專利名稱：通過酶促乙醇酸－乙醛酸循環反應測定髓過氧化物酶的方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明一般涉及髓過氧化物酶檢測領域。特別地，本發明提供用于檢測樣品中的髓過氧化物酶的方法和試劑盒。
背景技術：
髓過氧化物酶(MPO；EC 1.11.1.7)是一種大約150kDa的四聚體的、大量糖基化的堿性血紅素蛋白。它由兩個相同的二硫鍵連接的原聚體組成，其每一個原聚體具有含有原卟啉的59-64kDa重鏈亞單位和14kDa的輕鏈亞單位。U.S.Pub.No.2002/0164662；Hoy等.，Clin.Chem.Lab.Med.402-8(2002)。在體內，MPO通過兩電子過氧化反應步驟將Cl-轉化成為次氯酸，HOCl，一種能夠破壞微生物的強氧化劑。Marquez等.，J.Biol.Chem.2655666-5670(1990)。
MPO在針對侵入的微生物的宿主防御中起著重要的作用。MPO富含在嗜中性粒細胞和單核細胞中，分別占這些細胞干重的5％和1-2％。Marquez等.，J.Biol.Chem.2655666-5670(1990)；U.S.Pub.No.2002/0164662。
MPO參與廣譜疾病。除了通過產生HOCl而參與針對微生物的防御，MPO在炎癥狀態下被釋放，在所述狀態中遷移的嗜中性粒細胞可以釋放活性酶。Hoy等.，Clin.Chem.Lab.Med.402-8(2002)。在傳染病中已報道了增加的MPO水平，和抗-MPO抗體在全身性脈管炎中累積。MPO還參與非傳染性疾病，諸如動脈硬化癥、癌癥和前髓細胞白血病、包括阿爾茨海默疾病和多發性硬化病的神經退化型疾病。Hoy等.，Clin.Chem.Lab.Med.402-8(2002)。
在臨床化學上，MPO mRNA被廣泛地用作急性骨髓性白血病(AML)的標記。Bennett等.，Br.J.Haematol.33451-8(1976)。還報道，MPOG-463A多態性的更高表達基因型與AML相關。Reynolds等.，Blood 902730-7(1997)。以G/A轉換為特征的MPO G-463A多態性位于含有激素應答元件的啟動子區域的Alu序列。G/G基因型與白血病患者細胞中增加的MPO表達和蛋白水平相關。Reynolds等.，Blood 902730-7(1997)。也已經表明，對于A等位基因純合的受試者處于降低的患肺癌的風險。London等.，Cancer Res.575001-3(1997)；Le Marchand等.，CancerEpidermiol.Biomarkers Prev.9181-4(2000)；Cascorb等.，Cancer Res.60644-9(2000)；Schabath等.，Carcinogenesis 211163-6(2000)。然而，最近的研究表明，A等位基因與老年男性子集中增加的肺癌危險相關。Misra等.，Cancer Lett.164161-7(2001)。
MPO在患有多發性硬化病(MS)的患者的腦的小神經膠質細胞中和在環繞阿爾茨海默疾病(AD)病例的大腦皮層的老年斑的小神經膠質細胞中存在。Jolivalt等.，Neurosci.Lett.21061-4(1996)；Nagra等.，J.Neuroimmunol.7897-107(1997)。MPO水平的變化還與動脈硬化癥和腦梗塞相關。據報道MPO/H2O2/Cl-系統是參與起始動脈粥樣硬化損傷的一種可能的機制。Dautherty等.，J.Clin.Invest.94437-44(1994).Heinecke等.Curr.Opinion Lip.8268-74(1997)；Hazell等.，J.Clin.Invest.971535-44(1996)；Malle等.，Eur.J.Biochem.2674495-503(2000)。動脈粥樣硬化的主要后果之一是腦梗塞，并且MPO活性的測定被廣泛地用作腦實質嗜中性粒細滲透的標記。Barone等.，J.Neuroscie.Res.29336-45(1991)。增加的MPO活性已經在缺血性腦梗塞后的患者的血清中觀察到。Re等.，Eur.J.Emerg.Med.45-9(1997)。MPO的測定還被用于預測心臟血管危險。Brennan等.，N.Engl.J.Med.3491595-1601(2003)；U.S.Pub.No.2002/0164662。
MPO參與的廣泛范圍的疾病，以及將MPO用作臨床標記和治療靶點的可能性，使得用于正確測定MPO水平和活性的檢測非常有價值。已經報道了一些檢測方法。WO 02/090575，U.S.Pat.No.6,022,699。然而，對于檢測MPO的可靠的和靈敏的方法仍存在一定的需要。
發明簡述本發明提供用于檢測樣品中的髓過氧化物酶的方法，所述方法包括a)將懷疑含有髓過氧化物酶的樣品與絲氨酸、過氧化氫、和氯接觸，以產生乙醇醛；b)在乙醇醛轉化酶和以其氧化形式的第一電子受體的存在下，將步驟a)中的所述乙醇醛轉化成為乙醇酸(glycolate)；c)在以其氧化形式的第二電子受體和乙醇酸轉化酶的存在下，將步驟b)的所述乙醇酸轉化成為乙醛酸，由此產生還原形式的第二電子受體；在以其還原形式的第三電子受體和乙醛酸轉化酶的存在下，所述乙醛酸被轉化回到乙醇酸，以形成循環反應系統，由此產生氧化形式的第三電子受體；其中所述第二電子受體和第三電子受體是不同的；和d)評估所述循環反應系統中還原或氧化形式的第二電子受體或者還原或氧化形式的第三電子受體的濃度變化，由此確定樣品中髓過氧化物酶的存在、不存在和/或量。
