專利名稱：用于制備(s)－5－氯－2－異丙基戊－4－烯酸酯的方法
技術領域：
本發明涉及(S)-5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸酯的制備，特別是其甲酯，其是制造藥物阿利克侖(Aliskiren)的關鍵中間體。
背景技術：
阿利克侖是正在開發中的用于治療幾種心血管跡象(包括充血性心力衰竭、高血壓和慢性腎衰竭)的腎素抑制劑。腎素-血管緊縮素系統(cascade)是電解質和流體平衡和血壓的關鍵調節劑中的一種。目前可獲得的包括ACE抑制劑(血管緊縮素轉換酶)的藥物是該系統后部分的拮抗藥。阿利克侖是新類型模擬肽學的第一種，其通過作用于途徑的前半部而具有作為更好選擇性抑制劑的潛能。
阿利克侖，也已知為SPP-100，可以通過將衍生自3-芳基-2-異丙基-1-氯丙烷的格氏試劑加成到假麻黃堿spiroanellatedγ-丁內酯中合成(Dondoni等，Tetrahedron Lett.，42(2001)，4819-4823)。在WO 01/09079和WO 02/092828中所述的更有效的合成經由(S)-5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸烷基酯(1)進行。可以通過相應的外消旋酯的水解以形成羧酸、隨后通過與手性胺堿形成非對映鹽進行外消旋物分離和結晶、隨后進行再酯化獲得為富含對應體的形式的通式(1)的酯。進一步描述了使用手性輔助劑的立體選擇性合成，該合成用于制備這種2(S)-戊烯酸并將其衍生以形成相應的羧酸鹵化物、酯和酰胺。酯的這種立體選擇性合成仍然是不令人滿意的，認為其太昂貴。WO 02/092828描述了如何使用哺乳動物的酯酶、即豬肝酯酶(PLE)通過外消旋羧酸酯(2)的生物分解優先獲得通式(1)的酯。盡管從技術角度看這提供了一種有效的方法，但由于如下的理由在關鍵中間體的商業化生產中不贊成使用哺乳動物的酯酶。而且，為克服該問題，對于這種制備的分解方法，確定用于提供同等催化劑作用的哺乳動物酶的合適的非哺乳動物的替代物通常是非常困難的。
有許多理由說明在藥物中間體的合成中使用衍生自動物的產品在商業上是沒有吸引力的。這其中的原理是由于其要經受日益嚴格的管理控制。“關于將海綿狀腦病劑通過人類和動物醫療產品的傳染風險最小化的指南”(EMEA/410/01/01 Rev2 October 2003)在2004年7月1日生效。該監管背后的驅動力是越來越多地發生以前未識別出的突發性疾病，例如由BSE(牛綿狀腦病)造成的傳染性海綿狀腦病。這種突發事件，與產生于跨越交叉品種障礙的有機體的病毒造成的SARS(嚴重急性呼吸道癥候群)一樣，也是未來關注的原因。在這種情況和其他高度傳染性動物疾病例如口蹄疫的情況下，已經造成動物的檢疫和質量檢查，這可能對來自易被傳染的動物的材料的供應產生嚴重的影響。作為回應，許多藥物公司采取先發制人的行動，要求需要研發的活性藥物中間體(API)和其注冊的起始材料的制備方法不用動物產品。這減少了以后為任何流行病傳染負責的風險，而且保護了用于制備API的原料的供應鏈。
為研究羧酸酯的對映選擇性水解過程，限制了商業上可獲得的酯酶的范圍。大多數來自動物源，例如，豬肝酯酶(PLE)。最近報道嘗試在異源細菌宿主中產生重組的PLE(WO 2004/055177)。然而，由于天生PLE制劑的選擇性可能得自衍生于動物的產品中存在的異構體的特定組合，這種人工酯酶對于給定反應并不是一直具有所希望的選擇性。
Politino等人(Appl Environ Microbiol.1997 63(12)4807-11；US5869309)描述了紅冬孢酵母作為頭孢霉菌素酯酶的來源的應用，其用于某些頭孢霉菌素的3′-乙酰基的水解。
發明概述本發明提供一種用于制備為富含對映體的形式的通式(1)的化合物的新型方法，該方法包括用來自非哺乳動物源的并且具有酯酶或脂肪酶活性的酶催化將相應的外消旋化合物(2)選擇性水解，其中R是甲基或C2-10線性或支化烷基。化合物(1)是制備藥物阿利克侖的關鍵中間體。
