神經細胞分化方法

專利名稱：神經細胞分化方法
技術領域：
本發明涉及在體外從多能細胞，特別是ES細胞產生神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元。
背景長久以來就已經知道多能細胞如胚胎癌性(EC)細胞和胚胎干(ES)細胞可以在體外分化成神經元。原則上，用ES細胞可以產生分離所選分化階段的細胞和表征神經元前體的可能性。ES細胞方便了體外分子和遺傳發育途徑的研究，并且也是用于移植到腦中以治療神經疾病的細胞的潛在來源。
然而，這些和其他應用已經受到培養物中神經元發育的不均一性、無組織的和經常不可再現的性質的阻礙。細胞不均一性是使用ES細胞產生神經細胞中的巨大問題(綜述見參考文獻3，4)。通常，來自ES細胞的神經元培養物含有多種不同的神經元亞型以及非神經元細胞，包括神經膠質細胞。缺少足夠多數目的具有確定和均一的表型的細胞是神經生物學中的主要困難。從ES細胞產生神經元的方法沒有一種可以導致一致數目的神經元或者它們的確定群體，從而不能以足夠的量得到均一的細胞群體以使用生物化學方法表征腦神經元。而且，神經元與它們的直接前體的譜系關系仍然不清楚。
關于使用ES細胞來源的神經元用于移植，希望得到能夠產生已知的后代的確定的祖細胞，而不是細胞的混合物，該混合物包括可以繼續分裂和形成腫瘤的某些細胞(參考文獻3，4)。異源細胞也可以干擾來自宿主組織的營養信號和/或引導信號，該信號促進移植的組織整合到腦中。植入的細胞類型是功能上重要的，例如，尤其需要多巴胺能神經元來治療諸如帕金森病的疾病，因此，此類醫學應用需要對產生的前體和神經細胞亞型增強控制。需要減小細胞不均一性來減小不希望的副作用，降低腫瘤風險；和通過增加具有所希望的神經元譜系的細胞的比例來提高治療潛力。
最近，通過使用誘導信號和轉錄因子大量地富集神經元亞型，尤其包括多巴胺能神經元和運動神經元，已經取得了進步。從而，轉錄因子，像Nurr1(參考文獻5)或者與干細胞與其他類型的共同培養物(參考文獻6)顯著增加了多巴胺能神經元的產生，而加入外在因子，包括Shh蛋白(sonichedgehog)，增加了運動神經元的產生，運動神經元在移植后也顯示出整合到宿主組織中(參考文獻7)。但是盡管取得了這些進步，但是對于可以產生特定神經元表型的確定的神經元前體的體外產生仍然知之甚少。
有許多不同的方案描述神經元和神經膠質細胞的產生(參考文獻14、15、25-31)。如以前用胚胎癌性細胞系P19實現的，用視黃酸處理多能細胞團塊引起神經元分化(參考文獻32)。隨后，已經觀察到用RA處理ES細胞來源的胚狀體(EB)也促進神經基因表達并且抑制中胚層基因表達(參考文獻33)。EB是ES細胞聚集和增殖產生的三維團聚體。通過在ES細胞不能貼壁的基質上，通常在細菌培養皿上培養ES細胞可以產生EB(見例如，參考文獻41)。
如Bain等人(參考文獻14)和Li等人(參考文獻10)例證的，用于從ES細胞產生神經細胞的一種方法包括步驟培養ES細胞；形成EB；將EB與視黃酸(RA)接觸；解離EB；和平板接種并培養所解離的EB細胞。
通常，最初的ES細胞培養在飼養細胞層支持體(滅活的成纖維細胞)上進行以使ES細胞保持在多能未分化的ES細胞集落形式中。認為成纖維細胞維持ES細胞的未分化狀態。在培養基中可以包括白血病抑制因子(LIF)以抑制分化。然而，已經觀察到即使在LIF的存在下，一些ES細胞也傾向于分化并且在EB形成期間，可以觀察到不同譜系的細胞(參考文獻3，34)。
在Bain等人和Li等人(參考文獻10，14，15)描述的方法中，將培養的ES細胞用胰蛋白酶處理和/或研磨成小團塊，然后將其接種在非貼壁的細胞培養物中用于EB形成。細胞在沒有RA的條件下培養4天，然后在培養基中加入RA培養4天，之后將EB解離并接種在層粘連蛋白包被的皿中。接種的細胞培養在含有血清的培養基中。
使用該方法，Bain等人報導產生了由緊密附著到層粘連蛋白包被的基質的扁平細胞群體和多數位于扁平細胞頂部的神經元樣細胞群體組成的培養物。觀察到約38％的細胞在2天培養后具有神經元樣形態。這些培養物是由多種類型的神經元，特別是γ-氨基丁酸能神經元組成的混合組分。
一些方法已經利用了神經元前體的選擇標記，從而除去了在分化步驟中不是神經元前體的細胞。從ES細胞產生的神經祖細胞已經多數通過中間絲標記如巢蛋白(參考文獻9)或者通過轉錄因子如sox基因(參考文獻10)的表達來限定。Li等人使用譜系選擇通過除去Sox-2陰性細胞富集它們的異質細胞群體得到表達Sox2的細胞(參考文獻10)。盡管選擇方法已經被證明可用于富集神經元前體，但是可疑的是所選的前體是否可以用于產生確定的神經元表型。在Li等人中可得到的數據表明，如與確定的亞譜系相反，Sox陽性細胞可以產生在中樞神經系統(CNS)中發現的多數細胞類型。從而，盡管Sox-陽性細胞的選擇可以增加ES細胞來源的群體中神經元前體細胞的比例，但是似乎這種選擇不可能特別富集單一亞型的神經元前體或者神經元。
已經建立了不使用RA的其他方法。例如，用于Okabe等人(參考文獻27，參考文獻43)的方法不使用RA，但是包括在解離前在特別培養基中貼壁基質上培養所形成的EB的中間步驟。在Abe等人(參考文獻30)中也使用了中間步驟，其中將培養的EB轉移到基質上，它們可以附著到所述基質。然后將它們以貼壁狀態培養，之后用胰蛋白酶解離。
一些方法，如Abe等人(參考文獻30)和Okabe等人(參考文獻27)的方法已經包括使用堿性成纖維細胞生長因子。Abe等人隨后使用有絲分裂抑制劑，其導致神經元和非神經元細胞的死亡(參考文獻30)。
本發明我們發現了這樣的方法，通過該方法，ES細胞向神經細胞的分化可以優化以得到在產生確定的神經細胞譜系和神經細胞群體的均一性方面令人驚奇的優點。因此，本發明提供了誘導和/或促進ES細胞發育和/或分化成神經元或者神經元前體細胞或者祖細胞，以在體外從ES細胞產生神經細胞的改進方法。
在優選實施方案中，本發明的方法允許產生基本上均一的神經細胞群體，其中神經細胞基本上都是單一的確定的神經元譜系、表型、細胞類型和/或處于同一分化階段。
如在本文別處詳細描述的，我們設計了得到均一神經元前體的步驟，所述前體被鑒定為放射狀神經膠質細胞。在隨后培養中，ES細胞來源的放射狀神經膠質細胞進行性地分化成錐體細胞。通過本發明的方法產生的前體和神經元基本上均一，與現有技術的方法相比，顯示出單一譜系神經元細胞的更高的％產率。
從而，在更優選的實施方案中，本發明的方法可以產生放射狀神經膠質細胞和錐形神經元的基本上純的群體，其是在現有技術中使用ES細胞難以產生的皮質的最重要的神經元群體。
考慮到本發明產生的神經前體/祖細胞的高水平的均一性，這些細胞適于進一步分化和/或成熟以產生確定譜系的神經元細胞。前體/祖細胞可以分化以產生如本文所示的錐形神經元，或者可以通過外在或者內在因子操作以產生其他神經元群體。
本發明提供的細胞數目和均一性方面的優點與神經發生和神經細胞分化的現有技術方法產生的細胞和從小鼠或者大鼠腦可以制備的有限數目的原代神經元形成對比。
生物化學研究以前受到通過現有技術方法可以方便地產生的有限數目的神經細胞的阻礙。本發明方便了涉及神經細胞發育，特別涉及從神經前體向神經元細胞的過渡的生物化學和遺傳學機理的研究。ES細胞可以容易地進行遺傳學操作和以不受限制的數目產生，并且本發明理想地適于產生用于生物化學研究的大數目的確定譜系的神經元。
此外，由于ES細胞可以容易地進行遺傳學操作或者從攜帶相關突變的小鼠分離，所以本發明方便了野生型和突變神經元的比較和導致神經變性疾病中特定細胞類型的損失的機理的鑒定。盡管ES細胞的遺傳操作是容易的，但是原代神經元的操作是極端困難的，特別是穩定操作。ES細胞的遺傳操作可以提供均一的經修飾的品系，其中整個子代含有相同的突變并且可以在一或者兩個月內實現，而具有穩定突變的小鼠品系的建立可以花費數年。從而，通過提供在體外從ES細胞產生前體、祖細胞和神經元細胞的方法，本發明避免了對建立轉基因小鼠品系的需要，從而允許在以前不現實的水平上研究突變神經元。
本發明的方法還提供了神經元的細胞測定系統(例如，軸突延長、神經細胞死亡、神經發生和突觸發生)。此類測定法是本領域需要的，但是它們的用途和性能受到限制，因為不能以足夠量方便地產生神經元。本發明使得比以前以更大量和更高均一性產生神經元，從而使得可以進行神經元測定。
本發明產生的神經元和/或神經元前體/祖細胞也適于醫學應用，如植入腦中以治療神經變性疾病或者神經元損失。由于通過本發明產生的所希望的亞型的神經細胞的更大的均一性，治療的治療潛力得到提高并且植入后腫瘤的風險減小。
發明詳述本發明涉及產生或生成神經細胞，例如，神經元和/或神經元前體/祖細胞、促進或者誘導ES細胞向神經元前體細胞或者祖細胞的分化的方法，還涉及促進或者誘導前體或者祖細胞向神經元分化或者成熟的方法。
本發明涉及誘導和/或促進胚胎干(ES)細胞向神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元的發育和/或分化，和/或產生或者生成神經細胞的體外方法，該方法包括培養ES細胞；形成胚狀體(EB)；將EB與視黃酸(RA)接觸；和解離EB；組合下文描述的一種或多種進一步的特征或者步驟。
在本發明方法中，解離的EB細胞是神經元前體細胞或者神經元祖細胞。從而，EB的解離可以產生神經元前體細胞或者祖細胞的培養物。
任選地，該方法還包括平板接種解離的EB細胞，從而得到神經元前體細胞或者祖細胞的平板接種的培養物。
該方法可以包括培養神經元前體細胞或者祖細胞以產生神經元。從而，在本發明的一些實施方案中，包括平板接種并培養解離的EB細胞以產生神經元。
本發明的方法還包括如下述的一種或多種特征/步驟。除非上下文中指出，任意特征或者步驟可以單獨使用或者與任意其他特征或者步驟組合使用。
無飼養細胞的ES細胞培養優選地，該方法包括不存在飼養細胞(通常是滅活的成纖維細胞)的條件下培養ES細胞。方法可以包括最初用飼養細胞培養ES細胞，然后不用飼養細胞進行培養。飼養細胞可以通過ES細胞的反復傳代稀釋或者除去。優選在胚狀體形成之前進行沒有飼養細胞情況下的至少一次，更優選至少兩次傳代。從而，飼養細胞優選缺席用于EB形成的ES細胞培養。“傳代”包括解離細胞，并將許多細胞再次平板接種。例如，傳代可以包括從培養皿(通常使用胰蛋白酶)脫離/解離細胞，解離細胞的團聚體并再次平板接種許多解離的ES細胞(貼壁培養物)并培養ES細胞。
合適的培養基在本文別處描述。在ES細胞培養基中可以任選包括白血病抑制因子(LIF)。
用于EB形成的ES細胞的選擇和平板接種我們已經認識到ES細胞的增殖狀態影響它們的多能性，并且該方法中接種的細胞的密度對它們分化的能力和傾向有影響。我們已經發現通過選擇和以受控的細胞密度接種增殖的ES細胞，可以得到具有確定的細胞譜系的更多神經元前體并且產生更少的不均一性細胞。
優選地，本發明的方法包括選擇高增殖性和/或形態上均一的ES細胞用于EB形成。優選地，方法包括平板接種經測量/估計/確定/決定數目或者密度的所述ES細胞用于EB形成。優選地，該方法包括選擇經測量、估計、確定或者決定數目的ES細胞用于平板接種以產生EB。