在一些實施方案中，步驟b)的第一電子受體不同于步驟c)的第二電子受體和/或第三電子受體。在其它實施方案中，步驟b)的第一電子受體和步驟c)的第二電子受體是相同的。在其它實施方案中，步驟b)的第一電子受體和步驟c)的第三電子受體是相同的。
在一些實施方案中，將懷疑含有髓過氧化物酶的樣品與絲氨酸、過氧化氫、氯、乙醇醛轉化酶、和以其氧化形式的第一電子受體相接觸。在其它實施方案中，將懷疑含有髓過氧化物酶的樣品與絲氨酸、過氧化氫、氯、乙醇醛轉化酶、以其氧化形式的第一電子受體、乙醇酸轉化酶、和以其氧化形式的第二電子受體相接觸。
在一些實施方案中，步驟b)的乙醇醛轉化酶是乙醇醛脫氫酶，并且所述第一電子受體選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+組成的組。
在一些實施方案中，步驟c)的循環反應系統中的所述乙醇酸轉化酶和所述乙醛酸轉化酶是不同的。在一些實施方案中，所述乙醇酸轉化酶不與第三電子受體反應，或者對于第三電子受體具有比第二電子受體更低的親和力，并且所述乙醛酸轉化酶不與第二電子受體反應，或者對于第二電子受體具有比第三電子受體更低的親和力。在一些實施方案中，所述乙醇酸轉化酶是乙醇酸還原酶或乙醇酸氧化酶。在一些實施方案中，所述乙醛酸轉化酶是乙醛酸還原酶或D-甘油酸脫氫酶。
在一些實施方案中，所述乙醇酸轉化酶是乙醇酸還原酶，并且所述乙醛酸轉化酶是乙醛酸還原酶。對于這些實施方案，氧化形式的第二電子受體可以選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+組成的組，并且還原形式的第三電子受體可以選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、乙酰-NADPH、(R)-乳酸、2，6-二氯靛酚和吩嗪硫酸二甲酯組成的組。
在其它實施方案中，所述乙醇酸轉化酶是乙醇酸氧化酶，并且所述乙醛酸轉化酶是D-甘油酸脫氫酶。對于這些實施方案，氧化形式的第二電子受體可以是O2，并且還原形式的第三電子受體可以是選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、乙酰-NADPH組成的組。
在一些實施方案中，步驟c)的循環反應系統中的乙醇酸轉化酶和乙醛酸轉化酶是相同的。例如，乙醇酸轉化酶和乙醛酸轉化酶都是乙醇酸還原酶或乙醛酸還原酶。氧化形式的第二電子受體可以選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+組成的組，并且還原形式的第三電子受體選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、和乙酰-NADPH組成的組。
在所述循環反應系統中，還原或氧化形式的第二電子受體或者環氧或氧化形式的第三電子受體的濃度變化可以通過光度測定方法進行評估。
本發明的方法還包括在步驟d)后將氧化或還原形式的第二電子受體或者還原或氧化形式的第三電子受體偶聯到生色劑上的步驟，其中氧化或還原形式的第二電子受體或者還原或氧化形式的第三電子受體的濃度變化通過比色方法進行評估。
可以通過本發明方法進行評估的樣品包括生物流體。所述生物流體可以是血液、血清、血漿或尿液。
本發明的方法可以用于疾病的預后和/或診斷。這樣的疾病的實例是動脈硬化癥、中風、多發性硬化、阿爾茨海默疾病、肺癌、白血病和傳染病。
本發明還提供用于檢測髓過氧化物酶的試劑盒，其包括絲氨酸、過氧化氫、氯、催化乙醇醛轉化為乙醇酸的乙醇醛轉化酶和以其氧化形式的第一電子受體、催化乙醇酸轉化成乙醛酸的乙醇酸轉化酶和以其氧化形式的第二電子受體、以及催化乙醛酸轉化成乙醇酸的乙醛酸轉化酶和以其還原形式的第三電子受體，其中所述第二電子受體和第三電子受體是不同的。
在一些實施方案中，步驟b)的第一電子受體與步驟c)的第二電子受體和/或第三電子受體不同。在其它實施方案中，步驟b)的第一電子受體和步驟c)的第二電子受體是相同的。在其它實施方案中，步驟b)的第一電子受體和步驟c)的第三電子受體是相同的。
在一些實施方案中，所述乙醇醛轉化酶是乙醇醛脫氫酶，并且所述第一電子受體選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+組成的組。
在一些實施方案中，在步驟c)的循環反應系統中的乙醇酸轉化酶和乙醛酸轉化酶是不同的。在一些實施方案中，所述乙醇酸轉化酶是乙醇酸還原酶，并且氧化形式的第二電子受體選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+組成的組；和所述乙醛酸轉化酶是乙醛酸還原酶，并且還原形式的第三電子受體是選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、和乙酰-NADPH(R)-乳酸、2，6-二氯靛酚和吩嗪硫酸二甲酯組成的組。
在其它實施方案中，所述乙醇酸轉化酶是乙醇酸氧化酶，并且氧化形式的第二電子受體是O2，以及所述乙醛酸轉化酶是D-甘油酸脫氫酶，并且還原形式的第二電子受體是選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、和乙酰-NADPH組成的組。