發明詳述在通式(1)和(2)的化合物中，R是甲基或C2-10線性或支化烷基，優選為甲基或C2-6線性烷基。更優選R是甲基，最優選R是甲基。本發明的生物溶解方法可以按照兩種方案中的一種進行。優選，酶選擇性地水解化合物(1)的相反的對映異構體，未反應的化合物(1)以富含對映體的形式回收。為獲得(1)的最佳對映純度，進行該方法直到達到至少50％的基質轉化。或者，酶選擇性地水解化合物(1)，在基質轉換率超過50％之前終止反應。將獲得的羧酸再酯化以獲得為富含對映體的形式的化合物(1)。本領域技術人員能夠意識到這種生物溶解方法能夠適用于非水解模式的操作，例如，其中羧酸通過分別與醇或酯反應進行酶酯化或酯交換反應。
本發明的區別性特征是使用來自非哺乳動物源的酶。非哺乳動物源通常是微生物，其可以是酵母、真菌或細菌。酶可以是野生類型的酶、野生類型的酶的重組形式或轉基因的酶，其中的每一種的形式可以是完整的細胞、凍干的完整的細胞、無細胞的酶制劑或至少部分純化的分離的酶，其任選地可以被固定。適用于本發明的方法的酶是E值為至少5的那些。優選，酶顯示出更高的E值，為至少15，更優選至少30。本發明的方法中的體積產率是另一個重要的因素。在反應混合物中集聚的最終產物的濃度優選至少為3g/L。優選，最終產物濃度為至少5g/L，更優選至少20g/L。
為確定合適的酶，我們的方法是從我們的微生物和酶收集庫中篩選微生物源的催化劑。從大約150種酵母和真菌和700多種其他的微生物中的廣泛研究中，發現只有兩種能夠選擇性水解外消旋酯(2)的分離菌。這種基質的抗性被如下事實強調除了用PIE，我們不能確定開放市場上和在我們的處理下所獲得的酯酶和脂肪酶的活性。
在本發明的一個實施方案中，酶的非哺乳動物源是酵母，其可以選自紅色冬孢酵母屬，優選的種類是紅冬孢酵母。這些有機體已顯示出生長連鎖方式的活性。活性在pH約8時最佳。典型地，這種生物催化劑激活的方法顯示出在25℃過夜培養后約60％的基質轉化率，其中初始基質濃度為約5g/L或更高。更特別地，下列酵母的菌株含有一種或多種具有酯酶或脂肪酶活性的酶，其能夠通過對映選擇性水解外消旋酯(2)來制備酯(1)。
紅冬孢酵母菌株CMC 103105在2004年7月28日存放在NCIMBLimited，分配給其臨時接受號41238；紅冬孢酵母CMC 103107在2004年7月28日存放在NCIMBLimited，分配給其臨時接受號41239。
在本發明的另一個實施方案中，酶的非哺乳動物源是選自長喙(ophiostoma)屬的真菌。優選的種類是榆樹長喙殼菌(ophiostomanovoulmi)。獲自這種真菌的酯酶已顯示出在用于例如納普羅森和(S)-酮洛芬的洛芬藥物的制備中的羧酸酯的生物水解中的應用。這進一步描述于US5912164中，在此并入其內容作為參考。
用下列實施例進一步說明本發明。
實施例1用于篩選的有機體的制備酵母在500ml錐形燒瓶中的100ml酵母麥芽浸膏瓊脂中在25℃下生長24～48小時。將其在再次懸浮在一半原始培養液C(在磷酸酯緩沖的鹽水中的10體積％的甘油)之前離心收集，并在-80℃下儲存。
實施例2篩選生物催化劑(完整細胞和分離的酶)初始篩選在0.1M磷酸酯緩沖液pH7+0.1％w/v吐溫80中用5g/l的外消旋甲基5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸酯進行。典型地將200μl加入到來自0.5ml培養液或1mg酶的凍干細胞中。在用乙腈稀釋和通過氣相色譜用Chirasil dex CB column分析之前，將反應物培養2天。確定紅冬孢酵母CMC 103105和紅冬孢酵母CMC 103107具有所期望的活性，顯示出在7～8％的基質轉化后7％ee的未反應的酯。
實施例3酵母生長和活性確定酵母在包含在500ml錐形燒瓶中的100ml酵母麥芽浸膏瓊脂中在25℃下從甘油原料中生長。用離心收集細胞為10,000g。然后將來自40ml培養液的球狀物再次懸浮在5ml的磷酸酯緩沖鹽水中。將0.5ml再次懸浮的細胞加入到0.5ml的磷酸酯緩沖的鹽水中的0.1％吐溫80的5g/l Synthon B中，并在30℃過夜培養。確定紅冬孢酵母CMC 103105具有所期望的活性，在過夜反應后獲得單對映體(S)-甲基5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸酯，表觀E值為28。進行類似的反應以確定描述于US5912164中的洛芬酯酶的活性。為該目的，重組的E.coli的生長介質為加入異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷和安匹西林的胰胨大豆瓊脂。
