截短的adamts分子的制作方法

專利名稱：截短的adamts分子的制作方法
背景技術：
發明領域本發明涉及新的截短的ADAMTS多肽，特別是具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的那些，以及編碼這種新的多肽的核酸分子。本發明進一步涉及生產這種新的截短的ADAMTS多肽的方法，以及使用這種新的多肽開發ADAMTS抑制劑，特別是軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑的方法。
相關的
背景技術：
ADAM(“解整連蛋白(disintegrin)和金屬蛋白酶”)蛋白代表具有高度序列同源性和結構域組織的膜相關多結構域鋅依賴性金屬蛋白酶家族。除了解整連蛋白和蛋白酶結構域外，ADAM蛋白通常含有前結構域(predomain)、富含半胱氨酸的結構域、EGF樣結構域、跨膜結構域以及胞質尾結構域。ADAM蛋白是細胞表面蛋白中獨特的，這在于其含有粘著蛋白和蛋白酶雙特性(Kaushal和Shah，J.Clin.Invest.1051335(2000))。
最近，已鑒定了缺乏跨膜和胞質尾結構域的ADAM家族的新成員。更重要的是，這些新成員含有未在其他ADAM中發現的獨特的血小板反應蛋白I型重復(TSRs)。這些ADAMTS(“具有血小板反應蛋白基序的解整連蛋白和金屬蛋白酶”)蛋白也含有前結構域、金屬蛋白酶結構域、解整連蛋白結構域、富含半胱氨酸的結構域和間隔區，并且可能也含有PLAC結構域，其是含有6個半胱氨酸的30-40個氨基酸的肽。如同其它ADAM蛋白，所有迄今鑒定的ADAMTS蛋白都含有催化性共有序列HXXGXXHD，其協調蛋白酶活性必需的Zn2+離子(Tang，Int.J.Biochem.Cell Biol. 445223(2001))。
ADAMTS家族的成員，其現在數目超過20個，所有都在解整連蛋白結構域后含有一個TSR；已表明此內部TSR結合肝素(Kuno等，J,Biol.Chem.272556(1997))。然而，ADAMTS相互之間可以區分，這部分地通過它們在間隔區下游所含有的可變數目的C-末端TSR實現。例如，ADAMTS-4不含有C-末端TSR，ADAMTS-5含有1個C-末端TSR，ADAMTS-1(以及人同源物METH1)和ADAMTS-16含有2個C-末端TSR，ADAMTS-10和-18含有5個C-末端TSR，以及ADAMTS-9和-20含有14個C-末端TSR。
ADAMTS已牽涉在多種病理障礙中。例如，ADAMTS-2的突變導致人類Ehlers-Danlos綜合征和牛的皮膚脆裂癥(Colige等，Am.J.Hum.Genet.65308(1999))，而ADAMTS-13(也稱作vonWillebrand因子切割蛋白)的突變導致血栓形成性血小板減少性紫癜(Kokame等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9911902(2002))。
最近，幾個ADAMTS也已牽涉在引起關節軟骨的炎性障礙的病理生理性事件中，如骨關節炎(OA)和類風濕性關節炎(RA)。最初將ADAMTS-4和ADAMTS-5(后者也稱作ADAMTS-11)鑒定為負責軟骨聚集蛋白聚糖切割的蛋白酶(它們現在分別被命名為軟骨聚集蛋白聚糖酶-1和軟骨聚集蛋白聚糖酶-2)，其有助于關節軟骨在負荷下抵抗壓縮變形的機械特性(Tortorella等，Science2841664(1999)；Abbaszade等，J.Biol.Chem.27423443(1999))。隨后，也表明ADAMTS-1具有這種損害關節的“軟骨聚集蛋白聚糖酶”活性(Rodriguez-Manzaneque等，Biochem.Biophys.Res.Commun.293501(2002))。也有證據提示這些軟骨聚集蛋白聚糖酶具有大腦富含的透明質酸糖胺多糖結合/短蛋白聚糖切割活性，這可能在神經膠質瘤的侵襲性中起作用(Matthews等，J.Biol.Chem.27522695(2000))。軟骨聚集蛋白聚糖酶更普遍地被稱為透明質酸糖胺多糖和凝集素結合的模塊蛋白聚糖酶(hyalectanase)，因為它們切割透明質酸糖胺多糖和凝集素結合的模塊蛋白聚糖(hyalectan)，其包括軟骨聚集蛋白聚糖、短蛋白聚糖和多能蛋白聚糖。
ADAMTS軟骨聚集蛋白聚糖酶在軟骨聚集蛋白聚糖的G1球形結構域的球間結構域內的氨基酸Glu373-Ala374之間切割，其暴露所得C-末端軟骨聚集蛋白聚糖片段上的N-末端的新表位(neoepitope)(374ARGSV)(Tortorella等，Matrix Biol.21499(2002)；Westling等，J.Biol.Chem.27716059(2002)；Tortorella等，J.Biol.Chem.27518566(2000))。已在患有炎性關節病、關節損傷和OA患者的滑液中發現了該374ARGSV軟骨聚集蛋白聚糖片段(Malfait等，J.Biol.Chem.27722201(2002)；Lohmander等，ArthritisRheum.361214(1993)；Sandy等，J.Clin.Invest.891512(1992))。另外，已在患有關節損傷、OA和RA患者的關節軟骨中發現了所得的含有C-末端NITEGE373新表位的N-末端軟骨聚集蛋白聚糖片段(Malfait等，見上；Sandy和Verscharen，Biochem.J.358615(2001)；Lark等，J.Clin.Invest.10093(1997))。已表明用合成的ADAMTS抑制劑抑制軟骨聚集蛋白聚糖酶活性能在骨關節炎軟骨中阻止軟骨聚集蛋白聚糖降解，如通過含有374ARGSV新表位的軟骨聚集蛋白聚糖片段的釋放所測量的(Malfait等，見上)。
由于它們涉及各種炎性障礙，如OA和RA，因此需要鑒定ADAMTS軟骨聚集蛋白聚糖酶的抑制劑，特別是小分子抑制劑。為此，需要大量純化的、均質的軟骨聚集蛋白聚糖酶蛋白以進行必需的篩選測定和結晶研究。然而，已證明由于這些分子的異質性、低表達和差的穩定性，分離和純化大量這些蛋白很困難。例如，由于在多肽各種位置處的C-末端截短，所以軟骨聚集蛋白聚糖酶-1(ADAMTS-4)的重組表達產生分子量低于成熟蛋白的幾個同種型(Flannery等，J.Biol.Chem.27742775(2002)；Gao等，J.Biol.Chem.27711034(2002))。另外，天然軟骨聚集蛋白聚糖酶-1和-2(ADAMTS-5)均以表示C-末端截短的各種低分子量形式存在(Tortorella等，J.Biol.Chem.27525791(2000)；Abbaszade，見上)。
美國專利申請公開No.2004/0044194 A1，在此以其整體引入作為參考，涉及ADAMTS 18核酸分子和其編碼的多肽。
美國專利申請公開No.2004/0054149 A1，在此以其整體引入作為參考，涉及截短的ADAMTS分子，且優選地為截短的ADAMTS-4(軟骨聚集蛋白聚糖酶-1)和ADAMTS-5(軟骨聚集蛋白聚糖酶-2)核酸分子及其編碼的多肽。類似地，美國專利申請公開No.2004/0142863 A1，在此以其整體引入作為參考，涉及截短的ADAMTS-4核酸分子及其編碼的多肽。
迄今所描述的截短的ADAMTS分子通常是在C-末端截短的。仍需要鑒定其它的ADAMTS相關分子，且特別是用于增加ADAMTS軟骨聚集蛋白聚糖酶的產量、穩定性和同質性的截短的ADAMTS分子。
發明概述
本發明提供截短的有生物活性的ADAMTS多肽，特別是具有透明質酸糖胺多糖和凝集素結合的模塊蛋白聚糖酶活性的那些，且更特別地是具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的那些，其顯示比它們的全長對應物更高的穩定性和同質性以及更高的表達產量。在一個方面，截短的ADAMTS缺乏富含半胱氨酸結構域的重要部分。優選地，截短的ADAMTS保留催化結構域、解整連蛋白結構域以及中央血小板反應蛋白I型重復的重要部分。在一個具體的實施方案中，截短的ADAMTS多肽缺乏保守的Phe后的C-末端的重要部分，并且可進一步缺乏，或者可選擇地缺乏前結構域。本發明也提供編碼這種截短的有生物活性的ADAMTS多肽的核酸分子。本發明進一步提供生產這種截短的有生物活性的ADAMTS多肽的方法，以及鑒定能調節有生物活性的ADAMTS多肽的化合物的方法，特別是那些抑制軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的化合物。
在本發明的一個方面，提供了可通過從全長ADAMTS蛋白中缺失多個氨基酸殘基獲得的分離的或重組的軟骨聚集蛋白聚糖酶，其中全長ADAMTS蛋白包括富含半胱氨酸的結構域，且多個缺失的氨基酸殘基包括富含半胱氨酸結構域的重要部分，且其中全長ADAMTS蛋白不是全長ADAMTS-4蛋白。
附圖簡述


圖1示意性圖示ADAMTS-7、-9、-10、-16和-18蛋白的結構域結構。
圖2示意性圖示修飾的ADAMTS-7、-9、-10、-16和-18蛋白的結構域結構。
圖3顯示(a)缺乏前結構域的修飾的ADAMTS-7(SEQID NO2)；(b)缺乏保守的Phe后C-末端的修飾的ADAMTS-7(SEQ ID NO3)；以及(c)缺乏前結構域和保守的Phe后C-末端兩者的修飾的ADAMTS-7(SEQ ID NO4)的氨基酸序列。
圖4顯示(a)缺乏前結構域的修飾的ADAMTS-9(SEQID NO6)；(b)缺乏保守的Phe后C-末端的修飾的ADAMTS-9(SEQ ID NO7)；以及(c)缺乏前結構域和保守的Phe后C-末端兩者的修飾的ADAMTS-9(SEQ ID NO8)的氨基酸序列。
圖5顯示(a)缺乏前結構域的修飾的ADAMTS-10(SEQ ID NO10)；(b)缺乏保守的Phe后C-末端的修飾的ADAMTS-10(SEQ ID NO11)；以及(c)缺乏前結構域和保守的Phe后C-末端兩者的修飾的ADAMTS-10(SEQ ID NO12)的氨基酸序列。
圖6顯示(a)缺乏前結構域的修飾的ADAMTS-16(SEQ ID NO14)；(b)缺乏保守的Phe后C-末端的修飾的ADAMTS-16(SEQ ID NO15)；以及(c)缺乏前結構域和保守的Phe后C-末端兩者的修飾的ADAMTS-16(SEQ ID NO16)的氨基酸序列。
圖7顯示(a)缺乏前結構域的修飾的ADAMTS-18(SEQID NO18)；(b)缺乏保守的Phe后C-末端的修飾的ADAMTS-18(SEQ ID NO19)；以及(c)缺乏前結構域和保守的Phe后C-末端兩者的修飾的ADAMTS-18(SEQ ID NO20)的氨基酸序列。
圖8顯示牛軟骨聚集蛋白聚糖與(a)截短的ADAMTS-7；(b)截短的ADAMTS-9；(c)截短的ADAMTS-10；(d)截短的ADAMTS-16；以及(e)截短的ADAMTS-18溫育后，含有新表位的軟骨聚集蛋白聚糖G1結構域的蛋白印跡。
包括所有附圖都是用于說明，且不應被解釋為限制本發明。
發明詳述
