應用順式作用核酶對轉錄進行調節的制作方法

專利名稱：應用順式作用核酶對轉錄進行調節的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學和重組DNA技術領域。更具體地，提供了可以產生能夠自我切割以限制轉錄物的大小和內容的重組DNA構建物。因而，本發明提供了制備這種構建物的方法以及應用這種構建物產生預定大小的轉錄物的方法。本發明特別有利于限制聚腺苷酸化信號后的轉錄連讀長度。本發明可以被用于轉錄和/或翻譯任何已知的核苷酸序列。
背景技術：
由于DNA或RNA質粒或載體的環狀性質，以及在質粒上通常存在一個以上包括啟動子和待被轉錄的核苷酸序列的轉錄單位，任何一個啟動子引起的轉錄可以潛在地產生比所期望的要長的多順反子信使RNA。例如，如果啟動子下游的核苷酸序列編碼蛋白質，則該蛋白質的表達水平會受到影響。此外，不正確的信息可能充當產生可復制病毒的潛在底物，例如，在反轉錄期間通過基于RNA的重組事件所進行的。
因此，利用其中轉錄連讀被防止或減弱的質粒是有優勢的。
在制備轉基因動物時，常常產生與轉錄連讀有關的問題。在轉基因動物的基因組中已經插入了一個基因或幾個基因，其中意圖研究所述一個基因或幾個基因的影響。通常地，第一基因被表達，然后在不同的時間點，第二基因被表達，其對第一基因具有影響。為了幫助插入到動物的細胞和基因組中，這些基因被放置在載體中。通常，在載體中，第一基因被放置在第二基因的下游。雖然第一基因中可以具有作為其核苷酸序列的一部分的切割信號，但是通常地，一旦第一基因被轉錄，RNA聚合酶閱讀通過切割信號并轉錄第二基因。如果發生了這種連讀轉錄，則第一基因和第二基因都可能被轉錄，這就阻礙了在不存在第二基因表達的情況下欲被研究的第一基因的效應。
因此，創建其中第一基因和第二基因之間的連讀轉錄被防止的質粒，將是有優勢的。
最后，在試圖生產大量的反轉錄病毒載體，以便利用這些載體作為研究工具和/或疾病預防和/或治療工具時，載體的產量常常低下。這些低下的產量可能歸因于含有包裝所述病毒所需的全部必須核苷酸序列的三種不同載體之間的競爭/干擾。應用三種不同的載體使反轉錄病毒“處于控制中(in check)”，這阻礙了任一載體獲得全部的必須組分，成為可復制型載體。此外，制備這三種不同的載體通常成本高且費時。
因此，得到僅含有兩個載體的反轉錄病毒載體生產系統是有優勢的，所述系統中的每個載體都不能成為可復制載體。此外，雙質粒生產降低了質粒生產成本，這可能在工業規模中是明顯的。為了得到雙載體系統，來自三個載體中的兩個載體的組分將必須合并在一個載體中。因此，為確保不存在從一組組分向先前隔離在不同載體上的另一組組分的轉錄連讀的一種方法是在兩組組分之間插入核酶，因而為實現所有功能目的，制備含有兩個轉錄單位的單個質粒，其在安全性方面如同兩個單獨的質粒一樣有效運轉，同時維持雙質粒生產系統的成本優勢和效率優勢。因而，雙質粒系統會導致反轉錄載體的產量較高，并例如降低維持三質粒系統的總成本。
核酶是具有催化活性的小RNA。取決于核酶的性質，這些小RNA的大小范圍是從40個核苷酸至2600個核苷酸。核酶是天然發生的，并被認為它是在蛋白質形成之前催化化學反應的最早的酶。
存在順式作用核酶和反式作用核酶。順式作用核酶可以對鄰近、接近或遠離其位置的目標RNA起作用。錘頭型、丁型肝炎病毒(HDV)，發夾型、Varkud satellite(VS)、I組內含子和II組內含子是各種類型的順式作用核酶的例子(Doudna，J.and Cech，T.，Nature，418222-228(2002))。
核酶切割是位點特異性的，并且是由目標區域的互補堿基之間的氫鍵介導的。核酶的催化單位通過促進原子置換介導切割，這引起目標RNA骨架斷裂。
根據現有的知識，在其天然環境中，核酶反應是不可逆的。因此，核酶能夠引起獨特位置的永久切割。

發明內容
本發明提供了制備產生預定大小的RNA轉錄物的轉錄單位的方法，這通過將編碼順式作用核酶的序列引入所述轉錄單位的非編碼區域實施，因而所述轉錄單位轉錄為RNA分子包括產生核酶。一旦核酶產生，其可以順式發揮作用，在用于切割的核酶識別位點切割RNA轉錄物，以限制RNA的大小。本發明因此提供了重組DNA構建物，其可以被轉錄產生能夠自我切割以限制自身大小的RNA轉錄物。這提供了控制轉錄物的內容以使得能夠調節不期望的效應如轉錄連讀的能力。
本發明的轉錄單位是重組DNA構建物，其包括調節轉錄的序列，如一個或多個啟動子，以及可以在所述啟動子的調控下被轉錄的序列。可以被轉錄的序列可以編碼感興趣的多肽或不編碼任何多肽。轉錄單位也可以含有非編碼序列，例如，如3’非翻譯序列、聚腺苷酸化信號、中止位點(pause site)、強中止位點(strong pause site)、或近端上游(NUE)序列(near upstream sequence)。
雖然本發明提供了通過將編碼順式作用核酶的序列引入編碼序列或非編碼序列中而將所述序列插入轉錄單位，這可以利用多種方法來實現，包括插入到已經可操作地連接到調節序列的編碼序列或非編碼序列中，或者在編碼序列或非編碼序列可操作地連接到調節序列之前將其插入到編碼序列或非編碼序列中。編碼順式作用核酶的序列僅需要位于轉錄單位中調節序列的下游或3’端，因而一旦所述單位轉錄產生RNA，就可以產生核酶。編碼順式作用核酶的序列甚至可以位于切割信號下游，例如，在真核轉錄單位情況下存在的聚腺苷酸化信號的下游。然而，本發明也包括不含有聚腺苷酸化信號的原核轉錄單位。
本發明的構建物可以被認為是重組體，原因是它們不是自然界天然發生的。優選地，編碼順式作用核酶的序列被導入核酶通常不是天然存在的異源編碼序列或非編碼序列中。
因此，本發明使得能夠應用編碼順式作用核酶的序列來調節編碼各種多肽的RNA轉錄物的大小。在本發明的一個方面，多肽是病毒如慢病毒(lentivirus)或HIV的多肽。在本發明的另一方面，多肽對于病毒復制和/或傳播是必須的，如病毒包膜蛋白。然而，本發明不受被編碼的多肽的類型所限。事實上，如果需要，本發明可以在不編碼任何多肽的轉錄單位的情況下實施。
相似地，本發明不受所應用的順式核酶的來源、身份或類型的限制。可以應用各種這樣的核酶，非限制性例子包括錘頭型、丁型肝炎病毒、發夾型、Varkud satellite(VS)、I組內含子和II組內含子。D.B.McKay and J.E.Wedekind，The RNA World 265-286(R.F.Gesteland，T.R.Cech，J.F.Atkins，eds.，CSH Laboratory Press 1999)中描述了順式作用核酶。Burke，J.M.，Biochemical Soc.Trans.，301116-1119(2002)中描述了發夾型核酶和錘頭型核酶。實施本發明的優選順式作用核酶是煙草環斑病毒(sTobRV)衛星RNA的順式作用核酶。Haseloff，J.and Gerlach，W.L.，Gene，8243-52(1989)中描述了煙草環斑病毒的衛星RNA。
本發明作為限制從轉錄單位產生的RNA轉錄物的大小的方法特別具有優勢。同樣地，其在功能上與真核轉錄單位中的聚腺苷酸化信號略有相似，原因是如同聚腺苷酸化信號，核酶引起RNA轉錄物的切割，并因而限制其大小。當本發明的轉錄單位處于其中編碼順式作用核酶的序列被轉錄的條件下時，本發明的轉錄單位中發生上述情況。同樣地，可以應用本發明在原核轉錄單位中提供類似聚腺苷酸化信號的切割功能。
在編碼順式作用核酶的序列位于切割信號，例如聚腺苷酸化信號的下游時，聚腺苷酸化信號指導的切割可能阻止編碼核酶的序列的轉錄。但是在這種情況下，可以將編碼順式作用核酶的序列考慮為轉錄單位中的第二切割信號，以便在不發生聚腺苷酸化信號指導的切割的情況下確保切割。
在不期望發生轉錄連讀的多順反子DNA構建物的情況下，限制RNA轉錄物大小的能力特別具有優勢。在較長的轉錄物增加與另一序列發生重組的可能性的情況下，限制RNA轉錄物大小的能力也具有優勢。
在兩個或更多個轉錄單位之間存在有編碼核酶的核苷酸序列在防止轉錄連讀中將是有用的。此外，在單個轉錄單位末端存在編碼核酶的核苷酸序列也是有優勢的，因為在轉錄單位中存在的切割信號未完全起作用的情況下，核酶可以起備份(back up)的作用。
用于隔開轉錄單位的順式作用核酶的一個益處是，通過降低產生可復制病毒的重組的概率來提高雙質粒病毒載體生產系統的安全性。為了產生雙載體系統，來自三個載體中的兩個載體的組分必須合并到一個載體中。因而，確保不發生從一組組分到以前分隔在不同載體上的另一組組分的連讀轉錄的一個方法是，在兩組組分之間插入核酶。雙質粒系統在載體之間具有較小的干擾，原因是其少了一個載體，這引起反轉錄病毒載體更有效地生產。
與應用三質粒病毒載體生產系統相比，大規模的雙質粒病毒載體生產花費較少并產生更高的載體滴度。因此，將順式作用核酶整合入雙質粒病毒載體生產系統可以在生產中表現出顯著的優勢。
在三質粒病毒載體生產中，含有有效負載(payload)的載體被放置在一個質粒(載體質粒)上、結構基因被放置在第二質粒(輔助質粒)上，非結構基因被放置在第三質粒(另一輔助質粒)上。可選地，結構基因和非結構基因被放置在第二質粒上，包膜基因被放置在第三質粒上。在第二質粒上并入順式作用核酶，在功能上允許單個質粒合而為一起第二質粒和第三質粒的作用。因此，例如，通過將順式作用核酶插入結構基因和非結構基因之間，不僅防止了連讀轉錄的風險，而且順式作用核酶的并入使得兩個輔助質粒合并進單個輔助質粒中。
特別地，順式作用核酶的并入導致被該核酶隔開的RNA轉錄物迅速切割。這確保從載體質粒轉錄的RNA與從含有順式作用核酶的輔助質粒轉錄的RNA之一之間的單個重組事件不形成可復制病毒。在反轉錄期間可能發生這樣的重組，此時聚合酶通常在包封在顆粒中的RNA之間跳躍，產生含有來自兩個RNA的基因的互補DNA序列。因此，在雙質粒系統中，將順式作用核酶整合入區分結構基因和非結構基因的單一質粒中提供了與三質粒系統相同的安全性，并使得在大規模水平具有滴度更高和生產成本更低的附加益處。
有效負載可以是，例如，反義分子、RNA誘餌(RNA decoy)、反式顯性突變體、毒素、針對病毒結構蛋白的單鏈抗體(scAb)、siRNA或核酶。