實施例4紅冬孢酵母CMC 103105的發酵批次發酵以2和201的規模進行，均使用用0.1％聚丙二醇防沫劑補充的酵母麥芽浸膏。不進行pH控制。使用單個小瓶的甘油原料來接種100ml的YM瓊脂。在24小時的生長之后其用于提供給發酵桶0.5％v/v的接種體。在24小時的生長之后，離心收集細胞，并在使用之前在-20℃下保存。
實施例5在基質和生物催化劑的不同濃度下的外消旋(rac)-甲基5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸酯的水解i)濃度為8g/l的外消旋-甲基5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸酯在與濃度為5％w/v的紅冬孢酵母CMC 103105的凍干細胞反應24小時后進行水解，獲得為＞99％ee(GC分析)的(S)-甲基5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸酯。計算該反應的E值為41.3。該反應的反應緩沖液為Tris-HCl(0.1M，pH8.0)。通過加入含水氫氧化鈉(1M)將反應pH維持在pH8.0。在劇烈攪拌下在21℃進行該反應。
ii)濃度為15g/l的外消旋-甲基5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸酯在與負載為5％w/v的紅冬孢酵母CMC 103105的凍干細胞反應18小時后進行水解，獲得為＞99％ee(GC分析)的(S)-甲基5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸酯。計算該反應的E值為23。反應緩沖液為Tris-HCl(0.1M，pH8.0)。通過加入含水氫氧化鈉(1M)將反應pH維持在pH8.0。在劇烈攪拌下在21℃進行該反應。
iii)濃度為50g/l的外消旋-甲基5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸酯在與紅冬孢酵母CMC 3105的凍干細胞(15％w/v)反應95小時后進行水解，獲得為＞99％ee(GC分析)的(S)-甲基5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸酯。反應緩沖液為Tris-HCl(0.1M，pH8.0)。通過加入含水氫氧化鈉(1M)將反應pH維持在pH8.0。在劇烈攪拌下在21℃進行該反應。
實施例6外消旋-甲基5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸酯的制備規模水解向在20℃的外消旋-甲基5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸酯(80.0g，0.41摩爾)和0.1M的Tris.HCl pH8.0(9.4L)的攪拌混合物中加入紅冬孢酵母CMC 103105的凍干細胞(620g)。通過加入1.0M的NaOH將反應pH維持在8.0。當通過GC確定的剩余S-異構體的對映過量為＞98％時，通過用6M HCl酸化至pH2.5將反應終止，并離心獲得15000g。將獲得的細胞球狀物再次懸浮在MeCN(1.5L)中，攪拌30分鐘，用硅藻土過濾。將濾出液真空濃縮，再溶解在MTBE(1L)中。用飽和的含水NaHCO3(2×750mL)洗滌該溶液。將有機相合并，用飽和鹽水(500mL)洗滌。在用CH2Cl2洗滌鹽水后，將所有的有機相合并，用MgSO4干燥，并真空濃縮以制得棕色油，其可以通過在存在MTBE(250mL)中的活性碳(7.5g)的情況下回流脫色。在冷卻和用硅藻土過濾之后，真空濃縮獲得淺黃色的油(33.37g)。NMR顯示該物質包含約15％的羧酸。其通過在MTBE(250mL)中再溶解和用飽和的含水NaHCO3(3×125mL)洗滌除去。將有機相干燥(MgSO4)并真空濃縮獲得為淺黃色的油的(S)-甲基5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸酯(27.38g，34％產率)。該物質在真空下進行兩次蒸餾以獲得為無色油的(S)-甲基5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸酯(11.60g，ee 99.3％，98.4％純度)。
