由下列步驟組成的方法確定氨基酸改變的存在e.從個體制備含有基因組DNA的生物樣品。
F.如果不用原位方法直接分析靶序列，來自根據a)的樣品的基因組DNA必須是分離的或至少部分純化的，所述原位方法例如原位PCR或直接使用上述樣品(例如組織樣品或細胞)的直接基因組測序；g.使用能夠擴增多核苷酸片段的引物通過使用PCR反應擴增多核苷酸片段，所述多核苷酸片段包含對應于編碼序列位置67/68/69和/或1009/1010/1011的基因組kir6.2序列的核苷酸位置，h.測序根據c)的多核苷酸片段。
就根據SEQ ID No.13的基因組Kir6.2序列而言，上述基因組序列內的“相應位置”分別為5657106/5657107/5657108和5657978/5657979/5657980(見圖8)。
基因組序列中一個或多個核苷酸改變的存在引起蛋白質中一個或多個上述氨基酸改變，可隨后根據已知的標準方法鑒定(例如使用標記的測序引物并進行放射自顯影或熒光檢測信號)。
用于擴增上述多核苷酸片段的合適引物的選擇和設計在本領域技術人員能力之內。作為參考，參閱例如Sambrook等或Current Protocols inMolecular Biology。這同樣適用于制備所述引物，其也可從供應商(例如MetaBion，Martinsried，Germany)處定購。優選地，至少使用根據SEQ.IDNo.9、10、11或12的引物之一(見圖5)用于測序和/或擴增。
根據本發明另一優選的實施方案，通過包括或由下列步驟組成的方法確定氨基酸改變的存在a.制備含有染色體/基因組DNA的生物樣品。
b.從根據a)的樣品中分離染色體DNA。
c.將其固定在載體上。
d.用一個或多個探針與固定的DNA雜交，所述探針在嚴格條件下能夠與含有一個或多個核苷酸改變的Kir6.2序列以與野生型Kir6.2序列相比更高的親和力雜交，所述核苷酸改變引起一個或兩個所述氨基酸改變。
雜交可根據標準方法如放射自顯影法或熒光使用相應標記的探針成像。
基因組Kir6.2序列中引起Kir6.2蛋白位置337和/或23氨基酸改變的核苷酸改變的存在或不存在可隨后通過將來自患者樣品的雜交模式和/或強度與含有野生型基因組DNA的對照樣品的雜交模式和/或強度比較來確定。
分離的多核苷酸和寡核苷酸可用于在不同嚴格度條件下雜交。
嚴格度描述了影響兩個單鏈核酸分子雜交或退火特異性的反應條件。嚴格度和由此的反應特異性取決于(特別是)用于反應的溫度和緩沖液條件可通過例如提高反應溫度和/或降低反應緩沖液離子強度來提高嚴格度和由此的特異性。低嚴格度條件(以及由此的低反應特異性和雜交特異性)存在于例如在室溫2×SSC溶液中進行雜交。高嚴格度條件包括例如在68℃0.1×SSC和0.1％SDS溶液中的雜交反應。
本發明不同方面中嚴格條件下雜交優選理解為1)在65℃將標記的探針與待分析的核酸樣品雜交，或在寡核苷酸探針情況下在比由寡核苷酸和樣品組成的雙鏈體退火或解鏈溫度(退火和解鏈溫度在下文中理解為同義)低5℃，于50mM Tris pH7.5、1M NaCl、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、0.5mg/ml變性的鮭魚精DNA或鯡魚精DNA中過夜。
2)室溫在2×SSC中洗滌10分鐘。
3)65℃(或在寡核苷酸情況下低于退火溫度5℃)在1×SSC/0.1％SDS中洗滌30分鐘。
4)65℃(或在寡核苷酸情況下低于退火溫度5℃)在0.1×SSC/0.1％SDS中洗滌30分鐘。
寡核苷酸為多核苷酸并優選具有15到30，優選20個核苷酸長度的DNA片段。退火溫度根據公式Tm＝2×(A+T的數目)+4×(G+C的數目)℃確定。
為了制備2×SSC或0.1×SSC(或任何其他種類SSC稀釋液)，相應地稀釋例如20×SSC溶液。20×SSC包括3M NaCl/0.3M檸檬酸鈉×2H2O。
進行雜交反應前，(如果需要)在進行電泳分離后(然后Southern印跡(DNA)或Northern印跡(RNA))或不進行電泳分離(然后狹線或斑點印跡)將多核苷酸轉移至適當的膜上，例如尼龍膜或硝酸纖維素膜。使用適當標記的探針進行雜交。合適的標記技術為例如放射標記或使用熒光染料標記。探針為單鏈的聚核糖核苷酸或聚脫氧核糖核苷酸，其為天然單鏈的或通常是雙鏈并已通過變性成為單鏈的。該探針通過堿基配對與DNA或RNA樣品(其也為單鏈狀態)結合。
DNA可例如直接固定在芯片基質上(例如Affymetrix Chips等)或于適當的膜上(例如硝酸纖維素、尼龍或其他適用于斑點或狹線印跡的)，或其可轉移至凝膠基質上、電泳分離并印跡在合適的膜上(例如硝酸纖維素、尼龍或其他適用于Southern印跡的)。合適的芯片或膜以及相應的方法為本領域技術水平公知。上述方法如芯片雜交、斑點/狹線或Southern印跡為本領域公知(作為參考涉及例如下文所列文獻)。
合適探針的選擇和設計為本領域公知(參閱例如Sambrook等或Current Protocols in Molecular Biology)。這同樣適用于所述探針的制備，其也可從供應商(例如MetaBion，Martinsried，Germany)處獲得。合適的為例如與基因組Kir6.2序列部分有更高親和力的任何探針，所述序列部分包含對應于編碼序列位置67/68/69和/或1009/1010/1011的那些核苷酸位置，所述編碼序列含有至少一個引起Kir6.2蛋白質位置23和/或位置337的至少一個上述氨基酸改變的核苷酸改變。合適的探針為例如可能覆蓋根據圖6的基因組核苷酸三聯體的探針。
氨基酸交換的存在還可通過分析個體RNA確定。合適的技術為本領域公知并包括例如RT PCR技術、芯片雜交或Northern印跡。
根據本發明另一優選的實施方案，通過包括或由下列步驟組成的方法確定氨基酸改變的存在a.提供來自個體的含有RNA的生物樣品。
b.如果不直接分析RNA(例如通過原位PCR)，該RNA是從根據a)的樣品中分離的或至少部分純化的。
c.使用能夠擴增多核苷酸片段的引物通過RT-PCR反應擴增多核苷酸片段，所述多核苷酸片段包含Kir6.2 cDNA序列的位置67和/或1009。
d.測序根據c)的多核苷酸片段。
測序可根據標準操作進行。產生的序列梯的成像可通過例如使用熒光或放射性標記的引物或核苷酸進行。
Kir6.2編碼序列中引起Kir6.2蛋白位置337和/或23氨基酸改變的一個或多個核苷酸改變的存在或不存在可隨后通過分析獲得的序列并將其與野生型Kir6.2序列比較確定。
合適引物的選擇和設計為本領域公知(參閱例如Sambrook等或Current Protocols in Molecular Biology)。這同樣適用于所述引物的制備，其也可從供應商(例如MetaBion，Martinsried，Germany)處獲得。合適的為例如能夠擴增至少包含Kir6.2編碼序列部分的多核苷酸的任何引物集合，所述部分跨越位置67到69和/或位置1009到1011。優選的引物為例如根據SEQ ID No9到12的引物。
根據本發明另一優選的實施方案，通過包括或由下列步驟組成的方法確定氨基酸改變的存在a.從個體制備含有RNA的生物樣品。