結構基因可以是，例如，gag、gag-pol前體、pro、反轉錄酶(RT)、整合酶(In)或env。非結構基因可以是，例如，tat、rev、nef、vpr、vpu或vif。
順式作用核酶的體內治療應用使得能夠用輔助質粒和載體質粒共轉導細胞，以便輔助質粒的轉錄是可誘導的并引起載體質粒的表達和增殖，而沒有產生可復制病毒的高風險。例如，可以用輔助SIN載體轉導細胞，所述SIN載體自身不能復制，但是當受到啟動子的特異性活化時，可以使含有功能性LTRs的可移動載體質粒增殖。輔助SIN載體可以含有必要的結構基因和非結構基因，它們由編碼順式作用核酶的序列分隔開。這相對于應用兩個輔助質粒是一個改進，原因有幾個。首先，應用兩個質粒而不是三個質粒時，用輔助質粒和載體的給定的目標比率對目標細胞進行轉導更加容易實現。第二，如果輔助基因在相同的誘導型啟動子之下各自表達，對輔助質粒表達的控制更容易調節。
抗病毒劑(antiviral)、或抗載體劑(antivector)、反義分子或核酶也可以被保留在載體包裝系統的輔助質粒組分上。這可以充當用于載體包裝以降低可復制慢病毒(RCL)潛在產生的安全機制。抗病毒或抗載體序列將靶向于載體基因組中存在的序列，但是不表達為能夠阻滯細胞中的生產性載體包裝的單獨轉錄物。抗病毒或抗載體序列將預期阻礙含有輔助質粒的拷貝和載體基因組的拷貝的載體顆粒的繁殖，而不是通常見于載體顆粒中的載體基因組RNA雙鏈體。不含有包裝信號的合適大小核酸序列的非特異性包裝已經被描述，并且已知其以低頻率發生。因此，這種設計對于反轉錄病毒生產的安全性具有重要含意。
順式作用核酶也可以幫助產生轉基因動物，例如小鼠。與上述相似地，可以用順式作用核酶隔開在欲導入小鼠的轉基因構建物中表達的轉錄物。例如，應用插入在質粒的第一基因末端和轉錄第二基因的啟動子之間的核酶是有利的。作為非限制性例子，這在被表達用于研究的基因是顯性失活的感興趣基因時是有用的。在同一轉錄物上表達的是可以將顯性失活轉基因轉變成功能基因的第二基因。轉錄物的有效分隔對于小鼠表型的成功分析是至關重要的，因為如果發生連讀將顯性失活轉變成功能基因，那么表型會被掩蓋。在歷史上，中止位點、強中止位點和聚腺苷酸信號已被用于實現這一目標。然而，如提供的例子的結果所示地，這些終止信號以低下的水平不充分地防止連讀發生。因此，在制備轉基因小鼠以確定基因功能時，在這些位點之外應用順式作用核酶，或用順式作用核酶替換這些位點，可以確保獲得更大的成功。
本發明的一個方面是制備能夠產生預定大小RNA轉錄物的重組轉錄單位的方法，包括可操作地連接調節序列和含有轉錄區域的核苷酸序列，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述調節序列的調控，其中轉錄區域包括編碼病毒序列的區域和位于編碼所述病毒序列的區域下游的非編碼區域，其中所述非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。
非編碼區域還可以包括編碼切割信號的核苷酸序列，其位于編碼順式作用核酶的核苷酸序列的上游。
病毒序列可以是，例如，病毒蛋白。病毒蛋白可以是，例如，由慢病毒編碼的蛋白或病毒包膜蛋白。病毒蛋白可以是，例如，VSV-G、gag、pol、tat或rev，或VSV-G、gag、pol、tat和rev的任何組合。
病毒序列還可以包括編碼抗病毒劑的核苷酸序列，位于編碼病毒蛋白的核苷酸序列的上游或下游。抗病毒劑可以是，例如，反義分子或核酶。
本發明的另一方面是包括能夠產生預定大小的RNA轉錄物的重組轉錄單位的宿主細胞，其中的轉錄單位包括與含有轉錄區域的核苷酸序列可操作連接的調節序列，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述調節序列的調控，其中的轉錄區域包括編碼病毒序列的區域和位于編碼所述病毒序列的區域下游的非編碼區域，其中所述非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。非編碼區域還可以包括編碼切割信號的核苷酸序列，其位于編碼順式作用核酶的核苷酸序列的上游。
本發明的又一方面是能夠產生預定大小的RNA轉錄物的重組轉錄單位，其包括與核苷酸序列可操作連接的調節序列，所述核苷酸序列包括編碼病毒序列的轉錄區域和位于編碼所述病毒序列的區域下游的非編碼區域，其中所述非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。非編碼區域還可以包括編碼切割信號的核苷酸序列，其位于編碼順式作用核酶的核苷酸序列的上游。
轉錄單位中的病毒序列可以是，例如，病毒蛋白。病毒蛋白可以是，例如，由慢病毒編碼的蛋白或病毒包膜蛋白。病毒蛋白可以是，例如，VSV-G、gag、pol、tat或rev，或VSV-G、gag、pol、tat和rev的任何組合。
病毒序列還可以包括編碼抗病毒劑的核苷酸序列，位于編碼病毒蛋白的核苷酸序列的上游或下游。抗病毒劑可以是，例如，反義分子或核酶。
本發明的另一方面是限制從轉錄單位產生的RNA轉錄物的大小的方法，所述方法包括誘導轉錄單位轉錄，所述轉錄單位包括與含有轉錄區域的核苷酸序列可操作連接的調節序列，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述調節序列的調控，其中的轉錄區域包括編碼病毒序列的區域和位于編碼所述病毒序列的區域下游的非編碼區域，其中所述非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列，其中的轉錄單位在編碼所述順式作用核酶的序列被轉錄并順式切割轉錄物的條件下產生轉錄物。非編碼區域還可以包括編碼切割信號的核苷酸序列，其位于編碼順式作用核酶的核苷酸序列的上游。
本方法的病毒序列可以是，例如，病毒蛋白。病毒蛋白可以是，例如，由慢病毒編碼的蛋白或病毒包膜蛋白。病毒蛋白可以是，例如，VSV-G、gag、pol、tat或rev，或VSV-G、gag、pol、tat和rev的任何組合。
病毒序列還可以包括編碼抗病毒劑的核苷酸序列，位于編碼病毒蛋白的核苷酸序列的上游或下游。抗病毒劑可以是，例如，反義分子或核酶。
本發明的又一方面是載體，其包括，能夠產生預定大小的第一RNA轉錄物的第一轉錄單位，其中第一轉錄單位包括與含有轉錄區域的核苷酸序列可操作連接的第一啟動子，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述第一啟動子的調控，其中的轉錄區域包括編碼第一基因的區域和位于編碼所述第一基因的區域下游的第一非編碼區域，其中所述第一非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列；以及能夠產生預定大小的第二RNA轉錄物的第二轉錄單位，其中第二轉錄單位包括與含有轉錄區域的核苷酸序列可操作連接的第二啟動子，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述第二啟動子的調控，其中的轉錄區域包括編碼第二基因的區域和位于編碼所述第二基因的區域下游的第二非編碼區域，其中所述第二非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。此外，第一基因、第二基因或兩者在它們的羧基端可以有切割信號。
載體可以具有，例如，第一啟動子和第二啟動子，其中第一啟動子是組成型啟動子，第二啟動子是誘導型啟動子。載體可以具有，例如，第一基因和第二基因，其中第一基因是顯性失活轉基因，第二基因是在其表達時，表達產物可以將所述顯性失活轉基因轉變成功能基因的基因。第一基因例如可以是酶原，第二基因的表達產物將所述酶原轉變為有活性的酶。例如，第一基因可以編碼蛋白質，其中所述蛋白質中的至少一個氨基酸能夠被磷酸化，第二基因可以編碼激酶，所述激酶能夠使蛋白質中的氨基酸磷酸化。可選地，第一基因可以編碼第一蛋白質，其包括至少一個磷酸化的氨基酸，第二基因可以編碼蛋白磷酸酶，其能夠使第一蛋白質中的氨基酸去磷酸化。
本發明的又一方面是包括載體的宿主細胞，所述載體包括能夠產生預定大小的第一RNA轉錄物的第一轉錄單位，其中第一轉錄單位包括與含有轉錄區域的核苷酸序列可操作連接的第一啟動子，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述第一啟動子的調控，其中的轉錄區域包括編碼第一基因的區域和位于編碼所述第一基因的區域下游的第一非編碼區域，其中所述第一非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列；以及能夠產生預定大小的第二RNA轉錄物的第二轉錄單位，其中第二轉錄單位包括與含有轉錄區域的核苷酸序列可操作連接的第二啟動子，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述第二啟動子的調控，其中的轉錄區域包括編碼第二基因的區域和位于編碼所述第二基因的區域下游的第二非編碼區域，其中所述第二非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。此外，第一基因、第二基因或兩者的羧基端可以有切割信號。
本發明的另一方面是制造轉基因動物的方法，該方法包括向動物的基因組中插入載體，所述載體包括能夠產生預定大小的第一RNA轉錄物的第一轉錄單位，其中第一轉錄單位包括與含有轉錄區域的核苷酸序列可操作連接的第一啟動子，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述第一啟動子的調控，其中的轉錄區域包括編碼第一基因的區域和位于編碼所述第一基因的區域下游的第一非編碼區域，其中所述第一非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列；以及能夠產生預定大小的第二RNA轉錄物的第二轉錄單位，其中第二轉錄單位包括與含有轉錄區域的核苷酸序列可操作連接的第二啟動子，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述第二啟動子的調控，其中的轉錄區域包括編碼第二基因的區域和位于編碼所述第二基因的區域下游的第二非編碼區域，其中所述第二非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。此外，第一基因、第二基因或兩者的羧基端可以有切割信號。