本發明基于ADAMTS蛋白的截短形式比它們的全長對應物具有更高的穩定性和更高的表達水平以及更高的同質性，而仍保留生物活性的發現。由此，本發明提供新的有生物活性的ADAMTS蛋白的截短形式，特別是具有透明質酸糖胺多糖和凝集素結合的模塊蛋白聚糖酶活性的那些，且更特別地是具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的那些，其具有比該蛋白的全長形式更高的穩定性和更高的表達水平。
在一個優選的實施方案中，截短的ADAMTS分子在C-末端截短并保留透明質酸糖胺多糖和凝集素結合的模塊蛋白聚糖酶活性，且優選地為軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。在另一個優選的實施方案中，截短的ADAMTS分子包括圖1和2所示的保守的苯丙氨酸(Phe)后C-末端的重要截短。在另一個優選的實施方案中，截短的ADAMTS分子缺乏前結構域的重要部分并保留透明質酸糖胺多糖和凝集素結合的模塊蛋白聚糖酶活性，且優選地為軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。在一個特別優選的實施方案中，缺失富含半胱氨酸結構域的重要部分，從而截短的ADAMTS保留透明質酸糖胺多糖和凝集素結合的模塊蛋白聚糖酶活性，且更優選地為軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。
在本發明的一個方面，具有透明質酸糖胺多糖和凝集素結合的模塊蛋白聚糖酶活性，且更優選地具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的截短的ADAMTS是缺乏至少前結構域的截短的ADAMTS。這種截短的ADAMTS分子尤其包括缺乏至少前結構域的ADAMTS-4、ADAMTS-5、ADAMTS-7、ADAMTS-9、ADAMTS-10、ADAMTS-16和ADAMTS-18。這些具有透明質酸糖胺多糖和凝集素結合的模塊蛋白聚糖酶活性的截短的ADAMTS分子可進一步包括C-末端截短，例如，在C-末端保守的Phe處的截短。
在本發明的一個方面，具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的截短的ADAMTS是截短的ADAMTS-7。在一個實施方案中，該截短缺失ADAMTS-7的富含半胱氨酸的結構域、間隔區結構域和5個C-末端TSR結構域。全長ADAMTS-7如SEQ ID NO1所示(GenBank登記號No.NP_055087)。在一個具體的實施方案中，截短的ADAMTS-7分子缺乏前結構域，并且包括氨基酸233-1686、基本上由氨基酸233-1686組成或由氨基酸233-1686組成，如SEQ IDNO2所示(圖3a)。在另一個具體的實施方案中，截短的ADAMTS-7缺乏保守的Phe后的C-末端，并且包括氨基酸1-599、基本上由氨基酸1-599組成或由氨基酸1-599組成，如SEQ ID NO3所示(圖3b)。在另一個具體的實施方案中，截短的ADAMTS-7分子缺乏蛋白結構域和保守的Phe后的C-末端，并且包括氨基酸233-599、基本上由氨基酸233-599組成或由氨基酸233-599組成，如SEQ IDNO4所示(圖3c)。
在本發明的另一個方面，具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的截短的ADAMTS是截短的ADAMTS-9。全長ADAMTS-9如SEQ ID NO5所示(GenBank登記號No.AAF89106)。在一個實施方案中，該截短缺失ADAMTS-9的富含半胱氨酸的結構域、間隔區結構域和2個C-末端TSR結構域。在一個具體的實施方案中，截短的ADAMTS-9缺乏前結構域，并且包括氨基酸288-1072、基本上由氨基酸288-1072組成或由氨基酸288-1072組成，如SEQ IDNO6所示(圖4a)。在另一個具體的實施方案中，截短的ADAMTS-9缺乏保守的Phe后的C-末端，并且包括氨基酸1-649、基本上由氨基酸1-649組成或由氨基酸1-649組成，如SEQ ID NO7所示(圖4b)。在另一個實施方案中，截短的ADAMTS-9缺乏保守的Phe后的C-末端和前結構域，并且包括氨基酸288-649、基本上由氨基酸288-649組成或由氨基酸288-649組成，如SEQ ID NO8所示(圖4c)。
在本發明的另一個方面，具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的截短的ADAMTS是截短的ADAMTS-10。在一個實施方案中，該截短缺失ADAMTS-10的富含半胱氨酸的結構域、間隔區結構域和5個C-末端TSR結構域。全長ADAMTS-10如SEQ ID NO9所示(GenBank登記號No.NP_112219)。在一個具體的實施方案中，截短的ADAMTS-10缺乏前結構域，并且包括氨基酸234-1103、基本上由氨基酸234-1103組成或由氨基酸234-1103組成，如SEQ IDNO10所示(圖5a)。在另一個具體的實施方案中，截短的ADAMTS-10缺乏保守的Phe后的C-末端，并且包括氨基酸1-608、基本上由氨基酸1-608組成或由氨基酸1-608組成，如SEQ ID NO11所示(圖5b)。在另一個實施方案中，截短的ADAMTS-10缺乏保守的Phe后的C-末端和前結構域，并且包括氨基酸234-608、基本上由氨基酸234-608組成或由氨基酸234-608組成，如SEQ ID NO12所示(圖5c)。
在本發明的另一個方面，具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的截短的ADAMTS是截短的ADAMTS-16。在一個實施方案中，該截短缺失ADAMTS-16的富含半胱氨酸的結構域、間隔區結構域和2個C-末端TSR結構域。全長ADAMTS-16如SEQ ID NO13所示(GenBank登記號No.NP_620687)。在一個具體的實施方案中，截短的ADAMTS-16缺乏前結構域，并且包括氨基酸279-1072、基本上由氨基酸279-1072組成或由氨基酸279-1072組成，如SEQ IDNO14所示(圖6a)。在另一個具體的實施方案中，截短的ADAMTS-16缺乏保守的Phe后的C-末端，并且包括氨基酸1-647、基本上由氨基酸1-647組成或由氨基酸1-647組成，如SEQ ID NO15所示(圖6b)。在另一個具體的實施方案中，截短的ADAMTS-16缺乏前結構域和保守的Phe后的C-末端，并且包括氨基酸279-647、基本上由氨基酸279-647組成或由氨基酸279-647組成，如SEQ IDNO16所示(圖6c)。
在本發明的另一個方面，具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的截短的ADAMTS是截短的ADAMTS-18。在一個實施方案中，該截短缺失ADAMTS-18的富含半胱氨酸的結構域、間隔區結構域和5個C-末端TSR結構域。全長ADAMTS-18如SEQ ID NO17所示(GenBank登記號No.NP_955387)。在一個具體實施方案中，截短的ADAMTS-18缺乏前結構域，并且包括氨基酸285-1221、基本上由氨基酸285-1221組成或由氨基酸285-1221組成，如SEQ IDNO18所示(圖7a)。在另一個具體實施方案中，截短的ADAMTS-18缺乏保守的Phe后的C-末端，并且包括氨基酸1-650、基本上由氨基酸1-650組成或由氨基酸1-650組成，如SEQ ID NO19所示(圖7b)。在另一個具體的實施方案中，截短的ADAMTS-18缺乏保守的Phe后的C-末端和前結構域，并且包括氨基酸285-650、基本上由氨基酸285-650組成或由氨基酸285-650組成，如SEQ IDNO20所示(圖7c)。
除了上述蛋白，這里所提供的截短的有生物活性的ADAMTS蛋白也包括具有與SEQ ID NOs2-4、6-8、10-12、14-16和18-20所示序列相似的氨基酸序列，但其中已天然地提供(即，等位基因變體)或通過有意地工程改造形成插入、缺失或取代的蛋白。例如，可能在功能相似氨基酸(例如，酸性的、堿性的、分支的，等等)之間進行大量保守性的取代，而不顯著影響上述截短的蛋白的結構或活性。
在一個實施方案中，可通過從全長ADAMTS蛋白中缺失至少富含半胱氨酸結構域的重要部分獲得本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶。例如，缺失可包括，沒有限制地，富含半胱氨酸結構域的氨基酸殘基的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。也可缺失其它區或輔助結構域的氨基酸殘基。這些其它區或輔助結構域包括，例如，解整連蛋白樣結構域、中央血小板反應蛋白I型重復、間隔區結構域、任何C-末端血小板反應蛋白I型重復、任何位于輔助結構域之間或之后的區、信號肽以及前結構域。
在另一個實施方案中，可通過從全長ADAMTS蛋白中缺失位于中央血小板反應蛋白I型重復后空間上保守的苯丙氨酸殘基的C-末端的氨基酸殘基的重要部分，獲得本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶。如這里所使用的，保守殘基是至少大多數ADAMTS家族成員所共有的。例如，保守殘基可由所有ADAMTS家族成員中的至少60％、70％、80％、90％、95％或100％成員共有。可使用本領域中的各種已知方法鑒別保守殘基。在一個實例中，首先產生不同ADAMTS家族成員的最佳序列比對。適用于此目的的算法包括，但不限于，CLUSTALW、MSA、PRALINE、DIALIGN、PRRP、SAGA和MACAW。見Mount，BIOINFORMATICS(Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，2001)，p.141。可鑒別至少由大多數ADAMTS家族成員共有的保守殘基。也可使用其它方法來鑒別保守殘基。
所利用的缺失可包括位于中央血小板反應蛋白I型重復后第一個保守的苯丙氨酸殘基C-末端的任何殘基或序列片段。例如，缺失的氨基酸殘基可選自富含半胱氨酸的結構域、間隔區結構域、C-末端血小板反應蛋白結構域或位于其之間或其之后的任何區。缺失的殘基可包括一個或多個結構域的殘基。結構域的缺失可以是全部的或部分的。
在一個實例中，缺失包括位于第一個保守的苯丙氨酸殘基C-末端總氨基酸殘基的至少30％。例如，缺失可包括位于保守的苯丙氨酸殘基C-末端所有氨基酸殘基的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。缺失的殘基可包括一個或多個連續的片段序列。每個缺失的序列片段可包括，例如，2-5個氨基酸、5-10個氨基酸、10-20個氨基酸、20-30個氨基酸、30-50個氨基酸、50-100個氨基酸、100-150個氨基酸、150-200個氨基酸、200-250個氨基酸、250-300個氨基酸、300-350個氨基酸、350-400個氨基酸、400-450個氨基酸、450-500個氨基酸或大于500個氨基酸。另外，缺失的殘基可包括非連續的殘基。