在一些實施方案中，在步驟c)的循環反應系統中的乙醇酸轉化酶和乙醛酸轉化酶是相同的。在一些實施方案中，乙醇酸轉化酶和乙醛酸轉化酶是乙醇酸還原酶或乙醛酸還原酶，并且其中所述氧化形式的第二電子受體是選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+組成的組，并且還原形式的第三電子受體是選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、和乙酰-NADPH組成的組。
本發明的試劑盒還可以包括用于實行本申請所述的任何方法的用法說明，和/或對于疾病的預后和/或診斷的指示應用，所述疾病包括但不限于動脈硬化癥、中風、多發性硬化病、阿爾茨海默疾病、肺癌、白血病和傳染病。
發明詳述本發明提供用于檢測髓過氧化物酶活性的方法。在所述檢測中，將含有髓過氧化物酶或懷疑含有髓過氧化物酶的樣品與底物相接觸，所述底物包括絲氨酸、過氧化氫和鹵化物。如果樣品中存在髓過氧化物酶，那么絲氨酸被轉化為乙醇醛，乙醇醛進一步被glycoaldehyde轉化酶轉化成為乙醇酸。然后所述方法應用乙醇酸和乙醛酸之間的循環反應系統來產生可檢測的信號，所述可檢測的信號與髓過氧化物酶活性相對應。
為了本公開內容的清楚性，并且不是限制的方式，本發明詳述被分成下列分部。
A.定義除非另外定義，本文所用的所有技術和科學術語具有本發明所屬技術領域的普通技術人員通常所理解的相同的意思。本申請所參考的所有的專利、申請、公布的申請和其它出版物通過參考全文完全結合于此。如果在本部分提出的定義與通過參考結合于此的專利、申請、公布的申請和其它出版物中所提出的定義相反或者另外不相一致，那么在本部分提出的定義優于通過參考結合于此的定義。
當用于本文時，″a″或″an″意為“至少一個”或“一個或多個”。
當用于本文時，″髓過氧化物酶″(EC 1.11.1.7)是指一種從供體和H2O2催化氧化供體和H2O形成的酶。例如，髓過氧化物酶從Cl-和H2O2催化HOCl和H2O的形成。它意欲包括基本上不改變其活性的髓過氧化物酶的衍生物、變體和類似物。髓過氧化物酶可以從任何來源獲得，諸如人、小鼠、牛、大鼠、果蠅等。
當用于本文時，“glycoaldehyde轉化酶”是指一種在以其氧化形式的電子受體的存在下從glycoaldehyde催化乙醇酸的形成的酶。它意欲包括基本上不改變其活性的乙醇醛轉化酶的衍生物、變體和類似物。
當用于本文時，“乙醇酸轉化酶”是指在以其氧化形式的電子受體的存在下從乙醇酸催化乙醛酸的形成的酶。它意欲包括基本上不改變其活性的乙醇酸轉化酶的衍生物、變體和類似物。
當用于本文時，“乙醛酸轉化酶”是指在以其還原形式的電子受體的存在下從乙醛酸催化乙醇酸的形成的酶。它意欲包括基本上不改變其活性的乙醛酸轉化酶的衍生物、變體和類似物。
當用于本文時，術語“評估”意欲包括在下列意義上的定量和定性確定，即，獲得關于分析物在反應系統中存在的量或濃度的絕對值，以及還獲得指示分析物在反應系統中的水平的指數、比例、百分數、光學值(visual)或其它值。評估可以是直接的或間接的，并且實際上檢測的化學物種類不必當然是分析物本身，而是可以是，例如，其衍生物或一些其它的物質。
當用于本文時，“樣品”是指可以包含需要對其進行分析物檢測的分析物的任何事物。所述樣品可以是生物樣品，諸如生物流體或生物組織。生物流體的實例包括尿液、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰液、腦脊液、淚液、黏液、羊水等。生物組織是細胞聚集體，通常是特殊種類的細胞與它們的細胞間物質一起，形成人、動物、植物、細菌、真菌或病毒結構的結構物質之一，包括結締組織、上皮組織、肌肉組織和神經組織。生物組織的實例還包括器官、腫瘤、淋巴結、動脈和個體細胞。
當用于本文時，“血清”是指移除血纖維蛋白凝塊和血細胞后獲得的血液的流體部分，顯著不同于循環血液中的血漿。
當用于本文時，“血漿”是指血液的流體、非細胞部分，顯著不同于凝結后獲得的血清。
當用于本文時，“流體”是指可以流動的任何組合物。因此，流體包括以半固體、糊狀、溶液、水性混合物、凝膠、洗液、膏劑形式的組合物和其它這樣的組合物。
當用于本文時，“疾病或紊亂(disorder)”是指，例如，由感染或遺傳缺陷導致的生物體中的病理病況，并且以可確認的癥狀為特征。
當用于本文時，“接觸”意指使得兩種或多種成分在一起。“接觸”可以通過將所有的成分在流體或半流體混合物中混合而實現。“接觸”還可以這樣實現，即，當使得一種或多種成分與一種或多種其它成分在固體表面諸如固體組織切片或底物上接觸時而實現。
當用于本文時，“循環反應系統”是指將乙醇酸轉化成為乙醛酸并且從乙醛酸轉化回到乙醇酸的過程。
B.用于檢測髓過氧化物酶的方法本發明提供用于檢測髓過氧化物酶在樣品中存在、不存在和/或其量的方法，所述方法包括a)將含有髓過氧化物酶或懷疑含有髓過氧化物酶的樣品與絲氨酸、過氧化氫和鹵化物(優選為氯)接觸，以產生乙醇醛；b)在乙醇醛轉化酶和以其氧化形式的第一電子受體的存在下，將步驟a)中產生的所述乙醇醛轉化為乙醇酸；c)在以其氧化形式的第二電子受體和乙醇酸轉化酶的存在下，將步驟b)的所述乙醇酸轉化為乙醛酸，由此產生還原形式的第二電子受體；在以其還原形式的第三電子受體和乙醛酸轉化酶的存在下，將所述乙醛酸轉化回到乙醇酸，以形成循環反應系統，由此產生氧化形式的第三電子受體；其中所述第二電子受體和第三電子受體是不同的；和d)對在步驟c)中產生的至少一種可檢測的信號進行評估。在一些實施方案中，步驟c)中產生的可檢測信號是還原或氧化形式的第二電子受體或者還原或氧化形式的第三電子受體在所述循環反應系統中的濃度變化。