該方法優選包括測量、估計、觀察或者決定ES細胞的增殖狀態(其可以通過確定倍增時間、細胞數目的增加或者任何其他合適的度量來測量和估計)；ES細胞的形態；和/或平板接種用于EB形成的ES細胞的數目或者密度。
從而，優選地，將細胞以測量的、估計的或者確定的密度平板接種。細胞數目的測量、估計或者確定可以通過本領域已知的任一方法來進行，例如，包括在顯微鏡下對給定區域中的細胞計數，或者使用常規細胞計數器，如Casy1(Scharfe System GmbH)。通過顯微鏡觀察可以觀察到細胞形態。
在下面更詳細地討論這些方面的每一方面。
高增殖性細胞的產生和選擇高增殖性細胞可以是通過如本文描述的特定培養方法產生的細胞。我們已經發現通過培養ES細胞的方法可以改變ES細胞的增殖狀態。
ES細胞培養或者傳代優選產生高增殖性細胞。優選地，傳代約每2天重復，ES細胞培養優選包含在飼養細胞上至少兩次傳代，接著是沒有飼養細胞時至少兩次傳代。ES細胞應該在高增殖狀態中除去飼養細胞，例如，通過將飼養細胞上的ES細胞的10cm培養皿分裂培養并在沒有飼養細胞的情況下再次平板接種(例如，取1/4體積的細胞懸浮液并在最初體積的培養基中再次平板接種)將在第二天再次得到60％匯合的ES細胞培養物。不用飼養細胞進行的傳代可以包括平板接種約0.5×105個細胞/cm2。
優選地，培養ES細胞包括測量、估計或者確定用于ES細胞培養而接種的細胞的數目或者密度。
高增殖性細胞可以是基本上如下(基本上無飼養細胞)培養或者傳代ES細胞而產生的ES細胞以約0.3×105到4×105個細胞/cm2的密度，例如，約0.5-2×105，優選約1×105個細胞/cm2的密度平板接種ES細胞；并在平板接種后2天回收/解離ES細胞，和任選地再次平板接種。
應該在平板接種后2天通過分裂(解離)回收ES細胞。通常，該培養步驟(傳代)應該進行至少2次或者3次，然后選擇高增殖性細胞用于EB形成。
例如，可以將約2×106個細胞平板接種在10cm2細胞培養皿中。上面的步驟通常使得在2天后回收10×106到35×106個細胞/10cm2，例如，10-20×106個。
可以按照ES細胞的倍增時間測量增殖狀態。本發明的方法可以包括測量ES細胞的倍增時間，并選擇高增殖性細胞。例如，高增殖性細胞可以具有8小時或者更短、16小時或者更短、或者24小時或者更短，通常8到24小時的倍增時間。
形態特征用于EB形成的ES細胞優選是形態上均一的，其中所有或者基本上所有ES細胞都具有相同或者相似的形態特征。
優選地，本發明的方法包括選擇用于EB形成的形態上均一的ES細胞，并平板接種那些細胞用于EB形成。優選地，選擇用于EB形成的所有或者基本上所有(例如，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％或者至少99％)ES細胞具有一種或多種，并且最優選地所有下面的形態特征(無飼養細胞的條件下培養)以扁平單層生長；鄰近細胞不相互直接接觸(但是仍然稠密疊積)；大核；許多核仁；細胞不在相互的上方生長或者以集落樣形式生長。優選地，細胞稠密疊積，例如，細胞的密度為每10cm2培養皿約20×106個細胞(2×106個細胞/cm2)，優選密度為每10cm2培養皿約10-30×106個細胞，例如，15-25×106個細胞。該方法可以包括觀察ES細胞的一種或多種優選的形態特征，和/或選擇具有一種或多種這些特征的細胞。
細胞形態還可以用作增殖狀態的指示劑。高增殖性細胞優選具有一種或多種，優選所有上面列出的形態特征。
優選地，所有培養的ES細胞都來自單個ES細胞，例如，該方法的早期步驟可以包括選擇單個ES細胞集落并從該集落培養ES細胞。從而，可以增加培養物中ES細胞的均勻性和均一性，包括形態均一性。
平板接種密度對于EB形成，所產生的高增殖性細胞和/或形態上均一的細胞應該通常使用每15ml培養基約0.5×106到5×106個細胞，例如，15ml培養基中3×106個細胞接種用于EB形成。通常應該接種約0.3-3.5×105個細胞ml-1，優選1.6-2.5×105個細胞ml-1，最優選2×105個細胞ml-1。15ml培養基是優選的體積，盡管通常在10cm培養皿上可以使用10ml，或者10-15ml。
用于EB形成而平板接種的細胞的密度應該根據所用的ES細胞的增殖狀態來調節。從而，如果ES細胞培養物更稠密，那么應該接種更多細胞，而如果培養物較不稠密，那么應該接種較少的細胞。我們已經發現使用多數快速增殖的ES細胞得到了最好的結果。
例如，可以選擇具有約12-16小時的倍增時間的均一形態的ES細胞并以每cm2約0.5×105個細胞的密度平板接種。
細胞的解離一般在本發明的方法中，細胞的解離優選包括解離細胞(ES細胞或者EB)以形成單個細胞的懸浮液，其基本上缺少多于2或者3個細胞的團聚體。優選地，懸浮液完全是單個解離的細胞(即，懸浮液沒有細胞團聚體)。優選地，懸浮液中的90％、95％、98％或者99％的細胞是單個解離的。優選地，懸浮液中少于5％的細胞形成4個或者更多細胞的團聚體。
使用本文別處詳述的方法，胰蛋白酶(例如，0.05％)和/或研磨可以用于解離細胞。
ES細胞在平板接種用于EB形成之前應該是良好解離的。從而，優選地，本發明的方法包括解離ES細胞以形成單個細胞的懸浮液，其基本上缺少多于2個或3個細胞的團聚體。優選地，懸浮液完全是單個解離的細胞(即，懸浮液沒有細胞團聚體)。優選地，懸浮液中的90％、95％、98％或者99％的細胞是單個解離的。優選地，懸浮液中少于5％的細胞形成4個或者更多細胞的團聚體。
本發明的方法可以包括確定或者估計ES細胞的解離水平。優選地，方法包括解離ES細胞并根據本發明選擇解離細胞的懸浮液。顯微鏡觀察或者常規細胞計數器可以用于確定或者估計解離程度。例如，使用Casy1細胞計數器，如果存在團聚體，那么就檢測到更大直徑的細胞峰。
EB細胞的直接解離EB以懸浮培養，然后解離EB細胞，產生解離的EB細胞的懸浮液。通常，EB在8天后解離，即在用于EB形成的細胞平板接種后第8天，或者在加入RA后4天。解離可以在這之前或者之后進行，但是通常在加入RA后3到5天進行。本領域技術人員能夠通過實驗確定最佳的解離時間。
優選地，EB在解離之前不平板接種在貼壁的基質上，而是保持在非貼壁的培養物中直到細胞解離。從而，EB應該優選在接種之前解離而不是直接平板接種。
EB的解離通常包括將EB與胰蛋白酶(通常0.05％，或者0.01-0.5％)溫育。優選地，本發明的方法包括過濾解離的EB的懸浮液以除去細胞團塊，例如，細胞可以通過網孔或者過濾器過濾，通常用尼龍網孔或者過濾器過濾。通常，使用40μm細胞網孔或者過濾器。在本發明的實施方案中，孔或者網孔直徑優選為至少20、30或者40μm，更優選為100、80、60或者50μm或者更小。
EB細胞的保存本發明的方法可以包括保存解離的EB細胞，例如，在液氮中冷凍細胞。例如，保存可以包括離心細胞，離心后在EB培養基+10％DMSO中重懸浮細胞，并用液氮冷凍細胞。從而，在一些實施方案中，該方法包括解離EB，并保存解離的EB細胞。從而可以得到神經前體的方便的、容易的供應。
冷凍的原種當需要時可以解凍，例如，用于平板接種和培養產生神經元。保存此類前體用于以后使用的可能性以前還沒有在本領域中公布。通常，將細胞解凍并且在解凍后立即重懸浮在培養基，通常10ml N2培養基中，離心(通常以1000轉/分鐘在室溫下離心5分鐘)，并重懸浮(通常在N2培養基中)。
解離的EB細胞的平板接種密度在其中接種EB細胞的方面，我們已經發現EB細胞的接種密度對于細胞存活和分化是重要的。接種太稀減小細胞存活，而接種太密不利地影響分化的速度。接種的密度也影響培養物的純度，即，非神經元細胞對比神經元細胞的量。優選地，應該接種約0.5×105到2.5×105個解離的EB細胞/cm2，例如，約1-2×105，最優選約1到1.5×105個細胞/cm2。
本發明的方法可以包括使用本文描述的方法測量、估計或者確定接種的EB細胞的數目或者密度。
培養基的更換我們已經觀察到，如果在平板接種解離的EB細胞后約2小時更換培養基，那么實現細胞存活率的明顯的很大增加。該發現使得可能產生長期神經元培養物，其直到現在在本領域還是罕見的。
在該上下文中，更換培養基是指更新或者替換培養基。新培養基優選與所解離的EB細胞最初或者以前接種的培養基具有相同組成，即，使用相同類型的培養基。可以使用相似組成的培養基，但是優選地，組成與以前使用的相同。例如，培養基可以是N2培養基。
因此，本發明的方法優選包括解離EB后更換培養基并將解離的EB細胞在培養基中接種。優選地，在接種后約1到6小時更換培養基。
培養基可以在平板接種的6小時內更換，優選在接種的5、4、3或2.5小時內更換。在接種后至少約1小時、1.5小時或者2小時后更換培養基。
最優選地，在接種后約1到3小時，更優選地在約1.5到2.5小時，最優選地約2小時后更換培養基。
平板接種的解離的EB細胞的培養優選在N2培養基中接種解離的EB細胞。
2天后，優選將培養基更換成用于神經元分化的合適的培養基，如“完全培養基”(見實施例)。培養基的選擇和組成可以取決于所希望的神經元譜系。例如，本文所用的完全培養基基于Brewer培養基并且設計成促進錐形神經元的發育。可以選擇其他培養基或者因子來維持不同的神經元譜系，例如，Shh(Sonic hedgehog)來產生膽堿能運動神經元。
我們發現根據本發明產生的前體在植入雞胚后能夠分化成許多不同的特異神經元譜系，包括運動神經元。
在一些實施方案中，優選培養基不含有T3。本文所用的完全培養基是基于Brewer培養基，但是組分中省略T3。在FCS中發現的T3可能抑制神經元分化。
優選地，不使用神經基礎培養基(Neurobasal medium)。神經基礎培養基+B27添加物(都可以從GIBCO得到)通常在現有技術中用于神經元培養。然而，我們觀察到神經基礎培養基可以促進神經膠質細胞發育而不是神經元細胞發育。從而，使用神經基礎培養基可以導致在所產生的神經元細胞中存在不希望的神經膠質細胞。相比，本文使用的完全培養基似乎抑制神經膠質細胞發育，有利于神經元發育。
優選地，平板接種的細胞(解離的EB細胞、神經元前體/祖細胞)在不存在血清的條件下培養，不在血清存在下培養。(血清可以用于在細胞解離后失活胰蛋白酶，但是應該之后例如通過離心沉淀細胞并基本上完全除去上清液來除去血清)。
優選地，生長因子(特別是EGF、FGF/bFGF和PDGF)不存在于培養基中并且不在這些和其他生長因子的存在下培養前體細胞或者祖細胞。
方法可以包括培養神經元，并且神經元也優選不在血清的存在下培養并且優選不在生長因子，特別是EGF、FGF/bFGF或PDGF的存在下培養。