在另一個實施方案中，全長ADAMTS蛋白，本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶可從其中衍生，是天然存在的全長ADAMTS蛋白。天然存在的全長蛋白包括通過可變RNA剪接所產生的ADAMTS同種型。全長ADAMTS蛋白可以是包括信號肽或前結構域的前蛋白。全長ADAMTS蛋白也可以是缺乏信號肽和前結構域的成熟蛋白。
在另一個實施方案中，全長ADAMTS蛋白，本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶可從其中衍生，是天然存在的全長ADAMTS蛋白的變體。變體的氨基酸序列與天然存在的蛋白的氨基酸序列基本相同。在一個實例中，變體的氨基酸序列具有與天然存在的蛋白至少80％、85％、90％、95％、99％或更高的全局序列同一性或相似性。可使用本領域中的各種已知方法確定序列同一性或相似性。例如，可使用標準比對算法測定序列同一性或相似性，如在Altschul，等，J.MOL.BIOL.，215403-410(1990)中所描述的基本局部比對工具(BLAST)、Needleman，等，J.MOL.BIOL.，48444-453(1970)的算法、Meyers，等，COMPUT.APPL.BIOSCI.，411-17(1988)的算法，以及點矩陣分析。適當的序列比對程序包括，但不限于，由國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)(Bethesda，MD)所提供的BLAST程序和由DNASTAR，Inc.(Madison，WI)所提供的MegAlign。在一個實例中，通過使用Genetics Computer Group(GCG)程序GAP(Needleman-Wunsch算法)測定序列同一性或相似性。使用由程序所指定的默認值(例如，在序列之一中打開缺口的罰分是11，延伸缺口的罰分是8)。可使用BLOSUM62取代矩陣定義相似氨基酸。
在一個實例中，天然存在的ADAMTS蛋白和其變體可在一個或多個區域中基本相同，但在其它區中不同。在另一個實例中，變體保留天然存在的蛋白的全部結構域結構。在另一個實例中，通過在天然存在的序列中進行至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多個氨基酸取代、缺失或插入制備變體。取代可以是保守的、非保守的或者是兩者。本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶可以是包括信號肽或前結構域的前蛋白。本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶也可以是缺乏任何信號肽或前結構域的成熟蛋白。
本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶也可包括位于中央血小板反應蛋白I型重復后的第一個連續苯丙氨酸殘基N-末端的缺失。例如，可缺失金屬蛋白酶催化結構域、解整連蛋白樣結構域或中央血小板反應蛋白I型重復中的某些殘基，而不取消或顯著改變原始蛋白的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。缺失的殘基可能涉及或可能不涉及軟骨聚集蛋白聚糖結合或蛋白水解活性。
本發明也預期上述軟骨聚集蛋白聚糖酶的變體。這些變體具有可使用下述測定很容易測定的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。蛋白序列的變體可能是天然存在的，如通過等位基因變異或多態性，或者通過有意的工程改造。可將大量保守的氨基酸取代引入到蛋白序列中，而不顯著改變蛋白的結構或生物活性。可基于殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性或者兩親性特性的相似性進行保守性氨基酸取代。例如，可在具有堿性側鏈的氨基酸，如賴氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和組氨酸(His或H)；具有酸性側鏈的氨基酸，如天冬酰胺(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)；具有無電荷的極性側鏈的氨基酸，如天冬酰胺(Asn或N)、谷氨酰胺(Gln或Q)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)和酪氨酸(Tyr或Y)；以及具有非極性側鏈的氨基酸，如丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、纈氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、異亮氨酸(Ile或I)、脯氨酸(Pro或P)、苯丙氨酸(Phe或F)、甲硫氨酸(Met或M)、色氨酸(Trp或W)和半胱氨酸(Cys或C)之間進行保守的氨基酸取代。在表1中舉例說明其它示例性的氨基酸取代。
表1.示例性的氨基酸取代
可使用非天然存在的氨基酸殘基進行保守性取代。一般地通過化學方法的肽合成而不是通過在生物系統中的合成摻入這些氨基酸殘基。
另外，軟骨聚集蛋白聚糖酶變體可包括氨基酸取代以提高分子的穩定性。例如，在軟骨聚集蛋白聚糖酶分子催化結構域的411位上的E到Q的突變可提高軟骨聚集蛋白聚糖酶的穩定性和半衰期。也可使用軟骨聚集蛋白聚糖酶的其它區中的氨基酸突變來提高分子的穩定性。
也可將其它期望的氨基酸取代(無論是保守的還是非保守的)引入到軟骨聚集蛋白聚糖酶分子中。例如，可鑒定對軟骨聚集蛋白聚糖酶分子的生物活性重要的氨基酸殘基。隨后可選擇能夠增加或降低軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的取代。
此外，軟骨聚集蛋白聚糖酶變體可包括糖基化位點的修飾。這些修飾可包括O-連接或N-連接的糖基化位點。例如，可取代或缺失在天冬酰胺連接的糖基化識別位點上的氨基酸殘基，從而導致部分糖基化或糖基化的完全取消。天冬酰胺連接的糖基化識別位點一般包括被適當的細胞糖基化酶識別的三肽序列。這些三肽序列可以是天冬酰胺-X-蘇氨酸或天冬酰胺-X-絲氨酸，其中X通常是任何氨基酸。在糖基化識別位點的第一或第三個氨基酸位置中的一個或兩者上的多種氨基酸取代或缺失(或在第二位置上的氨基酸缺失)可導致修飾的三肽序列上的非糖基化。另外，軟骨聚集蛋白聚糖酶相關蛋白的細菌表達也導致產生非糖基化的蛋白，即使糖基化位點未被修飾。
也可通過將其它修飾摻入到原始多肽中來制備軟骨聚集蛋白聚糖酶變體。這些修飾可通過天然存在的方法引入，如翻譯后修飾，或者通過人工的或合成的方法引入。合適的修飾可發生在多肽中的任何位置，包括主鏈、氨基酸側鏈以及氨基或羧基末端。可在變體的幾個位點上存在相同或不同程度的相同類型的修飾。變體也可含有許多不同類型的修飾。適于本發明的示例性的修飾包括，但不限于，乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價附著、血紅素部分的共價附著、核苷酸或核苷酸衍生物的共價附著、脂質或脂質衍生物的共價附著、磷脂酰肌醇的共價附著、交聯、環化、二硫鍵形成、脫甲基作用、共價交聯的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化(pegylation)、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、selenoylation、硫酸化、轉移-RNA介導的向蛋白中添加氨基酸如精氨酰化、遍在蛋白化或者它們的任何組合。多肽變體可以是分支的，例如，由于遍在蛋白化，或者其可以是環狀的，具有或不具有分支。
在另一個實施方案中，可根據本發明通過修飾可缺失的氨基酸殘基，從全長ADAMTS蛋白中獲得本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶。示例性的修飾包括，但不限于，取代和插入。在一個實例中，修飾基本上改造輔助結構域或其片段，從而考慮從全長ADAMTS蛋白中缺失該輔助結構域或片段。在另一個實例中，改造的結構域或片段與原結構域或片段的序列同一性或相似性低于50％、40％、30％、20％、10％或5％。在另一個實例中，修飾包括中央血小板反應蛋白I型重復后第一個保守的苯丙氨酸殘基后的至少一個序列的插入。位于插入序列N末端的結構域保留軟骨聚集蛋白聚糖酶活性并因此構成可分離的軟骨聚集蛋白聚糖酶單位。
在許多實施方案中，本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶是分離的或純化的形式。在一個實例中，本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶制劑基本上無其它蛋白。例如，軟骨聚集蛋白聚糖酶制劑包括按重量計算低于80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的其它蛋白。在另一個實例中，軟骨聚集蛋白聚糖酶制劑含有將不干擾軟骨聚集蛋白聚糖酶的預期用途的可忽略量的污染物。
本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶具有蛋白水解活性，且優選地切割軟骨聚集蛋白聚糖的IGD中的Glu373-Ala374鍵。在一個實例中，本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶保留可從其中衍生軟骨聚集蛋白聚糖酶的全長ADAMTS蛋白的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的重要部分。例如，軟骨聚集蛋白聚糖酶可保留全長ADAMTS蛋白的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者100％軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。在另一個實例中，本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶具有比全長ADAMTS蛋白更高的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。在另一個實施方案中，全長ADAMTS蛋白沒有可檢測到的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性，且全長蛋白的多個氨基酸殘基的缺失賦予修飾蛋白的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。
本發明也提供編碼有生物活性的ADAMTS蛋白的新的截短形式，特別是具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的那些的多核苷酸。
