專利名稱：包括酶消化步驟的提取dna的方法
技術領域：
本發明涉及從植物材料開始(更特別地從藻類開始)提取DNA的方法，所獲得的DNA準備通過PCR進行擴增或者被提取以便大量使用。
本發明可以應用于不同的工業領域，尤其是化妝品工業或生物技術工業(通過改進應用于從植物中和特別是從藻類中提取的DNA的聚合酶鏈式反應(PCR)方法)。
在提取DNA的技術領域中，為了分析或再生植物物種的目的，優選對原生質體進行操作。
這些原生質體的產生要求酶促水解細胞壁，從而使得能夠更容易地抽提或標記在原生質體的細胞核中含有的DNA。
另外，在分析和/或再生植物物種的情況中，尋求在原生質體的產生過程中保持細胞的生存力，特別是當為了最終產生出完整植物時。
酶促水解細胞壁從而產生原生質體(特別是藻類)的操作條件通常如下(例如Araki等人，1998.Journal of Marine Biotechnology，6193-197)-在一般含有蛋白酶(例如木瓜蛋白酶)、滲透劑(甘露醇)和其中pH調節至7.5的緩沖液MES的介質中進行酶預處理；-由酶混合物(離析酶、纖維素酶...)、滲透劑和其中pH調節至6.5的緩沖液MES所構成的酶浸解(macération)(或細胞壁的酶促水解)；溫育的最佳條件是2小時30分鐘的持續時間和22℃的溫度。
不過，這樣的操作條件明顯地用于實驗性的應用和保持脫去細胞壁的細胞的生存力。
另一種提取技術采用研碎植物材料特別是藻類以提取DNA這樣的操作。該提取技術受到壁中存在的多糖的限制，所述多糖減少所提取的DNA的溶解度和/或阻礙為了通過PCR技術來擴增DNA的TAQ聚合酶的正確結合。
因此，本發明的目標尤其是緩解現有技術的不便之處。
更準確地，本發明的目標是提出一種提取DNA的方法，其使得能夠提供適合于工業規模的數量。
本發明的目標還在于提供概念簡單和實施容易的這樣的方法。
這些目標以及后來出現的其他目標由于本發明而達到，本發明的目標是提取植物材料的DNA的方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟-在大約5至大約7的pH以及大約35℃至40℃的溫度下用酶浸解所述植物材料；-離心經浸解的所述植物材料的提取物，以獲得含有所述植物材料的DNA的沉淀；-提取在所述沉淀中含有的所述植物材料的所述DNA；-純化所述DNA的步驟；-擴增所述DNA的步驟。
以這樣的方式，酶浸解技術和特殊操作條件的組合使得能夠想到以比現有技術方法的收率明顯高的收率提取DNA。
因為，細胞壁的降解和由這些操作條件引起的細胞的破裂使得能夠提取比用已知方法大得多的量的DNA。
當然，這樣的方法屬于基本上不同于現有技術的方法，因為其導致細胞的破壞，而同時原生質體的產生是以保持細胞的生存力為目標的。
而且，酶浸解步驟避免了DNA被多糖污染，所述多糖能夠限制聚合酶的結合。
因此，擴增步驟能夠以非常高的收率來進行。
有利地，所述提取步驟如此進行將所述沉淀溶解在pH為大約8的鹽水緩沖液中，并用苯酚(phenol)/氯仿/異戊醇(isoamyl)(25∶24∶1v/v/v)處理。
優選地，所述純化步驟通過用異丙醇沉淀來進行。
根據一個有利的應用，該方法用于提取藻類的DNA。
將會注意到，本發明的方法還可以應用于其他植物材料，例如也含有限制PCR(聚合酶鏈式反應)的多糖的陸生植物。
根據第一個特殊的應用，該方法用于提取掌形藻屬(Palmaria)的紅藻的DNA，所述酶浸解步驟借助于含有木聚糖酶和纖維素酶的混合物的溶液來進行。