步驟a)在過氧化氫和鹵化物的存在下，通過髓過氧化物酶將絲氨酸轉化為glycoaldehyde本發明中用于檢測髓過氧化物酶的方法是基于測定髓過氧化物酶催化的酶促活性。在過氧化氫和鹵化物存在下，髓過氧化物酶催化將絲氨酸轉化為乙醇醛的反應。因此，樣品中髓過氧化物酶的存在或不存在和其量可以通過確定在這些反應中產生的glycoaldehyde而確定。在這些反應中的鹵化物可以是Cl-、Br-或I-。優選地，所述鹵化物為Cl-。因此，本發明步驟a)的一種示例性反應式為絲氨酸+H2O2+Cl-+H+→乙醇醛+HOCl+H2O (1)步驟a)中的絲氨酸、過氧化氫和氯(或其它鹵化物)可以是任何濃度，所述濃度適于髓過氧化物酶反應，并且取決于樣品中髓過氧化物酶的活性。例如，絲氨酸的濃度為大約0.05mM-大約100mM；大約0.1mM-大約0.5mM，大約1mM-大約50mM，或大約5mM-大約10mM；過氧化氫為大約5μM-大約10mM，大約10μM-大約1mM，或大約50μM-大約500μM；氯(或其它鹵化物)為大約1mM-500mM，大約10mM-200mM，或大約100mM-大約150mM。氯化鈉或其它鹽可以用作適宜的氯來源。
應用本發明，可以對任何含有或者懷疑含有髓過氧化物酶的樣品進行評估。在一些實施方案中，所述樣品是血液、血清、血漿、或尿液。在一些實施方案中，所述樣品包括白細胞，諸如嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、和/或單核細胞。在一些實施方案中，所述樣品是組織樣品。在一些實施方案中，將所述組織樣品進行勻漿，以在進行所述檢測之前獲得粗組織勻漿物。
在一些實施方案中，在進行檢測前，將所述樣品進行預處理。示例性的處理步驟包括離心、提取/洗滌、細胞裂解、冷凍/解凍、和超聲。在檢測前，還可以將樣品稀釋。
步驟b)通過乙醇醛轉化酶催化，將乙醇醛轉化為乙醇酸在以其氧化形式的電子受體存在下，本發明的步驟b)通過乙醇醛轉化酶的作用將乙醇醛轉化為乙醇酸。在以其氧化形式的電子受體的存在下，將glycoaldehyde轉化為乙醇酸的任何乙醇醛轉化酶都可以應用。在一些實施方案中，所述乙醇醛轉化酶是乙醇醛脫氫酶。因此，由乙醇醛脫氫酶催化的一種一種示例性反應式為乙醇醛+NAD++H2O→乙醇酸+NADH+H+(2)可以應用任何乙醇醛脫氫酶。例如，可以應用具有下列GenBank登記號的氨基酸序列的乙醇醛脫氫酶(EC 1.1.1.21)A39763(智人)，A35452(牛)，A60603(大鼠)，A34406(兔)，I49484(小鼠)，A59021(豬)，C85505(大腸桿菌(E.coli))，A97465(根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens))，S46020(釀酒酵母菌(S.cerevisiae))，和JQ2253(雀麥草)。
可以應用與所選的乙醇醛轉化酶相容的任何電子受體。例如，當應用乙醇醛脫氫酶時，所述電子受體(氧化形式)可以是NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、或乙酰-NADP+。
步驟c)乙醇酸-乙醛酸循環反應系統在第二電子受體(以其氧化形式)存在下，本發明的步驟c)通過乙醇酸轉化酶的作用將乙醇酸轉化為乙醛酸，并且然后在第三電子受體(以其還原形式)的存在下，通過乙醛酸轉化酶的作用從乙醛酸轉化回到乙醇酸。所述第二電子受體和第三電子受體是不同的電子受體。因此，步驟c)形成循環反應系統，其產生以其還原形式的第二電子受體的增加和以其氧化形式的第二電子受體的減少，以及以其氧化形式的第三電子受體的增加和以其還原形式的第三電子受體的減少。可以測定以具體形式的電子受體的增加或者以具體形式的電子受體的減少。在一些實施方案中，積累了一種以具體形式的電子受體，并且評估所述積累。
在一些實施方案中，所述乙醇酸轉化酶和乙醛酸轉化酶是不同的。在一些實施方案中，所述乙醇酸轉化酶不與第三電子受體交叉反應，或者以比對于第二電子受體更低的親和力同第三電子受體結合，并且所述乙醛酸轉化酶不與第二電子受體交叉反應，或者以比對于第三電子受體更低的親和力同第二電子受體相結合。
可以應用在以其氧化形式的電子受體存在下從乙醇酸催化乙醛酸形成的任何乙醇酸轉化酶。
在一些實施方案中，所述乙醇酸轉化酶是乙醇酸還原酶。例如，可以應用由下列GenBank登記號的核苷酸序列編碼的任何乙醇酸還原酶(EC1.1.1.79)NC_000913(大腸桿菌)，U00096(大腸桿菌)，NC_004722(蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus))，和AE017002(蠟狀芽孢桿菌)。
在其它實施方案中，所述乙醇酸轉化酶是乙醇酸氧化酶。例如，可以應用具有下列GenBank登記號的氨基酸序列的乙醇酸氧化酶(EC1.1.3.15)S33322(大鼠)，NP_105534(Mesorhizobium loti)，AE3642(馬爾他布魯氏菌(Brucella melitensis))，T17471(東方擬無枝酸菌(Amycolatopsisorientalis))，S74706(集胞藍細菌屬(Synechocystis sp))，T10242((葫蘆科cucurbit))，T02150(稻屬)，S75231(集胞藍細菌屬)，和OXSPH(菠菜屬)。