在本發明的一個方面，多核苷酸編碼截短的ADAMTS-7。優選地，多核苷酸編碼缺失富含半胱氨酸的結構域、間隔區結構域和5個C-末端TSR結構域的截短的ADAMTS-7分子。在一個具體的實施方案中，編碼截短的ADAMTS-7的多核苷酸缺乏編碼前結構域的區域，并且包括核酸699-5058、基本上由核酸699-5058組成或由核酸699-5058組成，如SEQ ID NO21所示。在另一個實施方案中，編碼截短的ADAMTS-7的多核苷酸缺乏編碼保守的Phe后C-末端的區域，并且包括核酸1-1797、基本上由核酸1-1797組成或由核酸1-1797組成，如SEQ ID NO22所示。在另一個實施方案中，編碼截短的ADAMTS-7的多核苷酸缺乏前結構域和保守的Phe后的C-末端兩者，并且包括核酸699-1797、基本上由核酸699-1797組成或由核酸699-1797組成，如SEQ ID NO23所示。
在本發明的另一個方面，多核苷酸編碼截短的ADAMTS-9。優選地，多核苷酸編碼缺失富含半胱氨酸的結構域、間隔區結構域以及2個C-末端TSR結構域的截短的ADAMTS-9分子。在一個具體的實施方案中，編碼截短的ADAMTS-9的多核苷酸缺乏前結構域，并且包括核苷酸864-3216、基本上由核苷酸864-3216組成或由核苷酸864-3216組成，如SEQ ID NO24所示。在另一個實施方案中，編碼截短的ADAMTS-9的多核苷酸缺乏編碼保守的Phe后C-末端的區域，并且包括核酸1-1947、基本上由核酸1-1947組成或由核酸1-1947組成，如SEQ ID NO25所示。在另一個實施方案中，編碼截短的ADAMTS-9的多核苷酸缺乏前結構域和保守的Phe后的C-末端兩者，并且包括核酸864-1947、基本上由核酸864-1947組成或由核酸864-1947組成，如SEQ ID NO26所示。
在本發明的另一個方面，多核苷酸編碼截短的ADAMTS-10。優選地，多核苷酸編碼缺失富含半胱氨酸的結構域、間隔區結構域以及5個C-末端TSR結構域的截短的ADAMTS-10分子。在一個具體的實施方案中，編碼截短的ADAMTS-10的多核苷酸缺乏前結構域，并且包括核酸702-3309、基本上由核酸702-3309組成或由核酸702-3309組成，如SEQ ID NO27所示。在另一個實施方案中，編碼截短的ADAMTS-10的多核苷酸缺乏編碼保守的Phe后的C-末端的區域，并且包括核苷酸1-1824、基本上由核苷酸1-1824組成或由核苷酸1-1824組成，如SEQ ID NO28所示。在另一個實施方案中，編碼截短的ADAMTS-10的多核苷酸缺乏編碼前結構域和保守的Phe后的C-末端兩者的區域，并且包括多核苷酸702-1824、基本上由多核苷酸702-1824組成或由多核苷酸702-1824組成，如SEQ ID NO29所示。
在本發明的另一個方面，多核苷酸編碼截短的ADAMTS-16。優選地，多核苷酸編碼缺失富含半胱氨酸的結構域、間隔區結構域以及5個C-末端TSR結構域的截短的ADAMTS-16分子。在一個具體的實施方案中，編碼截短的ADAMTS-16的多核苷酸缺乏前結構域，并且包括核酸837-3216、基本上由核酸837-3216組成或由核酸837-3216組成，如SEQ ID NO30所示。在另一個實施方案中，編碼截短的ADAMTS-16的多核苷酸缺乏編碼保守的Phe后的C-末端的區域，并且包括核苷酸1-1941、基本上由核苷酸1-1941組成或由核苷酸1-1941組成，如SEQ ID NO31所示。在另一個實施方案中，編碼截短的ADAMTS-16的多核苷酸缺乏編碼前結構域和保守的Phe后的C-末端的區域，并且包括多核苷酸837-1941、基本上由多核苷酸837-1941組成或由多核苷酸837-1941組成，如SEQ ID NO32所示。
在本發明的另一個方面，多核苷酸編碼截短的ADAMTS-18。優選地，多核苷酸編碼缺失富含半胱氨酸的結構域、間隔區結構域以及5個C-末端TSR結構域的截短的ADAMTS-18分子。在一個具體的實施方案中，編碼截短的ADAMTS-18的多核苷酸缺乏前結構域，并且包括核酸855-3663、基本上由核酸855-3663組成或由核酸855-3663組成，如SEQ ID NO33所示。在另一個實施方案中，編碼截短的ADAMTS-18的多核苷酸缺乏編碼保守的Phe后的C-末端的區域，并且包括核苷酸1-1950、基本上由核苷酸1-1950組成或由核苷酸1-1950組成，如SEQ ID NO34所示。在另一個實施方案中，編碼截短的ADAMTS-18的多核苷酸缺乏編碼前結構域和保守的Phe后的C-末端兩者的區域，并且包括多核苷酸855-1950、基本上由多核苷酸855-1950組成或由多核苷酸855-1950組成，如SEQ ID NO35所示。
本發明的多核苷酸也包括具有在密碼子序列上與上述那些不同的核苷酸序列的那些，但是其編碼由SEQ ID NOs2-4、6-8、10-12、14-16和18-20所示氨基酸序列組成的蛋白(例如，由于公知的遺傳密碼的簡并性)。
除了編碼上述截短的有生物活性的ADAMTS蛋白的多核苷酸，本發明的多核苷酸也包括在嚴格(優選高度嚴格)條件下與SEQ ID NOs21-35所示的核苷酸序列雜交的那些。這種多核苷酸包括具有與SEQ ID NOs21-35所示多核苷酸相似的核苷酸序列的那些，但是其中已天然提供(即，等位基因變體)或通過有意地工程改造形成插入、缺失或取代。優選地，本發明的等位基因變體與SEQID NOs21-35所示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性(更優選地，至少95％同一性；最優選地，至少99％同一性)。
在嚴格條件下與SEQ ID NOs21-35所示核苷酸序列雜交的本發明的多核苷酸也包括具有與所公開的多核苷酸同源的序列的那些。這些同源物是從與所公開的多核苷酸(以及翻譯的多肽)的那些不同的物種中分離的多核苷酸(以及翻譯的多肽)，或者是在相同物種內，但是與所公開的多核苷酸(以及翻譯的多肽)具有顯著的序列相似性。優選地，多核苷酸同源物與所公開的多核苷酸具有至少60％序列同一性(更優選地，至少75％同一性；最優選地，至少90％同一性)，并且是從哺乳動物物種(更優選地是靈長類，最優選的是人)中分離的。
高度嚴格的雜交條件是本領域公知的。在下面的表2中顯示各種嚴格條件的實例高度嚴格條件是至少與，例如，條件A-F一樣嚴格的那些；嚴格條件是至少與，例如，條件G-L一樣嚴格的那些；且降低的嚴格條件是至少與，例如，條件M-R一樣嚴格的那些。
表2
在表2中1雜交體長度是對于雜交多核苷酸的雜交區域所預期的。當多核苷酸與未知序列的靶多核苷酸雜交時，假設雜交體長度是雜交多核苷酸的長度。當已知序列的多核苷酸雜交時，可通過將多核苷酸的序列進行比對并且鑒別最佳序列互補性的一個或多個區域，來測定雜交體長度。
2在雜交和洗滌緩沖液中可用SSPE(1xSSPE是0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH 7.4)代替SSC(1xSSC是0.15MNaCl和15mM檸檬酸鈉)代替；在雜交完成后洗滌15分鐘。TB*-TR*預計長度小于50個堿基對的雜交體的雜交溫度應當比雜交體的解鏈溫度(Tm)低5-10℃，其中根據下列等式確定Tm。對于長度小于18個堿基對的雜交體，Tm(℃)＝2(A+T堿基的數目)+4(G+C堿基的數目)。對于長度為18至49個堿基對的雜交體，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10Na+)+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是雜交體中堿基的數目，且Na+是雜交緩沖液中鈉離子的濃度(對于1xSSC，Na+＝0.165M)。
在Sambrook等，Molecular Cloning4 LaboratoryManual，Chs.9 & 11，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY(1989)，和Ausubel等，編輯，Current Protocols inMolecular Biology，Sects.2.10 & 6.3-6.4，John Wiley & Sons，Inc.(1995)中提供多核苷酸雜交嚴格條件的另外實例，在此引入作為參考。
可使用各種方法制備編碼本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶的多核苷酸。例如，可通過1個或多個缺失從全長ADAMTS的cDNA序列中獲得本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶的編碼序列。對于公開的全長ADAMTS cDNA序列，見，例如，Tortorella，等，SCIENCE，2841664-1666(1999)；Hurskainen，等，見上；Clark，等，GENOMICS，67343-350(2000)；和Cal，等，GENE，28349-62(2002)。可使用多種方法制備全長ADAMTS cDNA序列的缺失。
在一個實施方案中，使用PCR介導的反應制備位于兩個所選片段之間的序列的缺失。可首先PCR擴增所選片段，并然后符合讀框地連接，從而缺失位于其間的序列。可將連接產物亞克隆到在宿主細胞中表達的載體內。在另一個實施方案中，可通過PCR僅擴增ADAMTS編碼序列的期望部分來產生截短的ADAMTS。在另一個實施方案中，缺失基于ADAMTS編碼序列中兩個天然存在的或基因工程改造的限制性內切核酸酶識別位點。可通過任何常規方法，如定點誘變，將期望的限制位點引入到ADAMTS編碼序列中。在兩個限制位點的切割以及隨后的符合讀框的連接將缺失位于兩個限制位點之間的序列。也可使用其它缺失方法，如寡核苷酸指導的“環出”誘變、PCR重疊延伸、時間控制的外切核酸酶III消化、大引物(megaprimer)法、反向PCR或者自動DNA合成。
可將缺失引入到ADAMTS編碼序列中的任何區域。修飾的ADAMTS蛋白可通過2個或更多個缺失與全長ADAMTS蛋白不同。缺失可發生在ADAMTS蛋白的相同結構域或不同結構域。
在一個實施方案中，產生缺失文庫。缺失文庫可包括N-末端、C-末端或內部缺失的ADAMTS蛋白的編碼序列。用于這種目的的示例性的方法描述于Pues，等，NUCLEIC ACIDS RES.，251303-1305(1997)。也可使用商品化的試劑盒，如EZ::TNPlasmid-Based Deletion Machine和pWEB::TNCTMDeletion CosmidTransposition Kit(Epicentre，Madison，WI)以產生ADAMTS缺失文庫。可通過DNA或蛋白測序證實缺失。可選擇產生有生物活性的軟骨聚集蛋白聚糖酶的缺失。
在另一個實施方案中，通過將突變隨機引入到片段的編碼序列中來缺失ADAMTS片段。用于該目的的適當方法包括，但不限于，飽和誘變。在引入終止密碼子時，缺失包括位于終止密碼子后的所有殘基。