本方法的載體可以，例如，被插入動物的生殖細胞的基因組中，被插入動物的未受精卵或受精卵的基因組中，被插入動物的胚胎的基因組中，或被插入位于所述動物子宮中的細胞的基因組中。
本發明的另一方面是包括載體的轉基因非人動物，所述載體包括能夠產生預定大小的第一RNA轉錄物的第一轉錄單位，其中第一轉錄單位包括與含有轉錄區域的核苷酸序列可操作連接的第一啟動子，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述第一啟動子的調控，其中的轉錄區域包括編碼第一基因的區域和位于編碼所述第一基因的區域下游的第一非編碼區域，其中所述第一非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列；以及能夠產生預定大小的第二RNA轉錄物的第二轉錄單位，其中第二轉錄單位包括與含有轉錄區域的核苷酸序列可操作連接的第二啟動子，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述第二啟動子的調控，其中的轉錄區域包括編碼第二基因的區域和位于編碼所述第二基因的區域下游的第二非編碼區域，其中所述第二非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。此外，第一基因、第二基因或兩者的羧基端可以具有切割信號。
本發明的又一方面是雙載體反轉錄病毒生產系統，其包括第一載體和第二載體，第一載體包括編碼有效負載的核苷酸序列和調控所述有效負載轉錄的第一啟動子，第二載體包括編碼結構基因的核苷酸序列和調控所述結構基因轉錄的第二啟動子，以及編碼非結構基因的核苷酸序列和調控所述非結構基因轉錄的第三啟動子，其中編碼結構基因的核苷酸序列和編碼非結構基因的核苷酸序列被編碼順式作用核酶的核苷酸序列隔開。
本發明的另一方面是雙載體反轉錄病毒生產系統，包括第一載體和第二載體，其中第一載體包括編碼有效負載的核苷酸序列和調控所述有效負載轉錄的第一啟動子，第二載體包括編碼結構基因的核苷酸序列和調控所述結構基因轉錄的第二啟動子，編碼非結構基因的核苷酸序列和調控所述非結構基因轉錄的第三啟動子，以及編碼包膜基因的核苷酸序列和調控所述包膜基因轉錄的第四啟動子，其中編碼三種基因的每一核苷酸序列被編碼順式核酶的核苷酸序列隔開。
本發明的又一方面是產生反轉錄病毒的方法，該方法包括使細胞與雙載體反轉錄病毒生產系統接觸，所述系統包括第一載體和第二載體，其中第一載體包括編碼有效負載的核苷酸序列和調控所述有效負載轉錄的第一啟動子，第二載體包括編碼結構基因的核苷酸序列和調控所述結構基因轉錄的第二啟動子，以及編碼非結構基因的核苷酸序列和調控所述非結構基因轉錄的第三啟動子，其中編碼結構基因的核苷酸序列和編碼非結構基因的核苷酸序列被編碼順式作用核酶的核苷酸序列隔開。
本發明的另一方面是產生反轉錄病毒的方法，該方法包括使細胞與雙載體反轉錄病毒生產系統接觸，所述系統包括第一載體和第二載體，第一載體包括編碼有效負載的核苷酸序列和調控所述有效負載轉錄的第一啟動子，第二載體包括編碼結構基因的核苷酸序列和調控所述結構基因轉錄的第二啟動子，編碼非結構基因的核苷酸序列和調控所述非結構基因轉錄的第三啟動子，以及編碼包膜基因的核苷酸序列和調控所述包膜基因轉錄的第四啟動子，其中編碼三種基因的每一核苷酸序列被編碼順式核酶的核苷酸序列隔開。
附圖簡述

圖1針對兩個基于HIV載體的包裝質粒的示意圖，其中一個(pVRX577)含有衍生自煙草環斑病毒衛星RNA的核酶，另一個(pVRX170)不含有該核酶。在質粒下放大了插入的核酶的序列，黑色箭頭表示切割位點。在質粒中，聚腺苷酸和轉錄中止位點位于核酶之前。這些位點的含納對于核酶的活性不是必需的。
圖2(A)示出了含有順式作用核酶的連讀病毒包裝質粒(VIRPAC)RNA的示例和核酶功能的體外確認。用含有T7啟動子的引物經PCR擴增不帶有天然順式作用核酶的VIRPAC(-cis-RZ)(圖2A的上圖)和帶有順式作用核酶的VIRPAC(+cis-Rz)(圖2A的下圖)的1300個堿基區域。隨后體外轉錄得到的DNA。(B)將濃度是約1μg/μl的2μl轉錄的RNA加入2μl RT-PCR緩沖液，隨后將2μl(2μg)上樣在凝膠上，使之可視。切割快速發生，因為在凝膠上樣之前，在緩沖液中溫育5、10、20和60分鐘之間沒有觀察到差異(數據未顯示)。
圖3示出了含有順式作用核酶的輔助區域，和用于測定轉錄連讀的PCR引物A、B和D的位置。該圖下方示出的是證實用于確定試驗敏感度的方案的示意圖。也示出了制備慢病毒載體的過程。
圖4顯現了獲自陽性對照移取稀釋(spike dilution)系列的反轉錄(RT)PCR產物。每μg細胞RNA、DNA或每個細胞被移取的RNA對照的濃度表示在每一泳道上面。
圖5用于檢測輔助構建物中的轉錄連讀的RT-PCR試驗。引物對A/B檢測沒有連讀的質粒RNA，而引物對A/D檢測僅在連讀情況下的質粒RNA(參照圖3中的示意圖)。此試驗的敏感度是每μg細胞RNA為45個拷貝，應用來自VRX170的體外轉錄的RNA作為陽性對照和標準。在所有13次試驗中，當對照RNA的45個移取的拷貝被加入反應中時，檢測到信息。在13次試驗中的8次中，加入15個拷貝時檢測到信息，在1次試驗中，加入5個拷貝時檢測到信息。
圖6在含有順式作用核酶的輔助構建物(VRX577)中，用RT-PCR檢測不到轉錄連讀。試驗完全如上面圖5所示地進行。每一試驗表示用VRX577和VRX496對293F細胞獨立進行轉染。每一反應進行三次(a、b、c)。反應的敏感度是45個拷貝/μg細胞RNA。
圖7包含順式作用核酶不影響產生的載體的滴度。通過在293F細胞中共轉染載體和輔助質粒，用含有(VRX577)和不含有(VRX170)分隔轉錄單位的順式作用核酶的輔助質粒三次產生基于HIV的慢病毒載體(VRX496)。2-3天后，收集含載體的上清液，在HeLa-tat細胞上滴定。作為對照，細胞僅用載體轉染。滴度顯示在左側，用每ml培養基中的轉導單位(TU)表示。
實施本發明的方式本發明的轉錄單位包括與含有轉錄區域的核苷酸序列可操作連接的調節序列，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述調節序列的調控。所述轉錄區域包括編碼病毒序列的區域和位于編碼所述病毒序列的區域下游的非編碼區域，其中所述非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。
實施例1提供了轉錄單位的兩個非限制性例子。轉錄單位1包括巨細胞病毒(CMV)啟動子，其含有HIV-1 GagPol和TatRev基因，在牛生長激素聚腺苷酸化(poly-A)信號末端終止。核酶被放置在載體中緊接聚腺苷酸信號之后的位置。轉錄單位2包括延伸因子(EF)啟動子，其含有VSV-G基因，在SV40聚腺苷酸位點末端終止。如果需要，核酶可以被放置在載體中緊接聚腺苷酸位點之后的位置。
可以制備許多類型的轉錄單位。本領域技術人員能夠應用公知方法容易地構建多種類型的轉錄單位。可以制備包括例如任何啟動子和任何序列或基因以及任何終止信號的轉錄單位。此外，可以隨后將核酶加入載體中緊接終止信號之后的位置。如果將要應用轉錄單位，例如，在細菌培養物中產生蛋白質，所述單位將包括啟動子、基因和順式核酶。
在本發明轉錄單位中可以應用任何的肽，只要其活性獨立于順式核酶的功能即可。
許多核酶的切割位點是本領域公知的。本領域技術人員能夠容易地選擇核酶并將其插入本發明的轉錄單位中。
除HIV之外，可以在其它病毒系統中應用抑制連讀轉錄的能力。特別地，轉錄單位使得應用三質粒的任何載體生產減為雙質粒。
病毒顆粒的產生 本發明的構建物和細胞可以被設計為，提供產生含有感興趣的特定病毒核酸的任何病毒顆粒所需的因子。病毒核酸可以是復制缺陷型的，衍生于沒有去除或丟失內源性“包裝信號”的天然發生病毒。此外，病毒核酸可以衍生自HIV-1。HIV-1衍生病毒核酸可以由pNL4-3HIV-1分子克隆產生，其為野生株，可以通過National Institutes of Health從AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog得到(也參見Adachi，et al，J.Virol.，59，284-291(1986))。可以將細胞看作和用作可被單獨導入細胞的病毒核酸的“包裝細胞”，這是因為它們產生將病毒核酸包裝成感染性病毒顆粒所需的所有成分。
當病毒核酸提供所有其它成分時，包裝細胞可以從感興趣的編碼序列表達出至少一種病毒包膜蛋白，或其等價物(如其突變體、融合物或截短形式)或其異源形式。包膜蛋白的例子是由與天然形式的病毒核酸具有內源性的序列(即，通常用于包裝所述病毒核酸由之產生的病毒的序列)編碼的蛋白，或由與病毒核酸異源的序列編碼的那些蛋白。在本發明的本方面的實踐中，許多包膜蛋白可以被表達，包括改變包裝的病毒顆粒的目標細胞特異性的蛋白或形成假型病毒顆粒的其它包膜蛋白。與HIV-1衍生病毒核酸一起應用的異源包膜蛋白的例子包括VSV G蛋白、Mokola病毒G蛋白和HIV-2包膜蛋白。
可選地，細胞可以提供至少一種病毒包膜蛋白和用于從待被包裝的病毒核酸表達包裝成分所需的一種或多于一種的蛋白。非限制性例子是提供了包膜蛋白以及同源tat蛋白，或包裝反轉錄病毒核酸所反式需要的一種或多于一種其它蛋白的細胞(例如，提供了包裝HIV-1衍生載體的VSV G蛋白和HIV-1 tat蛋白的細胞)。反式需要的其它蛋白的例子包括由gag、pol和rev序列編碼的那些蛋白。
待被包裝的感興趣的病毒核酸可以缺少表達或編碼一種或多于一種的病毒附屬蛋白序列(例如但不限于Vif、Vpu、Vpr或Nef，或其組合或片段)的能力，所述附屬蛋白序列會使核酸具有致病性或可能具有致病性。通過去除相應的編碼序列或使其突變以在轉錄水平或翻譯水平防止其表達，可以實現這一點。這種蛋白，就它們是包裝所必需這一點上說，將通過本發明的構建物或通過附加核酸構建物由包裝細胞提供。
轉基因動物的產生 Brinster，R.L.，et al，Cell，27223(1981)中描述了產生轉基因小鼠的一般過程。