b.從根據a)的樣品中分離RNA。
c.將RNA固定在載體上。
d.用一個或多個探針與固定的RNA雜交，所述探針在嚴格條件下能夠與編碼在位置23上含非谷氨酸的其他氨基酸和/或在位置337上含非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2多肽的Kir6.2 RNA以與編碼在位置23上含谷氨酸和/或在位置337上含纈氨酸的Kir6.2多肽的Kir6.2 RNA相比更高的親和力雜交。
雜交可根據標準方法如放射自顯影法或熒光使用相應標記的探針成像。
Kir6.2編碼序列中引起Kir6.2蛋白位置337和/或23氨基酸改變的核苷酸改變的存在或不存在可隨后通過分析雜交模式和/或信號強度并與含有Kir6.2野生型RNA的對照樣品的雜交模式和/或信號強度比較確定。RNA可在雜交前例如直接固定在芯片基質上或合適的膜上，或其可以置于凝膠基質上并在進行凝膠電泳后印跡在合適的膜上(Northern印跡)。作為參考參閱例如下文所列文獻。
合適探針的選擇和設計為本領域公知(參閱例如Sambrook等或Current Protocols in Molecular Biology)。這同樣適用于所述探針的制備，其也可從供應商(例如MetaBion，Martinsried，Germany)處獲得。合適的為例如與包含位置67到69和/或1009到1011的Kir6.2 RNA序列部分有更高親和力的任何探針，所述部分含有至少一個引起Kir6.2蛋白質位置23和/或位置337的至少一個上述氨基酸改變的核苷酸改變。
氨基酸改變的存在還可通過分析個體的蛋白質組(即個體中表達的蛋白質)確定。合適的技術為本領域公知并包括例如蛋白質組學芯片分析、來自蛋白質、細胞或組織樣品的免疫組織學或免疫化學技術或Western印跡分析。作為參考例如參考下文所列文獻。
根據本發明另一優選的實施方案，通過包括或由下列步驟組成的方法確定氨基酸改變的存在a.從個體制備含有蛋白質的生物樣品。
b.從根據a)的樣品中分離蛋白質。
c.將其固定在載體上。
d.使用能夠與其多肽鏈上位置23含非谷氨酸的其他氨基酸和/或在位置337含非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2以比與其多肽鏈上位置337含谷氨酸和/或在位置337含纈氨酸的Kir6.2更高的親和力結合的抗體進行結合反應(在不允許與野生型蛋白質結合或以更小親和力結合的條件下)；e.使抗體對蛋白質的結合成像(例如通過標記的第一抗體或標記的第二抗體等)。
蛋白質可例如直接固定在芯片基質上或合適的膜上或其他類型載體如ELISA板上。還可將蛋白質置于凝膠上并在進行凝膠電泳后轉移并固定在載體(如合適的膜)上(Western印跡)。
根據本發明另一優選的實施方案，通過包括或由下列步驟組成的方法確定氨基酸改變的存在a.從個體制備組織學樣品。
b.使用能夠與其多肽鏈上位置23含非谷氨酸的其他氨基酸和/或在位置337含非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2以比與其多肽鏈上位置337含谷氨酸和/或在位置337含纈氨酸的Kir6.2更高的親和力結合的抗體進行結合反應(在不允許與野生型Kir6.2蛋白質結合或以更小親和力結合的條件下)；c.使得抗體對蛋白質的結合成像(例如通過標記的第一抗體或標記的第二抗體)。
突變的存在或不存在可通過分析標記的組織學樣品并將信號強度與對照樣品(例如來自用假的第一抗體或抗血清(即第一抗體或抗血清不與含有突變的Kir6.2反應，或與含有突變的Kir6.2以與特異的第一抗體或抗血清相比小得多的程度反應)或特意于野生型Kir6.2蛋白質的第一抗體處理的相同患者的樣品和/或已知僅含有野生型Kir6.2蛋白質的對照樣品)的比較來確定。
檢測結合優選通過免疫組織化學或免疫放射測定方法進行。
根據上述方法優選的實施方案，位置23的氨基酸改變為從谷氨酸(野生型)到賴氨酸；也優選位置337的氨基酸改變為從纈氨酸(野生型)到異亮氨酸。
根據本發明的不同方面，冠心病優選冠狀動脈疾病，并還更優選其為心絞痛。
根據本發明不同方面的另一優選的實施方案，在樣品中確定Kir6.2-23-KK(在Kir6.2基因兩個等位基因上作為核苷酸多態性結果蛋白質的位置23中具有賴氨酸(K)的Kir6.2變體)和/或Kir6.2-337-II(在Kir6.2基因兩個等位基因上作為核苷酸多態性結果蛋白質的位置337中具有異亮氨酸(I)的Kir6.2變體)的存在。
樣品可以是含有包括相應多態性的Kir6.2的任何樣品。以允許容易檢測相應多態性的方式制備樣品是有利的。適當的實例取決于應用的檢測方法并且是例如組織學樣品、細胞提取物或組織提取物或細胞，優選分離自人體。適當的用于鑒定各多態性的技術例如PCR、以核酸或蛋白質為基礎的陣列技術、使用適當抗體的免疫組織學或免疫化學技術為本領域技術人員公知。這同樣適用于合適的引物集合和抗體或抗血清的選擇和制備。這類技術參考例如下列文獻。
本發明的另一方面涉及用于檢測Kir6.2蛋白質、Kir6.2-23-KK或Kir6.2-337-II中位置23非谷氨酸的其他氨基酸和/或位置337非纈氨酸的其他氨基酸的存在的試劑盒，其中所述試劑盒包括至少一種用于在蛋白質中檢測所述存在的工具。在本發明上下文中，試劑盒部件(簡稱試劑盒)應理解為本申請中鑒定的組分的任何組合，其空間地共存組合為功能單元，其中所述試劑盒可包含其他組分。
所述工具可以是例如對位置23含谷氨酸和/或位置337含纈氨酸的Kir6.2與位置23并非谷氨酸和/或位置337并非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2之間的結合特征有區別的抗體。特異抗體的制備為本領域公知。作為參考例如參考下文所列文獻。另外，優選試劑盒含有標記的第二抗體。試劑盒還可含有合適的試劑、緩沖液等用于進行結合和/或標記反應等。如果包括使用說明(例如公開優選的反應條件、緩沖液組分等的手冊或紙張)也是合適的。
根據優選的實施例，所述工具為對野生型Kir6.2和位置23和/或337所含氨基酸改變的Kir6.2之間結合性質有區別的抗體(即單克隆抗體、多克隆抗血清或重組抗體)。這類抗體可以例如與位置23和/或337為野生型的Kir6.2蛋白質以更高親和力結合，或與位置23和/或337的一個或多個較不常見變體以更高親和力結合。檢測試劑盒中包含一組抗體也是有利的，其中各抗體能夠特異地檢測一種多態性；實踐中也包括僅識別野生型蛋白質的對照抗體(還可能是用于確定背景信號的假抗體或抗血清)，也可包含用于進行所選檢測技術(例如蛋白質印跡、陣列技術或其他免疫或免疫組織化學技術)有用的或必須的其他試劑。合適抗體的使用或制備和用于組裝檢測試劑盒的有用或必須試劑為本領域公知。另外具有期望的結合特性的抗體的制備由不同的供貨商如BioTrend，Cologne，Germany商業進行。