此外，本發明的方法不需要并且優選不包括陽性或者陰性選擇步驟，例如，Sox-2遺傳選擇，以富集神經細胞或者神經元，盡管如果希望，可以使用此類選擇步驟。即使沒有選擇步驟，本發明的方法也基本上產生均一的神經細胞群體。優選地，本發明的方法不包括對非神經或者非神經元細胞類型(例如，分裂的細胞)進行陰性選擇的步驟。優選地，本發明的方法不包括陽性選擇以富集神經細胞或者神經元的步驟。已知的選擇方法包括遺傳選擇，例如，對Sox-2陰性細胞進行Sox-2選擇，和將細胞與陰性選擇劑接觸以抑制和/或殺死非神經或非神經元細胞，例如，將細胞與抗促分裂劑如AraC或者FRDU接觸以抑制和/或殺死正分裂的細胞。
ES細胞胚胎干細胞是從哺乳動物胚泡的內細胞團分離的多能干細胞。用于本發明的胚胎干細胞可以來自任意哺乳動物，其可以是人或者非人，如豚鼠、大鼠、小鼠或者其他嚙齒動物、貓、狗、豬、綿羊、山羊、牛、馬或者靈長類動物，例如，猴。通常使用小鼠ES細胞。
在本發明中，ES細胞通常是多能細胞，不是全能細胞，并且不能產生生殖細胞。用于本文中實施例的ES細胞是多能的。任選地，可以使用全能ES細胞。
許多ES細胞系是本領域已知的并且可以用于本發明(例如，J1、E14)。
設計ES細胞以允許可以使用選擇步驟，例如Sox2選擇。
如本文別處描述的，用于本發明的ES細胞可以是靶定細胞系或者遺傳操作的細胞系，該靶定細胞系或者遺傳操作的細胞系含有導入的基因或者突變基因或者過表達內源基因。
可以使用包含有效連接啟動子(例如，用于神經元特異的表達的啟動子)的報道基因的ES細胞系。我們描述了本文的Tau-GFP細胞系的應用。Tau基因座的性質包括所插入的cDNA的高相關表達水平、高重組效率、僅在神經元中表達，并且Tau敲除者沒有明顯的表型。我們使用tau基因座插入將研究的cDNA。Tau可以容易地被多種cDNA置換，或者cDNA可以插入Tau基因座(從而它們的表達有效連接Tau啟動子)，以快速建立在神經元中特異的高水平穩定表達(參考文獻42)。
神經細胞如本文使用的，除非上下文中指出，神經細胞是神經系統的細胞，并且包括神經干細胞、神經元前體細胞或者祖細胞，和神經元(神經元細胞)。術語“神經元”和“神經元細胞”可以互換使用。
“干細胞”是指可以自身更新的任何細胞類型，如果它是多能的或者神經干細胞，那么可以產生神經系統中的所有細胞類型，包括神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。干細胞可以表達一種或多種下面的標記Oct-4；Sox1-3；時期專一的胚胎抗原(SSEA-1、-3和-4)(Tropepe等人，2001，Neuron 30，65-78)。神經干細胞可以表達一種或多種下面的標記巢蛋白；p75神經營養因子受體；Notch1、SSEA-1(Capela和Temple，2002，Neuron35，865-875)。
“神經祖細胞”是指神經干細胞的子細胞或者后代，與所述干細胞相比具有更分化的表型和/或更小的分化潛力。前體細胞是指在發育期間與神經元處于或不處于直接譜系的任意其他細胞，其在確定的環境條件下可以誘導而轉分化或者再分化或者獲得神經元表型。
“譜系”是指一種確定的細胞類型的子代或者從該細胞類型得到的細胞。“亞譜系”是指某種譜系的亞型。
標記的檢測和細胞類型的鑒定本發明的方法優選產生細胞群體，其中至少80％、至少85％、至少90％或者至少95％的細胞是神經元前體/祖細胞，例如，放射狀神經膠質細胞，或者神經元，例如，錐形神經元。方法優選包括鑒定至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％的細胞是神經元前體/祖細胞，例如，放射狀神經膠質細胞，或者神經元，例如，錐形神經元。本發明的神經元細胞培養方法優選產生具有少于5％星形膠質細胞，例如，少于4％、3％、2％或者1％的細胞群體。
如上述的本發明的方法優選為諸如實現這些比例。本發明提供了使用如上述的一個或多個方法步驟和特征實現、產生或者生成這些比例的細胞的方法。
本發明的方法可以包括鑒定解離的EB細胞為神經元前體，或者(下面接種的培養物)為神經元。該方法可以包括確定、觀察或者證實至少80％、至少85％、至少90％或者至少95％的細胞并鑒定至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％的細胞是神經元前體/祖細胞，例如，放射狀神經膠質細胞，或者神經元，例如，錐形神經元。通常，通過本文描述的神經元細胞培養方法產生的細胞中少于5％的細胞是星形膠質細胞，例如，少于4％、3％、2％或者1％。
通過觀察細胞形態，例如，通過顯微鏡檢查可以確定細胞譜系和/或細胞類型。該方法可以包括至少在所產生的這些比例的細胞中觀察神經元前體/祖細胞形態或者神經元細胞形態。神經元前體/祖細胞可以延長和/或具有兩極紡錘體形態。通過觀察神經元形態可以確定神經元譜系，例如，錐形神經元是三角形并且具有分枝的軸突延伸，而膽堿能神經元具有兩極形態。
根據本發明的方法產生的細胞可以備選地或者額外地通過檢測標記，通常被抗體識別的細胞表面標記來鑒定。該方法可以包括檢測一種或多種標記的存在，其存在表明細胞是特定譜系或者亞譜系，或者特定細胞類型或者亞型。技術人員已知可以鑒定并且用作譜系或者細胞類型的指示的標記。
例如，本發明可以包括檢測細胞上標記Pax6的存在并鑒定細胞為神經元前體，例如，放射狀神經膠質細胞。可以檢測的其他標記包括巢蛋白、RC2和BLBP，其存在于放射狀神經膠質細胞上，和p75、GluR1、突觸泡蛋白、Trk(例如，TrkA、TrkB、TrkC)和APP，其存在于某些神經元細胞上。
該方法可以包括檢測高百分比的表達神經元前體標記的細胞，例如，至少80％、至少85％、至少90％或者至少95％的細胞，并鑒定至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％的細胞為神經元前體。
該方法可以包括檢測高百分比的表達神經元前體標記的細胞，例如，至少80％、至少85％、至少90％或者至少95％的細胞，并鑒定至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％的細胞為神經元，優選確定譜系的神經元，例如，錐形神經元或者多巴胺能神經元。
從而，該方法可以產生神經元前體細胞或者神經元的基本上均一的群體。至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％的細胞可以是相同類型/譜系或者亞型/譜系，例如，相同類型的神經元前體，例如，放射狀神經膠質細胞或者相同譜系的神經元，如錐形神經元。
本文的實例提供了多種標記的表達的時間過程和隨著時間的形態發展。本發明的方法可以包括在EB解離后(如實施例中指出)的某些時間檢測標記和/或觀察特定形態，例如，在EB解離后2天內觀察神經元形態和/或在約7天后檢測Trk受體的表達。例如，本文中闡明通過本發明的方法產生的約99％的細胞是放射狀神經膠質細胞，如通過檢測99％的解離的EB細胞的RC2+表達所指出。本文中還顯示至少80％的神經元可以通過本發明的方法常規地產生，如通過在EB解離后約7天后測量vGLUT1和GFP的表達或者計數所指出。
百分比可以計算為表達核標記，例如DAPI或者Hoechst的％存活細胞或者％細胞。
EB的形成和用RA治療一般在本發明的方法中，在培養基中形成并培養EB細胞。在EB形成和培養期間，通常每兩天更換培養基。
通常，在本發明的方法中，在RA的存在下培養EB一天或者多天，通常2、3或者優選4天，或者多達5、6、7或者8天。在與RA接觸前，可以最初在RA缺失下培養EB一天或多天，通常2到6天，通常2、3、或者優選4天，或者多達5天或者6天。Bain等人和Li等人使用了4-天/4+天的步驟。
技術人員可以選擇合適濃度的RA。例如，濃度可以為例如至少0.25μM，至少0.5μM或者至少1μM。濃度可以為例如，10μM或者更小，7.5μM或者更小或者5μM或者更小。優選地，濃度為0.5到5μM(包括0.5和5μM)。例如，濃度可以為1μM或者5μM。
神經細胞測定本發明的其他方面提供了用神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞進行的細胞測定方法，所述細胞通常是體外產生的細胞(不是原代神經元)并且優選是本發明的方法產生的細胞。該測定方法可以包括如本文描述的本發明方法，其用于產生神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元。本發明的方法可以包括進行如本文描述的本發明的方法用于神經分化(產生神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元)，并且還包括本文描述的細胞測定方法的步驟。
從而，上面描述的神經分化方法可以用于測定法的上下文中。
此外，由于我們已經首次提供了神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞的基本上均一的培養物/群體，所以本發明還提供了用神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞的基本上均一的培養物/群體進行的測定方法，所述細胞可以是或者不是由本發明的神經分化方法產生，但是通常通過體外方法產生。
本發明的測定方法可以包括檢測、定量、觀察或者確定神經元前體細胞或者祖細胞，或者神經元的一種或多種特征(“神經元特征”)，例如，軸突生長或者軸突延長/退化、神經元形狀、神經元細胞死亡、神經發生、神經元分化、電活性、突觸發生和/或神經元細胞標記。
在一些實施方案中，本發明的測定方法可以包括用于產生神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞的本文描述的神經分化方法，其中該方法還包括在測試條件下培養ES細胞和/或EB，并檢測、定量、觀察或者確定神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞的一種或多種神經元特征。
在其他實施方案中，本發明的測定方法可以包括在測試條件下培養神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞；并檢測、定量、觀察或者確定細胞的一種或多種神經元特征。任選地，根據本文別處描述的神經分化方法可以產生和/或培養所述細胞。
測定方法可以任選包括比較在測試條件(“測試培養”)下的神經元特征與在第二種條件(“對照培養”)下培養的細胞的神經元特征，任選與從第二種條件下培養的細胞的組織學數據比較。方法可以包括在第二種條件下培養細胞。
從而，測定方法可以包括本文描述的神經分化方法，其用于產生神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞，所述方法包括在第一種和第二種條件下培養ES細胞或者EB細胞；并分別比較在第一種條件下培養的神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞的一種或多種神經元特征與在第二種條件下培養的神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞的一種或多種相同的神經元特征。