如上所述，缺失包括用其它殘基或片段替換缺失的氨基酸殘基或片段的情況。可使用本領域中的各種已知方法很容易地在編碼序列水平上完成這種替換。也可使用其它適當的方法。因此，當隨機引入的突變基本上轉化所編碼的多肽片段時，可產生片段的缺失。
缺失的制備不限于使用全長ADAMTS cDNA序列。也可使用已表達序列標志或者其它部分的或不完整的cDNA或mRNA序列制備缺失。另外，可使用基因組序列產生本發明的修飾的ADAMTS。此外，可通過修飾剪接受體或供體位點或者ADAMTS編碼序列中的其它功能性內含子序列來完成缺失。
也可使用包括遺傳密碼的簡并性或其它變異的序列。由于遺傳密碼的簡并性，有許多編碼相同多肽的多核苷酸變體。這些多核苷酸變體中的一些具有與原始多核苷酸最小的序列同一性。盡管如此，但是本發明預期使用由于密碼子選擇的差異而不同的多核苷酸。
可將編碼其它多肽的核酸序列符合讀框地與軟骨聚集蛋白聚糖酶編碼序列的5’或3’端融合。這些附加的多肽可以是，例如，肽標簽、酶、配體/受體結合蛋白、抗體或它們的任何組合。
可修飾本發明的多核苷酸以提高體內穩定性。可能的修飾包括，但不限于，在5’或3’端添加側翼序列；在主鏈中使用硫代磷酸酯或2-o-甲基而不是磷酸二酯鍵；以及包括非傳統堿基，如肌苷、Q核苷(queosine)和wybutosine，以及腺嘌呤、胞苷、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷的乙酰基、甲基、硫代或其它修飾形式。
本發明的多核苷酸可以是DNA、RNA或其它可表達的核酸分子。多核苷酸可以是單鏈的或雙鏈的。
在一個實施方案中，本發明的多核苷酸是包括與編碼本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶的序列可操作地連接的5’或3’非翻譯的調節序列的表達載體。在另一個實施方案中，從不經歷任何C-末端蛋白水解切割的表達載體中表達本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶。
表達載體通常包括一個或多個選擇性標記以及一個或多個復制起點，盡管本領域中的那些技術人員將會認識到，在某些系統中可在獨立的載體上提供選擇性標記，以及可通過整合到宿主細胞基因組內提供外源DNA的復制。表達載體的設計依賴于這些因素，如宿主細胞或者期望的表達水平的選擇。啟動子、增強子、選擇性標記以及其它元件是本領域普通技術人員水平內的常規設計的事情。文獻中描述了許多這樣的元件并可通過商品供應商獲得。
表達載體可來自各種來源，如質粒、病毒或它們的任意組合。適當的病毒載體包括，但不限于，逆轉錄病毒、慢病素、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、皰疹病毒、甲病毒、星狀病毒、冠狀病毒、正粘病毒、乳頭多瘤空泡病毒、副粘病毒、細小病毒、細小核糖核酸病毒、痘病毒或者披膜病毒載體。
在一個實施方案中，表達載體是具有組成型或誘導型啟動子的大腸桿菌(E.coli)載體。為了符合所需目的，如提高重組蛋白的表達或溶解度或者幫助其純化，可將編碼附加肽的序列與軟骨聚集蛋白聚糖酶編碼序列融合。在一個實例中，融合肽可從重組蛋白中切割下來。適于此目的的表達載體包括，但不限于，pGEX(PharmaciaPiscataway，NJ)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRITS(Pharmacia，Piscataway，NJ)。
可使用各種方法使重組蛋白在大腸桿菌中的表達最大化。一個策略是使用蛋白水解切割重組蛋白的能力損害的宿主細菌。另一個策略是改變編碼序列從而使得每個氨基酸的單個密碼子優先被大腸桿菌利用。
在另一個實施方案中，表達載體是酵母表達載體。示例性的酵母表達載體包括，但不限于，pYepSec1、pMFa、pJRY88、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)以及picZ(Invitrogen Corp，San Diego，CA)。
在另一個實施方案中，表達載體是昆蟲細胞表達載體。常用的昆蟲細胞表達載體包括桿狀病毒表達載體，如pAc和pVL系列。
在另一個實施方案中，表達載體是哺乳動物表達載體。合適的哺乳動物表達載體包括，但不限于，pCDM8、pMT2PC、pJL3、pJL4、pMT2 CXM以及pEMC2β1。當在哺乳動物細胞中使用時，經常由病毒調節元件提供表達控制序列。例如，通常在哺乳動物表達載體中使用來自多形瘤、腺病毒2、巨細胞病毒或猿猴病毒40的啟動子。
本發明的哺乳動物表達載體也可包括組織特異性調節元件。合適的組織特異性啟動子包括，但不限于，肝特異性啟動子、淋巴特異性啟動子、T細胞特異性啟動子、神經元特異性啟動子、胰特異性啟動子以及乳腺特異性啟動子。另外，本發明預期使用發育調節的啟動子，如甲胎蛋白啟動子。已在許多組織和在各種發育階段檢測到了ADAMTS的表達。例如，RNA印跡分析表明ADAMTS-9在成人心臟、胎盤和骨骼肌中高度表達，但在脾、胸腺、前列腺、睪丸、小腸和外周血白細胞中低至不可檢測到的水平。見Somerville，等，J.BIOL.CHEM.，2789503-9513(2003)。RT-PCR分析也在卵巢、胰、肺和腎中檢測到ADAMTS-9的表達。在發育期間，ADAMTS-9的表達在7天和17天齡的小鼠胚胎中高，而在11天和15天齡的小鼠胚胎中更低。同樣地，已在多種組織，如腦、心、肺、肝、胰、腎、骨骼肌和胎盤中檢測到ADAMTS-7。見Hurskainen，等，見上。組織特異性或發育調節的啟動子的使用允許ADAMTS蛋白的更特異的功能分析。
在另一個實施方案中，表達載體包括反義方向的ADAMTS編碼序列。可選擇與反義方向的編碼序列可操作地連接的調節序列以指導反義RNA分子在各種細胞類型中的連續表達。合適的調節序列包括病毒啟動子或增強子。也可選擇調節序列以指導反義RNA的組成型或組織特異性表達。
此外，本發明預期使用可調節的表達系統在許多類型的細胞中表達軟骨聚集蛋白聚糖酶。適合于此目的的系統包括，但不限于，Tet-開/關系統、蛻皮激素系統、孕酮系統和雷帕霉素系統。Tet-開/關系統基于來自大腸桿菌Tn10轉座子的四環素抗性操縱子的兩個調節元件。該系統包括兩個組分調節質粒和報告質粒。調節質粒編碼含有與單純皰疹病毒的VP16活化結構域融合的突變的Tet阻遏物(rtetR)的雜合蛋白。報告質粒含有控制報告基因表達的tet-反應元件(TRE)。rtetR-VP16融合蛋白結合TRE，因此在存在四環素時激活報告基因的轉錄。可將Tet-開/關系統摻入到各種病毒載體中，如逆轉錄病毒、腺病毒或AAV載體。
蛻皮激素系統基于果蠅(Drosophila)中的蛻皮誘導系統。該系統使用muristerone A，一種果蠅類固醇激素蛻皮激素的類似物，以通過異二聚體核受體激活基因表達。在某些實施方案中，誘導的表達水平可為基本水平的至少200倍，而不顯著影響轉染的細胞的生理學。
孕酮系統基于孕酮受體的作用。孕酮受體是核/類固醇受體超家族的成員。在結合于其激素配體(如孕酮)后，該受體便結合孕酮反應元件，從而激活基因轉錄。可通過結合于米非司酮(RU486)，即一種孕酮拮抗劑，來阻斷孕酮受體的作用。可通過將孕酮受體的RU486-結合結構域與酵母GAL4 DNA-結合結構域和HSV VP16轉錄激活結構域融合，來制備嵌合的轉錄因子。嵌合因子在不存在RU486時無活性。然而，添加RU486誘導構象變化，其反過來激活嵌合因子并允許從含有GAL4結合位點的啟動子進行轉錄。
雷帕霉素系統，也稱作CID系統(“二聚化的化學誘導物”)，使用由雷帕霉素引起的二聚化活性。雷帕霉素誘導兩個細胞蛋白FKBP12和FRAP的異二聚體化。雷帕霉素系統使用兩個嵌合蛋白。第一個嵌合蛋白包括與結合DNA反應元件的DNA結合結構域融合的FKBP12。第二個嵌合蛋白包括與轉錄激活結構域融合的FRAP。雷帕霉素的加入引起兩個嵌合蛋白的二聚化，從而激活由DNA反應元件控制的基因轉錄。
本發明也提供生產截短的有生物活性的ADAMTS蛋白的方法，優選地為具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的那些。例如，可在生產截短的ADAMTS蛋白(例如，SEQ ID NOs2-4、6-8、10-12、4-16和18-20)的條件下，培養用在表達控制序列控制下的本發明的多核苷酸(例如，SEQ ID NOs21-35)轉化或轉染的適當的宿主細胞系。將蛋白從細胞或培養基中回收并純化，從而使得該蛋白基本上無其它蛋白。表達和純化重組蛋白的一般方法是本領域公知的。
許多細胞系可作為適于截短的ADAMTS蛋白多肽重組表達的宿主細胞。哺乳動物宿主細胞系包括，例如，COS細胞、CHO細胞、293T細胞、A431細胞、3T3細胞、CV-1細胞、HeLa細胞、L細胞、BHK21細胞、HL-60細胞、U937細胞、HaK細胞、Jurkat細胞，以及來自原代組織和原代外植塊的體外培養物的細胞株。
也可在昆蟲細胞中重組產生截短的ADAMTS蛋白，如Sf9細胞和果蠅S2細胞。用于Sf9和S2表達的材料和方法可通過商業途徑以試劑盒的形式獲得(例如，分別為MaxBac試劑盒和DES試劑盒，Invitrogen，Carlsbad，CA)。
可選擇地，可能在更低等的真核生物如酵母或在原核生物中重組生產截短的ADAMTS蛋白。潛在合適的酵母株包括Sshizosaccharomyces cerevisiae、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克魯維氏酵母(Kluyveromyces)株和假絲酵母(Candida)株。潛在合適的細菌株包括大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)以及鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)。如果在酵母或細菌中生產截短的ADAMTS蛋白，那么為了獲得功能性，可能必須通過，例如，適當位點的磷酸化或糖基化來修飾它們。可使用公知的化學的或酶促法完成這種共價附著。
可將附加多肽融合到本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶的N-或C-末端。可利用各種方法制備融合蛋白。融合的多肽便于蛋白純化、檢測、固定、折疊、尋靶作用，或其它期望的目的。融合的多肽也可用于提高重組蛋白的表達、溶解度或穩定性。在一個實施方案中，融合的多肽不顯著影響軟骨聚集蛋白聚糖酶的蛋白水解活性。
適于制備融合蛋白的示例性多肽包括，但不限于，肽標簽、酶、抗體、受體、配體/受體結合蛋白，或者它們的任何組合。如這里所使用的，抗體可以是，例如，多克隆的、單克隆的、單特異性的、多特異性的、非特異性的、人源化的、人類的、單鏈的、嵌合的、合成的、重組的、雜合的、突變的、移植的或者體外所產生的抗體。抗體也可以是Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、dAb或保留抗原結合功能的任何其它抗體片段。