本發明的另一方面涉及用于檢測Kir6.2核苷酸序列中一個或兩個Kir6.2基因的等位基因上存在改變的檢測試劑盒，所述改變產生Kir6.2蛋白質中位置23含非谷氨酸的其他氨基酸和/或位置337含非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2多肽序列，其中所述試劑盒包括用于檢測核苷酸序列中所述變異的至少一種工具。
其他工具為例如合適的測序引物，或僅用于特異擴增野生型Kir6.2的DNA或RNA的引物集合，和/或僅用于擴增含有位置23和/或337突變的Kir6.2的DNA或RNA的引物集合。選擇和使用合適引物，能夠用于特異性測序或擴增某些序列是本領域技術人員的能力(參閱例如根據實施例2的引物和條件)。檢測試劑盒中也可包括用于進行測序反應或擴增的有用和必須試劑，如聚合酶、緩沖液、核苷酸等(參閱例如根據實施例2的引物和條件)。如果試劑盒包含組裝的對不同Kir6.2多態性特異的不同測序引物和PCR引物集合從而可以確定Kir6.2中不同類型多態性的存在，是非常有利的。
根據另一優選的實施方案，所述工具為識別野生型Kir6.2和/或在位置23和/或337含有突變的Kir6.2的核酸探針。用于進行所選檢測技術的有用探針的使用和選擇(例如所有種類的核酸印跡、陣列技術或其他種類的芯片技術)也在本領域技術人員范圍之內。也可包括在檢測試劑盒中的合適試劑的選擇也是如此。優選地，一組識別不同多態性的不同探針也包括在測試試劑盒中。
位置23的氨基酸優選為賴氨酸而位置337的氨基酸優選為異亮氨酸。
優選Kir6.2的核苷酸序列在編碼序列的位置67帶有G。還優選Kir6.2的核苷酸序列在編碼序列的位置1009帶有A。
根據優選的實施方案，檢測試劑盒含有能夠擴增多核苷酸片段的引物集合，所述片段含有Kir6.2編碼序列的位置67和/或1009。優選的引物為例如根據SEQ ID No.9到12的引物。
根據另一優選的實施方案，檢測試劑盒含有能夠擴增多核苷酸片段的至少一種引物集合，所述片段包含根據SEQ ID No.13的基因組Kir6.2序列的位置5657106/7/8和/或5657978/79/80。優選的引物為例如根據SEQ IDNo.9到12的引物。
根據另一優選的實施方案，檢測試劑盒包含在嚴格條件下特異性識別Kir6.2基因組DNA或RNA的一種或多種核酸探針，所述基因組DNA或RNA帶有編碼位置23并非谷氨酸和/或位置337并非纈氨酸的其他氨基酸的核苷酸序列。
本發明的另一方面涉及帶有多肽序列位置23的賴氨酸和位置337的異亮氨酸的分離的Kir6.2多肽或其片段。本發明優選的實施方案涉及分離的根據SEQ ID No.7的Kir6.2多肽或其片段，所述片段包括位置23和/或337的氨基酸。
本發明的另一方面還涉及分離的多核苷酸，其編碼上述K23/I337-Kir6.2多肽或其包含位置23和337的片段之一。本發明優選的實施方案涉及分離的根據SEQ ID No.8的Kir6.2多核苷酸或其片段，或分離的與上述DNA序列或它們的互補鏈在高嚴格度條件下雜交的多核苷酸，所述片段包括核苷酸位置67和1009(還優選包括位置68、69、1010和1011)。
本發明的另一方面涉及含有多肽序列位置23的谷氨酸和位置337的異亮氨酸的分離的Kir6.2多肽或其片段。本發明優選的實施方案涉及分離的根據SEQ ID No.5的Kir6.2多肽或其包括氨基酸位置23和/或337的片段。
本發明的另一方面還涉及分離的多核苷酸，其編碼上述E23/I337Kir6.2多肽或其包括位置23和337的片段之一。本發明優選的實施方案涉及分離的根據SEQ ID No.6的Kir6.2多核苷酸或其片段，或分離的與上述DNA序列或它們的互補鏈在高嚴格度條件下雜交的多核苷酸，所述片段包括核苷酸位置67和1009(還優選包括位置68、69、1010和1011)。
本發明的另一方面涉及用于檢測Kir6.2基因或RNA內核苷酸變異的探針，所述探針包含或由Kir6.2序列的至少17個，優選19到100個連續核苷酸組成，所述連續核苷酸跨越Kir6.2編碼序列位置67和/或1009或跨越基因組Kir6.2序列位置5657106/07/08和/或5657978/79/80。
本發明的另一方面涉及用于擴增Kir6.2多核苷酸的引物或引物集合，其中擴增的多核苷酸至少包含編碼Kir6.2序列的位置67和/或1009和/或基因組Kir6.2序列的位置5657106/07/08和/或5657978/79/80。
在下文中，通過若干實施例更詳細地解釋本發明，所述實施例并非旨在限制本發明的范圍。
實施例在患有I和II型糖尿病的患者群(主要為II型，即糖尿病)中分析Kir6.2蛋白質位置23和位置337的Kir6.2多態性(野生型蛋白質序列NCBI登錄號D 50582(SEQ.ID No1；圖1A)；編碼序列的NCBI登錄號D 05852(SEQ.ID No.2；圖1B))。
實施例1研究受試者(研究人群)篩選335位患者基因組DNA在產生蛋白質變體Kir6.2-E23K和Kir6.2-V337I的Kir6.2基因中的SNP(單核苷酸多態性)。納入標準為德國祖先的高加索人個體，穩定的臨床狀況和冠狀動脈造影照片。排除標準為除ACS外的急性病、慢性非心臟性疾病(即風濕性關節炎)和過去五年間有惡性病史。該患者群的基本特征在表2中概述。所有的患者簽署了書面知情同意書。
實施例2通過測序和分析檢測SNP2.1擴增具有目的多態性的基因組區域擴增引物A用于檢測登錄號NT 009307的Kir6.2基因序列位置5657978/79/80上的核苷酸改變。
正向引物M675’-AGGTGGAGGTAAGGAAGAG-3’(SEQ ID.No.9)反向引物M675’-GGTGAAGATGAGCAATGTG-3’(SEQ ID.No.10)B用于檢測登錄號NT 009307的Kir6.2基因序列位置5657106/07/08上的核苷酸改變。
正向引物M10095’-GGGTGGCAACAGCATCTTC-3’(SEQ ID.No.11)反向引物M10095’-TGGCTCAGGACAGGGAATC-3’(SEQ ID.No.12)引物也可用于擴增Kir6.2編碼序列。
用于擴增的PCR方案所有的試劑均來自Applied Biosystems(Foster City，USA)20ng基因組DNA、1單位TaqGold聚合酶、1×Taq聚合酶緩沖液、500μM dNTP、2.5mM MgCl2、200nM各種擴增引物對(序列參閱上文的擴增引物對1.A和1.B)、加H2O至5μl。
用于PCR/基因型分型的擴增程序95℃×10分鐘×1循環95℃×30秒70℃×30秒×2循環；95℃×30秒65℃×30秒×2循環；95℃×30秒60℃×30秒×2循環；95℃×30秒56℃×30秒72℃×30秒×40循環；72℃×10分鐘4℃×30秒×1循環；2.2鑒定目的多態性多態性的微測序和檢測方案所有的試劑來自Applied Biosystems(Foster City，USA)。2μl純化的PCR產物、1.5μl BigDye終止子試劑盒、200nM一種測序引物(序列參閱上文的正向或反向擴增引物1.A和1.B)、加H2O至10μl。