在測試條件或者第一種條件下培養可以包括將細胞與測試化合物接觸或者將細胞暴露于測試化合物或者將細胞在測試化合物的存在下培養，測試化合物可以加入或者包括在培養基中。在第二種條件下培養可以包括在所述測試化合物不存在時培養，或者不將細胞接觸或暴露于測試化合物。
測試化合物可以是任一分子或者可以來自測試化合物文庫。在一些實施方案中，測試化合物是雙鏈RNA(dsRNA)分子，并且在第一種或測試條件下培養包括將ES細胞或者EB細胞暴露于雙鏈RNA分子從而通過RNA干擾(RNAi)抑制細胞中的基因。
已經發現dsRNA在基因沉默中比僅僅有義或者反義鏈更有效(Fire A.等人Nature，Vol 391，(1998))。dsRNA介導的沉默是基因特異的并且通常稱作RNA干擾(RNAi)(也參見Fire(1999)Trends Genet.15358-363，Sharp(2001)Genes Dev.15485-490，Hammond等人(2001)Nature Rev.Genes 21110-1119和Tuschl(2001)Chem.Biochem.2239-245)。
RNA干擾是兩步過程。首先，dsRNA在細胞內被切割產生長約21-23nt的短的干擾RNA(siRNA)，其具有5’末端磷酸和3’短突出端(-2nt)。siRNA靶定對應的mRNA序列特別用于破壞(Zamore P.D.Nature StructuralBiology，8，9，746-750，(2001)。
使用化學合成的具有3’-突出端的相同結構的siRNA雙鏈體可以有效誘導RNAi(Zamore PD等人Cell，101，25-33，(2000))。已經證明，合成的siRNA雙鏈體特異抑制多種哺乳動物細胞系中內源和異源基因的表達(Elbashir SM.等人Nature，411，494-498，(2001))。可以使用含有20到25bp，更優選21到23bp序列的siRNA雙鏈體。
備選地，可以在體外(用于回收和利用)或體內產生siRNA。
在其他實施方案中，測試化合物可以是核酸(DNA、cDNA或者RNA)，任選地，編碼基因，例如，cDNA。從而，測試化合物可以是編碼基因的載體，其中將細胞暴露于核酸或者載體導致該基因在細胞中表達。在一個實施方案中，載體可以在有義和反義方向包含根據本發明的核酸序列，從而當作為RNA表達時，有義和反義部分將結合而形成雙鏈RNA。這可以例如是長的雙鏈RNA(例如，長于23nt)，其可以在細胞中被加工而產生siRNA用于RNAi(見例如，Myers(2003)Nature Biotechnology 21324-328)。
在其他實施方案中，測試化合物可以是抗體。
從而，測定方法可以鑒定增加或者減少目的特征的化合物或者條件。
通常用神經元細胞進行比較，例如，接種解離的EB細胞后一周進行比較。
測試和對照培養物通常是兩種單獨的培養物，它們在其他方面相同的條件下培養。當條件是存在測試化合物，特別當它是核酸時，在測試條件或者第一種條件下培養可以包括將細胞(特別是ES細胞或者解離的EB細胞)暴露于測試化合物然后培養細胞。
通過導致并允許神經元特異的報道基因表達，并檢測或定量該報道基因的表達，可以檢測神經元特征(例如，軸突生長或者軸突延長)。報道基因可以編碼熒光蛋白，例如，綠色熒光蛋白(GFP)。報道基因可以靶定或者有效連接神經元特異的基因座或者啟動子(如tau基因座或者啟動子)用于神經元特異的表達。已經描述了神經元特異的報道基因從tau基因座的表達(Tucker等人(42))。一旦細胞分化成神經元，報道基因的表達就被接通，并且僅在神經元，而不在神經系統的前體或者其他細胞類型中表達。包括神經元細胞測定法的本發明的方法可以使用含有報道基因的細胞系(ES細胞)，其具有神經元特異的表達，所述報道基因有效連接僅在神經元中表達的啟動子或者基因座(例如，如本文別處描述的Tau-GFP細胞系)。
本發明還提供了用于鑒定抑制或者減小神經元特征的增加的試劑的方法，所述神經元特征的增加由已知增加所述特征或者與所述特征的增加有關的條件產生(例如，在一些實施方案中，其中該條件是在淀粉狀蛋白β肽的存在下培養)，即，鑒定減小或者抑制與這種條件有關的效應的試劑。
這種測定法可以包括在試劑存在下并且在已知增加神經元特征或者與神經元特征有關的條件下培養神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞；在所述試劑不存在并且在已知增加神經元特征的條件下培養神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞；
定量或者測定神經元特征的水平；并比較存在試劑時的神經元特征的水平與不存在該試劑時神經元特征的水平；其中，與不存在試劑時相比，存在試劑時神經元特征的較低水平表明該試劑抑制或者減小所述條件產生或者與該條件相關的神經元特征的增加。
已知增加神經元特征或者與神經元特征的增加有關的條件可以是通過本發明的測定法鑒定為增加神經元特征的條件的條件。
例如，當測試化合物是核酸(例如，dsRNA)時，在已知增加神經元特征的條件下培養可以包括將細胞暴露于核酸然后培養細胞。
用試劑培養和在所述條件下培養可以同時進行，或者用試劑培養可以在所述條件下培養之前進行，或者在所述條件下培養可以在用試劑培養之前進行。技術人員可以確定合適的順序，并且在一些實施方案中，一種順序可以比另一種順序優選。例如，細胞優選暴露于核酸，然后在試劑的存在下培養。
軸突延長或者退化本發明的方法可以包括定量軸突生長、軸突延長或者軸突退化。定量可以包括確定軸突特異性蛋白質的表達水平，其中較高的表達水平表明較高水平的軸突生長和/或軸突延長和/或較低水平的軸突退化，并且其中較低的表達水平表明較低水平的軸突生長和/或軸突延長和/或較高水平的軸突退化。定量可以包括導致或允許神經元特異的報道基因表達并測量報道基因的表達水平，從而定量軸突生長、軸突延長或者軸突退化。例如，當報道基因編碼熒光蛋白，如GFP時，表達水平的測量包括測量熒光。本發明的方法可以包括定量軸突生長、軸突延長或者軸突退化，通過將神經元與針對軸突標記(如微管蛋白、神經絲、突觸泡蛋白)的抗體接觸，并測定或者定量結合所述標記的抗體，從而檢測或者定量軸突生長或者延長來進行所述定量。
神經元與抗體接觸可以在裂解細胞后，用細胞提取物進行(例如，在蛋白質印跡上)。備選地，可以將完整神經元接觸抗體。
測定方法可以包括將神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞分別在第一和第二種條件下接觸，并比較在第一種條件下培養的神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞與在第二種條件下培養的神經元前體或者祖先或者神經元的軸突生長、延長或者退化。例如，當在第一種條件下培養的細胞中軸突生長、延長或者退化高于(如通過軸突特異的蛋白質的表達水平的升高/降低指出，見上面)在第二種條件下培養的細胞中時，這表明第一種條件(相對于第二種條件)分別增加軸突生長、延長或者退化。
在優選實施方案中，在第一種條件下的培養包括在受試化合物存在下培養細胞，其中受試化合物優選為淀粉狀蛋白(Aβ)肽(來自淀粉狀蛋白前體蛋白，APP)。
本發明提供了鑒定抑制或者減小一種條件產生的軸突退化加劇的試劑的測定方法，已知所述條件增加軸突退化(例如，其中該條件是在淀粉狀蛋白β肽的存在下培養)，即，鑒定減小或者抑制與這種條件有關的效果的試劑的測定法。該測定法可以包括在試劑和已知增加軸突退化的條件下培養神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞；在試劑不存在和已知增加軸突退化的條件下培養神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞；定量或者測定存在和不存在試劑時軸突退化的水平；并比較存在試劑時的軸突退化水平與不存在試劑時的軸突退化水平；其中與不存在試劑時相比，存在試劑時的軸突退化的較低水平表明該試劑抑制或者減小所述條件產生的或者與該條件有關的軸突退化的增加。
如上指出，比較突觸退化的水平可以包括比較突觸特異的蛋白質的表達水平，其中與不存在試劑相比，存在試劑時的表達的較高水平(較低的降解水平)表明該試劑抑制或者減小所述條件產生的軸突退化的增加。
所述條件可以是化合物的存在，該化合物可以是通過本發明的測定方法鑒定的能夠增加軸突退化的化合物Aβ肽。
神經元細胞死亡本領域存在對神經元細胞死亡測定法的需要，并且此類測定法由本發明提供。
神經元細胞死亡測定法可以用于測試或者測定神經元或者神經元細胞群體對給定條件，例如，一種或多種化合物的存在的敏感性，例如，以鑒定增加或者減小神經元細胞死亡的條件(例如，化合物)。
例如，根據本發明的測定法可以包括在第一種條件下培養神經元(“測試培養”)；在第二種條件下培養神經元(“對照培養”)；定量或者測定在第一種和第二種條件下的神經元細胞死亡；和比較在第一種條件下神經元細胞死亡的水平與在第二種條件下神經元細胞死亡的水平；其中與第二種條件下相比，在第一種條件下神經元細胞死亡的較高水平表明第一種條件增加細胞死亡；和/或其中與第二種條件相比，在第一種條件下神經元細胞死亡的較低水平表明第一種條件減小神經元細胞死亡。
在神經元細胞死亡測定中，特別是用于鑒定減小神經元細胞死亡的條件的測定中，神經元優選遺傳上傾向于細胞凋亡。例如，神經元可以表達p75神經營養因子受體，和/或可以表達有效連接神經元特異的啟動子(例如，Tau基因座)的細胞凋亡蛋白(例如，胱天蛋白酶)。因此，用于本發明以產生用于神經元細胞死亡測定的神經元的ES細胞可以表達有效連接神經元特異的啟動子(例如，Tau基因座)的細胞凋亡蛋白(例如，胱天蛋白酶)。
神經元細胞死亡測定可以用于鑒定抑制或者減小已知增加神經元細胞死亡的條件產生的神經元細胞死亡的增加的試劑，即，減小或者抑制這種條件的效果的試劑。該測定可以包括在試劑存在和已知增加神經元細胞死亡的條件下培養神經元；
在試劑不存在和已知增加神經元細胞死亡的條件下培養神經元；定量或者測定存在和不存在試劑時神經元細胞死亡的水平；并比較存在試劑時的神經元細胞死水平與不存在試劑時的神經元細胞死亡水平；其中與不存在試劑時相比，存在試劑時的神經元細胞死亡的較低水平表明該試劑抑制或者減小所述條件產生的神經元細胞死亡的增加。
通過本領域已知的方法，例如，通過測定神經元中細胞凋亡的誘導機制，可以測定細胞死亡。可以確定的細胞死亡的指征包括凋亡蛋白(例如，胱天蛋白酶，特別是胱天蛋白酶-3，見，參考文獻43)的誘導、用碘化丙錠染色和/或DNA片段化和/或核小體破壞(例如，通過抗體與DNA和/或組蛋白的結合可以檢測，見參考文獻44)。