在其它實施方案中，所述乙醇酸轉化酶是乙醛酸還原酶。例如，可以應用具有下列GenBank登記號的氨基酸序列的任何乙醛酸還原酶(EC1.1.1.26)AB033995(thermococcus litoralis)和AF134895(人)。
可以應用在以其還原形式的電子受體的存在下，從乙醛酸催化乙醇酸形成的任何乙醛酸轉化酶。
在一些實施方案中，所述乙醛酸轉化酶是甘油酸脫氫酶。例如，可以應用具有下列GenBank登記號的氨基酸序列的甘油酸脫氫酶(E.G.1.1.1.29)NP_283114(腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis))，CAB83582(腦膜炎奈瑟氏球菌)，F82022(腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitis))，S68165(Cucurbita)，S68164(南瓜屬(Cucurbita))，DEKVG(黃瓜)。
在其它實施方案中，所述乙醛酸轉化酶是乙醛酸還原酶。本文描述了乙醛酸還原酶。
在其它實施方案中，所述乙醛酸轉化酶是乙醇酸還原酶。本文描述了乙醇酸還原酶。
在一些實施方案中，所述乙醇酸轉化酶和乙醛酸轉化酶是相同的。在一些實施方案中，乙醇酸轉化酶和乙醛酸轉化酶都是乙醇酸還原酶。在其它實施方案中，乙醇酸轉化酶和乙醛酸轉化酶都是乙醛酸還原酶。可以應用本領域已知的和本文所述的任何乙醇酸還原酶和乙醛酸還原酶。
所述第二和第三電子受體可以是與反應的不同步驟所選的酶相容的任何電子受體，條件是第二電子受體和第三電子受體是不同的。
在一些實施方案中，所述乙醇酸轉化酶是乙醇酸還原酶，并且第二電子受體選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+、乳酸、2，6-二氯靛酚和吩嗪硫酸二甲酯組成的組。在一些實施方案中，所述乙醇酸轉化酶是乙醇酸氧化酶，并且第二電子受體是O2。在一些實施方案中，所述乙醇酸轉化酶是乙醛酸還原酶，并且第二電子受體選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+、乳酸、2，6-二氯靛酚和吩嗪硫酸二甲酯組成的組。
在一些實施方案中，所述乙醛酸轉化酶是乙醛酸還原酶，并且第三電子受體是選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH和乙酰-NADPH組成的組。在一些實施方案中，所述乙醛酸轉化酶是D-甘油酸脫氫酶，并且第三電子受體是選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH和乙酰-NADPH組成的組。在一些實施方案中，所述乙醛酸轉化酶是乙醇酸還原酶，并且第三電子受體是選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH和乙酰-NADPH組成的組。
在一些實施方案中，所述乙醇酸轉化酶和乙醛酸轉化酶可以選擇性地催化乙醇酸和乙醛酸之間的循環反應，所述循環反應放大了在檢測中產生的信號。所述乙醇酸轉化酶和乙醛酸轉化酶可以應用不同的電子受體，并且不與另一種酶所用的電子受體交叉反應，或者以低親和力反應。備選地，這兩種酶可以識別相同的電子受體。可以將足夠量的氧化形式的第二電子受體和還原形式的第三電子受體添加到所述循環反應中，以推進反應，并且允許所述循環繼續進行，直到產生充分的信號。
在步驟c)的下列兩種示例性反應式中，所述乙醇酸轉化酶和乙醛酸轉化酶是不同的。例如，所述乙醇酸轉化酶是乙醇酸還原酶，并且所述乙醛酸轉化酶是乙醛酸還原酶。因此，步驟c)的一種示例性反應式為乙醇酸+硫代-NAD++H2O→乙醛酸+硫代-NADH+H+(4a)乙醛酸+NADH+H+→乙醇酸+NAD++H2O (4b)反應(4a)代表由乙醇酸還原酶催化的反應，和反應(4b)代表由乙醛酸還原酶催化的反應。可以將足夠的硫代-NAD+和NADH添加到反應中，以產生循環反應，其引起硫代-NADH的累積。
在另一實例中，在循環反應中，乙醇酸氧化酶被用作乙醇酸轉化酶，并且D-甘油酸脫氫酶被用作乙醛酸轉化酶。一種示例性的反應式為乙醇酸+O2→乙醛酸+H2O2(5a)乙醛酸+硫代-NADH→乙醇酸+硫代-NAD+(5b)反應(5a)代表由乙醇酸氧化酶催化的反應，和反應(5b)代表由D-甘油酸脫氫酶催化的反應。可以將足夠量的O2和硫代-NADH添加到反應中，以產生循環反應，其引起硫代-NAD+和H2O2的累積。
下述是一種示例性反應式，其中乙醇酸轉化酶和乙醛酸轉化酶是相同的。一種這樣的示例性反應式為乙醇酸+硫代-NAD++H2O→乙醛酸+硫代-NADH+H+(3a)
乙醛酸+NADH+H+→乙醛酸+NAD++H2O (3b)反應(3a)和(3b)都是由相同的酶催化，所述酶為乙醇酸還原酶或乙醛酸還原酶。可以將足夠的硫代-NAD+和NADH添加到反應混合物中，以推進循環反應中的這兩個反應，其引起硫代-NADH的累積。
可以應用任何其它的乙醇酸轉化酶和乙醛酸轉化酶的組合，來獲得相同的循環效果。