根據第二個特殊的應用，該方法用于提取江蘺屬(Gracilaria)的紅藻的DNA，所述酶浸解步驟借助于含有葡聚糖酶和纖維素酶的混合物的溶液來進行。
當然，通過選擇合適的酶，本發明還可以應用于所有屬于紅藻(例如紫球藻屬物種(Porphyridium sp))、綠藻(例如石莼屬物種(Ulvasp)、滸苔屬物種(Enteromorpha sp))或褐藻(例如墨角藻屬物種(Fucus sp)、囊葉藻屬物種(Ascophyllum sp))這些類群的其他藻類(大型藻類和顯微藻類)。
根據一個有利的解決方案，所述纖維素酶為纖維二糖酶(celluclast)。
在前述第一種應用的情況下，所述木聚糖酶優選為Shearzym。
在前述第二種應用的情況下，所述葡聚糖酶優選為Finizym。
根據一個優選的實施方案，所述酶浸解步驟以大約6小時至大約12小時的持續時間來進行。
這樣的持續時間使得能夠獲得細胞的充分破裂以及多糖的完全或幾乎完全的降解。
根據下文中關于兩個作為示例性而非限制性實施例提供的本發明實施變化形式的描述，并參考唯一的附圖，本發明的其他特征和優點將會更清楚地顯現出來。
正如所已經描述的，本發明的原理在于將步驟和操作條件結合在一起，所述操作條件能夠增加DNA提取的收率和DNA擴增的收率。
也就是說，本發明使得能夠
-通過酶促水解藻類的細胞壁而改善DNA提取的收率；-通過酶促降解污染藻類DNA的多糖而改善該DNA的聚合反應(經PCR)。
使用作為藻類DNA的預處理的酶浸解這一過程(提取DNA、去除限制例如TAQ聚合酶的結合的多糖)，以及pH(5至7)和溫度(35℃至40℃)條件對于獲得該結果是特別具有決定性的。
希望的應用例如為使用該方法用于為了化妝品目的而獲得藻類DNA(例如滋潤性活性成分...)等。
在本發明方法的范圍內，下文中描述將針對下述內容來進行使用降解屬于掌形藻屬和江蘺屬的紅藻(紅藻類)的細胞壁的酶(木聚糖酶、纖維素酶或葡聚糖酶)，以改善DNA的提取和其經PCR(聚合酶鏈式反應)的擴增。
該技術方案如下。
將屬于掌形藻屬或江蘺屬的藻類例如掌形藻(Palmaria palmata)(Dulse)或江蘺(Gracilaria verrucosa)(Ogonori)在酶溶液存在下進行浸解，對于每種藻類所述酶溶液中的組成如下-對于江蘺，葡聚糖酶(例如Finizym novo)和纖維素酶(例如Celluclast novo)的混合物；-對于掌形藻，木聚糖酶(例如Shearzyme novo)和纖維素酶(Celluclast novo)的混合物。
可應用于這兩種藻類的浸解操作條件(最低和最佳)在下面描述，浸解進行的持續時間可以為6小時至12小時。所使用的酶的量取決于待處理的藻類的重量。其表示為單位/g藻類(U/g)。作為參考，一個單位U相當于能夠在40℃的溫度下于1分鐘內釋放出1mol糖的酶的量。
對于每種藻類的水解的最佳條件描述在下表中掌形藻
江蘺
還在相同條件下進行沒有酶的溫育，以作為用于評價酶浸解方法的相對效用的對照。
通過測量在260nm處的吸光度來測定DNA的量。其純度通過該比例來評價Abs 260/Abs 280nm。
參考
圖1，在浸解步驟(步驟1)之后是離心步驟(步驟2)，其參數為10,000g至20,000g。
在離心步驟結束后，一方面得到其中含有寡糖的上清液，另一方面得到含有經浸解的植物材料的DNA的沉淀，對所述沉淀進行提取步驟(步驟3)，然后進行純化步驟(步驟4)。
提取步驟通過如下方式進行溶解在pH 8的鹽水緩沖液中，并用苯酚/氯仿混合物處理在離心步驟結束后獲得的沉淀。純化步驟通過用異丙醇沉淀來進行。