神經發生和神經元分化本發明的方法可以包括神經發生或者神經元分化的測定法，其中檢測和/或定量神經元的產生或者生成或者ES細胞和/或神經元前體和/或祖細胞的分化。該方法可以包括檢測和/或定量一種或多種神經元特異的標記。本發明的方法可以包括監視一種或多種特定神經元亞型或者譜系的神經發生的水平，或者通常神經元的水平，這取決于所選的標記。通過檢測和/或定量譜系特異的標記，可以測定確定譜系的神經元的產生。方法可以包括將細胞與針對細胞標記的抗體接觸并測定結合，其中標記的存在(因此抗體結合)表明細胞是特定細胞類型、亞型、譜系或者亞譜系的細胞。方法可以包括測定或者定量抗體結合水平，并因此測定或定量細胞的分化水平、分化階段，和/或特定類型、亞型、譜系或者亞譜系或特定分化階段的細胞百分數。關于標記的檢測和細胞類型的鑒定的更多細節包含在本文中，并且適宜的標記是本領域技術人員已知的。
本發明的神經元分化測定方法適于測定標記，所述標記可以用于鑒定特定分化階段的ES細胞和/或神經細胞，或者鑒定細胞的類型或亞型，從而指出該細胞或者細胞類型或者亞型的分化狀態。例如，測定方法可以包括誘導或者允許ES細胞分化以產生神經元前體細胞或者祖細胞，和/或培養神經元前體細胞或者祖細胞以產生神經元(優選使用如本文別處描述的神經分化方法)；比較在一種分化階段下細胞中蛋白質的表達水平與第二種分化階段下細胞中蛋白質的表達水平；和鑒定在第一種和第二種分化階段下細胞中表達水平不同的蛋白質。表達水平的不同表明該蛋白質可以用作標記來指出細胞的分化狀態、類型或者亞型和/或區分在第一種和第二種分化狀態下的細胞。使用本領域技術人員可以確定的任意合適的方法可以比較表達水平。優選地，比較在細胞表面蛋白質的表達，例如，將細胞或者細胞提取物與抗體的表面表達文庫接觸并測定結合。例如，該方法可以包括比較神經元前體/祖細胞(例如，放射狀神經膠質細胞)與ES細胞中蛋白質的表達。
表達水平的差異可以例如為至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.8倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍，或者以上。可以檢測第一種分化階段下細胞中的表達并且根本不檢測第二種分化階段下細胞中的表達。
電活性可以觀察、檢測、測定或者定量神經元中電活性，例如指示特定通道(例如，離子通道)的打開的電活性的水平。
測定方法可以用于鑒定能夠調節神經元的電活性的化合物。方法可以包括在第一種條件下培養神經元，在第二種條件下培養神經元，并比較分別在第一種條件下培養的神經元的電活性與第二種條件下培養的神經元的電活性。電活性的差異表明該條件調節電活性。
突觸發生測定方法可以包括檢測或定量神經元細胞中的突觸發生。檢測或定量可以包括測量細胞的電生理活性和/或檢測或測量表明突觸發生的一種或多種標記(例如，突觸泡蛋白)的表達。
遺傳上不同的神經元的比較本發明提供了比較參照(通常野生型)神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元與突變的神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元的方法，所述神經元具有不同的表型。該方法可以包括上述用于產生神經細胞的方法。
因此，本發明提供了方法，其包括提供神經元細胞或神經元前體細胞或者祖細胞的第一種和第二種培養物，其中第一種培養物中的細胞與第二種培養物中的細胞具有不同表型；和比較第一種培養物中的神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元與第二種培養物中的神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元。
可以比較目的基因中具有和不具有突變的神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞。突變可以是例如所有或者部分基因的缺失，所有或者部分基因啟動子和/或增強子的缺失，或者在編碼區、啟動子或者增強子中一個或多個核苷酸的替代。通常，突變導致改變的(減小或者增加)基因表達水平，或者突變蛋白質(例如，在其氨基酸序列中截短的或者含有一個或多個缺失或替代)的表達。備選地，第一種培養物中的神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞可以含有導入的基因(例如，插入的基因或者插入的cDNA)或者過表達內源基因，而第二種培養物中的神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞則否。
ES細胞可以被遺傳操作并且可以在ES細胞中誘導突變，或者可以從攜帶突變的動物，例如，具有目的突變的小鼠ES細胞分離ES細胞。本發明的方法可以使用具有和不具有目的突變的ES細胞，以產生具有和不具有目的突變的神經細胞，例如，分別地神經元或者神經元祖細胞/前體細胞。從而，本發明可以產生突變的和野生型神經細胞，例如，神經元或者神經元祖細胞/前體細胞。可以例如進行從不同ES細胞類型(一種具有目的突變，另一種不具有)產生的神經細胞之間的比較以鑒定負責或者促進神經變性疾病中神經細胞類型損失的機理，和鑒定疾病表型中相關的靶標。
在一些實施方案中，該方法可以包括分別從ES細胞的第一種和第二種培養物產生神經元前體/祖細胞或者神經元，其中第一種和第二種培養物中的ES細胞具有不同表型。任選地，通過如本文別處描述的方法可以從ES細胞產生神經元前體/祖細胞或者神經元。第一種培養物中的ES細胞可以含有目的基因中的突變，而第二種培養物中的ES細胞不含有該突變(例如，野生型細胞)。備選地，第一種培養物中的ES細胞可以含有導入的基因或者過表達內源基因，而第二種培養物中的ES細胞則否。
作為使用遺傳上不同的ES細胞的備選方案，可以在遺傳上操作解離的EB細胞。方法可以包括用核酸構建體轉染解離的EB細胞、或者神經元前體細胞或者祖細胞的第一種培養物，從而與第二種培養物中的細胞相比，改變第一種培養物中細胞的表型。例如，核酸構建體可以編碼內源基因，或者編碼含有突變的目的基因。本發明的此類方法通常包括允許從核酸構建體表達(通常瞬時表達，持續約2、3或者4天)。該方法可以包括培養細胞以產生神經元細胞。第一種培養物中的細胞將與第二種培養物中的神經元前體、祖細胞或者神經元細胞比較，其中第二種培養物中的細胞不含有所述核酸構建體、導入的基因和/或突變。
比較神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元可以包括比較(通常測定或定量)一種或多種特征，如軸突生長或者軸突延長、神經元形狀、神經元細胞死亡、神經發生、神經元分化、電活性、突觸發生和/或神經元細胞標記。在其他實施方案中，比較可以包括比較目的基因，例如，導入的或突變的或過表達的基因的讀數，或者該基因的效果。讀數的性質取決于該基因，但是可以由技術人員為給定基因確定。從而，可以闡明、阻斷和/或操作神經元信號傳遞機制。
比較神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞可以包括比較在測試條件下該細胞的一種或多種特征，并且比較遺傳上不同的神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞的方法可以用于本文別處描述的測定方法的上下文中。從而，在優選實施方案中，細胞的第一種和第二種培養物每種培養在測試條件下，并比較細胞的神經元特征。其他方法和變通方案如上面關于細胞測定所描述。例如，在測試條件下培養可以包括在Aβ肽存在下培養。
抗體如本文所用，“抗體”覆蓋具有結合結構域的任意特異性結合物質，所述結合結構域具有所需的特異性。從而，該術語覆蓋抗體片段、抗體的衍生物、功能等同物和同源物，包括包含免疫球蛋白結合結構域的天然或合成的任意多肽。因此包括嵌合分子，其包含融合另一多肽的免疫球蛋白結合結構域或者等同物。嵌合抗體的克隆和表達在EP-A-0120694和EP-A-0125023中描述。
已經表明完整抗體的片段可以執行結合抗原的功能。結合片段的實例為(i)由VL、VH、CL和CH1結構域組成的Fab片段；(ii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iii)由單一抗體的V1和VH結構域組成的Fv片段；(iv)由VH結構域組成的dAb片段(Ward，E.S.等人，Nature341，544-546(1989)；(v)分離的CDR區；(vi)F(ab’)2片段，其是包含兩個連接的Fab片段的二價片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結構域和VL結構域通過肽接頭連接，該接頭使得兩個結構域結合而形成抗原結合部位(Bird等人，Science，242，423-426，1988；Huston等人，PNAS USA，85，5879-5883，1988)；(viii)雙特異性單鏈Fv二聚體(PCT/US92/09965)和(ix)“雙抗體”，其是通過基因融合構建的多價或者多特異性片段(WO94/13804；PHolliger等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA90 6444-6448，1993)。
雙抗體是多肽的多聚體，每個多肽包含第一個結構域和第二個結構域，第一個結構域包含免疫球蛋白輕鏈的結合區，第二個結構域包含免疫球蛋白重鏈的結合區，兩個結構域相連(例如，通過肽接頭)但是不能彼此結合形成抗原結合部位抗原結合部位通過多聚體內一個多肽內的第一個結構域與該多聚體內另一多肽的第二個結構域結合形成(WO94/13804)。
可以以多種方式修飾抗體，例如，它們可以經標記，例如，用熒光標記物標記，使得可以通過測量熒光水平定量抗體的結合。
考慮到本公開，本發明的多種其他方面和實施方案將是本領域技術人員顯而易見的。
本說明書中提到的所有文獻都完整引入本文作為參考。
現在將僅通過實施例并參考

圖1闡明本發明的實施方案的一些方面，圖1顯示了在接種解離的EB細胞后在所選的時間點的％Pax6陽性細胞。Pax-6最初由多數細胞表達但是快速消失。結果代表用2種不同ES細胞系進行的4個獨立實驗的平均值。它們表達為％±SD，100％為DAPI陽性細胞核的數目。
實施例ES細胞的培養導致從ES細胞產生神經元的該方法包括下面的步驟，概述如下1.培養在飼養層上的細胞以集落生長，然而飼養層耗竭后，它們作為扁平單層生長。
2.非貼壁細菌培養皿上的ES細胞形成懸浮生長的細胞團聚體(EB)。
3.EB形成4天后，加入RA再培養4天。
4.共8天后EB解離并將其接種在PDL/層粘連蛋白包被的培養皿上N2培養基中。
5.N2培養基在2小時后更換，12-24小時后再次更換。在該階段，多數前體細胞具有紡錘形形態。在30-48小時后加入神經元分化培養基。
使用表達來自tau基因座的GFP(參考文獻13)的ES細胞對該方法顯色。GFP從內源啟動子的表達允許在紫外線下觀察神經元和它們的過程，并且我們用它最大化熒光細胞的產生。