步驟a)到c)的酶促反應通常在適于完成所述酶促反應的條件(諸如緩沖液和溫度)下進行。用于本文所述的步驟a)、b)和c)的緩沖液可以是相同的或者可以是不同的。可以應用本領域已知的適用于特殊的酶促反應的任何緩沖液。例如，所述緩沖液可以是具有大約6-大約8的pH的磷酸緩沖液；具有大約7-大約9的pH的Tris-HCl緩沖液，或具有大約6-大約9的pH的Good′s緩沖液。
對于每一步驟的溫度可以是相同的或不同的。溫度優選地在約25-約37℃之間。
在一些實施方案中，本文所述的一個或多個步驟在獨立的反應混合物中進行。例如，在添加用于下一步驟的試劑之前，反應中一步或多個步驟的終產物可以部分或者完全地從所述反應混合物中分離。
在一些實施方案中，本文所述的步驟a)-c)在單一反應混合物中進行。
在一些實施方案中，在前一步驟的末期，將用于下一步驟的酶、底物、或電子受體順序添加到同一反應混合物中。在一些實施方案中，在加入用于下一步驟的試劑之前，將前一步驟的反應終止。在一些實施方案中，將用于多于一步的一些或全部試劑同時添加到反應混合物中。在一些實施方案中，用于步驟a)和b)的試劑與樣品同時混合。在這些實施方案中，將懷疑含有髓過氧化物酶的樣品與絲氨酸、過氧化氫、氯、乙醇醛轉化酶、和以其氧化形式的第一電子受體接觸。在一些實施方案中，將用于步驟a)、b)的試劑和用于步驟c)的一些試劑與樣品同時混合。在這些實施方案中，將懷疑含有髓過氧化物酶的樣品與絲氨酸、過氧化氫、氯、乙醇醛轉化酶、以其氧化形式的第一電子受體、乙醇酸轉化酶、和以其氧化形式的第二電子受體相接觸。在其它實施方案中，用于步驟a)、b)和c)的試劑與樣品同時混合。在這些實施方案中，將懷疑含有髓過氧化物酶的樣品與絲氨酸、過氧化氫、氯、乙醇醛轉化酶、以其氧化形式的第一電子受體、乙醇酸轉化酶、以其氧化形式的第二電子受體、乙醛酸轉化酶、和以其還原形式的第三電子受體相接觸。
在一些實施方案中，所述第一電子受體不同于第二電子受體和/或第三電子受體。在其它實施方案中，第一電子受體與第二電子受體相同。在其它實施方案中，第一電子受體與第三電子受體相同。
步驟d)評估步驟c)產生的信號樣品中髓過氧化物酶的定量可以通過監測步驟c)中產生的信號的減少或增加的不同而獲得。評估可以在連續地進行或者在不同時間點進行。
在一些實施方案中，評估還原或氧化形式的第二電子受體的濃度變化。在一些實施方案中，通過評估還原形式的第二電子受體的濃度的增加而確定髓過氧化物酶的活性。在一些實施方案中，通過評估氧化形式的第二電子受體的濃度的減少而確定髓過氧化物酶的活性。
在一些實施方案中，評估還原或氧化形式的第三電子受體的濃度變化。在一些實施方案中，通過評估還原形式的第三電子受體的濃度的減少而確定髓過氧化物酶的活性。在一些實施方案中，通過評估氧化形式的第三電子受體的濃度的增加而確定髓過氧化物酶的活性。
本文所述的電子受體的濃度變化可以應用本領域已知的方法進行評估。例如，可以通過測定340nm的吸收而分光光度性地確定NADH或NADPH的濃度變化。可以通過測定405nm的吸收而分光光度性地確定硫代-NADH的濃度變化。
在一些實施方案中，應用電子轉運發色團，其包括但不限于，3-(對碘苯基)-2-(對硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑氯化物、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-聯苯-2H-四唑溴化物、3，3′-(4，4′-亞聯苯基)-雙(2，5-聯苯-2H-四唑氯化物)、3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亞聯苯基)-雙[2-(對硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑氯化物](＝硝基-四唑NTB)、3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亞聯苯基)-雙[2，5-雙(對硝基苯基)-2H-四唑氯化物]、3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亞聯苯基)-雙(2，5-聯苯-2H-四唑氯化物)和2，6-二氯苯酚-靛酚，可以通過比色方法測定NADH或NADPH的濃度變化。優選的實例是水溶性四唑鹽和硫辛酰胺脫氫酶或吩嗪硫酸二甲酯的組合。這些電子轉運發色團是用于NADP或NADPH的電子受體，以形成有色的甲色素，并且在其最大吸收比色測定所形成的色素。
用于NADH或NADPH的其它檢測方法是熒光光度法，其中在熒光劑諸如resazulin的存在下，將NAD或NADPH用硫辛酰胺脫氫酶處理。
本文所述的還原和/或氧化形式的電子受體的濃度的測定在本領域內是已知的。例如，消耗的O2量或形成的H2O2的量可以通過應用電子傳感器而進行檢測。各種還原-氧化指示劑可以用于這一目的，并且在文獻中描述了用于檢測溶液中H2O2和O2的廣泛范圍的方法。通過將一種指示劑與H2O2反應，產生的H2O2還可以作為可檢測的產物進行測定。指示劑的實例是可以通過分光光度方法、顏色指示劑、熒光劑或發光劑而進行測定的試劑。例如，H2O2可以應用peroxioxalate和吖啶鎓酯的非酶促化學發光反應來評估。
檢測可以重復進行，具有陽性和背景對照。通過應用已知量的已知活性的髓過氧化物酶而獲得標準曲線。在每份樣品中髓過氧化物酶的水平可以通過將測定的每種信號和所述標準曲線進行比較而確定。