實施例7長喙酯酶的比較一系列與重組長喙相關的酯酶的生長和活性確定如實施例3中進行。三個相關的酶顯示出對選擇性水解外消旋酯(2)的不同的能力；包括重組的酮洛芬酯酶CMC104131(E＝4.31，24小時內的轉換率為23％)、納普羅森酯酶CMC104432(E＝1.1，24小時內的轉換率為45％)和上述的無活性的溜曲霉CMC104383(WO 9904015)。這三種酯酶顯示出明顯不同的選擇性，但僅在三個氨基酸上不同。
權利要求
1.一種用于制備為富含對映體的形式的通式(1)的化合物的方法，其包括用來自非哺乳動物源的并且具有酯酶或脂肪酶活性的酶催化將相應的外消旋化合物(2)選擇性水解，其中R是甲基或C2-10線性或支化烷基。
2.根據權利要求1所述的方法，其中R是甲基或C2-6線性烷基。
3.根據權利要求2所述的方法，其中R是甲基或乙基。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述酶選擇性地水解化合物(1)的相反的對映異構體，未反應的化合物(1)以富含對映體的形式回收。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述酶選擇性地水解化合物(1)，將獲得的羧酸再酯化以獲得為富含對映體的形式的化合物(1)。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述酶是野生類型的酶、野生類型的酶的重組形式或轉基因的酶。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述酶的形式是完整的細胞、凍干的完整的細胞、無細胞的酶制劑或至少部分純化的分離的酶，其任選地被固定。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所述非哺乳動物源是選自酵母、真菌或細菌的微生物。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述非哺乳動物源是來自紅色冬孢酵母屬的酵母。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述酵母是紅冬孢酵母。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述酵母是紅冬孢酵母CMC 103105或CMC 103107。
12.根據權利要求8所述的方法，其中所述非哺乳動物源是來自長喙屬的真菌。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述真菌是榆樹長喙殼菌。
14.根據權利要求1所述的方法，其中獲得對應于至少5的E值的對映選擇性。
15.根據權利要求13所述的方法，其中獲得對應于至少15的E值的對映選擇性。
16.根據權利要求1所述的方法，其中最終產物濃度優先至少是3g/l。
17.根據權利要求15所述的方法，其中最終產物濃度至少是5g/l。
18.根據權利要求16所述的方法，其中最終產物濃度至少是20g/l。
19.一種酵母菌株，其基本具有紅冬孢酵母CMC 103105或CMC103107的特征。
全文摘要
一種用于制備為富含對映體的形式的通式(1)的化合物的方法，其包括用來自非哺乳動物源的并且具有酯酶或脂肪酶活性的酶催化將相應的外消旋化合物(2)選擇性水解，其中R是甲基或C
文檔編號C12P7/62GK1993476SQ200580026782
公開日2007年7月4日 申請日期2005年7月28日 優先權日2004年8月11日
發明者I·N·泰勒 申請人:陶氏環球技術公司