解凍后，首先將ES細胞培養在飼養細胞上進行2-3次傳代，然后漸進地耗竭飼養細胞。然后用確定數目(3×106)的細胞形成團聚體(胚狀體，EB)，其在非貼壁的細胞培養皿(10cm培養皿，15ml培養基)中培養8天。4天后加入視黃酸(RA，5μM)并經過最后4天。一個重要步驟是選擇具有均一、扁平形態和高增殖速率的飼養細胞耗盡的ES細胞(見材料和方法)。
8天后，用新鮮制備的胰蛋白酶懸浮液解離EB細胞并將其接種在由聚-D-賴氨酸(PDL)和層粘連蛋白組成的基質上。發現接種密度(1.5×105個細胞/cm2)是關鍵的，因為較低密度的細胞傾向于快速死亡。將解離的細胞接種在無血清培養基中，接種后2小時更換培養基以除去殘渣和死亡的細胞。一天(約24小時)后再次更換培養基。48小時后，用富含補充物(參考文獻12)的無血清培養基更換培養基。除了表達來自兩個tau等位基因的GFP的ES細胞外，我們還使用了超過7種其他的ES細胞系，結果與該研究中報導的結果無差別。這些細胞系包括野生型J1和E14ES細胞，以及GFP在一個或兩個tau等位基因中的J1。我們還從混合的BL6/SV129背景的胚泡分離了四種不同的ES細胞系并將它們進行我們的分化方案，得到相似結果。
神經元前體ES細胞分化成放射狀神經膠質細胞的均一群體。
從EB解離的細胞采取了明顯延長的、紡錘形形態，其暗示放射狀神經膠質細胞的形狀(見參考文獻16)。相差圖像圖解了在2小時分化后的二極紡錘形態。
通過用針對中間絲蛋白巢蛋白的抗體(參考文獻9)染色，將這些細胞鑒定為神經前體細胞。接種后2小時，發現與通過細胞核染色定量的接種細胞的總數目比較時，多數細胞對于巢蛋白為陽性(表I)。
我們然后使用RC2，其是所有放射狀神經膠質細胞表達的一種標記物，并且發現幾乎所有細胞都是陽性的(表I)。用針對腦脂類結合蛋白(BLBP)對抗體染色進一步證實了從EB新鮮解離的細胞的身份(表I)，發育中的CNS中放射狀神經膠質細胞也表達BLBP。同源域轉錄因子Pax-6由所有皮質神經膠質細胞表達(參考文獻19)并且發現EB中的基本上所有細胞都在它們解離前表達，這意味著在該階段，它們已經是前體細胞。
接種后2小時的定量揭示多數細胞都是Pax-6陽性的(圖1)，并且其表達在后面的幾天中快速下降到在7天后基本上不存在(圖1)。
表1
接種后2小時％神經元前體。接種解離的EB后2小時，通過免疫細胞化學分析巢蛋白、RC2、BLBP、Pax-6。確定相對于通過細胞核標記DAPI染色的細胞總數，陽性細胞的百分數(±SD)。
神經元分化在EB解離后2天內開始出現具有神經元形態的細胞。所有正分化的細胞都表達GFP，表明它們是神經元。通過用染色實驗證實了該結論，該實驗中使用的抗體識別微管蛋白的神經元特異形式。
4天后，約85％的細胞都是GFP-和微管蛋白陽性的。通過相差和熒光，我們被神經元細胞體的非常均一的外觀所震驚。隨著培養的進行，它們越來越采用從嚙齒動物海馬分離的細胞觀察到的錐形性狀(參考文獻20)。當用針對突觸泡蛋白的抗體染色時，看到許多簇內襯在GFP-陽性過程中，表明在我們的培養物中可以產生突觸接觸。
為了測試這些神經元是否使用谷氨酸作為神經遞質，我們用針對泡狀谷氨酸轉運蛋白vGlut1的抗體將細胞染色，vGlut1是大腦皮質和海馬中多數錐形神經元表達的一種膜蛋白(參考文獻21)。培養7天后，將93±4.7％的細胞用vGlut1抗體染色。用vGlut1抗體得到的發現與將神經元鑒定為錐形細胞相一致。在EB解離后第一周結束時，少于0.1％的細胞對Is1-1、酪氨酸羥化酶和膽堿乙酰基轉移酶陽性染色。少于5％的細胞在3周后為GABA陽性。
為了鑒定在從放射狀神經膠質細胞到神經元過渡期間表達的蛋白質，我們使用在不同時間間隔制備的體外分化的神經元進行了蛋白質印跡分析。
盡管在放射狀神經膠質細胞的裂解物中檢測不到，但是AMPA受體亞基GluR1像突觸泡蛋白一樣，在培養幾天后可以清楚地檢測到。隨著神經元開始分化，GluR1和突觸泡蛋白蛋白質水平增加。
由于錐形神經元在大腦皮質和海馬中都表達高水平的Trk受體(參考文獻22)，我們還使用針對這些神經營養因子受體的細胞內結構域的抗血清分析了它們的表達。盡管在第5天時，幾乎檢測不到Trk受體，但是在接下來的幾天內，它們的水平顯著增加。約7天后在體外觀察到Trk受體的大量表達，之后它顯著增加。相反地，發現在神經元成熟期間，神經營養因子受體p75的水平下降，跟它們在體內的情況很像(參考文獻23)。
最后，我們測試了淀粉樣蛋白前體(APP)的表達。已經表明，該膜蛋白被放射狀神經膠質細胞表達(參考文獻24)，以及被包括神經元的許多細胞在發育后期表達。我們的結果表明，不像所測試的其他膜蛋白，在放射狀神經膠質細胞的裂解物中清楚地檢測到APP。表達水平隨后增加，可能是由于神經元成熟的結果，神經元成熟包括神經元過程的顯著生長。植入的前體的體內分化本發明的神經元前體細胞的發育潛力是通過將它們植入雞胚中來測試的，在雞胚中，所述細胞可以分化成不同的特異神經元譜系，包括運動神經元。
電生理學電生理學實驗表明神經元形成突觸，顯示出AP并且在電生理學特征中非常均一。神經元主要是谷氨酸能的(通過用NBOX阻斷突觸電流，vGAT染色證明)，具有一定的γ-氨基丁酸能輸入(用荷包牡丹堿阻斷，否則培養物將不存活)。電生理學清楚地表明在所用的條件下不存在其他神經元細胞類型。
為了表征我們的ES細胞來源的神經元的電生理學特征，對培養10到最多22天的細胞進行全細胞膜片鉗記錄。所有研究的細胞(n＝22)都顯示出自發的或者去極化誘導的動作電位并且在所有情況中，這些都可以通過應用河豚毒素阻斷。而且，所研究的細胞的電生理學特征表明它們關于它們的功能性質方面相當均一，所述功能性質類似于以前對錐形神經元所描述的功能性質。可以觀察到自發突觸電流(SSC)，其可以通過加入NBQX/AP-5和荷包牡丹堿或者僅加入NBQX/AP-5來完全阻斷。這些結果表明ES細胞來源的神經元形成功能突觸，其利用谷氨酸作為神經遞質。由于這些實驗還揭示在長期培養物中存在功能GABA神經元，所有我們定量了在3周后GABA神經元的數目。使用針對小泡轉運蛋白vGAT的抗體，我們發現3周后，約5％的細胞對于該標記是陽性的。與和谷氨酸和GABA系統不相關的神經遞質缺少染色一致的是，我們沒有檢測到可以規因于谷氨酸或者GABA的任何突觸活性。
討論使用小鼠ES細胞，我們發現了導致產生定義為放射狀神經膠質細胞的神經元前體的幾乎純的群體的條件。這些細胞然后繼續產生具有錐形細胞特征的神經元的均一群體。
當高度增殖時，選擇未定型的干細胞用于形成EB，我們發現用RA處理將整個細胞群體轉化成確定類型的神經元前體。未定型ES細胞的選擇是重要的，因為已經觀察到即使存在LIF時，一些ES細胞也傾向于分化并且在EB形成期間，可以通常觀察到不同譜系的細胞(綜述見參考文獻3，34)。
為了在進行性除去飼養細胞后選擇高增殖性ES細胞，在用確定數目的細胞開始EB形成之前，我們通過細胞計數、細胞的相差外觀以及它們達到的匯合程度來監視分裂速率。
還使用ES細胞或者P19胚胎癌性細胞報導了在非解離的EB中存在放射狀神經膠質細胞(參考文獻35)。當將EB接種在聚賴氨酸基質上時，可以觀察到延長的細胞放射狀遷移，遠離EB并且不斷轉化成星形膠質細胞(參考文獻35)。我們通過解離EB得到的細胞的鑒定是基于用RC2-、BLBP-和Pax-6抗體染色時它們的形態和它們的定量。以前已經表明皮質中的放射狀神經膠質細胞表達該組標記(參考文獻11，16)。重要的是，不是所有放射狀神經膠質細胞都表達Pax-6。具體地，那些定位于神經節隆起的放射狀神經膠質細胞不表達Pax-6并且不是神經發生性的(參考文獻11)。有趣的是，最近已經表明向EB加入RA導致誘導Wnt信號傳遞拮抗劑sFRP2(參考文獻36)。然后可以想象正發育的前腦中存在的分子的Wnt信號傳遞的抑制導致細胞采取放射狀神經膠質細胞表型。sFRP1的空間和時間上的表達與該觀點是相容的(參考文獻37)。
在我們的體外條件下，RA的加入是關鍵的(參考文獻38)。然而RA處理后4天，幾乎所有細胞都在EB中表達Pax-6，不存在RA時不能觀察到Pax-6陽性細胞，并且未處理的EB解離后不能得到神經元。盡管似乎RA不可能在正發育的皮質中Pax-6的誘導中起生理學作用，但是對于正發育的CNS的其他部分，有充分的理由可以是這種情況。實際上，盡管在包括大腦皮質的CNS中，Pax-6具有受限制的表達模式，但是在大部分腹部神經管的發育期間也表達Pax-6，并且最近的結果提示體節來源的RA在神經管的腹部圖式發育中起生理作用(參考文獻39，40)。關于RA處理的EB，Renoncourt等人(參考文獻28)和Wichterle等人(參考文獻7)也觀察到EB中的一些細胞在RA處理后是Pax-6陽性的。然而，也觀察到Pax-7陽性細胞具有相似的豐度(參考文獻7)，提示RA處理的EB的細胞組成中的不均一性。
在用層粘連蛋白包被的聚陽離子基質上，放射狀神經膠質細胞快速失去它們的紡錘形形態。當使用我們的EGP-ES細胞系時，我們注意到熒光細胞數目快速增加并且神經元在它們的形狀和它們的細胞體的大小方面都看起來非常相似。到解離后第四天，幾乎所有細胞都已經具有神經元特征。隨著時間的推移，幾乎所有神經元都采取了錐形形狀并且也發現對于谷氨酸囊泡轉運蛋白是陽性的。所有細胞不管它們的身份都在所有時間染色。相比，當培養1周后用針對Is1-1、酪氨酸羥化酶或者膽堿乙酰轉移酶染色時，小于0.1％的細胞是明顯陽性的。三周后，小于5％的細胞是vGAT陽性的。GABA和Is1-1染色的缺乏排除了許多中間神經元和長投射神經元，尤其包括運動神經元，它們的許多也來自體內的Pax-6陽性細胞。
可能需要誘導信號如sonic hedgehog的存在以沿著該特定分化途徑驅動Pax-6-陽性放射狀神經膠質細胞(參考文獻7)。我們的神經元的谷氨酸能表型與它們作為皮質錐形神經元的身份相一致，如它們的形狀所表明。最重要地，該表明與這些神經元都來自放射狀神經膠質細胞這一觀察相符合。實際上，Malatesta等人(參考文獻11)最近證明皮質放射狀神經膠質細胞的后代是錐形神經元，其定居于所有皮質層，以及海馬。從而，我們的培養條件可以描述為“允許的”，允許放射狀神經膠質細胞內在的分化程序在體外展開。與這符合的是，我們使用的培養基最初開發是用于維持從胚胎嚙齒動物海馬分離的錐形神經元的存活和分化(參考文獻12)。該培養基的一種性質也是防止或者抑制諸如星形膠質細胞的增殖。將預期這些細胞存在于我們的培養物中，因為它們也屬于放射狀神經膠質細胞的后代。
使用GFAP抗體，我們觀察到我們的培養物中一些分枝的星形膠質細胞的發育。然而，它們的數目非常少(3周后總細胞數目的1-2％)。
我們的神經元培養物的相對均勻性促使我們檢查已知在特定發育時間點表達的膜蛋白質的表達。與體內結果相符(參考文獻23)，我們發現p75表達與我們的培養物中神經元的外觀高度相關并且隨后被下調。相比，盡管Trk受體表達在早期時間點不能檢測到，但是它在幾天后顯著增加，提示神經元同步發育。Trk受體表達的高水平是體內錐形神經元特征性的(參考文獻22)。RT PCR實驗表明盡管TrkB和TrkC促成使用pan-Trk抗體得到的信號，但是在體外前幾天后幾乎檢測不到TrkA表達。相比，使用p75和Trk受體，EB解離后2小時就可以清楚地檢測到APP并且它的水平在神經元分化期間增加。這與免疫化學實驗的結果相符，表明APP特異標記正發育的嚙齒動物皮質中的放射狀神經膠質細胞(參考文獻24)。