C.方法應用本發明提供具有增加的靈敏性的檢測，其用于檢測樣品中存在的即使少量的髓過氧化物酶。因此，本發明的方法提供用于檢測與髓過氧化物酶改變的水平相關的疾病并且監測患者中髓過氧化物酶的水平的實用方法。所述方法可以用于與受試者中不適當量或者與存在的髓過氧化物酶反應的、或者所述髓過氧化物酶的作用或活性相關的任何疾病的預后或診斷。這樣的疾病的實例包括，但不限于，急性骨髓性白血病、全身性紅斑狼瘡、橋本甲狀腺炎、重癥肌無力、風濕性關節炎、多發性硬化病、急性熱病性多神經炎、腎小球腎炎、動脈硬化癥、中風、多發性硬化病、阿爾茨海默疾病、白血病、傳染病、哮喘、癌癥諸如肺癌、囊腫性纖維化、慢性阻塞性肺病、炎癥性腸病和神經炎癥疾病。
本發明的酶促檢測還提供用于研究髓過氧化物酶在生物過程和各種病理疾病中的作用的研究工具。
D.檢測髓過氧化物酶的試劑盒本發明還提供用于檢測髓過氧化物酶活性的試劑盒，諸如診斷試劑盒。這樣的試劑盒包括本文所述的一種或多種底物、酶促試劑和電子受體，以用于實行本發明的方法，例如，絲氨酸、過氧化氫、氯(或其它鹵化物)、乙醇醛轉化酶、以其氧化形式的第一電子受體、乙醇酸轉化酶、以其氧化形式的第二電子受體、乙醛酸轉化酶、以其還原形式的第三電子受體，其中所述第二電子受體和第三電子受體是不同的。本文所述的任何底物、酶和電子受體可以包含在所述試劑盒中。所述試劑盒還可以包括陽性和/或陰性對照標準物，以及對于檢測步驟c)產生的信號的必需試劑，例如，可以包括用于進行比色檢測的試劑。所述試劑盒還可以包括這樣的器械或容器，其用于實行本發明的方法和/和將樣品轉移到診斷實驗室以進行處理，以及適用于實行本發明方法的用法說明。
本發明的試劑盒可以是任何適宜的包裝。例如，本文所討論的與診斷系統相關的包裝是通常用在診斷系統中的那些。這樣的包括包括適用于自動分析器的容器。
E.實施例包括下列實施例僅僅是用于舉例說明的目的而不是意欲限制本發明的范圍。
實施例1.應用乙醇酸還原酶和乙醛酸還原酶進行髓過氧化物酶檢測在本研究中，所述乙醇醛轉化酶是乙醇醛脫氫酶，所述乙醇酸轉化酶是乙醇酸還原酶，并且所述乙醛酸轉化酶是乙醛酸還原酶。在本研究中所用的試劑在下述表1和2中列出。
表1.試劑1的組成
表2.試劑2的組成
在本研究中，將250μl試劑1與20μl要檢測的樣品混合，并且將混合物在37℃溫育5分鐘。然后將50μl試劑2添加到混合物中，并且在37℃再溫育1分鐘。溫育后，連續2分鐘測定405nm處吸收的變化。
實施例2.應用乙醇酸氧化酶和D-甘油酸脫氫酶進行髓過氧化物酶檢測在本研究，所述乙醇醛轉化酶是乙醇醛脫氫酶，所述乙醇酸轉化酶是乙醇酸氧化酶，并且所述乙醛酸轉化酶是D-甘油酸脫氫酶。本研究所用的試劑在下述表3和4中列出。
表3.試劑1的組成
表4.試劑2的組成
在本研究中，將280μl試劑1與30μl要檢測的樣品混合，并且將混合物在37℃溫育5分鐘。然后將60μl試劑2添加到混合物中，并且在37℃再溫育2分鐘。溫育后，連續2分鐘測定405nm處吸收的變化。
實施例3.應用乙醇酸還原酶進行髓過氧化物酶檢測在本研究中，所述乙醇醛轉化酶是乙醇醛脫氫酶，所述乙醇酸轉化酶和所述乙醛酸轉化酶都是乙醇酸還原酶。本研究所用的試劑在下述表5和6中列出。
表5.試劑1的組成
表6.試劑2的組成
在本研究中，將240μl試劑1與20μl要檢測的樣品混合，并且將混合物在37℃溫育5分鐘。然后將60μl試劑2添加到混合物中，并且在37℃再溫育1分鐘。溫育后，連續2分鐘測定405nm處吸收的變化。
上述實施例僅出于舉例說明的目的包含于此，并不意欲限制本發明的范圍。對上文所描述的那些的許多變化是可能的。由于對上述實施例的改進和改變對于本領域的技術人員是顯而易見的，所以，它的目的是本發明只應該受到附上的權利要求的范圍的限制。
權利要求
1.一種用于檢測樣品中的髓過氧化物酶的方法，所述方法包括a)將懷疑含有髓過氧化物酶的樣品與絲氨酸、過氧化氫、和氯接觸，以產生乙醇醛；b)在乙醇醛轉化酶和以其氧化形式的第一電子受體的存在下，將步驟a)中產生的所述乙醇醛轉化成為乙醇酸；c)在以其氧化形式的第二電子受體和乙醇酸轉化酶的存在下，將步驟b)的所述乙醇酸轉化成為乙醛酸，由此產生還原形式的第二電子受體；在以其還原形式的第三電子受體和乙醛酸轉化酶的存在下，所述乙醛酸被轉化回到乙醇酸，以形成循環反應系統，由此產生氧化形式的第三電子受體；其中所述第二電子受體和第三電子受體是不同的；和d)評估所述循環反應系統中還原或氧化形式的第二電子受體或者還原或氧化形式的第三電子受體的濃度變化，由此確定樣品中髓過氧化物酶的存在、不存在和/或量。
2.權利要求1的方法，其中所述第一電子受體和第二電子受體是相同的。
3.權利要求1的方法，其中將所述懷疑含有髓過氧化物酶的樣品與絲氨酸、過氧化氫、氯、乙醇醛轉化酶和以其氧化形式的第一電子受體相接觸。
4.權利要求1的方法，其中將所述懷疑含有髓過氧化物酶的樣品與絲氨酸、過氧化氫、氯、乙醇醛轉化酶、以其氧化形式的第一電子受體、乙醇酸轉化酶和以其氧化形式的第二電子受體相接觸。
5.權利要求1的方法，其中步驟b)的所述乙醇醛轉化酶是乙醇醛脫氫酶，并且所述第一電子受體選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+組成的組。
6.權利要求1的方法，其中在步驟c)的循環反應系統中的所述乙醇酸轉化酶和乙醛酸轉化酶是不同的。
7.權利要求6的方法，其中所述乙醇酸轉化酶是乙醇酸還原酶或乙醇酸氧化酶。
8.權利要求6的方法，其中所述乙醛酸轉化酶是乙醛酸還原酶或D-甘油酸脫氫酶。