下表提供了關于掌形藻的DNA提取的比較，其比較了傳統方法(在經緩沖的介質中研碎藻類)和本發明的方法(不研碎，而是在木聚糖酶(在該情況下為Shearzyme)和纖維素酶(在該情況下為Celluclast)存在下進行溫育)。
掌形藻
因此注意到，對于掌形藻，相對于傳統方法來說，本發明的方法使得能夠獲得DNA回收的41％的增益。
下表提供了關于江蘺的DNA提取的比較，其比較了傳統方法(在經緩沖的介質中研碎藻類)和本發明的方法(不研碎，而是在葡聚糖酶(在該情況下為Finizym)和纖維素酶(在該情況下為Celluclast)存在下進行溫育)。
江蘺
因此注意到，對于江蘺，相對于傳統方法來說，本發明的方法使得能夠獲得DNA回收的20％的增益。
然后將如此提取的DNA進行擴增步驟(圖1中的步驟5)。
正如所已經描述的，酶浸解步驟使得能夠進行掌形藻和江蘺的DNA的擴增，這是由于酶促水解了污染DNA并阻礙用于擴增的聚合酶(例如TAQ聚合酶)結合至DNA上的多糖(木聚糖或葡聚糖，或者瓊脂或纖維素)。
對于屬于硅藻類群的顯微藻類也可以觀察到該結果，并且看來可以移用于所有這樣的大型藻類和顯微藻類，即對于這些藻類來說，通過PCR進行的DNA擴增受限于多糖在該DNA上的結合。
權利要求
1.提取植物材料的DNA的方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟-在大約5至大約7的pH以及大約35℃至40℃的溫度下用酶浸解所述植物材料；-離心經浸解的所述植物材料的提取物，以獲得含有所述植物材料的DNA的沉淀；-提取在所述沉淀中含有的所述植物材料的所述DNA；-純化步驟；-擴增所述DNA的步驟。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述提取步驟通過將所述沉淀溶解在pH為大約8的鹽水緩沖液中，并用氯仿/苯酚/異戊醇處理來進行。
3.根據權利要求1和2中任一項的方法，其特征在于，所述純化步驟通過用異丙醇沉淀來進行。
4.根據權利要求1-3中任一項的方法，其特征在于，所述方法用于提取藻類DNA。
5.根據權利要求4的方法，其特征在于，所述方法用于提取掌形藻屬(Palmaria)的紅藻的DNA，所述酶浸解步驟借助于含有木聚糖酶和纖維素酶的混合物的溶液來進行。
6.根據權利要求4的方法，其特征在于，所述方法用于提取江蘺屬(Gracilaria)的紅藻的DNA，所述酶浸解步驟借助于含有葡聚糖酶和纖維素酶的混合物的溶液來進行。
7.根據權利要求5和6中任一項的方法，其特征在于，所述纖維素酶為纖維二糖酶。
8.根據權利要求5和7中任一項的方法，其特征在于，所述木聚糖酶為Shearzym。
9.根據權利要求6和7中任一項的方法，其特征在于，所述葡聚糖酶為Finizym。
10.根據權利要求1-9中任一項的方法，其特征在于，所述酶浸解步驟以大約6小時至大約12小時的持續時間來進行。
全文摘要
本發明涉及提取植物材料的DNA的方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟在大約5至大約7的pH以及大約35℃至40℃的溫度下用酶浸解所述植物材料；離心經浸解的所述植物材料的提取物，以獲得含有所述植物材料的DNA的沉淀；提取在所述沉淀中含有的所述植物材料的所述DNA；純化所述DNA的步驟；擴增所述DNA的步驟。
文檔編號C12P19/34GK1993465SQ200580024764
公開日2007年7月4日 申請日期2005年6月16日 優先權日2004年6月30日
發明者J·弗勒朗斯, Y·茹貝爾 申請人:南特大學