材料和方法材料從Gibco得到ES細胞培養基成分，LIF來自Chemicon，PDL和N2和完整培養基的母液來自Sigma。BSA粉劑級分(powder fraction)V來自Gibco。從Engelbreth-Holm-Swarm肉瘤分離層粘連蛋白(Roche)。RA從Sigma得到并且當使用不同批時，沒有觀察到結果的差異。
抗體用于免疫組織化學的一級抗體是小鼠單克隆抗體抗巢蛋白(大鼠401，IgG1；1∶10；Developmental Studies Hybridoma Bank，DSHB)、小鼠單克隆抗體RC2(IgM；1∶4；DSHB)、兔多克隆抗體抗-BLBP(1∶2000；由N.Heintz(Rockefeller University，New York)友情提供給M.Goetz)、小鼠多克隆抗體抗-Pax6(IgG1；1∶100；DSHB)、小鼠單克隆抗體抗-β微管蛋白III(IgG2b；1∶100；Sigma)和兔多克隆抗體抗-vGlut1(1∶5000；SYSY)。亞類特異的Cy2-或Cy3-偶聯的抗血清用作二級抗體。對于蛋白質印跡，我們使用小鼠單克隆抗體抗-突觸泡蛋白(IgG1；1∶1000；Sigma)、兔多克隆抗體抗-GluR1(1∶1000；Upstate)、兔多克隆抗體抗Trk(C-14，sc-11；1∶1000；SantaCruz)、兔多克隆抗體抗-APP(1∶3000；由P.Paganetti(Novartis，Basel)友情提供)和兔多克隆抗體抗-p75(1∶2000；Promega)。
培養基ES培養基(500ml)DMEM 410mlFCS 75ml(55℃下熱失活30分鐘)LIF 5ml谷氨酰胺 5ml非必需氨基酸 5mlβ-MeOH 5μl
EB培養基(500ml)DMEM 440mlFCS 50ml谷氨酰胺 5ml非必需氫基酸 5mlβ-MeOH 5μlN2培養基DMEM 125ml谷氨酰胺 1.25mlF-12(Gibco#21765029) 125ml胰島素1.25ml25μg/ml轉鐵蛋白 6.25ml50μg/ml黃體酮0.25ml6ng/ml腐胺 0.25ml16μg/ml亞硒酸鈉 25μl 30nMBSA 1.25ml50μg/mlP/S 2.5ml 1％P/S代表抗生素，例如，青霉素/鏈霉素。它可以任選地被排除在本文的培養基之外并且被等體積的DMEM替換。
N2培養基的貯存液BSA Gibco #A-9418 Powder Fraction V100g等分試樣10mg/ml貯存在-20℃終濃度50μg/ml
胰島素Sigma I-6634 100mg水中的貯存液5mg/ml(滴加濃鹽酸酸化到pH2以溶解胰島素)貯存在-80℃轉鐵蛋白Sigma#T-1147脫鐵運鐵蛋白人100mg水中貯存液2mg/ml貯存在-80℃黃體酮Sigma#P-8783 5gEtOH中貯存液2mM，貯存在-80℃工作溶液20μM，貯存液在水中的稀釋液，貯存在-80℃腐胺Sigma#P-5780水中的貯存液100μM，貯存在-80℃亞硒酸鈉Sigma#S-5261 25g水中的貯存液300μM，貯存在4℃完全培養基水溶液L-丙氨酸(Sigma#A-7627)[貯存液2mg/ml]2μg/ml生物素(Sigma#B-4501)[貯存液0.1mg/ml]0.1μg/mlL-肉堿(Sigma#C-0283)[2mg/ml]2μg/ml乙醇胺(Sigma#E-9508)[1mg/ml)1μg/mlD+-半乳糖(Sigma#G-0625)[15mg/ml]15μg/mlL-脯氨酸(Sigma#P-0380)[7.76mg/ml] 7.76μg/ml腐胺(Sigma P-7505)[16.1mg/ml] 16.1μg/ml丙酮酸鈉(Sigma#P-5280)[25mg/ml] 25μg/ml
亞硒酸鈉(Sigma#S-1382)
0.016μg/ml維生素B12(Sigma#V-2876)
0.34μg/ml硫酸鋅(Sigma#Z-4750)
0.194μg/ml過氧化氫酶(Sigma#C-40)[16mg/ml]16μg/ml谷胱甘肽(Sigma#G-6013)[1mg/ml] 1μg/mlSOD(Sigma#S-2515)[2.5mg/ml]2.5μg/ml乙醇溶液亞油酸(Sigma#L-1376)[100mg/ml] 1μg/ml亞麻酸(Sigma#L-2376)[100mg/ml] 1μg/ml黃體酮(Sigma#P-8783)
6.3ng/ml全反式視黃醇(Sigma#R-7632)[10mg/ml]100ng/ml乙酸視黃酯(Sigma#R-7882)[10mg/ml] 100ng/ml生育酚(Sigma#T-3251)[100mg/ml] 1μg/ml維生素E(tocopherolacetate)(Sigma#T-3001)[100mg/ml]1μg/ml溶解BSA 1g轉鐵蛋白2mg胰島素 1.6mg谷氨酰胺2mMP/S(任選的) 1％在400ml DMEM中并加入上面的溶液。
ES細胞培養物最初，將ES細胞解凍后在由絲裂霉素失活的小鼠胚胎成纖維細胞組成的飼養細胞上培養至少兩次傳代。對于接下來的傳代，在沒有飼養細胞時培養ES細胞并且可以在沒有飼養細胞下至少兩次傳代后立即開始分化或者從無飼養細胞的ES細胞的冷凍原種開始分化。用于分化的原種在開始該過程前傳代至少兩次。在飼養細胞上培養ES細胞后，沒有飼養細胞的第一次傳代是重要的。成功的分化取決于用于第一次傳代的ES細胞的密度。ES細胞在第一次分裂培養后1天應該占據平板的至少1/3。ES培養基是基于含有15％FCS(特別為ES細胞培養物測試，然后是神經元分化)、LIF(1000U/ml)、非必需氨基酸和β-巰基乙醇的DMEM。細胞培養板總是用0.2％明膠溶液包被至少10分鐘。發現培養的溫度是重要的因素，因為在37℃以上時神經元分化不是成功的。將ES細胞在7％CO2/空氣下保持在最高溫度37℃下。所有培養基都在37℃預熱。
ES細胞每2天分裂培養一次，在10cm細胞培養板(Corning)上的接種密度為1.5×106到4×106個細胞。2天后，可以回收10-25×106個細胞，并且高增殖速率是實驗成功的必要條件。細胞必須處于快速生長相中并且形成扁平單層。
通過2×PBS洗滌并將細胞與胰蛋白酶溶液(1×胰蛋白酶溶液Gibco-0.02％EDTA中0.05％)薄膜在37℃7％CO2中培養，進行細胞的分裂，可以用手搖動培養板并且細胞將脫落并且通過上下抽吸(失活胰蛋白酶)重懸浮在新鮮ES培養基中。然后以1000轉/分鐘在室溫下離心5分鐘。通過上下抽吸幾次將沉淀再次重懸浮在新鮮ES培養基中。細胞將解離成單個細胞培養物，盡管可以存在2-3個細胞的團聚體；但是將不存在更大的團塊。將所希望量的細胞再次接種在明膠包被的平板上。
為了使ES細胞脫離飼養細胞。它們可以在解凍后在飼養細胞上培養約2次，然后將進行沒有飼養細胞的情況下至少兩次傳代，從而將稀釋除去成纖維細胞。從而ES細胞從集落樣形狀改變成扁平形態。
解凍ES細胞涉及快速解凍約3×106個ES細胞的原種瓶，將細胞重懸浮在10ml ES培養基中并以1000轉/分鐘在室溫下離心5分鐘。將細胞沉淀物再次重懸浮在ES培養基中并將細胞的量接種在6cm細胞培養皿中。通過將胰蛋白酶消化并離心后分裂時的細胞重懸浮在ES培養基+10％DMSO中進行ES細胞的冷凍。
神經元分化方案對于EB形成，將3×106個ES細胞接種在非貼壁的細菌培養皿(Greiner)中15ml EB培養基(沒有LIF并且僅有10％FCS的ES培養基)中并培養8天。
通過從細菌培養皿(50ml Falcon管中)除去總細胞培養物并讓EB靜置(約3-5分鐘)，每2天更換培養基。然后小心吸除上清液，并用15ml EB培養基再次回收EB。EB應該通過移液小心地重懸浮在培養基中，使用具有足夠寬開口的移液器以避免損傷或者解離EB(例如，10ml塑料移液器)。
4天后，將5μM RA(Sigma)直接加到培養皿并通過輕輕搖動培養皿分散。RA不應該在光線下放置太長時間，因為它是光線敏感的。然后解離EB并將細胞接種在PDL/層粘連蛋白包被的平板上，如下。
將細胞培養皿用硼酸鹽緩沖液(150mM pH8.4)中的10μg/ml PDL溶液包被并在培養箱中放置過夜(37℃，7％CO2)。還使用100μg/ml的多鳥氨酸得到相似的結果。用PBS(對于多鳥氨酸使用水)洗滌平板3次，向PBS溶液中直接加入層粘連蛋白(約0.5μg/cm2)并將平板返回到培養箱中至少2小時。
EB形成8天后，將EB用PBS洗滌2次并通過將它們在37℃水浴中在0.04％EDTA/PBS中的0.05％胰蛋白酶溶液(用胰蛋白酶粉劑新鮮制備，TPCK處理的，Sigma)溫育3分鐘。溫育時間期間，Falcon管應該用手小心搖動幾次并且可以容易地看到EB的崩解。然后EB的解離變得溫和，但是完全重懸浮在含有用于胰蛋白酶失活的血清的10ml EB培養基中。可以通過約5次上下吹吸進行解離。最好的研磨是通過具有小體積(約1.5ml)的平滑邊緣的/in flame巴斯德移液器進行兩次，然后用5ml塑料移液器進行。然后通過以1000轉/分鐘在室溫下離心研制(trituration)。然后完全除去上清液，將沉淀物重懸浮在N2培養基中，并通過40μm Nylon細胞滲濾器(Falcon)過濾細胞懸浮液。
從包被的平板除去層粘連蛋白，并立即加入細胞懸浮液，不讓平板干燥。將解離的細胞以1.5×105個細胞/cm2的密度接種。2小時后更換N2培養基，1天后再次更換。2天后，通過Brewer和Cotman(參考文獻12)描述的富集的無血清培養基更換培養基，所述培養基中的變動是省略谷氨酸、HEPES、皮質酮、硫辛酸和T3。
神經元分化繼續并且神經元培養物可以保持數周。
免疫化學通過將玻璃蓋玻片在水中洗滌并在65％硝酸中溫育1到2天來準備玻璃蓋玻片。隨后，將它們漂浮在水中幾小時，用乙醇沖洗、風干并在紫外線下消毒。將細胞用4％低聚甲醛(PFA)固定10分鐘，用PBS洗滌并在封閉緩沖液(0.03％角叉藻聚糖，10％NGS，0.3％Triton X-100)中封閉1小時。在AquaPoly/Mount(Polysciences)中封固。
蛋白質印跡如上述接種解離的EB并在所指示的時間點收集蛋白質印跡的樣品。收獲前將平板用冰預冷的PBS洗滌兩次。在補加蛋白酶抑制劑混合物(Roche)的用于6cm平板的750μl裂解緩沖液(50mM Tris pH7.4，150mMNaCl，10％甘油，1％Triton X-100)中制備全細胞提取物。以4200轉/分鐘在Eppendorf離心機中離心30分鐘后，除去上清液并通過DC蛋白質測定法(BioRad)測定蛋白質含量。樣品在Laemmli緩沖液中煮沸并將5μg樣品裝入聚丙烯酰胺凝膠。用5％奶溶液封閉印跡，用一級抗體溫育過夜溫育并用二級抗體溫育2小時。用ECL Plus(Amersham)進行檢測。