通過本領域技術人員已知的幾種不同方法，可以容易地產生轉基因單細胞生物、植物和動物。這些修飾的生物含有一個或多個拷貝的整合入基因組的克隆基因。
可以用轉基因技術將正常的基因拷貝引入突變體生物，從而鑒定出對應于突變限定基因的克隆DNA。它也用于研究基因表達所必需的序列、用于開發出顯性形式人類疾病的小鼠模型、用于修飾植物、和用于研究由基因編碼的蛋白質的結構與其功能之間的關系。
外來基因或改變形式的內源基因可以被插入生物。這些技術可以引起內源性基因的置換，或整合內源性基因的附加拷貝。這樣導入基因被稱為轉基因；攜帶它們的生物被稱為轉基因生物。以多種不同的方式，轉基因可以被用于研究生物功能和發育。例如，可以對通常在發育期間在特定時間和位置被表達的基因進行體外遺傳改造，使其在不同時間、在不同組織中表達，隨后再導入動物中，以評價細胞結果和生物學結果。
轉基因動物的產生利用體外誘變克降的基因并隨后將它們轉移到真核細胞中的技術。許多類型的細胞可以從培養基吸收DNA。例如，可以用酶處理酵母細胞以去除它們厚的外壁；得到的原生質球會吸收加入到培養基中的DNA。植物細胞也可以被轉變為從培養基中吸收DNA的原生質球。培養的哺乳動物細胞直接吸收DNA，特別是在通過用鈣離子處理首先將其轉變為精細沉淀物時。將DNA導入酵母、植物和動物細胞的另一流行方法稱作電穿孔。接受幾千伏短暫電擊的細胞瞬時變得可透過DNA。大概是電擊短暫地在細胞膜上開孔，使得DNA在孔重新閉合之前進入細胞。也可以將DNA直接注入培養細胞和發育胚胎的細胞核中。
一旦外來DNA位于宿主細胞內，通常可能在DNA修復和重組中起作用的酶將外來DNA片段與宿主細胞的染色體連接起來。由于僅相對小部分細胞吸收DNA，必須有可利用選擇技術來鑒定轉基因細胞。在大多數情況下，外源DNA包括編碼選擇性標記如藥物抗性標記的基因。導入的DNA可以以不表現出位點特異性的高度可變的方式插入宿主基因組，可以通過同源重組替換內源性基因，或者可以保持為稱作附加體的獨立的染色體外DNA分子。
轉基因技術具有許多試驗用途和潛在的農業價值和治療價值。例如，可以用引起腫瘤的基因的顯性作用等位基因產生轉基因小鼠，從而得到用于研究癌癥的動物模型。在果蠅中，轉基因通常用于確定DNA的克隆片段是否相應于突變所限定的基因。如果克隆的DNA確實是研究的基因，則將其作為轉基因導入突變體蒼蠅會使突變體轉變為表型正常的個體。在農業中，轉基因植物可能具有商業價值。例如，植物學家已經開發出轉基因番茄，其表現出乙烯的產生減少，乙烯能夠促進果實成熟。這些轉基因番茄的成熟過程被延遲，因而延長它們的貨架期。最后，在人類遺傳性疾病的基因治療的萌芽領域中，轉基因技術是至關重要的組成部分。
外源DNA隨機整合入小鼠基因組非同源位點的頻率非常高。由于這一現象，轉基因小鼠的產生是高效的和簡單的過程。
制備轉基因小鼠的一般過程如下將含有感興趣基因的外來DNA注入已受精小鼠卵的兩個前核(親代提供的雄性單倍體核和雌性單倍體核)中的其中一個，這在所述前核融合之前實施。注射的DNA具有被隨機整合進二倍體受精卵染色體的很大的可能性。隨后將注射的卵轉移到代孕雌性動物，在其中發生正常的細胞生長和分化。約10-30％的子代會在所有組織中含有等量的外來DNA(每個細胞多達100個拷貝)，包括生殖細胞。正常繁殖的這些小鼠中的10％-20％即刻繁殖和回交(親代-子代交配)可以產生對于轉基因純合的純轉基因品系。
有關應用轉基因小鼠研究正常哺乳動物生物學各個方面的許多研究已被公開。這些研究提供了對疾病過程更多了解的模型系統。例如，許多形式的癌癥由正常細胞基因引起，這些基因由于它們錯誤調節的活性以顯性方式起作用。雖然攜帶這些基因之一、稱作myc的轉基因小鼠正常發育，但腫瘤形成的頻率高。表達轉基因的細胞中僅少數細胞產生腫瘤的現象支持了這一模型，其中附加的遺傳變化對于腫瘤形成是必需的。這些小鼠為鑒定這些變化提供了重要工具。核酶的切割機制 對核酶的一般描述見于Fedor，MJ.and Westhof，E.，Mol.Cell.，10(4)703-704(2002)，多種類型核酶的作用機制在Takagi，Y.，et al，Nucleic Acids Res.，29(9)1815-1834(2001)中論述。
I組內含子最初被鑒定為間插序列并根據保守序列和二級結構元件而限定。I組內含子分布廣泛，在真核細胞的核、線粒體和葉綠體基因組、真細菌和噬菌體中，已經發現了幾乎1000種I組內含子。II組內含子也被鑒定為間插序列并根據保守序列和二級結構元件而限定。II組內含子也分布廣泛，在真菌、原生生物和植物細胞器的rRNA、tRNA和mRNA中，以及在細菌的mRNA中，已經發現了約100種II組內含子(Bonen，L.，and Vogel，J.，TRENDS Genet.，17322(2001))。
I組內含子折疊形成介導其自身RNA剪接的活性部位。對可得到的66個I組內含子之間保守的序列元件進行編輯。比較序列分析使得能夠預測一些保守結構特征。Cech，T.R.，Gene，73(2)259-271(1988)中論述了這些保守特征的意義。此外，在Cech，T.R.，Annu.Rev.Biochem.，59543-568(1990)中示出了對I組內含子的自我剪接性質的綜述。
II組內含子見于真細菌和來自真細菌的細胞器的基因組中。它們具有核酶活性，通過該活性，它們指導和催化其側翼的外顯子的剪接。II組內含子的核酶組分的二級結構和已知三級相互作用在Michel，F.and Ferat，J.L.，Annu.Rev.Biochem.，64435-461(1995)中論述。
在I組內含子和II組內含子核酶的情況下，可能的切割機制包括但不限于，通過酯交換作用的自我切割或剪接，和水解。這種反應可以通過簡單的酸堿反應或通過親核取代而驅動。II組內含子在Bonen，L.and Vogel，J.，Trends.Genet.，17(6)322-331(2001)中論述。
錘頭型和發夾型核酶都可以被改造，以便切割含有GUC序列的任何目標RNA(Haseloff et al，Nature，334，585-591(1988)；Uhlenbeck，Nature，334，585(1987)；Hampel et al.，Nuc.Acids Res.，18，299-304(1990)；和Symons，Ann.Rev.Biochem.，61，641-671(1992))。一般而言，錘頭型核酶具有兩類功能域，保守催化結構域，其側翼是兩個雜交結構域。雜交結構域與GUC序列周圍的序列結合，催化結構域切割GUC序列3’端的RNA靶標(Uhlenbeck(1 987)，supra；Haseloff et al.(1988)，supra；和Symons(1992)，supra)。
有關錘頭型核酶自我切割的結構基礎的其它信息可見于Murray，J.B.，et al，Cell，92(5)665-673(1998)。有關發夾型核酶的結構和功能以及發夾型核酶的催化機制的進一步信息可見于Fedor，M.J.，J.MoI.Biol.297(2)269-291(2000)，和Fedor，M.J.，Biochem.Soc.Trans.，301109-1115(2002)。
可以在本發明轉錄單位中應用的一種核酶是衍生自煙草環斑病毒(sTobRV)衛星RNA的錘頭型核酶。sTobRV在復制期間經歷自我催化的切割。(+)鏈和(-)鏈切割所需的序列已經確定(Haseloff，J.andGerlach，W.L.，Gene，8243-52(1989))。(+)鏈切割需要切割部位側翼的那些序列形成“錘頭型”結構域，這與在其它衛星RNA和類病毒RNA中所見的相似。具體地，(+)鏈的切割在序列GUC之后發生，并產生含5’羥基和2’，3’環磷酸二酯基團的末端(Prody，G.A.，et al，Science，2311577-1580(1986))。公認的二級結構基序成為sTobRV(+)鏈切割的基礎，有可能此高度保守的結構直接參與催化。(-)鏈的切割僅需要切割部位的12個核苷酸的小區域，和位于分子中其它部位的55個核苷酸的序列。與sTobRV(-)鏈切割有關的RNA結構可以相似地在催化中起作用，并包括將在其它催化性RNA中重復發現的新的結構基序。
此外，與南芥菜花葉病毒(Arabis mosaic virus)(ArMv)有關的300個核苷酸的衛星RNA序列也已經被報道(Kaper，J.M.，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.154318-325(1988)。來自與ArMV有關的衛星RNA的核酶也可以被用在本發明的轉錄單位中。ArMV是與TobRV及其衛星RNA有關的線蟲傳多面體病毒。sArMV與sTobRv有50％的序列相似性。保守序列和潛在堿基對的存在被用來鑒定可能與sArMV(+)鏈切割有關的結構域。涉及切割的結構域的結構和核苷酸在上面由Kaper，J.M.，et al.論述。sTobRV、sArMV，和其它衛星RNA和類病毒RNA，以及相似二級結構之間存在保守區域。因此，衍生自其它衛星RNA和類病毒RNA的核酶也可以用于本發明的轉錄單位中。
切割信號 能夠被插入轉錄單位非編碼區域的切割信號可以是，例如，聚腺苷酸化信號、中止位點、強中止位點、終止位點、近端上游序列(NUE)或3’非翻譯序列。
已知下列轉錄起始RNA聚合酶可以在稱作暫停位點、中止位點、強中止位點和終止位點的幾個位置中止。此現象描述于，例如，Landick，R.，Cell，88741-744(1997)和Reeder，R.H.and Lang，W.，Mol.Microbiol，1211-15(1994)中。
調節序列和編碼序列 有用的調節序列可以包括，例如，病毒長末端重復序列(LTR)，如莫洛尼鼠白血病病毒的LTR、SV40的早期和晚期啟動子、腺病毒或巨細胞病毒即時早期啟動子、lac系統、trp系統、TAC或TRC系統、表達受T7 RNA聚合酶指導的T7啟動子、λ噬菌體的主要操縱子和啟動子區域、fd包被蛋白的調控區域、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子、酸性磷酸酶的啟動子例如Pho5、酵母α交配因子的啟動子、桿狀病毒系統的多角體啟動子、和已知調控原核細胞或真核細胞或其病毒的基因表達的其它序列、和它們的各種組合。合適的真核啟動子包括CMV即時早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒LTRs啟動子如勞斯肉瘤病毒(″RSV″)的啟動子、和金屬硫蛋白啟動子如小鼠金屬硫蛋白I啟動子。