適合于本發明的肽標簽包括，但不限于，聚組氨酸或聚組氨酸-甘氨酸標簽、FLAG附加表位、KT3表位肽、flu HA標簽多肽、c-myc標簽、單純皰疹糖蛋白D、β-半乳糖苷酶、麥芽糖結合蛋白、鏈霉抗生物素蛋白標簽、微管蛋白表位肽、T7基因10蛋白肽標簽和谷胱甘肽S-轉移酶。可很容易獲得抗這些肽標簽的抗體。代表性的抗體包括抗flu HA標簽多肽的抗體12CA5以及抗c-myc標簽的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗體。
在一個實施方案中，融合的多肽與天然存在的ADAMTS序列基本上沒有序列同一性或相似性。例如，融合的多肽與天然存在的全長ADAMTS蛋白的序列同一性或相似性低于80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或5％。可通過使用，例如，GCGBESTFIT(Smith-Waterman算法)確定序列同一性或相似性。
在一個實施方案中，將Strep-標簽(IBA)共價附著到本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶的C-末端。Strep-標簽具有氨基酸序列“WSHPQFEK”(SEQ ID NO36的氨基酸殘基4-11)，其由例如核苷酸TGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAATAA(SEQ ID NO37)編碼。可在標簽和軟骨聚集蛋白聚糖酶之間加入肽接頭(例如，“GSA”)以提高標簽的可接近性，以產生由核苷酸GGAAGCGCTTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAATAA(SEQ IDNO39)編碼的GSAWSHPQFEK(SEQ ID NO38)。
SEQ ID NO40-44顯示示例性融合蛋白的氨基酸序列，其包括分別在C-末端與Strep-標簽共價連接的修飾的ADAMTS-7、-9、-10、-16和-18。
可在融合的多肽和軟骨聚集蛋白聚糖酶之間的連接處引入蛋白水解切割位點。在重組蛋白純化后，切割位點使軟骨聚集蛋白聚糖酶從融合的多肽上分離。適合此目的的切割酶包括，但不限于，因子Xa、凝血酶和腸激酶。
在另一個實施方案中，在相同蛋白中包括本發明軟骨聚集蛋白聚糖酶的兩個或更多個拷貝。這種融合蛋白可具有提高的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。
截短的ADAMTS蛋白也可用小的表位標記，隨后使用表位的特異性抗體鑒別或純化。優選的表位是FLAGTM表位，其可商購自Eastman Kodak(New Haven，CT)。另外，可將截短的ADAMTS蛋白表達為6xHis-標記的蛋白，以使用金屬螯合物親和層析進行純化。用于His-標記的蛋白表達和純化的材料和方法可通過商業途徑以試劑盒形式獲得(例如，QIAexpress系統，Qiagen，Valencia，CA)。
也可通過已知的常規化學合成生產截短的ADAMTS蛋白。化學合成多肽的方法是本領域中技術人員公知的。這種化學合成的多肽可具有與天然的、純化的多肽相同的生物學特性，并因此可用作天然多肽的有生物活性的或免疫學替代品。
ADAMTS蛋白(具體地為軟骨聚集蛋白聚糖酶)的抗體分子可商購自，例如，Cedarlane Laboratories，Ontario，加拿大；Triple Point Biologics，Forest Grove，OR；以及Acris GmbH，Hiddenhausen，德國。這種抗體應當識別本發明的截短的ADAMTS蛋白，前提是它們針對蛋白的成熟N-末端(未截短的部分)制備。可選擇地，可通過本領域技術人員公知的方法生產特異性識別本發明截短的ADAMTS蛋白的抗體。
例如，可通過用截短的ADAMTS蛋白免疫適當的受試者來生產多克隆血清和抗體。可通過標準技術，如用使用固定的標記蛋白的酶聯免疫吸附測定(ELISA)隨時間推移監控所免疫的受試者中的抗體效價。如果期望的話，可將抗體分子從受試者或培養基中分離并通過已知技術，如A蛋白或G蛋白層析法進一步純化以獲得IgG級分。
可根據已知方法通過產生雜交瘤，來生產識別截短的ADAMTS蛋白的單克隆抗體。然后使用標準方法，如ELISA，篩選以這種方式形成的雜交瘤，以鑒別一個或多個產生特異性識別該蛋白的抗體的雜交瘤。整個截短的ADAMTS蛋白可用作免疫原，或者，可選擇地，可使用蛋白的抗原性肽片段。另外，可使用本領域技術人員公知的試劑盒和方法生產本發明截短的ADAMTS蛋白的重組單特異性抗體。
一旦蛋白經過純化，則可使用標準技術如SDS-PAGE或免疫印跡進行分析和證實。SDS-PAGE可用考馬斯藍、銀或其它適當的試劑染色以顯現純化的蛋白。純化的蛋白可通過蛋白測序或質譜法進一步分析。在一個實例中，從SDS-PAGE上人工切下目的蛋白條帶，然后進行還原、烷基化以及用胰蛋白酶或內肽酶Lys-C(Promega，Madison，WI)消化。可使用自動凝膠內消化自動機在原位進行消化。消化后，可濃縮肽提取物并通過微量電噴射反相HPLC進行分離。可在Finnigan LCQ離子阱質譜儀(ThermoQuest，San Jose，CA)上進行肽分析。可使用整合到Finnigan Bioworks數據分析包(ThermoQuest，San Jose，CA)內的SEQUEST計算機算法進行MS/MS數據的自動分析。
也可用免疫印跡如蛋白印跡對純化的軟骨聚集蛋白聚糖酶蛋白進行分析或證實。在一個實施方案中，將SDS-PAGE中的蛋白樣品轉移至硝酸纖維素膜上，然后通過抗體進行檢測。在一個實例中，使用抗修飾的ADAMTS的兔抗體，隨后用山羊抗兔IgG-HRP和化學發光底物(Pierce，Milwaukee，WI)檢測純化的軟骨聚集蛋白聚糖酶。
在另一個實施方案中，使用無細胞的轉錄和翻譯系統表達軟骨聚集蛋白聚糖酶。合適的無細胞的表達系統包括，但不限于，麥胚提取物、網織紅細胞裂解物或HeLa核提取物。
本發明的截短的ADAMTS優選地具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。可利用許多測定檢測本發明的截短的ADAMTS的生物學活性。示例性的測定包括，但不限于，熒光肽測定、新表位蛋白印跡、軟骨聚集蛋白聚糖ELISA和活性測定。前兩個測定適于檢測在軟骨聚集蛋白聚糖的IGD中Glu373-Ala374鍵處的切割能力。
在熒光肽測定中，將軟骨聚集蛋白聚糖酶與含有軟骨聚集蛋白聚糖酶切割位點上的氨基酸序列的合成肽一起溫育。將合成肽的N-末端或C-末端用熒光團標記而另一個末端包括猝滅劑。肽的切割將熒光團和猝滅劑分離，從而引起熒光。相對熒光可用于測定所表達的軟骨聚集蛋白聚糖酶的相對活性。
在新表位蛋白印跡中，將軟骨聚集蛋白聚糖酶與完整的軟骨聚集蛋白聚糖一起溫育。然后在通過SDS-PAGE分離前，將切割產物進行幾個生物化學處理。生物化學處理包括，例如，透析、軟骨素酶(chondroitinase)處理、冷凍干燥以及重構。將SDS-PAGE中的蛋白樣品轉移到膜(如硝酸纖維素紙)上，并用新表位特異性抗體染色。新表位抗體特異性識別通過軟骨聚集蛋白聚糖的蛋白水解切割所暴露的新的N-或C-末端氨基酸序列。抗體不結合原始的或未切割的分子上的這種表位。合適的新表位特異性抗體包括，但不限于，MAb BC-13、MAb BC-3和I19C抗體。見，例如，Caterson，等，見上；和Hashimoto，等，FEBS LETTERS，494192-195(2001)。可使用堿性磷酸酶綴合的第二抗體和氮藍四唑色原和溴氯吲哚磷酸底物(NBT/BCIP)顯現切割的軟骨聚集蛋白聚糖片段。條帶的相對密度表示相對的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。
可使用軟骨聚集蛋白聚糖ELISA檢測軟骨聚集蛋白聚糖分子中的任何切割。在該測定中，將修飾的蛋白與先前已附著到塑料孔上的完整的軟骨聚集蛋白聚糖溫育。將孔洗滌，且然后與檢測軟骨聚集蛋白聚糖的抗體溫育。用第二抗體使孔顯色。如果最初量的軟骨聚集蛋白聚糖保留在孔中，那么抗體染色將會是濃的。如果軟骨聚集蛋白聚糖被軟骨聚集蛋白聚糖酶消化，那么附著的軟骨聚集蛋白聚糖分子將離開孔，從而減少隨后抗體的染色。該測定可檢測修飾的蛋白能否切割軟骨聚集蛋白聚糖。也可使用該測定來測定修飾的蛋白的相對切割活性。
也可使用活性測定來評估軟骨聚集蛋白聚糖酶的切割活性。在該測定中，首先用透明質酸(ICN)，隨后用軟骨素酶處理的牛軟骨聚集蛋白聚糖包被微量滴定板。軟骨素酶可購自SeikagakuChemicals。向軟骨聚集蛋白聚糖包被的板添加含有所表達的重組軟骨聚集蛋白聚糖酶的培養基。洗去在IGD內的Glu373-Ala374處被切割的軟骨聚集蛋白聚糖。可用3B3抗體(ICN)，隨后用抗-IgM-HRP第二抗體(Southern Biotechnology)檢測剩余的未切割的軟骨聚集蛋白聚糖。可使用，例如，3，3″，5，5″-四甲聯苯胺(TMB，BioFxLaboratories)獲得最終的顯色。
在許多實施方案中，本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶具有改良的穩定性和增加的表達。這允許大量分離軟骨聚集蛋白聚糖酶，從而便于軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑的開發。
可使用任何適當的篩選測定開發抑制劑。一般地，篩選方法包括在存在或不存在目的化合物時將軟骨聚集蛋白聚糖酶與軟骨聚集蛋白聚糖酶底物接觸。然后測量軟骨聚集蛋白聚糖酶的切割活性以確定目的化合物的抑制作用。見，例如，Hashimoto，等，見上。在一個實施方案中，用高通量方法或化合物文庫篩選抑制劑。在它們表達和純化后，可在篩選測定中使用截短的有生物活性的ADAMTS蛋白以鑒別能調節ADAMTS活性的藥學試劑或主要化合物(leadcompound)。例如，可將含有純化的截短的ADAMTS蛋白的樣品與多個測試化合物(例如，小的有機分子、生物試劑)中的一個接觸，并將ADAMTS蛋白的活性(例如，hyelectanase活性、軟骨聚集蛋白聚糖酶活性、α2-巨球蛋白切割活性)與未接觸的蛋白或與不同測試化合物接觸的蛋白的活性比較，以測定測試化合物中的任何一種是否提供1)基本上降低的ADAMTS活性水平，從而表明是ADAMTS活性的抑制劑；或2)基本上提高的ADAMTS活性水平，從而表明是ADAMTS活性的活化劑。
優選地，純化的截短的ADAMTS蛋白具有hyelectanase活性，且更優選地，軟骨聚集蛋白聚糖切割活性，并且用于上述篩選測定以鑒別hyelectanase和/或軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的抑制劑。使用類似的篩選測定已鑒別了幾個選擇性的軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑(見，例如，Cherney等，Bioorg.Med.Chem.Lett.12101(2002)；Yao等，Bioorg.Med.Chem.Lett.131297(2003)；Yao等，J.Med．Chem.443347(2001))。軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的測定是本領域公知的，且包括軟骨聚集蛋白聚糖-聚丙烯酰胺顆粒測定(Vankemmelbeke等，Eur.J.Biochem.2702394(2003))和通過SDS-PAGE檢測軟骨聚集蛋白聚糖核心蛋白片段(Hashimoto等，FEBSLett.494192(2001))。