用于測序的擴增程序96℃×2分鐘×1循環；96℃×10秒55℃×10秒65℃×4分鐘×30循環；72℃×7分鐘4℃×30秒×1循環；分析測序產物
首先用測序分析軟件(Applied Biosystems，Foster City，USA)進行原始數據提取并用Phred(堿基調用)、Phrap(匯編)、Polyphred(SNP調用)和Consed(結果評價)進行加工來分析序列。Phred、Phrap、Polyphred和Consed是在WashU由Phil Green設計的軟件(http://www.genome.washington.edu)。
PCR反應導致鑒定編碼序列位置67從G到A的改變和位置1009從A到G的改變。
2.3Kir6.2蛋白質中氨基酸改變與冠心病的關聯為了分析Kir6.2多態性對患有心血管疾病和代謝性疾病患者臨床結果的影響，發明者在335個患有I型或II型糖尿病個體的患者群內進行了Kir6.2多態性E23K、L270V和I337V的相關分析。在350個臨床參數中，心絞痛與Kir6.2蛋白質位置23賴氨酸(K)和/或位置337纈氨酸(V)純合的患者顯著相關。
Kir6.2-23-EE(位置23為野生型)定義了這樣的個體群，其中兩個Kir6.2等位基因編碼引起Kir6.2蛋白質位置23谷氨酸(Glu或E)的Kir6.2基因變體，該組對Kir6.2蛋白質位置23的該Kir6.2多態性是純合的。
Kir6.2-23-EK定義了這樣的個體群，其中兩個Kir6.2等位基因之一編碼引起Kir6.2蛋白質位置23谷氨酸(Glu或E)的Kir6.2基因變體，而另一Kir6.2等位基因編碼引起Kir6.2蛋白質位置23賴氨酸(Lys或K)的Kir6.2基因變體，該組對Kir6.2蛋白質位置23的Kir6.2多態性是雜合的。
Kir6.2-23-KK定義了這樣的個體群，其中兩個Kir6.2等位基因均編碼引起Kir6.2蛋白質位置23賴氨酸(Lys或K)的Kir6.2基因變體，該組對Kir6.2蛋白質位置23的該Kir6.2多態性是純合的。Kir6.2-23-KK還定義了患者這樣的生物樣品，其中兩個Kir6.2等位基因均編碼引起Kir6.2蛋白質位置23賴氨酸(賴氨酸或K)的Kir6.2基因變體。
Kir6.2-337-II定義了這樣的個體群，其中兩個Kir6.2等位基因均編碼引起Kir6.2蛋白質位置337異亮氨酸(Ile或I)的Kir6.2基因變體，該組對Kir6.2蛋白質位置337的該Kir6.2多態性是純合的。Kir6.2-337-II還定義了患者這樣的生物樣品，其中兩個Kir6.2等位基因均編碼引起Kir6.2蛋白質位置337異亮氨酸(異亮氨酸或I)的Kir6.2基因變體。
Kir6.2-337-IV定義了這樣的個體群，其中兩個Kir6.2等位基因之一編碼引起Kir6.2蛋白質位置337異亮氨酸(Ile或I)的Kir6.2基因變體，而另一Kir6.2等位基因編碼引起Kir6.2蛋白質位置337纈氨酸(Val或V)的Kir6.2基因變體，該組對Kir6.2蛋白質位置337的Kir6.2多態性是雜合的。
Kir6.2-337-VV(位置337為野生型)定義了這樣的個體群，其中兩個Kir6.2等位基因均編碼引起Kir6.2蛋白質位置337纈氨酸(Val或V)的Kir6.2基因變體，該組對Kir6.2蛋白質位置337的該Kir6.2多態性是純合的。
基因型/表型關聯的統計學途徑所有的分析都用SAS統計軟件包(6.12版，SAS Institute GmbH，Heidelberg/Germany)完成。為了檢測遺傳多態性和大量臨床相關參數之間的關聯，計算描述統計學(中位數，四分位數)并進行Wilcoxon秩和檢驗。Wilcoxon秩和檢驗用于比較兩個獨立的樣本。測試統計值的計算基于匯合樣本的等級。以類似方式搜索SNP和風險因子以及疾病之間的關聯。進行卡方檢驗并計算數字和百分比以描述數據。卡方檢驗為計算兩個變量依賴性的統計學檢驗。變量值包含于兩個或更多組中。為了分析那些變量的關聯，使用列聯表。該列聯表包含與第一變量的實現值數量一樣多的行和與第二變量的實現值數量一樣多的列。每個單元含有特定的患者特征。為了構建檢驗統計值，計算出計算頻率和觀察頻率的差異。檢查結果后選擇相關的變量。考慮到混雜的共變量，使用邏輯斯特回歸(logistic regression)驗證結果。使用邏輯斯特回歸方法分析若干說明變量對某一應答變量的影響。關聯的統計檢驗給出p值。該p值解釋為對關聯的說明變量有顯著影響。
對于二元變量，計算比值比。比值比是事件在一個集合中發生的比值與事件在另一集合中發生的比值的比。
實施例3分析表2中顯示了Kir6.2變體E23K和V337I在335個個體中的分布。如表3到8中所列的，可以看到Kir6.2-23-KK與Kir6.2-337-II、Kir6.2-23-EK與Kir6.2-337-VI以及Kir6.2-23-EE與Kir6.2-337-VV之間的強連鎖。因此，對例如Kir6.2-23-KK獲得的所有統計學數據應與Kir6.2-337-II的那些類似。
帶有Kir6.2-23-KK和Kir6.2-337-II的糖尿病患者顯示與心絞痛的提高關聯。使用卡方檢驗對糖尿病患者中Kir6.2-23-KK基因型與心絞痛關聯的統計學顯著性計算為p值＝0.015，而糖尿病患者中Kir6.2-337-II基因型與心絞痛關聯為p值＝0.012(圖2A和圖3A)。
用于分析致混雜因素(例如心肌梗塞和高血壓)影響的邏輯斯特回歸，產生糖尿病患者中Kir6.2-23-KK基因型與心絞痛關聯的p值＝0.0088，而糖尿病患者中Kir6.2-337-II基因型與心絞痛關聯的p值＝0.0072(圖2B和圖3B)。
糖尿病患者中提高的心絞痛風險的比值比為Kir6.2-23-KK基因型1.061而Kir6.2-337-II基因型1.615(圖2C和圖3C)。
本文顯示的數據說明Kir 6.2基因中由位置23從谷氨酸到賴氨酸的改變引起的突變(特別是Kir6.2-23-KK)和Kir6.2基因中引起位置337從纈氨酸到異亮氨酸的氨基酸改變的突變(特別是Kir6.2-337-II)，代表了糖尿病患者中心絞痛的風險標記物。由于心絞痛是冠心病的征兆，可以預期這些標記物通常是冠心病的指征。另外，可以預期Kir6.2基因中引起Kir6.2蛋白質中位置23氨基酸改變的其他突變(特別是將酸性谷氨酰酸改變為非極性的或優選堿性氨基酸的突變)具有相同或者類似的效應。可對位置337的氨基酸改變做相同預期，所述改變將纈氨酸改變為其他的，特別是酸性或堿性的或更大的脂肪族氨基酸。很可能這些氨基酸改變還與非糖尿病患者的冠心病(特別是心絞痛)發病非常密切地相關。
參考文獻Yamada Y，Kuroe A，Li Q，Someya Y，Kubota A，lhara Y，Tsuura Y1 SeinoY(2001).Genomic variation in pancreatic ion channel genes in Japanesetype 2 diabetic patients.Diabetes Metab Res Rev 17213-216.