本發明的構建物，特別是其調節序列和編碼序列部分，可以包括起源是病毒的序列。因此，病毒調節序列或區域(順式起作用)和編碼區域(反式起作用)可以被用在本發明實踐中。順式作用區域的例子是反轉錄病毒的TAR和RRE、INS(抑制序列或不穩定序列，也稱作CRS)元件，而反式作用編碼區域的例子是tat和rev編碼序列。
例如，與感興趣的病毒核酸異源的RRE可以用于本發明的載體。合適的RRE的例子包括但不限于，針對HIV-1衍生核酸的HIV-2 RRE、CTE(組成型轉運元件如來自Mason-Pfizer猴病毒和其它反轉錄病毒的那些)或PRE(翻譯后調節元件如來自土撥鼠肝炎病毒的那些)。RREs是控制RNA從細胞核運輸到細胞質進行翻譯的RNA序列。
對用于在宿主細胞中繁殖或表達的合適載體和啟動子的選擇是公知的過程。載體構建、載體向宿主細胞的導入和在宿主細胞中的增殖或表達的必要技術對于本領域技術人員而言是常規的。應該理解，上面未提及的許多啟動子和其它調控序列適用于本發明的本方面，這是眾所周知的，并且可以容易地被本領域技術人員應用。
載體 下面描述了可以在本發明中應用的載體。如本文所用，術語“載體”是指能夠運輸已與其連接的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體是附加體，即，能夠在染色體外復制的核酸。其它載體能夠自我復制和/表達已與其連接的核酸。能夠指導已與其可操作連接的基因表達的載體在本文中稱作“表達載體”。一般而言，在重組DNA技術中有用的表達載體通常采取“質粒”的形式，它是指環狀雙鏈DNA環，其為載體形式不與染色體結合。在本說明書中，“質粒”和“載體”可以交換應用。此外，本發明意圖于包括行使相同的功能并且在以后本領域中為人所知的其它形式的載體。
載體可以用于表達多核苷酸和多肽。一般而言，這種載體包括對在宿主細胞中的表達有效的順式作用調控區域，其與待被表達的多核苷酸可操作連接。合適的反式作用因子或是由宿主提供、由互補載體提供、或是在導入宿主時由載體本身提供。
多種載體可以用在本發明中。這樣的載體包括染色體，附加體，病毒衍生載體，衍生于細菌質粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件、病毒的載體，所述病毒如桿狀病毒、乳多空病毒，如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病毒和反轉錄病毒，和衍生自其組合的載體，如衍生自質粒和噬菌體遺傳元件如黏粒和噬菌粒的那些載體。一般而言，適于在宿主中維持、增殖或表達多核苷酸的任何載體都可以被應用。
商業上可得到的下列載體通過示例的方式提供。用于細菌的載體是pQE70、pQE60和pQE-9，可以從Qiagen得到；pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A，可以從Stratagene得到；和ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5，可以從Pharmacia得到。可得到的真核載體是pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG，可以從Stratagene得到；和pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL，可以從Pharmacia得到。這些載體僅以許多商業上可得和公知載體的示例的方式列出，本領域技術人員可以得到這些載體，并根據本發明而應用。應該理解，適于例如在宿主中引入、維持、繁殖和/或表達本發明多核苷酸或多肽的任何其它質粒或載體，都可以用在本發明的本方面中。
通過多種公知和常規技術中的任何技術，可以將合適的DNA序列插入載體中。一般而言，通過用一種或多種限制性內切核酸酶切割DNA序列和載體，并隨后用DNA連接酶將限制性片段連接在一起，使DNA序列與載體連接。可以應用的限制性切割和連接的方法是本領域技術人員公知和常規的。在這方面的合適方法以及應用可選技術構建載體的合適方法在本文其它處引用的Sambrook et al.中有詳細闡述，所述可選技術也是本領域技術人員公知和常規的。
載體中的序列可操作地與合適的表達調控序列連接，表達調控序列包括例如，指導mRNA轉錄的啟動子。
應該理解，對載體的選擇和/或設計可以取決于這樣的因素，如對待被轉化的宿主細胞的選擇和/或欲被表達的蛋白質的類型。此外，也應該考慮載體的拷貝數、控制該拷貝數的能力和該載體編碼的任何其它蛋白質如抗生素標記的表達。表達載體可以用于轉染細胞，從而復制調節序列和產生蛋白質或肽，包括本文所述核酸編碼的那些蛋白質和肽。
細胞的遺傳改造 本發明的轉錄單位可以被整合入載體和/或導入細胞中，如但不限于哺乳動物、嚙齒類動物、靈長類動物或人類細胞。本發明的構建物可以被整合入細胞基因組或作為附加型構建物而維持。本發明的構建物可以以任何順序被導入細胞中。在導入之后，通過置于所述構建物中的選擇性標記或可檢測標記檢測所述構建物，可以確認構建物在所述細胞中的存在。
可以對宿主細胞進行遺傳改造，以導入多核苷酸和表達本發明的多肽。例如，可以用公知的感染、轉導、轉染(例如電穿孔、脂轉染和磷酸鈣沉淀)、移位和轉化技術，將多核苷酸導入宿主細胞。多核苷酸可以單獨導入或與其它多核苷酸共同導入。這些其它多核苷酸可以獨立導入、共同導入或與本發明的多核苷酸連接導入。
因此，例如，應用標準的共轉染技術和在例如哺乳動物細胞中選擇的技術，可以將本發明的多核苷酸和編碼選擇性標記的另一單獨的多核苷酸轉染到宿主細胞中。在這種情況下，多核苷酸通常會被穩定整合入宿主細胞基因組中。
此外，可以將多核苷酸連接到含有選擇性標記的載體中，用于在宿主中繁殖。通過前述技術可以將載體構建物引入宿主細胞中。一般而言，質粒載體作為DNA以沉淀法，如磷酸鈣沉淀法引入，或以與帶電脂質形成復合物的方式引入。也可以用電穿孔將多核苷酸導入宿主。如果載體是病毒，它可以被體外包裝或導入包裝細胞，包裝的病毒可以被轉導進細胞。根據本發明的本方面，適于制備多核苷酸和將多核苷酸導入細胞的多種技術對本領域技術人員是公知和常規的。這些技術在Sambrook et al.中有詳細綜述，其示例了詳述這些技術的許多試驗指南。此外，載體可以是，例如，質粒載體、單鏈或雙鏈噬菌體載體、單鏈或雙鏈RNA或DNA病毒載體。應用將DNA和RNA導入細胞的公知技術，可以將這樣的載體作為多核苷酸如DNA導入細胞。在載體是噬菌體和病毒載體的情況下，可以用公知的感染和轉導技術將其作為包裝的病毒或殼內病毒導入細胞。病毒載體可以是復制型的或復制缺陷型的。在后一情況下，病毒繁殖通常僅在互補宿主細胞中發生。
如本文所用，術語“轉染”意味著通過核酸介導的基因轉移，將核酸，例如表達載體導入受體細胞。如本文所用，“轉化”是指作為細胞吸收外源DNA或RNA的結果，細胞的基因型得以改變的過程。例如，轉化的細胞表達重組形式的多肽，或當從轉移的基因發生反義表達時，天然發生形式的蛋白的表達受到干擾。
轉染可以是瞬時轉染或穩定轉染。構建物導入到宿主細胞中可以通過磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、陽離子脂質介導的轉染、電穿孔、轉導、感染或其它方法完成。這些方法描述在許多標準實驗室指南中，如Davis，et al.，Basic Methods In Molecular Biology(1986)。
細胞或宿主 如本文所用，“細胞”或“宿主”是指相應的活生物，在其中可以導入和表達本發明的核酸構建物或表達系統。“細胞”可以是任何細胞，優選地，是真核細胞。細胞可以是新分離的或轉化的細胞系細胞或原代細胞，所述轉化是通過導入本發明的核酸構建物或與導入本發明的核酸構建物聯合而實現的。細胞系或培養物是指通過體外培養而維持的細胞，其可以和衍生出該細胞系或培養物的親代細胞不一樣。細胞的非限制性例子包括真核細胞系如HeLa、293、HT-1080、CV-1、TE671或其它人類細胞；非洲綠猴腎細胞株系(Vero)細胞；或D17細胞。其它細胞包括淋巴細胞(如T細胞或B細胞)或巨噬細胞(如單核巨噬細胞)，或這些細胞中任一細胞的前體，如造血干細胞。用于實施本發明的其它細胞包括星形膠質細胞、皮膚成纖維細胞、腸上皮細胞、內皮細胞、上皮細胞、樹突細胞、朗格漢斯細胞、單核細胞、肌細胞、神經元細胞(如但不限于腦和眼神經元細胞)、肝細胞、造血干細胞、胚胎干細胞、產生精子或卵細胞的細胞、基質細胞、粘膜細胞和類似細胞。優選地，宿主細胞是真核、多細胞物種的細胞(例如，與單細胞酵母細胞相對)，甚至更優選地，是哺乳動物細胞，例如人類細胞。
細胞可以作為單個實體存在，或者可以是較大細胞集合的一部分。這種“較大的細胞集合(larger collection of cells)”可以包括，例如，細胞培養物(或是混合的或是純的)、組織(例如，內皮、上皮、粘膜或其它組織，包括含有上述CD 4缺失細胞的組織)、器官(例如，心臟、肺、肝臟、肌肉、膽囊、膀胱、性腺、眼和其它器官)、器官系統(例如，循環系統、呼吸系統、胃腸系統、泌尿系統、神經系統、皮被系統或其它器官系統)或生物(例如鳥、哺乳動物或類似生物)。優選地，器官/組織/細胞是循環系統的(例如，包括但不限于心臟、脈管和血液，包括白細胞和紅細胞)、呼吸系統的(例如，鼻、咽、喉、氣管、支氣管、細支氣管、肺和類似器官)、胃腸系統的(例如，包括口、咽、食道、胃、腸、唾液腺、胰腺、肝臟、膽囊和其它器官)、泌尿系統的(例如，如腎臟、輸尿管、膀胱、尿道和類似器官)、神經系統的(例如，包括但不限于腦和脊髓，和特殊感覺器官如眼)和皮被系統的(例如皮膚、表皮、和皮下或皮膚組織的細胞)。甚至更加優選地，細胞選自心臟、血管、肺臟、肝臟、膽囊、膀胱、和眼細胞。細胞不必是正常細胞，可以是患病細胞。這樣的患病細胞可以是腫瘤細胞、感染的細胞、遺傳異常細胞、或與異常組織接近或與其接觸的細胞如腫瘤血管內皮細胞，但不限于這些細胞。