優選地，上述軟骨聚集蛋白聚糖酶活性測定是免疫測定。這種免疫測定利用特異性識別由截短的ADAMTS蛋白的酶促活性所產生的軟骨聚集蛋白聚糖新表位(優選在軟骨聚集蛋白聚糖的Glu373-Ala374位置)的抗體。這種抗體，例如BC-3(其識別N-末端新表位374ARGSV)和BC-13(其識別C-末端新表位ITEGE373)，是本領域公知的(Hughes等，Biochem.J.305799(1995))或可通過本領域技術人員公知的方法生產，并且可用于通過蛋白印跡和ELISA檢測軟骨聚集蛋白聚糖切割產物(見，例如，Miller等，Anal.Biochem.314260(2003)；Hughes等，J.Biol.Chem.27220269(1997))。
可根據本領域的已知方法制備通過上述篩選測定鑒定的化合物(特別是抑制軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的那些)，并且在體內以藥物組合物的形式施用，以用于治療關節炎和其它炎性障礙。藥物組合物可以以本領域公知的任何途徑施用，包括，但不限于，關節內、經口、經鼻、直腸、局部、舌下、靜脈內、肌內、動脈內、髓內、鞘內、心室內、腹膜內以及經皮途徑。除了活性成分外，藥物組合物可含有藥學上可接受的載體，包括，例如，本領域公知的賦形劑、包衣以及輔助劑(auxiliaries)。
也可使用三維結構分析或計算機輔助的藥物設計鑒定或設計抑制劑。后一方法可能需要基于軟骨聚集蛋白聚糖酶或軟骨聚集蛋白聚糖的三維結構測定抑制劑的結合位點，然后開發與軟骨聚集蛋白聚糖酶或軟骨聚集蛋白聚糖上的結合位點反應的分子。隨后測定候選分子的抑制活性。也可使用適于開發蛋白酶抑制劑的其它常規方法以鑒定軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑。
軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑可以是，例如，蛋白、肽、抗體、小分子或化合物。抑制劑可產生軟骨聚集蛋白聚糖酶的蛋白水解活性的降低、減少或消除。可通過上述測定測量軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的降低、減少或消除。在一個實例中，本發明的抑制劑可將軟骨聚集蛋白聚糖酶活性降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在另一個實例中，軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑特異性降低或消除軟骨聚集蛋白聚糖酶，但不是其它蛋白酶，如MMPs的酶促活性。在另一個實例中，軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑降低或消除特異性ADAMTS蛋白，但不是其它ADAMTS蛋白的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。
各種疾病或狀況的特征是軟骨聚集蛋白聚糖的降解。可在這些疾病或狀況的治療中使用通過本發明所鑒定的軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑。預期可通過使用軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑治療的疾病包括，但不限于，骨關節炎、癌癥、炎性關節病、類風濕性關節炎、膿毒性關節炎、牙周病、角膜潰瘍、蛋白尿、動脈粥樣硬化斑塊破裂引起的冠狀血栓形成、主動脈瘤疾病(aneurysmal aortic disease)、炎性腸病、Crohn氏病、肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合癥、哮喘、慢性阻塞性肺部疾病、阿爾茨海默病、腦和造血惡性腫瘤、骨質疏松癥、帕金森氏病、偏頭痛、抑郁癥、周圍神經病、Huntington氏病、多發性硬化、眼血管發生、黃斑變性、主動脈瘤心肌梗死、自身免疫性疾病、創傷性關節損傷后的退行性軟骨喪失、頭部創傷、營養不良性大皰性表皮松解癥、脊髓損傷、急性和慢性神經變性病、骨量減少、顳頜關節病、神經系統脫髓鞘病、器官移植毒性和排斥、惡病質、變態反應、組織潰瘍、再狹窄，以及以胞外基質的異常降解、改變的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性或改變的軟骨聚集蛋白聚糖酶水平為特征的其它疾病。
如這里所使用的，治療包括治療性處理或者預防性的或預防性措施。需要治療的那些可包括已患有具體醫學障礙的個體以及可能最終獲得障礙的那些(即，需要預防性措施的那些)。治療可調節軟骨聚集蛋白聚糖酶活性或軟骨聚集蛋白聚糖酶的蛋白水平以預防或改善疾病的臨床癥狀。抑制劑可通過，例如，阻止軟骨聚集蛋白聚糖酶和軟骨聚集蛋白聚糖之間的相互作用，或者降低或消除蛋白水解活性來發揮功能。
在一個實施方案中，以藥物組合物向患者或動物施用本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑。藥物組合物包括足以治療患者或動物的有效量的抑制劑。藥物組合物也可包括藥學上可接受的載體。藥學上可接受的載體可包括與藥物施用相容的溶劑、增溶劑、填充物、穩定劑、粘合劑、吸收劑、基質(bases)、緩沖劑、潤滑劑、控釋載體、稀釋劑、乳化劑、濕潤劑、潤滑劑、分散介質、包衣、抗細菌或抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑，等等。這些介質和試劑用于藥學上有效的物質是本領域公知的。也可將補充試劑摻入到組合物中。
可配制藥物組合物以與其打算的施用途徑相容。施用途徑的舉例包括腸胃外、靜脈內、皮內、皮下、經口、吸入、經皮、直腸、跨粘膜、局部以及全身施用。在一個實例中，通過使用植入物施用。
用于腸胃外、皮內或皮下應用的溶液或懸浮液可包括下列成分無菌稀釋劑如注射用水、鹽溶液、固定油類、聚乙二醇、甘油；丙二醇或其它合成溶劑；抗細菌劑，如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖液如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及滲漲度調節劑如氯化鈉或葡萄糖。可用酸或堿調整pH，如鹽酸或氫氧化鈉。可將腸胃外制劑封入由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或者多劑小瓶。
可向患者或動物施用藥物組合物，從而使得軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑以足夠的量降低或消除靶定的軟骨聚集蛋白聚糖的活性。軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑的適當治療劑量范圍可以是，例如，5mg-100mg、15mg-85mg、30mg-70mg或者40mg-60mg。也可使用低于5mg或高于100mg的劑量。可以以單劑或多劑施用抑制劑。劑量可在如每日一次、每周一次或每月一次的時間間隔施用。可基于，例如，抑制劑與其軟骨聚集蛋白聚糖酶靶的親和力、抑制劑的半衰期以及患者狀況的嚴重程度調整軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑施用的劑量時間表。在一個實施方案中，以快速灌注給藥(bolus dose)施用抑制劑，以使它們的循環水平最大化。在另一個實施方案中，在快速灌注給藥后使用連續輸注。
可通過在細胞培養物或實驗動物模型中的標準藥學方法測定軟骨聚集蛋白聚糖酶化合物的毒性和治療功效。例如，可測定LD50(使群體的50％致死的劑量)和ED50(在群體的50％中治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比是治療指數，且可表示為比率LD50/ED50。在一個實例中，選擇顯示高治療指數的抑制劑。
可在配制用于人的劑量范圍中使用從細胞培養物測定和動物研究中所獲得的數據。這些化合物的劑量可能在顯示具有小的毒性或無毒性的ED50的循環濃度的范圍內。劑量可在該范圍內變化，這依賴于所使用的劑量形式和所利用的施用途徑。對于根據本發明所使用的任何抑制劑，可從細胞培養物測定中初步估計治療有效劑量。可在動物模型中配制劑量以達到顯示如通過細胞培養物測定所測定的IC50(即，達到癥狀的最大半數抑制的測試抑制劑的濃度)的循環血漿濃度范圍。例如，可通過高效液相層析測量血漿中的水平。可通過適當的生物測定監控任何特定劑量的效果。適當生物測定的實例包括DNA復制測定、基于轉錄的測定、GDF蛋白/受體結合測定、肌酸激酶測定、基于前脂肪細胞分化的測定、基于脂肪細胞中葡萄糖攝取的測定以及免疫學測定。
可由主治醫師根據修飾軟骨聚集蛋白聚糖酶蛋白作用的各種因素、病理學部位、疾病的嚴重程度、患者的年齡、性別和飲食、任何炎癥的嚴重程度、施用時間以及其它臨床因素確定組合物施用的劑量方案。通常，將以最小有效的劑量開始全身性或可注射的施用，且將在預選的時程提高劑量直到觀察到陽性效果。隨后，當考慮可能出現的任何副作用時，劑量的遞增增加將限于產生效果相應提高的水平。向最終的組合物添加其它已知因子也可影響劑量。
可通過疾病進展的周期性評估監控進展。可通過例如，X-射線、MRI或其它成像形式、滑液分析或者臨床檢查來監控進展。
在疾病是由軟骨聚集蛋白聚糖或其它胞外基質蛋白的累積所致的情況中，可將本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶引入患該病的人或動物以糾正這種缺陷。這樣引入的軟骨聚集蛋白聚糖酶應當有對爭論的胞外基質蛋白的蛋白水解活性。向人或動物施用治療性蛋白的方法是本領域公知的。適當的方法包括上述那些。另外，可使用基于基因治療的方法。
可在檢測的測定和方法中使用本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑以測定樣品中存在或不存在軟骨聚集蛋白聚糖酶，或者測定軟骨聚集蛋白聚糖酶的量。檢測的測定或方法可以是體內或體外的。通過將這些蛋白的存在或水平與疾病相聯系，本領域技術人員可診斷相關的疾病或確定其嚴重程度。可通過目前所公開的抑制劑所診斷的疾病如上所述。
如果打算將抑制劑用于診斷目的，那么可能期望修飾它們；例如，用配體基團(如生物素或具有特異性結合配偶體的其它分子)或者檢測標記基團(如熒光團、發色團、放射性原子、密電子試劑或酶)。具有特異性結合配偶體的分子包括，例如，生物素和抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白、IgG和A蛋白以及本領域已知的大量受體-配體偶。一般地通過它們的活性檢測酶。例如，可通過其將四甲聯苯胺(TMB)轉化為藍色色素的能力來檢測辣根過氧化物酶，所述色素可用分光光度計定量。