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實驗室方法的標準文獻如果沒有另外說明，根據下列標準文獻進行標準實驗室方法Sambrook等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual.第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.545頁；Current Protocols in Molecular Biology；常規更新的，例如2000卷；Wiley&Sons，Inc；編輯Fred M.Ausubel，Roger Brent，Robert Eg.Kingston，David D.Moore，J.G.Seidman，John A.Smith，Kevin Struhl.
Current Protocols in Human Genetics；常規更新的；Wiley&Sons，Inc；編輯Nicholas C.Dracopoli，Honathan L.Haines，Bruce R.Korf，Cynthia C.Morton，Christine E.Seidman，J.G.Seigman，Douglas R.Smith.
Current Protocols in Protein Science；常規更新的；Wiley&Sons，Inc；編輯John E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploegh，David W.Speicher，PaulT.Wingfield.Molecular Biology of the Cell；第3版；Alberts，B.，Bray，D.，Lewis，J.，Raff，M.，Roberts，K.，Watson，J.D.；Garland Publishing，Inc.New York&London，1994；Short Protocols in Molecular Biology，第5版，Frederick M.Ansubel(編輯)，Roger Brent(編輯)，Robert E.Kingston(編輯)，David D.Moore(編輯)，J.G.Seidman(編輯)，John A.Smith(編輯)，Kevin Struhl(編輯)，October2002，John Wiley&Sons，Inc.，New York＂


圖1在位置23(谷氨酸)和位置337(纈氨酸)包含最常見多肽鏈變體(對應于編碼序列位置67/68/69的密碼子GAG和位置1009/1010/1011的GTC)的Kir6.2(KCNJ 11)的蛋白質序列和編碼核苷酸序列。這些變體被稱為Kir6.2-23K-337V(或KK和/或VV，如果兩個等位基因就位置23和/或337而言是相似的)。該Kir6.2變體的蛋白質登錄號(NCBI蛋白質數據庫)為D50582。多肽序列的位置23和337以及相應的核苷酸位置和編碼序列中的ATG標有下劃線。
圖2在位置23上含有變體賴氨酸和在位置337為最常見變體纈氨酸(對應于編碼序列的位置67/68/69上密碼子AAG和位置1009/1010/1011上GTC)的Kir6.2(KCNJ11)蛋白質序列和編碼核苷酸序列。該Kir6.2變體的蛋白質序列登錄號(NCBI蛋白質數據庫)為XP_006398(圖2A；SEQ ID No.2)。核苷酸序列登錄號(NCBI核苷酸數據庫)為XM_006398(圖2B；SEQ ID No.4)。多肽序列的位置23和337和編碼序列中相應的核苷酸位置標有下劃線。
圖3在位置23上含有最常見變體谷氨酸和在位置337含有變體異亮氨酸(對應于編碼序列的位置67/68/69上密碼子GAG和位置1009/1010/1011上ATC)的Kir6.2(KCNJ11)蛋白質序列和編碼核苷酸序列。蛋白質序列除位置337外對應于根據序列登錄號D50582的“野生型”Kir6.2，所述位置337帶有異亮氨酸而非纈氨酸。編碼序列除位置1009外對應于根據序列登錄號D50582的“野生型”Kir6.2，所述位置1009帶有腺苷而非鳥苷。多肽序列的位置23和337和編碼序列中相應的核苷酸位置標有下劃線。
圖4在位置23含有變體賴氨酸和在位置337含有變體異亮氨酸(對應于編碼序列位置67/68/69的密碼子AAG和位置1009/1010/1011的ATC)的Kir6.2(KCNJ11)蛋白質序列和編碼核苷酸序列。除位置23帶有賴氨酸而非谷氨酸和位置337帶有異亮氨酸而非纈氨酸外，該蛋白質序列對應于根據序列登錄號D50582的“野生型”Kir6.2的蛋白質序列。除位置67帶有腺苷而非鳥苷和位置337帶有腺苷而非鳥苷外，該編碼序列對應于根據序列登錄號D50582的“野生型”Kir6.2的編碼序列。多肽序列的位置23和337和編碼序列中相應的核苷酸位置標有下劃線。
圖5DNA引物M67正向(SEQ ID No.9)和反向(SEQ ID No.10)用于檢測Kir6.2基因組序列中對應于Kir6.2編碼序列的位置67/68/69的核苷酸改變，而DNA引物M1009正向(SEQ ID No.11)和反向(SEQ ID No.12)用于檢測Kir6.2基因組序列中對應于根據序列登錄號的Kir6.2編碼序列的位置1009/1010/1011的核苷酸改變。就SEQ ID No.25而言，位置分別為5657106/107/108和5657978/79/80。
引物集合也可用于特異性擴增根據NCBI序列登錄號D50582的Kir6.2 cDNA。引物M67(正向(SEQ ID No.9)和反向(SEQ ID No.10)擴增包含Kir6.2 cDNA核苷酸67/68/69的區域，用于在RNA水平上檢測Kir6.2基因中的核苷酸改變。引物M1009(正向(SEQ ID No.11)和反向(SEQ IDNo.12)擴增包含Kir6.2 cDNA核苷酸1009/1010/1011的區域，用于在RNA水平上檢測Kir6.2基因中的核苷酸改變。
圖6一些Kir6.2變體的基因組和編碼序列的相應核苷酸位置概況。基因組序列內位置的編號來自NCBI登錄號NT 009307下人類染色體11基因組連續序列(包含Kir6.2基因組基因座連續序列的部分也參閱圖10)。
圖7引起多肽鏈位置23從谷氨酸到賴氨酸和位置337從纈氨酸到異亮氨酸氨基酸改變的Kir6.2核苷酸序列的改變。核苷酸位置是指Kir6.2編碼序列。這些位置與根據SEQ ID No.25的基因組Kir6.2序列的位置5657106/7/8和5657978/79/80相關(其中SEQ ID No.25編碼蛋白質序列位置337的纈氨酸)。最常見的變體(即野生型)用正常字母寫出，核苷酸或氨基酸序列中自該野生型的衍變用粗體字母給出。對于氨基酸23，單核苷酸改變G67A產生摻入多肽鏈的賴氨酸，而單獨的改變G69A并不引起氨基酸序列的改變。這一突變類型通常被稱為沉默突變。另一方面，如果上述兩個核苷酸改變同時發生，仍是賴氨酸摻入位置23。至于氨基酸鏈的位置337，單核苷酸改變C1011T、C1011A和C1011G是沉默突變，而單核苷酸改變G1009A使多肽鏈位置337摻入異亮氨酸，即使C1011T或C1011A與G1009A一起共同發生也是如此。位置67/68/69和/或1009/1010/1011的其他改變是可能的，分別引起其他氨基酸摻入多肽鏈代替位置23的G或K或位置337的V或I(這些遺傳密碼引起的關聯通常為本領域技術水平公知)。
圖8在位置5657106/107/108含有核苷酸GAC(對應于編碼序列位置1009/1010/1011的密碼子GTC并因此編碼多肽鏈位置337含有氨基酸纈氨酸的蛋白質變體)和位置5657978/79/80含有核苷酸CTT(對應于編碼序列位置67/68/69的密碼子AAG并因此編碼多肽鏈位置23含有氨基酸賴氨酸的蛋白質變體)的Kir6.2(KCNJ11)基因座基因組序列。所示的核苷酸三聯體打印為粗體并標有下劃線。根據SEQ ID No.9到12的PCR引物的雜交位置也打印為粗體并標有下劃線。如此選擇引物序列以允許使用Kir6.2cDNA作為模板擴增多核苷酸。可公開獲得的包含該Kir6.2基因組變體的人染色體11基因組連續序列的序列登錄號為NT_009307(SEQ ID No.25)。
表格說明表1已進行所有分析的患者群的基本特征。
表2分析的糖尿病患者群中Kir6.2變體的分布。
表3卡方檢驗計算的糖尿病患者中蛋白質位置23的Kir6.2變體與心絞痛的關聯。在心絞痛陽性組中能夠觀察到Kir6.2-23-KK攜帶者頻率提高。
表4通過邏輯斯特回歸計算糖尿病患者中Kir6.2-23-KK與心絞痛關聯的統計學顯著性。