病毒 “病毒”是由蛋白質和核酸組成并應用宿主細胞的遺傳機制產生病毒核酸確定的病毒產物的感染劑。本發明包括這樣的方面如病毒編碼序列的表達，其可以應用于RNA病毒和DNA病毒。RNA病毒是感染原核生物(例如噬菌體)以及包括哺乳動物、特別是人類在內的許多真核生物的多樣化群組。雖然至少一個家族以雙鏈RNA作為遺傳物質，大多數RNA病毒以單鏈RNA作為它們的遺傳物質。RNA病毒被分成三個主要的組正鏈病毒、負鏈病毒和雙鏈RNA病毒。涉及本發明的RNA病毒包括辛德比斯樣病毒(例如，披膜病毒科(Togaviridae)、雀麥花葉病毒、南瓜花葉病毒組、煙草花葉病毒、等軸不穩定環斑病毒組、煙草脆裂病毒組、和馬鈴薯X病毒組)，小RNA病毒樣病毒(例如，小RNA病毒科(Picomaviridae)、杯狀病毒科(Caliciviridae)、豇豆花葉病毒組、線蟲傳多面體病毒和馬鈴薯Y病毒組)，負鏈病毒(例如，副粘病毒科(Paramyxoviridae)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、正黏病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼病毒科(Bunyaviridae)和沙粒病毒科(Arenaviridae))，雙鏈病毒(例如，呼腸病毒科(Reoviridae)和雙RNA病毒科(Birnaviridae))，黃病毒樣病毒(例如，黃病毒科(Flaviviridae)和瘟病毒)，反轉錄樣病毒(例如，反轉錄病毒科(Retroviridae))，冠狀病毒科(Coronaviridae)和其它病毒組，包括但不限于野田病毒科(Nodaviridae)。本發明優選地應用黃病毒科家族的RNA病毒，更優選地線狀病毒屬的病毒，特別是馬爾堡病毒或依波拉病毒。黃病毒科家族的病毒是黃病毒屬的病毒，如黃熱病毒、登革病毒、西尼羅腦炎病毒、圣·路易斯腦炎病毒、日本腦炎病毒、Murray河谷腦炎病毒、羅西奧病毒(Rociovirus)、蜱媒腦炎病毒和類似病毒。本發明優選地應用小RNA病毒科家族的病毒，優選甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HBC)、或非甲非乙型肝炎病毒。
本發明可以應用的另一優選RNA病毒是反轉錄病毒科家族的病毒(即，反轉錄病毒)，特別是屬或亞科腫瘤病毒亞科(Oncovirinae)、泡沫病毒亞科(Spumavirinae)、泡沫病毒、慢病毒亞科(Lentivirinae)和慢病毒的病毒。亞科腫瘤病毒亞科的RNA病毒理想地是人嗜T淋巴細胞病毒1型或2型(即，HTLV-1或HTLV-2)或牛白血病病毒(BLV)，禽類白血病-肉瘤病毒(avian leukosis-sarcoma virus)(例如，勞斯肉瘤病毒(RSV)，禽類成髓細胞性白血病病毒(AMV)，禽類成紅細胞增生病毒(AEV)和勞斯相關病毒(RAV；RAV-0至RAV-50)，哺乳動物C型病毒(例如，莫洛尼鼠白血病病毒(MuLV)，哈維鼠肉瘤病毒(Harvey murinesarcoma virus)(HaMSV)，埃布爾森鼠白血病病毒(A-MuLV)，AKR-MuLV，貓科動物白血病病毒(FeLV)，猿猴肉瘤病毒，網狀內皮組織增殖病毒(REV)，脾壞死病毒(SNV))，B型病毒(例如，小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV))，和D型病毒(例如，Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)和“SAIDS”病毒)。慢病毒亞家族的RNA病毒理想地是人免疫缺陷病毒1型或2型(即，HIV-1或HIV-2，其中HIV-1以前稱作淋巴結病相關病毒3(HTLV-III)和獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)相關病毒(ARV))，或已經鑒定并與AIDS或AIDS樣疾病相關的、有關HIV-1或HIV-2的其它病毒。一般而言，首字母縮寫“HIV”或“人類免疫缺陷病毒”用于本文中指這些HIV病毒，以及HIV有關和相關病毒。而且，慢病毒亞家族中的RNA病毒優選地是腦膜腦炎/進行性間質性肺炎病毒(Visna/maedivirus)(例如，如感染綿羊)、貓科動物免疫缺陷病毒(FIV)、牛慢病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)和羊關節炎-腦炎病毒(CAEV)。本發明也應用DNA病毒。優選地，DNA病毒是皰疹病毒(如EB病毒、單純皰疹病毒、巨細胞病毒)，腺病毒，AAV，乳頭瘤病毒，牛痘病毒和類似病毒。
術語“3’”(3 prime)一般是指多核苷酸或寡核苷酸中的區域或位置，所述區域或位置位于同一多核苷酸或寡核苷酸中的另一區域或位置的3’端(下游)。
術語“5’”(5 prime)一般是指多核苷酸或寡核苷酸中的區域或位置，所述區域或位置位于同一多核苷酸或寡核苷酸中的另一區域或位置的5’端(上游)。
如果沒有另外規定，本文中應用的所有技術術語和科技術語具有與本發明所屬領域普通技術人員普遍理解的相同意義。
必須指出，如本說明書和所附權利要求書所用，單數形式“一(a)”、“一(an)”和“定冠詞(the)”包括相應的復數形式，除非上下文另外明確地作出說明。
如本文所用，術語“包括”及其同源詞以其包含性意義應用；即，等價于術語“包含”及其相應的同源詞。
如果沒有另外的說明，本發明的實踐將應用傳統的細胞生物學、細胞培養、分子生物學、微生物學、重組技術，這些技術在本領域技術人員的技術范圍內。這些技術在文獻中得到充分說明。參見，例如，Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd Ed.，由Sambrook，Fritsch和Maniatis編輯(Cold Spring Harbor Laboratory Press1989)；DNACloning，第I卷和第II卷(D.N.Glover ed.，1985)；OligonucleotideSynthesis (M.J.Gait ed.，1984)；Mullis et al.美國專利號4,683,195Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney.Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cell And Enzymes(IRL，Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；論文Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos eds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，Vols.154和155(Wu et al.eds.)，ImmunochemicalMethods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Manipulating theMouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
提供下列實施例以便為本領域技術人員提供如何制備和應用本發明的充分公開和描述，并且其并不意圖限制發明人考慮的發明范圍，也并不意圖表明下面的試驗是所進行的所有試驗和僅有的試驗。已經作了努力以確保所應用的數字(例如，數量、溫度等)的精確性，但是一些試驗誤差和偏差應當考慮。如果沒有其它規定，份數是重量份，分子量是重均分子量，溫度是攝氏度，壓力是大氣壓或接近大氣壓。
實施例1包裝載體構建物VRX577中的順式作用核酶的結構 在包裝載體構建物VIRPAC-也稱作VRX170中，有兩個轉錄單位。一個轉錄單位驅動HIV-I GagPol和TatRev在巨細胞病毒(CMV)啟動子的調控下的表達，其在牛生長激素聚腺苷酸(poly-A)信號末端處終止。另一轉錄單位編碼由延伸因子(EF)啟動子驅動的VSV-G，并在SV40聚腺苷酸位點末端終止。由于質粒的環狀性質，兩個轉錄單位都能夠潛在地連讀聚腺苷酸位點并形成較長的多順反子信使RNA，在反轉錄期間，所述信使RNA能夠充當通過基于RNA的重組事件產生可復制慢病毒(RCL)的潛在底物。為了防止連讀，含有煙草環斑病毒(sTobRV)衛星RNA的順式核酶(cis-Rz)的片段(Haseloff和Gerlach，1989)在緊接相應聚腺苷酸位點的下游插入到這兩個轉錄單位之間(圖1)。僅當發生轉錄連讀的情況下才產生核酶，隨后核酶能夠在圖1中的黑色箭頭所指的位點處切割其自身。
實施例2順式核酶(cis-RZ)的體外活性 應用含有T7啟動子的引物，經PCR擴增含有轉錄終止元件的VRX170(-cis-RZ)和VRX577(+cis-Rz)的1300個堿基的區域。隨后體外轉錄得到的DNA。將濃度約1μg/μl的2μl轉錄的RNA加入2μlRT-PCR緩沖液，隨后將2μl(2μg)上樣到凝膠中用于顯現(圖2)。切割迅速發生，原因是在凝膠上樣前在緩沖液中溫育5、10、20和60分鐘之間沒有觀察到差異。這一數據表明，cis-Rz非常有效地抑制連讀轉錄物。
實施例3應用VRX577作為包裝載體，在生產細胞中沒有出現轉錄連讀 在用病毒載體和含有cis-Rz(VRX577)的輔助構建物以及不含有cis-Rz的輔助構建物(VRX170)共轉染的293F細胞中，測定轉錄連讀。分離細胞RNA，用RT-PCR分析RNA轉錄物。能夠100％次測得轉錄物的試驗敏感度是每μg細胞DNA中含有50個拷貝的轉錄物，這等于每μg總細胞RNA中含有167個拷貝。除了對測定轉錄連讀的試驗設計的概述之外，對PCR引物設計的概括也表示在圖3中。用從VRX170體外轉錄的RNA作為陽性對照和標準品。在VRX170體外轉錄期間，預期出現連讀，原因是連接轉錄聚腺苷酸和中止位點所必需的細胞元件在反應中不存在。為了在統計學上確定該分析的檢測極限，對已知量的陽性對照RNA進行以3倍連續稀釋(圖4)，該試驗重復13次，以便獲得用于統計學確定敏感度的足夠的數據點。根據這些結果，如果在9次重復中沒有陽性事件，則在每次重復或每μgRNA中存在23.12個拷貝以下的連讀RNA轉錄物，置信上限是95％。