9.權利要求6的方法，其中所述乙醇酸轉化酶是乙醇酸還原酶，并且所述乙醛酸轉化酶是乙醛酸還原酶。
10.權利要求9的方法，其中所述氧化形式的第二電子受體選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+組成的組，并且還原形式的第三電子受體選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、乙酰-NADPH、(R)-乳酸、2，6-二氯靛酚和吩嗪硫酸二甲酯組成的組。
11.權利要求6的方法，其中所述乙醇酸轉化酶是乙醇酸氧化酶，并且所述乙醛酸轉化酶是D-甘油酸脫氫酶。
12.權利要求11的方法，其中所述氧化形式的第二電子受體是O2，并且所述還原形式的第三電子受體選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、乙酰-NADPH組成的組。
13.權利要求1的方法，其中步驟c)的循環反應系統中的所述乙醇酸轉化酶和乙醛酸轉化酶是相同的。
14.權利要求13的方法，其中所述乙醇酸轉化酶和乙醛酸轉化酶都是乙醇酸還原酶或乙醛酸還原酶。
15.權利要求14的方法，其中所述氧化形式的第二電子受體選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+組成的組，并且所述還原形式的第三電子受體選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、和乙酰-NADPH組成的組。
16.權利要求1的方法，其中所述濃度變化通過光度方法進行評估。
17.權利要求1的方法，所述方法還包括在步驟d)后，將所述氧化或還原形式的第二電子受體或者所述還原或氧化形式的第三電子受體偶聯到生色劑上的步驟，其中氧化或還原形式的第二電子受體或者還原或氧化形式的第三電子受體的濃度變化通過比色方法進行評估。
18.權利要求1的方法，其中所述樣品是生物流體。
19.權利要求18的方法，其中所述生物流體選自由血液、血清、血漿和尿液組成的組。
20.權利要求1的方法，所述方法用于疾病的預后和/或診斷。
21.權利要求20的方法，其中所述疾病選自由動脈硬化癥、中風、多發性硬化病、阿爾茨海默疾病、肺癌、白血病和傳染病組成的組。
22.一種用于檢測髓過氧化物酶的試劑盒，所述試劑盒包括絲氨酸、過氧化氫、氯、催化乙醇醛到乙醇酸的轉化的乙醇醛轉化酶和以其氧化形式的第一電子受體、催化乙醇酸到乙醛酸轉化的乙醇酸轉化酶和以其氧化形式的第二電子受體、以及催化乙醛酸到乙醇酸轉化的乙醛酸轉化酶和以其還原形式的第三電子受體，其中所述第二電子受體和所述第三電子受體是不同的。
23.權利要求22的試劑盒，其中所述乙醇醛轉化酶是乙醇醛脫氫酶，并且所述第一電子受體選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+組成的組。
24.權利要求22的試劑盒，其中所述乙醇酸轉化酶是乙醇酸還原酶，并且所述氧化形式的第二電子受體選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+組成的組，其中所述乙醛酸轉化酶是乙醛酸還原酶，并且所述還原形式的第三電子受體選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、和乙酰-NADPH(R)-乳酸、2，6-二氯靛酚和吩嗪硫酸二甲酯組成的組。
25.權利要求22的試劑盒，其中所述乙醇酸轉化酶是乙醇酸氧化酶，和所述氧化形式的第二電子受體是O2，并且所述乙醛酸轉化酶是D-甘油酸脫氫酶，和所述還原形式的第二電子受體選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、和乙酰-NADPH組成的組。
26.權利要求22的試劑盒，其中所述乙醇酸轉化酶和乙醛酸轉化酶都是乙醇酸還原酶或乙醛酸還原酶，并且其中所述氧化形式的第二電子受體選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰-NAD+、和乙酰-NADP+組成的組，以及所述還原形式的第三電子受體選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰-NADH、和乙酰-NADPH組成的組。
27.權利要求22的試劑盒，所述試劑盒還包括指示疾病的預后和/或診斷的應用的用法說明。
28.權利要求27的試劑盒，其中所述疾病選自由動脈硬化癥、中風、多發性硬化病、阿爾茨海默疾病、肺癌、白血病和傳染病組成的組。
全文摘要
本發明提供用于檢測髓過氧化物酶活性的方法。在所述檢測中，將含有髓過氧化物酶或者懷疑含有髓過氧化物酶的樣品與包括絲氨酸、過氧化氫和鹵化物的底物相接觸。如果樣品中存在髓過氧化物酶，那么絲氨酸被轉化成為乙醇醛，其進一步被glycoaldehyde轉化酶(例如，乙醇醛脫氫酶)(1.2.1.21)轉化為乙醇酸。然后，所述方法應用乙醇酸和乙醛酸之間的循環反應系統來產生與所述髓過氧化物酶活性相對應的可檢測的信號。本發明還提供了基于相同的原理用于檢測髓過氧化物酶的試劑盒。
文檔編號C12Q1/28GK101044246SQ200580027184
公開日2007年9月26日 申請日期2005年8月10日 優先權日2004年8月11日
發明者袁崇生, 竇超 申請人:通用原子公司