表5計算與Kir6.2-23-EK和Kir6.2-23-EE攜帶者相比，Kir6.2-23-KK攜帶者的糖尿病患者心絞痛風險的比值比。
表6通過卡方檢驗計算糖尿病患者中Kir6.2在蛋白質位置337的變體與心絞痛的關聯。心絞痛陽性組中能夠觀察到Kir6.2-337-II攜帶者頻率提高。
表7通過邏輯斯特回歸計算糖尿病患者中Kir6.2-337-II與心絞痛關聯的統計學顯著性。
表8計算與Kir6.2-337-VI和Kir6.2-337-VV攜帶者相比，Kir6.2-337-II攜帶者的糖尿病患者心絞痛風險的比值比。
表1

*中位數和四分位數(Q1-Q3)
表2

表3

表4

表5

表6

表7

表8

序列表<110>塞諾菲-安萬特德國有限公司<120>蛋白質多態性與冠心病的關聯<130>DEAV2004/0064<140>04021528.7<141>2004-09-10<160>13<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>390<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Met Leu Ser Arg Lys Gly Ile Ile Pro Glu Glu Tyr Val Leu Thr Arg1 5 10 15Leu Ala Glu Asp Pro Ala Glu Pro Arg Tyr Arg Ala Arg Gln Arg Arg20 25 30Ala Arg Phe Val Ser Lys Lys Gly Asn Cys Asn Val Ala His Lys Asn35 40 45Ile Arg Glu Gln Gly Arg Phe Leu Gln Asp Val Phe Thr Thr Leu Val50 55 60Asp Leu Lys Trp Pro His Thr Leu Leu Ile Phe Thr Met Ser Phe Leu65 70 75 80Cys Ser Trp Leu Leu Phe Ala Met Ala Trp Trp Leu Ile Ala Phe Ala85 90 95His Gly Asp Leu Ala Pro Ser Glu Gly Thr Ala Glu Pro Cys Val Thr100 105 110Ser Ile His Ser Phe Ser Ser Ala Phe Leu Phe Ser Ile Glu Val Gln115 120 125Val Thr Ile Gly Phe Gly Gly Arg Met Val Thr Glu Glu Cys Pro Leu130 135 140Ala Ile Leu Ile Leu Ile Val Gln Asn Ile Val Gly Leu Met Ile Asn145 150 155 160
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<400>2atgctgtccc gcaagggcat catccccgag gaatacgtgc tgacacgcct ggcagaggac 60cctgccgagc ccaggtaccg tgcccgccag cggagggccc gctttgtgtc caagaaaggc 120aactgcaacg tggcccacaa gaacatccgg gagcagggcc gcttcctgca ggacgtgttc 180accacgctgg tggacctcaa gtggccacac acattgctca tcttcaccat gtccttcctg 240tgcagctggc tgctcttcgc catggcctgg tggctcatcg ccttcgccca cggtgacctg 300gcccccagcg agggcactgc tgagccctgt gtcaccagca tccactcctt ctcgtctgcc 360ttccttttct ccattgaggt ccaagtgact attggctttg gggggcgcat ggtgactgag 420gagtgcccac tggccatcct gatcctcatc gtgcagaaca tcgtggggct catgatcaac 480gccatcatgc ttggctgcat cttcatgaag actgcccaag cccaccgcag ggctgagacc 540ctcatcttca gcaagcatgc ggtgatcgcc ctgcgccacg gccgcctctg cttcatgcta 600cgtgtgggtg acctccgcaa gagcatgatc atcagcgcca ccatccacat gcaggtggta 660cgcaagacca ccagccccga gggcgaggtg gtgcccctcc accaggtgga catccccatg 720gagaacggcg tgggtggcaa cagcatcttc ctggtggccc cgctgatcat ctaccatgtc 780attgatgcca acagcccact ctacgacctg gcacccagcg acctgcacca ccaccaggac 840ctcgagatca tcgtcatcct ggaaggcgtg gtggaaacca cgggcatcac cacccaggcc 900cgcacctcct acctggccga tgagatcctg tggggccagc gctttgtgcc cattgtagct 960gaggaggacg gacgttactc tgtggactac tccaagtttg gcaacaccgt caaagtgccc 1020acaccactct gcacggcccg ccagcttgat gaggaccaca gcctactgga agctctgacc 1080ctcgcctcag cccgcgggcc cctgcgcaag cgcagcgtgc ccatggccaa ggccaagccc 1140aagttcagca tctctccaga ttccctgtcc tga 1173<210>3<211>390<212>PRT<213>智人<400>3Met Leu Ser Arg Lys Gly Ile Ile Pro Glu Glu Tyr Val Leu Thr Arg1 5 10 15Leu Ala Glu Asp Pro Ala Lys Pro Arg Tyr Arg Ala Arg Gln Arg Arg20 25 30Ala Arg Phe Val Ser Lys Lys Gly Asn Cys Asn Val Ala His Lys Asn35 40 45Ile Arg Glu Gln Gly Arg Phe Leu Gln Asp Val Phe Thr Thr Leu Val50 55 60Asp Leu Lys Trp Pro His Thr Leu Leu Ile Phe Thr Met Ser Phe Leu65 70 75 80Cys Ser Trp Leu Leu Phe Ala Met Ala Trp Trp Leu Ile Ala Phe Ala85 90 95His Gly Asp Leu Ala Pro Ser Glu Gly Thr Ala Glu Pro Cys Val Thr100 105 110Ser Ile His Ser Phe Ser Ser Ala Phe Leu Phe Ser Ile Glu Val Gln115 120 125