在描述的敏感度試驗中，用VRX170作為輔助構建物，在293F細胞中檢測到連讀轉錄物，但是用VRX577作為輔助構建物，沒有檢測到連讀轉錄物(圖5)。隨后對來自用載體和VRX577共轉染的細胞的細胞RNA進行的9次試驗中，任何一次試驗都沒有連讀轉錄物，這意味著每μg細胞RNA中存在23.12個拷貝以下的連讀RNA轉錄物(圖6)。由于VRX170和VRX577之間的唯一差異是順式作用核酶的加入(請參見圖1)，可以斷定，核酶獨自負起防止連讀轉錄物的任務。因此，順式作用核酶的加入是非常有效的轉錄分隔元件。
實施例4cis-Rz的加入不影響輔助構建物的包裝功能 在包裝期間，cis-Rz的應用不以任何方式影響最終病毒載體產物，原因是核酶并不位于病毒載體中或輔助構建物(VRX577)的編碼序列中。為了證明這一點，對所得的在VRX170或VRX577存在下包裝的載體的滴度進行比較。簡言之，用載體和輔助構建物對293F細胞進行共轉染，用得到的載體產物轉導hela-tat細胞。從這些細胞分離DNA，通過對載體序列進行PCR擴增，分析載體的拷貝數(轉導單位(TU))。沒有觀察到載體包裝效率之間的差異。數據代表至少3個獨立的試驗，說明了在兩個輔助構建物(VRX577和VRX170)之間的滴度類似，在應用VRX577時具有較高滴度的可重復趨勢(圖7)。
本文中引用的所有參考文獻，包括專利、專利申請和出版物，以整體并入本文作為參考，不論其之前明確并入的或未并入的。
對上述文件的引用不是意圖承認前述文件是相關的現有技術。關于這些文件內容以及日期或陳述的所有說明都是基于申請人可以得到的信息，并且不構成對這些文件的日期或內容的正確性的任何承認。
充分描述了本發明之后，本領域技術人員將理解，在不進行過度的試驗和不背離本發明的精神和范圍的情況下，可以在寬范圍的等同參數、濃度和條件下進行相同的操作。
雖然聯系具體實施方案對本發明進行了描述，應該理解，可以對其作進一步修改。本申請意圖涵蓋對本發明的任何變化、用途或修改，所述變化、用途或修改一般而言遵循了本發明的原則并包括對本發明公開內容的偏離，所述偏離在本發明所屬領域已知的或慣例的實踐范圍內，并且可以應用于上文列出的基本特征中。
權利要求
1.制備能夠產生預定大小的RNA轉錄物的重組轉錄單位的方法，包括可操作地連接調節序列和包括轉錄區域的核苷酸序列，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述調節序列的調控，其中所述轉錄區域包括編碼病毒序列的區域和位于編碼所述病毒序列的所述區域下游的非編碼區域，其中所述非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。
2.權利要求1的方法，其中所述非編碼區域還包括編碼切割信號的核苷酸序列，其位于所述編碼順式作用核酶的核苷酸序列的上游。
3.權利要求2的方法，其中所述切割信號是聚腺苷酸化信號、暫停位點、強中止位點、終止位點、近端上游序列(NUE)或3’非翻譯序列。
4.權利要求3的方法，其中所述聚腺苷酸化信號是牛生長激素聚腺苷酸(poly-A)信號或SV40聚腺苷酸位點。
5.權利要求3的方法，其中應用一個以上的切割信號。
6.權利要求1的方法，其中所述調節序列是原核調節序列。
7.權利要求1的方法，其中所述調節序列是真核調節序列。
8.權利要求7的方法，其中所述調節序列是巨細胞病毒(CMV)啟動子或延伸因子(EF)啟動子。
9.權利要求1的方法，其中所述病毒序列編碼病毒蛋白。
10.權利要求9的方法，其中所述病毒蛋白是由慢病毒編碼的蛋白或病毒包膜蛋白。
11.權利要求9的方法，其中所述病毒蛋白是VSV-G、gag、pol、tat或rev，或VSV-G、gag、pol、tat和rev的任何組合。
12.權利要求9的方法，其中所述病毒序列還包括編碼抗病毒劑的核苷酸序列，其位于編碼所述病毒蛋白的核苷酸序列的上游或下游。
13.權利要求12的方法，其中所述抗病毒劑是反義分子或核酶。
14.權利要求1的方法，其中所述順式作用核酶衍生自衛星RNA或類病毒RNA。
15.權利要求14的方法，其中所述順式作用核酶衍生自煙草環斑病毒的衛星RNA或衍生自南芥菜花葉病毒的衛星RNA。
16.宿主細胞，包括能夠產生預定大小的RNA轉錄物的重組轉錄單位，其中所述轉錄單位包括調節區域，其可操作地連接到含有轉錄區域的核苷酸序列，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述調節序列的調控，其中所述轉錄區域包括編碼病毒序列的區域和位于編碼所述病毒序列的所述區域下游的非編碼區域，其中所述非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。
17.權利要求16的宿主細胞，其中所述非編碼區域還包括編碼切割信號的核苷酸序列，其位于編碼所述順式作用核酶的所述核苷酸序列的上游。
18.能夠產生預定大小的RNA轉錄物的重組轉錄單位，包括可操作地連接到核苷酸序列的調節區域，所述核苷酸序列包括編碼病毒序列的轉錄區域和位于編碼所述病毒序列的所述區域下游的非編碼區域，其中所述非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。
19.權利要求18的重組轉錄單位，其中所述非編碼區域還包括編碼終止切割信號的核苷酸序列，其位于編碼所述順式作用核酶的所述核苷酸序列的上游。
20.權利要求19的重組轉錄單位，其中所述切割信號是聚腺苷酸化信號、中止位點、強中止位點、近端上游序列(NUE)或3’非翻譯序列。
21.權利要求20的重組轉錄單位，其中所述聚腺苷酸化信號是牛生長激素聚腺苷酸(poly-A)信號或SV40聚腺苷酸位點。
22.權利要求20的重組轉錄單位，其中應用一個以上的信號。
23.權利要求18的重組轉錄單位，其中所述調節序列是原核調節序列。
24.權利要求18的重組轉錄單位，其中所述調節序列是真核調節序列。
25.權利要求24的重組轉錄單位，其中所述調節序列是巨細胞病毒(CMV)啟動子或延伸因子(EF)啟動子。
26.權利要求18的重組轉錄單位，其中所述病毒序列是病毒蛋白。
27.權利要求26的重組轉錄單位，其中所述病毒蛋白是由慢病毒編碼的蛋白或病毒包膜蛋白。
28.權利要求26的重組轉錄單位，其中所述病毒蛋白是VSV-G、gag、pol、tat或rev，或VSV-G、gag、pol、tat和rev的任何組合。
29.權利要求28的重組轉錄單位，其中除了編碼病毒蛋白的核苷酸序列之外，所述病毒序列還包括編碼抗病毒劑的核苷酸序列，其位于編碼所述病毒蛋白的核苷酸序列的上游或下游。
30.權利要求29的重組轉錄單位，其中所述抗病毒劑是反義分子或核酶。
31.權利要求18的重組轉錄單位，其中所述順式作用核酶衍生自衛星RNA或類病毒RNA。
32.權利要求31的重組轉錄單位，其中所述順式作用核酶衍生自煙草環斑病毒的衛星RNA或衍生自南芥菜花葉病毒的衛星RNA。
33.限制從轉錄單位產生的RNA轉錄物的大小的方法，所述方法包括誘導轉錄單位轉錄，所述轉錄單位包括與含有轉錄區域的核苷酸序列可操作連接的調節序列，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述調節序列的調控，其中所述轉錄區域包括編碼病毒序列的區域和位于編碼所述病毒序列的區域下游的非編碼區域，其中所述非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列；和其中所述轉錄單位在編碼所述順式作用核酶的序列被轉錄的條件下產生轉錄物并順式切割所述轉錄物。
34.權利要求33的方法，其中所述非編碼區域還包括編碼切割信號的核苷酸序列，其位于所述編碼順式作用核酶的核苷酸序列的上游。
35.權利要求33的方法，所述切割信號是聚腺苷酸化信號、暫停位點、強中止位點、終止位點、近端上游序列(NUE)或3’非翻譯序列。
36.權利要求33的方法，其中所述聚腺苷酸化信號是牛生長激素聚腺苷酸(poly-A)信號或SV40聚腺苷酸位點。
37.權利要求35的方法，其中應用一個以上的信號。
38.權利要求33的方法，其中所述調節序列是原核調節序列。
39.權利要求33的方法，其中所述調節序列是真核調節序列。
40.權利要求39的方法，其中所述調節序列是巨細胞病毒(CMV)啟動子或延伸因子(EF)啟動子。
41.權利要求33的方法，其中所述病毒序列編碼病毒蛋白。
42.權利要求41的方法，其中所述病毒蛋白是由慢病毒編碼的蛋白或病毒包膜蛋白。
43.權利要求41的方法，其中所述病毒蛋白是VSV-G、gag、pol、tat或rev，或VSV-G、gag、pol、tat和rev的任何組合。
44.權利要求41的方法，其中除了編碼病毒蛋白的核苷酸序列之外，所述病毒序列還包括編碼抗病毒劑的核苷酸序列，其位于編碼所述病毒蛋白的核苷酸序列的上游或下游。
45.權利要求44的方法，其中所述抗病毒劑是反義分子或核酶。
46.權利要求33的方法，其中所述順式作用核酶衍生自衛星RNA或類病毒RNA。
47.權利要求46的方法，其中所述順式作用核酶衍生自煙草環斑病毒的衛星RNA或衍生自南芥菜花葉病毒的衛星RNA。
48.載體，包括(a)能夠產生預定大小的第一RNA轉錄物的第一轉錄單位，其中所述第一轉錄單位包括與含有轉錄區域的核苷酸序列可操作連接的第一啟動子，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述第一啟動子的調控，其中所述轉錄區域包括編碼第一基因的區域和位于編碼所述第一基因的所述區域下游的第一非編碼區域，其中所述第一非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列；和(b)能夠產生預定大小的第二RNA轉錄物的第二轉錄單位，其中所述第二轉錄單位包括與含有轉錄區域的核苷酸序列可操作連接的第二啟動子，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述第二啟動子的調控，其中所述轉錄區域包括編碼第二基因的區域和位于編碼所述第二基因的所述區域下游的第二非編碼區域，其中所述第二非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。