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權利要求
1.誘導胚胎干(ES)細胞分化成神經元前體細胞或者祖細胞的方法，其包括培養ES細胞；形成胚狀體(EB)；將EB與視黃酸(RA)接觸；和解離EB以產生神經元前體細胞的培養物，其中形成EB包括選擇高增殖性ES細胞并將那些細胞以所測量的密度接種以形成EB。
2.根據權利要求1的方法，其中將所述細胞以約0.5×105到5×105個細胞/ml的密度接種。
3.根據權利要求2方法，其中形成EB包括將ES細胞以約2.5×105到3.5×105個細胞/ml的密度接種。
4.根據權利要求1、權利要求2或者權利要求3的方法，其中EB保持在非貼壁的培養物中直到EB細胞解離。
5.根據前面權利要求任一項的方法，其中該方法包括觀察ES細胞的形態并選擇形態上均一的ES細胞用于EB形成。
6.根據權利要求5的方法，其中該方法包括選擇具有一種或多種下面的形態特征的ES細胞以扁平單層生長；鄰近細胞不相互直接接觸；大細胞核；許多核仁；細胞不在相互的上方生長也不以集落樣形式生長。
7.根據前面權利要求任一項的方法，其中該方法包括確定ES細胞的增殖狀態并選擇高增殖性細胞用于EB形成。
8.根據前面權利要求任一項的方法，其中培養ES細胞包括在不存在飼養細胞的條件下傳代ES細胞。
9.根據前面權利要求任一項的方法，其中培養ES細胞包括通過將ES細胞以約0.5-2×105個細胞/cm2的密度接種并在接種后2天解離ES細胞進行傳代。
10.根據權利要求9的方法，其中在不存在飼養細胞時將傳代重復至少兩次。
11.根據前面權利要求任一項的方法，其中該方法包括解離ES細胞以形成單個細胞懸浮液，其中懸浮液中少于約5％的細胞形成4個或更多細胞的團聚體，并接種細胞以形成EB。
12.根據前面權利要求任一項的方法，其中解離EB包括用胰蛋白酶解離EB細胞以形成解離的EB細胞的懸浮液，然后過濾懸浮液以除去細胞團塊。
13.根據權利要求12的方法，其中通過約40μm的網孔過濾解離的EB細胞。
14.根據前面權利要求任一項的方法，其包括通過冷凍細胞來貯存解離的EB細胞。
15.根據前面權利要求任一項的方法，其還包括接種和培養解離的EB細胞以產生神經元，和任選地培養神經元。
16.根據權利要求15的方法，其中將解離的EB細胞以約0.5×105到2.5×105個細胞/cm2的密度接種。
17.根據權利要求16的方法，其中將解離的EB細胞以約1×105到1.5×105個細胞/cm2的密度接種。
18.根據權利要求15到17任一項的方法，其包括在接種解離的EB細胞后約1到6小時，更換解離的EB細胞的培養基。
19.根據權利要求18的方法，其包括在接種后約1到3小時更換培養基。
20.根據權利要求15到19任一項的方法，其中不在血清的存在下培養解離的EB細胞或神經元。
21.根據權利要求15到20任一項的方法，其中不在生長因子存在下培養神經元前體細胞、祖細胞或者神經元細胞。
22.根據權利要求15到21任一項的方法，其中不在神經基礎培養基中培養神經元前體細胞、祖細胞或者神經元細胞。
23.根據前面權利要求任一項的方法，其中該方法不包括負選擇步驟。
24.根據前面權利要求任一項的方法，其中ES細胞是非人ES細胞。
25.根據前面權利要求任一項的方法，其包括將至少80％的解離的EB細胞鑒定為神經元前體細胞或者祖細胞。
26.根據前面權利要求任一項的方法，其包括將至少99％的解離的EB細胞鑒定為神經元前體細胞或者祖細胞。
27.根據權利要求15到22任一項的方法，其包括將至少80％的細胞鑒定為神經元。
28.根據權利要求27的方法，其包括將至少90％的細胞鑒定為神經元。
29.測定方法，其包括確定神經元前體細胞或祖細胞或者神經元細胞的一種或多種特征。
30.根據權利要求29的測定方法，其中所述一種或多種特征是軸突生長或軸突延長/退化、神經元形狀、神經元細胞死亡、神經發生、神經元分化、電活性、突觸發生和/或神經元細胞標記的一種或多種。
31.根據權利要求29或者權利要求30的測定方法，其中通過根據權利要求1到28任一項的方法產生所述細胞。
32.根據權利要求31的測定方法，其包括誘導ES細胞分化成根據權利要求1到28任一項的神經元前體細胞或祖細胞或者神經元細胞；并確定在測試條件下所述神經元前體細胞或祖細胞或者神經元細胞的一種或多種特征。
33.根據權利要求29到32任一項的測定方法，其包括在第一種條件下培養神經元前體細胞或祖細胞或者神經元細胞；在第二種條件下培養神經元前體細胞或祖細胞或者神經元細胞；確定或定量所述細胞的一種或多種神經元特征；和比較分別在第一種條件下培養的細胞的一種或多種神經元特征與在第二種條件下培養的細胞中相同的一種或多種神經元特征。
34.根據權利要求33的測定方法，其中神經元特征是軸突延長并且其中該方法包括定量軸突特異的蛋白質的表達水平；和比較軸突特異的蛋白質的表達水平；其中在第一種條件下較高的表達水平表明第一種條件增加軸突延長。
35.根據權利要求33的測定方法，其中神經元特征是軸突退化并且其中該方法包括定量軸突特異的蛋白質的表達水平；和比較軸突特異的蛋白質的表達水平；其中在第一種條件下較低的表達水平表明第一種條件增加軸突退化。
36.鑒定抑制或者減小已知增加軸突退化的化合物產生的軸突退化的增加的試劑的方法，其包括在試劑存在并且在已知增加軸突退化的條件下培養神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞；在所述試劑不存在并且在已知增加軸突退化的條件下培養神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞；定量或者測定存在和不存在所述試劑時軸突退化的水平；并比較存在試劑時軸突退化的水平與不存在試劑時軸突退化的水平；其中，與不存在試劑時相比，存在試劑時軸突退化的較低水平表明該試劑抑制或者減小所述條件產生的或者與該條件相關的軸突退化的增加。
37.根據權利要求36的方法，其中通過定量軸突特異的蛋白質的表達水平來定量軸突退化的水平，其中與不存在試劑時相比，存在所述試劑時軸突特異的蛋白質的較高的表達水平表明該試劑抑制或者減小所述條件產生的或者與該條件相關的軸突退化的增加。
38.根據權利要求33的測定方法，其中神經元特征是神經元細胞死亡，并且其中該方法包括在第一種條件下培養神經元；在第二種條件下培養神經元；定量或者測定在第一種和第二種條件下培養的細胞的神經元細胞死亡；和比較在第一種條件下神經元細胞死亡的水平與在第二種條件下神經元細胞死亡的水平；其中與第二種條件下相比，在第一種條件下神經元細胞死亡的較高水平表明該化合物增加細胞死亡；和/或其中與第二種條件下相比，在第一種條件下神經元細胞死亡的較低水平表明該條件減小神經元細胞死亡。
39.根據權利要求38的測定方法，其中神經元表達p75神經營養蛋白和/或細胞凋亡蛋白。
40.鑒定抑制或者減小神經元細胞死亡的增加的試劑的方法，所述神經元細胞死亡的增加由已知增加神經元細胞死亡的條件產生，該方法包括在試劑存在和已知增加神經元細胞死亡的條件下培養神經元；在試劑不存在和已知增加神經元細胞死亡的條件下培養神經元；定量或者測定存在和不存在所述試劑時神經元細胞死亡的水平；并比較存在所述試劑時的神經元細胞死亡水平與不存在所述試劑時的神經元細胞死亡水平；其中與不存在試劑時相比，存在試劑時神經元細胞死亡的較低水平表明該試劑抑制或者減小所述條件產生的神經元細胞死亡的增加。
41.根據權利要求33到35、38和39任一項的測定方法，其中在第一種條件下培養包括在測試化合物存在下培養細胞或者將細胞暴露于測試化合物，并且其中在第二種條件下培養包括在所述測試化合物不存在時培養細胞，或者不將細胞暴露于測試化合物。
42.根據權利要求29到31任一項的測定方法，其用于鑒定指示細胞的分化狀態的標記，所述方法包括誘導ES細胞分化以產生神經元前體細胞或者祖細胞，和/或培養神經元前體細胞或者祖細胞以產生神經元；比較在一種分化階段下細胞中蛋白質的表達水平與第二種分化階段下細胞中蛋白質的表達水平；和鑒定在第一種和第二種分化階段下細胞中表達水平不同的蛋白質；其中表達水平的差異表明該蛋白質可以用作標記來指出細胞的分化狀態。
43.根據權利要求29到32之一的測定方法，其中神經元特征是突觸發生并且其中該方法包括測量細胞的電生理學活性和/或檢測或測量指示突觸發生的一種或多種標記的表達。
44.方法，其包括提供神經元細胞或神經元前體細胞或者祖細胞的第一種和第二種培養物，其中第一種培養物中的細胞與第二種培養物中的細胞具有不同表型；并比較第一種培養物中的神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元與第二種培養物中的神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元。
45.根據權利要求44的方法，其中第一種培養物中的細胞含有目的基因中的突變，并且第二種培養物中的細胞不含有所述突變。
46.根據權利要求44的方法，其中第一種培養物中的細胞含有導入的基因，并且第二種培養物中的細胞不含有所述導入的基因。
47.根據權利要求44的方法，其中第一種培養物中的細胞過表達一種內源基因，并且第二種培養物中的細胞不過表達所述內源基因。
48.根據權利要求44到47任一項的方法，其包括誘導ES細胞分化成根據權利要求1到28任一項的方法的神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞。
49.根據權利要求48的方法，其中在第一種培養物中，ES細胞含有目的基因中的突變，在第二種培養物中，所述細胞不含有所述突變。
50.根據權利要求48的方法，其包括用核酸構建體轉染解離的EB的第一種培養物，從而與第二種培養物中的細胞相比，改變第一種培養物中細胞的表型。
51.根據權利要求44到50任一項的方法，其包括在測試條件下培養神經元前體細胞或者祖細胞或者神經元細胞的第一種和第二種培養物；檢測、定量、觀察或者確定細胞的一種或多種神經元特征；并比較第一種培養物中細胞的神經元特征與第二種培養物中細胞的神經元特征。
52.根據權利要求51的方法，其中在第一種條件下培養包括在Aβ肽存在下培養細胞，并且在第二種條件下培養細胞包括在Aβ肽不存在時培養細胞。
53.根據權利要求52的方法，其中神經元特征是軸突降解。
54.基本上如本文描述的方法。
全文摘要
提供了用于誘導胚胎干細胞分化成神經元前體的方法以及神經元前體或者祖細胞的測定法，和用于鑒定抑制或者減小軸突退化的增加的試劑的方法。
文檔編號C12N5/00GK1997733SQ200580021045
公開日2007年7月11日 申請日期2005年5月4日 優先權日2004年5月5日
發明者Y-A·巴德, M·彼貝爾, J·里奇特, K·L·特克 申請人:諾瓦提斯研究基金會弗里德里克·米謝爾生物醫學研究所