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<210>4<211>1173<212>DNA<213>智人<400>4atgctgtccc gcaagggcat catccccgag gaatacgtgc tgacacgcct ggcagaggac 60cctgccaagc ccaggtaccg tgcccgccag cggagggccc gctttgtgtc caagaaaggc 120aactgcaacg tggcccacaa gaacatccgg gagcagggcc gcttcctgca ggacgtgttc 180accacgctgg tggacctcaa gtggccacac acattgctca tcttcaccat gtccttcctg 240tgcagctggc tgctcttcgc catggcctgg tggctcatcg ccttcgccca cggtgacctg 300gcccccagcg agggcactgc tgagccctgt gtcaccagca tccactcctt ctcgtctgcc 360ttccttttct ccattgaggt ccaagtgact attggctttg gggggcgcat ggtgactgag 420gagtgcccac tggccatcct gatcctcatc gtgcagaaca tcgtggggct catgatcaac 480gccatcatgc ttggctgcat cttcatgaag actgcccaag cccaccgcag ggctgagacc 540ctcatcttca gcaagcatgc ggtgatcgcc ctgcgccacg gccgcctctg cttcatgcta 600cgtgtgggtg acctccgcaa gagcatgatc atcagcgcca ccatccacat gcaggtggta 660cgcaagacca ccagccccga gggcgaggtg gtgcccctcc accaggtgga catccccatg 720gagaacggcg tgggtggcaa cagcatcttc ctggtggccc cgctgatcat ctaccatgtc 780attgatgcca acagcccact ctacgacctg gcacccagcg acctgcacca ccaccaggac 840ctcgagatca tcgtcatcct ggaaggcgtg gtggaaacca cgggcatcac cacccaggcc 900cgcacctcct acctggccga tgagatcctg tggggccagc gctttgtgcc cattgtagct 960gaggaggacg gacgttactc tgtggactac tccaagtttg gcaacaccgt caaagtgccc 1020acaccactct gcacggcccg ccagcttgat gaggaccaca gcctactgga agctctgacc 1080ctcgcctcag cccgcgggcc cctgcgcaag cgcagcgtgc ccatggccaa ggccaagccc 1140aagttcagca tctctccaga ttccctgtcc tga 1173<210>5<211>390<212>PRT<213>智人<400>5Met Leu Ser Arg Lys Gly Ile Ile Pro Glu Glu Tyr Val Leu Thr Arg1 5 10 15Leu Ala Glu Asp Pro Ala Glu Pro Arg Tyr Arg Ala Arg Gln Arg Arg20 25 30Ala Arg Phe Val Ser Lys Lys Gly Asn Cys Asn Val Ala His Lys Asn35 40 45Ile Arg Glu Gln Gly Arg Phe Leu Gln Asp Val Phe Thr Thr Leu Val50 55 60Asp Leu Lys Trp Pro His Thr Leu Leu Ile Phe Thr Met Ser Phe Leu65 70 75 80Cys Ser Trp Leu Leu Phe Ala Met Ala Trp Trp Leu Ile Ala Phe Ala85 90 95
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tgcaccggag cgcagggggc ggggccggag caagcccccg cccctcccgc gcccctcccc 3060gcccccgccc tccacctccc ctcccgggac tcacaacccg gc310權利要求
1.鑒定個體中提高的冠心病風險的方法，其中確定樣品中Kir6.2蛋白質位置23上非谷氨酸的其他氨基酸的存在和/或位置337上非纈氨酸的其他氨基酸的存在。
2.鑒定個體中提高的冠心病風險的方法，其中確定樣品中Kir6.2基因的一個或兩個等位基因Kir6.2核苷酸序列上變異的存在，所述變異產生的Kir6.2多肽序列含有Kir6.2蛋白質位置23上非谷氨酸的其他氨基酸和/或位置337上非纈氨酸的其他氨基酸。
3.調適治療和/或預防冠心病的藥物劑量的方法，其中確定個體樣品中Kir6.2的存在，所述Kir6.2含有a)Kir6.2蛋白質中位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非纈氨酸氨基酸，b)Kir6.2基因的一個或兩個等位基因上核苷酸序列的變異，所述變異產生Kir6.2蛋白質中位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非纈氨酸氨基酸，或c)Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II。
4.選擇應答冠心病藥物的個體的方法，其中確定個體樣品中Kir6.2的存在，所述Kir6.2含有a)Kir6.2蛋白質中位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非纈氨酸氨基酸，b)Kir6.2基因的一個或兩個等位基因上核苷酸序列的變異，所述變異產生Kir6.2蛋白質中位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非纈氨酸氨基酸，或c)Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II。
5.Kir6.2蛋白質或核酸在鑒定適用于治療和/或預防冠心病的藥物中的用途。
6.篩選適用于治療和/或預防冠心病的藥物的方法，包括a.提供含有Kir6.2的兩個樣品；b.將一個樣品與潛在的藥物接觸；c.確定存在或不存在潛在藥物時的Kir6.2活性或結構；d.比較存在和不存在潛在藥物時的Kir6.2活性或結構。
7.根據權利要求5的用途或根據權利要求6的方法，其使用a)Kir6.2蛋白質，其在Kir6.2蛋白質中含有位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非纈氨酸氨基酸；b)Kir6.2核酸，其在Kir6.2基因的一個或兩個等位基因核苷酸序列中含有變異，所述變異產生Kir6.2蛋白質中位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非纈氨酸氨基酸；或c)Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II。
8.根據權利要求5到8中任一項的方法或用途，其中Kir6.2為分離的Kir6.2蛋白質或蛋白質片段或分離的Kir6.2核酸或核酸片段。
9.根據權利要求8的方法或用途，其中所述蛋白質包含或具有根據SEQ ID No.3、5或7的序列。
10.根據權利要求8的方法或用途，其中所述蛋白質片段包含或具有對應于部分SEQ ID No.3、5或7的序列，所述部分包含氨基酸位置23和/或337。
11.根據權利要求8的方法或用途，其中核酸包含或具有根據SEQ IDNo.4、6或8的序列。
12.根據權利要求8的方法或用途，其中核酸片段包含或具有對應于部分SEQ ID No.4、6或8的序列，如果所述片段來自Kir6.2 cDNA，則所述部分包含位置67和/或1009，如果所述片段來自Kir6.2基因組DNA，則所述部分包含位置5657978和/或5657106。
13.根據權利要求1到12中任一項的方法或用途，其中蛋白質位置23的氨基酸為賴氨酸。
14.根據權利要求1到13中任一項的方法或用途，其中蛋白質位置337的氨基酸為異亮氨酸。
15.根據權利要求2到14中任一項的方法或用途，其中所述核苷酸序列在Kir6.2編碼序列位置67帶有A。
16.根據權利要求2到15中任一項的方法或用途，其中所述核苷酸序列在Kir6.2編碼序列位置1009帶有G。
17.根據前述權利要求中任一項的方法或用途，其中個體為糖尿病患者。
18.根據權利要求17的方法或用途，其中糖尿病為糖尿病diabetesmullitus。
19.根據前述權利要求中任一項的方法或用途，其中冠心病為心絞痛。
20.根據前述權利要求1到4或13到19中任一項的方法，其中確定樣品中Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II的存在。
21.根據前述權利要求1到19中任一項的方法，其中樣品為組織學樣品、細胞提取物或組織提取物或細胞。
22.根據權利要求1到4或6到21中任一項的方法，其中樣品從人體中分離。