49.權利要求48的載體，其中所述第一啟動子和第二啟動子是不同的。
50.權利要求48的載體，其中所述第一啟動子和第二啟動子非編碼區域包括編碼相同的或不同的順式作用核酶的核苷酸序列。
51.權利要求48的載體，其中所述第一基因、第二基因或兩者在其羧基端具有切割信號。
52.權利要求51的載體，其中所述切割信號是聚腺苷酸化信號、暫停位點、強中止位點、終止位點、近端上游序列(NUE)或3’非翻譯序列。
53.權利要求52的載體，其中應用一個以上的信號。
54.權利要求48的載體，其中所述第一順式作用核酶或第二順式作用核酶或兩者衍生自衛星RNA或類病毒RNA。
55.權利要求54的載體，其中所述順式作用核酶衍生自煙草環斑病毒的衛星RNA或衍生自南芥菜花葉病毒的衛星RNA。
56.權利要求48的載體，其中所述第一啟動子是組成型的，所述第二啟動子是誘導型的。
57.權利要求48的載體，其中所述第一基因與所述第二基因是不同的。
58.權利要求57的載體，其中所述第一基因是顯性失活轉基因，第二基因是在其被表達時，該表達產物可以將所述顯性失活轉基因轉變成功能基因的基因。
59.權利要求57的載體，其中所述第一基因是是酶原，所述第二基因的表達產物將所述酶原轉變為有活性的酶。
60.權利要求57的載體，其中所述第一基因編碼蛋白質，其中所述蛋白質中的至少一個氨基酸能夠被磷酸化，所述第二基因編碼能夠使所述蛋白質的所述氨基酸磷酸化的激酶。
61.權利要求57的載體，其中所述第一基因編碼第一蛋白，其包括至少一個磷酸化的氨基酸，所述第二基因編碼能夠使所述第一蛋白質的所述氨基酸去磷酸化的蛋白磷酸酶。
62.宿主細胞，其包括載體，所述載體包括(a)能夠產生預定大小的第一RNA轉錄物的第一轉錄單位，其中所述第一轉錄單位包括與含有轉錄區域的核苷酸序列可操作連接的第一啟動子，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述第一啟動子的調控，其中所述轉錄區域包括編碼第一基因的區域和位于編碼所述第一基因的所述區域下游的第一非編碼區域，其中所述第一非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列；和(b)能夠產生預定大小的第二RNA轉錄物的第二轉錄單位，其中所述第二轉錄單位包括與含有轉錄區域的核苷酸序列可操作連接的第二啟動子，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述第二啟動子的調控，其中所述轉錄區域包括編碼第二基因的區域和位于編碼所述第二基因的所述區域下游的第二非編碼區域，其中所述第二非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。
63.權利要求62的宿主細胞，其中所述第一基因、第二基因或兩者在其羧基端具有切割信號。
64.制造轉基因動物的方法，包括向所述動物的基因組中插入載體，所述載體包括(a)能夠產生預定大小的第一RNA轉錄物的第一轉錄單位，其中所述第一轉錄單位包括與含有轉錄區域的核苷酸序列可操作連接的第一啟動子，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述第一啟動子的調控，其中所述轉錄區域包括編碼第一基因的區域和位于編碼所述第一基因的所述區域下游的第一非編碼區域，其中所述第一非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列；和(b)能夠產生預定大小的第二RNA轉錄物的第二轉錄單位，其中所述第二轉錄單位包括與含有轉錄區域的核苷酸序列可操作連接的第二啟動子，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述第二啟動子的調控，其中所述轉錄區域包括編碼第二基因的區域和位于編碼所述第二基因的所述區域下游的第二非編碼區域，其中所述第二非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。
65.權利要求64的方法，其中所述第一基因、第二基因或兩者在其羧基端具有切割信號。
66.權利要求64的方法，其中所述載體被插入所述動物的生殖細胞的基因組中。
67.權利要求64的方法，其中所述載體被插入所述動物的未受精卵或受精卵的基因組中。
68.權利要求64的方法，其中所述載體被插入所述動物的胚胎的基因組中。
69.權利要求64的方法，其中所述載體被插入到位于所述動物子宮中的細胞的基因組中。
70.轉基因非人動物，其包括載體，所述載體包括(a)能夠產生預定大小的第一RNA轉錄物的第一轉錄單位，其中所述第一轉錄單位包括與含有轉錄區域的核苷酸序列可操作連接的第一啟動子，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述第一啟動子的調控，其中所述轉錄區域包括編碼第一基因的區域和位于編碼所述第一基因的所述區域下游的第一非編碼區域，其中所述第一非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列；和(b)能夠產生預定大小的第二RNA轉錄物的第二轉錄單位，其中所述第二轉錄單位包括與含有轉錄區域的核苷酸序列可操作連接的第二啟動子，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述第二啟動子的調控，其中所述轉錄區域包括編碼第二基因的區域和位于編碼所述第二基因的所述區域下游的第二非編碼區域，其中所述第二非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。
71.權利要求70的轉基因非人動物，其中所述第一基因、第二基因或兩者在它們的羧基端具有切割信號。
72.雙載體反轉錄病毒生產系統，包括(a)第一載體，包括編碼有效負載的核苷酸序列和調控所述有效負載轉錄的第一啟動子；和(b)第二載體，包括(i)編碼結構基因的核苷酸序列和調控所述結構基因轉錄的第二啟動子；和(ii)編碼非結構基因的核苷酸序列和調控所述非結構基因轉錄的第三啟動子，其中編碼所述結構基因的所述核苷酸序列和編碼所述非結構基因的所述核苷酸序列被編碼順式作用核酶的核苷酸序列隔開。
73.權利要求72的反轉錄病毒生產系統，其中所述第一啟動子、第二啟動子和第三啟動子是相同的或是不同的。
74.權利要求72的反轉錄病毒生產系統，其中所述有效負載選自反義分子、RNA誘餌、反式顯性突變體、毒素、針對病毒結構蛋白的單鏈抗體(scAb)、siRNA和核酶。
75.權利要求72的反轉錄病毒生產系統，其中所述結構基因選自gag、gag-pol前體、pro、反轉錄酶(RT)、整合酶(In)和env。
76.權利要求72的反轉錄病毒生產系統，其中所述非結構基因選自tat、rev、nef、vpr、vpu和vif。
77.雙載體反轉錄病毒生產系統，包括(a)第一載體，包括編碼有效負載的核苷酸序列和調控所述有效負載轉錄的第一啟動子；和(b)第二載體，包括(i)編碼結構基因的核苷酸序列和調控所述結構基因轉錄的第二啟動子，(ii)編碼非結構基因的核苷酸序列和調控所述非結構基因轉錄的第三啟動子，和(iii)編碼包膜基因的核苷酸序列和調控所述包膜基因轉錄的第四啟動子，其中編碼所述三個基因的每一核苷酸序列被編碼順式核酶的核苷酸序列隔開。
78.權利要求77的反轉錄病毒生產系統，其中所述第一啟動子、第二啟動子、第三啟動子和第四啟動子是相同的或是不同的。
79.權利要求77的反轉錄病毒生產系統，其中所述有效負載選自反義分子、RNA誘餌、反式顯性突變體、毒素、針對病毒結構蛋白的單鏈抗體(scAb)、siRNA和核酶。
80.權利要求77的反轉錄病毒生產系統，其中所述結構基因選自gag、gag-pol前體、pro、反轉錄酶(RT)、整合酶(In)和env。
81.權利要求77的反轉錄病毒生產系統，其中所述非結構基因選自tat、rev、nef、vpr、vpu和vif。
82.產生反轉錄病毒的方法，包括使細胞與雙載體反轉錄病毒生產系統接觸，所述雙載體反轉錄病毒生產系統包括(a)第一載體，包括編碼有效負載的核苷酸序列和調控所述有效負載轉錄的第一啟動子；和(b)第二載體，包括編碼結構基因的核苷酸序列和調控所述結構基因轉錄的第二啟動子，編碼非結構基因的核苷酸序列和調控所述非結構基因轉錄的第三啟動子，其中編碼所述結構基因的所述核苷酸序列和編碼所述非結構基因的所述核苷酸序列被編碼順式作用核酶的核苷酸序列隔開。
83.生產反轉錄病毒的方法，包括使細胞與雙載體反轉錄病毒生產系統接觸，所述雙載體反轉錄病毒生產系統包括(a)第一載體，包括編碼有效負載的核苷酸序列和調控所述有效負載轉錄的第一啟動子；和(b)第二載體，包括編碼結構基因的核苷酸序列和調控所述結構基因轉錄的第二啟動子，編碼非結構基因的核苷酸序列和調控所述非結構基因轉錄的第三啟動子，以及編碼包膜基因的核苷酸序列和調控所述包膜基因轉錄的第四啟動子，其中編碼所述三個基因的每一核苷酸序列被編碼順式核酶的核苷酸序列隔開。
全文摘要
本發明提供了能夠產生預定大小的RNA轉錄物的重組轉錄單位，其包括與含有轉錄區域的核苷酸序列可操作連接的調節序列，從而，所述轉錄區域的轉錄受到所述調節序列的調控。所述轉錄區域包括編碼病毒序列的區域和位于編碼所述病毒序列的區域下游的非編碼區域，其中所述非編碼區域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。也提供了應用這種重組轉錄單位的方法和包括含有這種重組轉錄單位的載體的細胞。
文檔編號C12N5/02GK101094920SQ200580022392
公開日2007年12月26日 申請日期2005年5月17日 優先權日2004年5月17日
發明者呂小賓, B·德羅普利奇, V·斯列普什金, G·賓德 申請人:維克西斯公司