23.根據權利要求1到4或13到22中任一項的方法，其中如下確定氨基酸改變的存在a.制備含有基因組DNA的生物樣品；b.優選地從根據a)的樣品中分離染色體DNA；c.使用能夠擴增多核苷酸片段的引物通過PCR反應擴增多核苷酸片段，所述多核苷酸片段包含基因組Kir6.2序列中對應于編碼序列位置67/68/69和/或1009/1010/1011的核苷酸位置；d.測序根據c)的多核苷酸片段。
24.根據權利要求23的方法，其中使用至少一種或優選兩個根據SEQID No.9到12的引物進行多核苷酸片段的擴增。
25.根據權利要求23或24的方法，其中使用根據SEQ ID No.9到12的引物之一進行測序反應。
26.根據權利要求1到4或13到22中任一項的方法，其中如下確定氨基酸改變的存在a.制備含有基因組DNA的生物樣品；b.從根據a)的樣品中分離基因組DNA；c.將其固定在載體上；d.用一個或多個探針在嚴格條件下與固定的DNA雜交，所述探針能夠與含有一個或多個核苷酸改變的Kir6.2序列以與野生型Kir6.2序列相比更高的親和力雜交，所述核苷酸改變引起一個或兩個所述氨基酸改變。
27.根據權利要求26的方法，其中分離的基因組DNA被a.固定在芯片基質、合適的膜上或b.轉移至凝膠基質上并印跡在合適的膜上。
28.根據權利要求1到4或13到22中任一項的方法，其中如下確定氨基酸改變a.提供來自個體的含有RNA的生物樣品；b.優選地，從根據a)的樣品中分離RNA；c.使用能夠擴增多核苷酸片段的引物通過RT-PCR反應擴增多核苷酸片段，所述多核苷酸片段包含Kir6.2 cDNA序列的位置67和/或1009；d.測序根據c)的多核苷酸片段。
29.根據權利要求28的方法，其中使用至少一種根據SEQ ID No.9到12的引物。
30.根據權利要求1到4或13到22中任一項的方法，其中如下確定氨基酸改變a.提供來自個體的含有RNA的生物樣品；b.從根據a)的樣品中分離RNA；c.將其固定在載體上；d.用一個或多個探針與固定的RNA雜交，所述探針在嚴格條件下能夠與編碼在位置23并非谷氨酸和/或在位置337并非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2多肽的Kir6.2 RNA以與編碼在位置23含谷氨酸和/或在位置337含纈氨酸的Kir6.2多肽的Kir6.2 RNA相比更高的親和力雜交。
31.根據權利要求30的方法，其中分離的RNA被a.固定在芯片基質或合適的膜上，或b.轉移至凝膠基質上并隨后印跡在合適的膜上。
32.根據權利要求1到4或13到22中任一項的方法，其中如下確定氨基酸改變a.提供來自個體的含有蛋白質的生物樣品；b.從根據a)的樣品中分離蛋白質；c.將其固定在載體上；d.使用抗體進行結合反應，所述抗體能夠與其多肽鏈上位置23含非谷氨酸的其他氨基酸和/或位置337含非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2以比其多肽鏈上位置337含谷氨酸和/或位置337含纈氨酸的Kir6.2更高的親和力結合；e.使抗體對蛋白質的結合成像。
33.根據權利要求32的方法，其中分離的蛋白質被a.固定在芯片基質或合適的膜上；b.轉移至凝膠基質上并隨后固定在合適的膜上，或c.固定在ELISA板上。
34.根據權利要求1到4或13到22中任一項的方法，其中如下確定氨基酸改變a.提供來自個體的組織學樣品；b.使用抗體進行結合反應，所述抗體能夠與其多肽鏈上位置23含非谷氨酸的其他氨基酸和/或位置337含非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2以比其多肽鏈上位置337含谷氨酸和/或在位置337含纈氨酸的Kir6.2更高的親和力結合；c.使抗體對蛋白質的結合成像。
35.根據權利要求34的方法，其中通過免疫組織化學或免疫放射反應進行結合檢測。
36.檢測試劑盒，其用于檢測Kir6.2蛋白質、Kir6.2-23-KK、Kir6.2-337-II中位置23非谷氨酸的其他氨基酸和/或位置337非纈氨酸的其他氨基酸的存在，其中所述試劑盒包括至少一種用于檢測蛋白質中所述存在的工具。
37.檢測試劑盒，其用于檢測在一個或兩個Kir6.2基因的等位基因上Kir6.2核苷酸序列中變異的存在，所述變異產生含有Kir6.2蛋白質中位置23含非谷氨酸的其他氨基酸和/或位置337含非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2多肽序列，其中所述試劑盒包括至少一種用于檢測核苷酸序列中所述變異的工具。
38.根據權利要求36或37之一的檢測試劑盒，其中位置23的氨基酸為賴氨酸。
39.根據權利要求36到38中任一項的檢測試劑盒，其中位置337的氨基酸為異亮氨酸。
40.根據權利要求36、38或39中任一項的檢測試劑盒，其含有對位置23含谷氨酸和/或位置337含纈氨酸的Kir6.2與位置23并非谷氨酸和/或位置337并非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2之間的結合特性有區別的抗體。
41.根據權利要求37到39中任一項的檢測試劑盒，其中Kir6.2核苷酸序列在編碼序列的位置67帶有G。
42.根據權利要求37到39或41中任一項的檢測試劑盒，其中Kir6.2核苷酸序列在編碼序列的位置1009帶有A。
43.根據權利要求37到39、41或42中任一項的檢測試劑盒，所述試劑盒含有能夠擴增多核苷酸片段的引物集合，所述片段含有Kir6.2編碼序列的位置67和/或1009。
44.根據權利要求43的檢測試劑盒，所述試劑盒含有至少一種根據SEQ ID No.9到12的引物。
45.根據權利要求37到39或41到43中任一項的檢測試劑盒，所述試劑盒含有能夠擴增多核苷酸片段的引物集合，所述片段包含根據SEQ IDNo.13的Kir6.2基因組序列的位置5657106/107/108和/或5657978/79/80。
46.根據權利要求45的檢測試劑盒，其中所述試劑盒含有至少一種根據SEQ ID No.9到12的引物。
47.根據權利要求37到39、41或42中任一項的檢測試劑盒，所述試劑盒含有在嚴格條件下特異識別Kir6.2基因組DNA或RNA的一種或多種核酸探針，所述Kir6.2基因組DNA或RNA帶有編碼位置23并非谷氨酸和/或位置337并非纈氨酸的其他氨基酸的核苷酸序列。
48.在多肽序列位置23帶有賴氨酸而在位置337帶有異亮氨酸的分離的Kir6.2多肽或其片段，所述片段包括位置23和337。
49.包含根據SEQ ID No.7的序列或由之組成的分離的Kir 6.2多肽或其片段，所述片段包括氨基酸位置23和/或337。
50.在多肽序列位置23帶有谷氨酸而在位置337帶有異亮氨酸的分離的Kir6.2多肽或其片段，所述片段包括位置23和337。
51.包含根據SEQ ID No.5的序列或由之組成的分離的Kir6.2多肽或其片段，所述片段包括氨基酸位置23和337。
52.分離的多核苷酸，其編碼根據權利要求51到54中任一項的Kir6.2蛋白質或其片段。
53.包括根據SEQ ID No.6或8的序列的分離的多核苷酸或其片段，所述片段包括核苷酸位置67和1009。
54.分離的多核苷酸，其在高嚴格條件下與根據權利要求54或55的DNA序列或它們的互補鏈雜交。
55.用于檢測Kir6.2基因或RNA內核苷酸變異的探針，所述探針包含Kir6.2序列的至少17個，優選19到100個連續核苷酸或由之組成，所述連續核苷酸屬于包括位置67和/或1009的Kir6.2編碼序列或屬于包括位置5657106/107/108和/或5657978/79/80的根據SEQ ID No.13的基因組Kir6.2序列。
56.用于擴增Kir6.2多核苷酸的引物，其中擴增的多核苷酸包含Kir6.2編碼序列的位置67和/或1009和/或根據SEQ ID No.13的基因組Kir6.2序列的位置5657978和/或5657106。
全文摘要
本發明涉及在個體中鑒定提高的冠心病風險的方法，其中在樣品中確定Kir6.2蛋白質位置23上非谷氨酸的其他氨基酸的存在和/或位置337上非纈氨酸的其他氨基酸的存在。此外，還要求保護適用于所述方法的探針、引物、多肽或多核苷酸。
文檔編號C12Q1/68GK101018873SQ200580030463
公開日2007年8月15日 申請日期2005年8月27日 優先權日2004年9月10日
發明者D·科齊安, H·戈蓋萊因, K-E·西格勒, M·雅各布斯, J-F·德勒茲, S·里卡德, S·馬賽 申請人:塞諾菲-安萬特德國有限公司