應當理解的是，上述實施方案和下列實施例是通過舉例說明，而不是限制的方式給予的。本發明范圍內的各種改變和修飾根據本說明書對于本領域技術人員將是顯而易見的。
實施例實施例1.截短的ADAMTS的構建
在圖1中描述了代表性的全長ADAMTS-7、-9、-10、-16和-18蛋白的全部結構域結構。與其它全長ADAMTS家族成員一樣，ADAMTS-7、-9、-10、-16和-18具有信號肽(SP)、前肽(Pro)、催化結構域(Cat結構域)、解整連蛋白樣結構域(Disint)、血小板反應蛋白1型重復(Tsp)、富含半胱氨酸的結構區結構域(富含Cys)、間隔區結構域(間隔區)以及可變數目的羧基末端血小板反應蛋白重復(T)。ADAMTS-7進一步含有位于第三和第四羧基末端血小板反應蛋白重復之間的一個附加間隔區結構域。在圖1中顯示中央血小板反應蛋白I型重復后空間上保守的苯丙氨酸殘基，對于ADAMTS-7是Phe599、對于ADAMTS-9是Phe649、對于ADAMTS-10是Phe608、對于ADAMTS-16是Phe647和對于ADAMTS-18是Phe650。
在圖2中舉例說明5種截短的ADAMTS-7(A7FS)、ADAMTS-9(A9FS)、ADAMTS-10(A10FS)、ADAMTS-16(A16FS)和ADAMTS-18(A18FS)蛋白的結構域結構。每種截短都包括位于保守的苯丙氨酸殘基C-末端的所有氨基酸殘基的缺失。將Step-標簽添加到每個截短的ADAMTS的C-末端以幫助蛋白純化。在SEQ IDNOs41-45中分別描述A7FS、A9FS、A10FS、A16FS和A18FS的氨基酸序列。
可使用PCR制備A7FS、A9FS、A10FS、A16FS和A18FS的DNA編碼序列。可從人ADAMTS-7(GenBank登記號No.AF140675)、ADAMTS-9(GenBank登記號No.AF261918)、ADAMTS-10(GenBank登記號No.NP_112219)、ADAMTS-16(GenBank登記號No.NP_620687)和ADAMTS-18(GenBank登記號No.NP_955387)的公開序列中設計PCR引物。在一個實例中，可使用Advantage-GC PCR試劑盒(Clontech)從適當的人cDNA文庫(例如，心臟、骨骼肌、腎或胰cDNA文庫)中擴增A7FS或A9FS的編碼序列。反應條件可以是由生產商推薦的那些。在某些情況中，反應條件包括下列例外所用的GC Melt的量是每50μl反應物10μl；所用的Not I線性化文庫的量是0.2ng/μl反應物；以及所用的每個寡核苷酸(oligo)的量是2pmol/μl反應物。循環條件如下95℃1分鐘，1個循環；隨后是由95℃15秒鐘/68℃2分鐘組成的30個循環。
用于PCR擴增的5′引物可在ADAMTS-7、-9、-10、-16和-18編碼序列的起始密碼子(ATG)的上游摻入EcoR I位點(GAATTC)和修飾的Kozak序列(CCACC)。用于PRC擴增的3′引物可摻入編碼接頭“GSA”的附加序列、Step標簽、終止密碼子(例如，TAA)和NotI位點(GCGGCCGC)。可在保守的苯丙氨酸殘基密碼子的下游添加附加序列。分離具有適當大小的PCR產物，且然后用EcoRI和NotI消化。將消化后的產物連接到包括相同限制位點的表達載體內。可對克隆的PCR片段進行測序以證實它們的特性。
在一個實例中，表達載體是CHO細胞表達載體，如pTmed載體，其序列如SEQ ID NO8所示。
實施例2.截短的ADAMTS的表達和純化
使用生產商所推薦的脂質轉染方案(In Vitrogen的Lipofectin)，將含有A7FS、A9FS、A10FS、A16FS或A18FS序列的pTmed載體轉染到CHO/DUKX細胞中。將克隆在0.02μM氨甲蝶呤中進行選擇。當在選擇培養基中培養時，挑取克隆并擴增形成細胞系。
通過使用與辣根過氧化物酶(HRP)綴合的抗鏈霉抗生物素蛋白抗體(Southern Biotech)的蛋白印跡，隨后通過ECL化學發光(Amersham Biosciences)和放射自顯影術監控CHO條件培養基中的重組蛋白，來選擇表達最高水平的重組蛋白的細胞系。
通過超濾和在Strep-Tactin柱(IBA)上親和純化的組合來純化重組蛋白。通過利用10,000 MWCO濾器的超濾法將CHO條件培養基濃縮大約35倍。然后將條件培養基滯留物(retentate)應用到Strep-Tactin親和柱中。根據生產商推薦的方案，通過應用多個等分試樣的洗滌緩沖液從柱中除去非特異性結合的蛋白。通過添加脫硫生物素從柱上洗脫重組蛋白。
實施例3.A7FS、A9FS、A10FS、A16FS和A18FS的軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的檢測
通過將牛軟骨聚集蛋白聚糖與純化的重組蛋白溫育，隨后通過消化物的SDS-PAGE分級分離和蛋白印跡分析測定軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。用C1單克隆抗體(C1 MAb)探測蛋白印跡，所述抗體特異性識別由軟骨聚集蛋白聚糖的蛋白水解所產生的新表位(即，軟骨聚集蛋白聚糖在Glu373-Ala374鍵切割后約70kDa的具有G1的產物的羧基末端序列...NITEGE373(SEQ ID NO9))。通過與NBT/BCIP底物(Promega)溫育顯現C1 MAb。
圖8A-8E分別顯示用重組A7FS蛋白、A9FS蛋白、A10FS蛋白、A16FS和A18FS蛋白消化牛軟骨聚集蛋白聚糖。將消化后的蛋白在SDS-PAGE上分級分離，然后轉移到尼龍膜用于蛋白印跡分析。陰性對照是無重組蛋白的牛軟骨聚集蛋白聚糖。陽性對照是重組軟骨聚集蛋白聚糖酶1蛋白(ADAMTS-4)。
實施例4.C1 MAb的產生
將合成肽CGGPLPRNITEGE(SEQID NO46)與載體蛋白KLH偶聯，且使用該綴合物作為免疫原用于通過標準雜交瘤技術生產單克隆抗體。簡要地，用溶于完全弗氏佐劑的20μg免疫原皮下免疫BALB/c小鼠。使用溶于不完全弗氏佐劑的肽重復注射2次(每2周一次)。在所免疫的小鼠上進行試驗放血，并通過ELISA評價血清對免疫肽和ADAMTS-4消化的牛關節軟骨軟骨聚集蛋白聚糖的反應性(Flannery等，見上)。在雜交瘤融合前三天，給予顯示最高抗體效價的小鼠最后一次無佐劑的免疫。從該小鼠分離脾細胞并與FO骨髓瘤細胞(美國典型培養物保藏中心，Manassas，VA)融合并在HAT選擇培養基(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中培養。通過ELISA篩選抗KLH和KLH-CGGPLPRNITEGE抗原的雜交瘤培養物上清液，以及通過蛋白印跡篩選抗ADAMTS-4消化的軟骨聚集蛋白聚糖的雜交瘤培養物上清液。通過有限稀釋選擇用于亞克隆的陽性雜交瘤克隆。將稱為C1 MAb的單雜交瘤細胞系在培養物中擴增。使用小鼠單克隆抗體同種型分型試劑盒(Roche，Indianapolis，IN)確定抗體同種型是IgG1(κ輕鏈)，并通過A蛋白親和層析從1升培養基中純化IgG。
實施例5.載體表達
也可以在本發明中使用p91023(b)的衍生物哺乳動物表達載體pMT2 CXM。pMT2 CXM載體不同于p91023(b)，因為前者含有替代四環素抗性基因的氨芐青霉素抗性基因并且進一步含有用于cDNA克隆插入的Xho I位點。pMT2 CXM的功能元件包括腺病毒VA基因、SV40復制起點(包括72 bp的增強子)、腺病毒主要晚期啟動子(包括5′剪接位點和在腺病毒晚期mRNAs上存在的腺病毒三聯前導序列的大多數)、3′剪接受體位點、DHFR插入片段、SV40早期聚腺苷酸化位點(SV40)以及在大腸桿菌中增殖必需的pBR322序列。
通過已在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD(美國)保藏，登記號為ATCC 67122的pMT2-VWF的EcoRI消化，獲得質粒pMT2 CXM。EcoR I消化切除pMT2-VWF中存在的cDNA插入片段，從而產生可被連接并用于轉化大腸桿菌HB 101或DH-5以獲得氨芐青霉素抗性的線性形式pMT2。可通過常規方法制備質粒pMT2 DNA。然后使用環出/環入誘變構建pMT2 CXM。這除去SV40復制起點附近與Hind III位點相關的第1075-1145位堿基以及pMT2的增強子序列。另外，其插入含有限制性內切核酸酶XhoI識別位點的序列。pMT2CXM的衍生物，稱作pMT23，含有限制性內切核酸酶PstI、EcoRI、SalI和XhoI的識別位點。可通過常規方法制備質粒pMT2 CXM和pMT23 DNA。
源自pMT21的pEMC2β1可能本發明的實踐中也是合適的。pMT21來源于從pMT2-VWF衍生的pMT2。如上所述，EcoRI消化切除了pMT-VWF中存在的cDNA插入片段，從而產生可被連接并用于轉化大腸桿菌HR101或DH-5以獲得氨芐青霉素抗性的線性形式pMT2。可通過常規方法制備質粒pMT2 DNA。
通過下列2次修飾從pMT2衍生pMT21。首先，從用于cDNA克隆的G/C加尾中缺失包括一段19個G殘基的76bp的DHFR cDNA的5′非翻譯區。在此過程中，立即在DHFR的上游插入PstI、EcoRI和Xho I位點。
其次，通過用EcoR V和Xba I的消化，用DNA聚合酶I的Klenow片段的處理，及連接于Cla I接頭(CATCGATG)，來引入唯一的Cla I位點。這從腺病毒相關的RNA(VAI)區中缺失了250bp片段，但不干擾VAI RNA基因的表達或功能。用EcoR I和Xho I消化pMT21，并用于衍生載體pEMC2B1。
通過用EcoR I和Pst I的消化，從pMT2-ECAT1中獲得EMCV前導區部分，從而得到2752bp片段。將該片段用Taq I消化，從而產生508bp EcoR I-Taq I片段，其通過在低熔點瓊脂糖凝膠上的電泳進行純化。合成具有5′Taq I突出端和3′Xho I突出端的68bp連接物及其互補鏈。
連接物序列與核苷酸763-827的EMC病毒前導序列匹配。其也將EMC病毒前導區內位置10上的ATG變為ATT并且隨后是Xho I位點。pMT21 EcoR I-Xho I片段、EMC病毒EcoR I-Taq I片段以及68bp寡核苷酸連接物Taq I-Xho I連接物的三種方式連接，導致產生載體pEMC2β1。
該載體含有SV40復制起點和增強子、腺病毒主要晚期啟動子、大多數腺病毒三聯前導序列的cDNA拷貝、小雜交體間插序列、SV40聚腺苷酸化信號和腺病毒VA I基因、DHFR和β-內酰胺酶標記和EMC序列，其處于適當的關系以指導期望的cDNA在哺乳動物細胞中的高水平表達。
載體的構建可能涉及軟骨聚集蛋白聚糖酶相關DNA序列的修飾。例如，可通過除去編碼區5′和3′端上的非編碼核苷酸，來修飾編碼軟骨聚集蛋白聚糖酶的cDNA。可用或可不用已知有利于表達的其它序列替換缺失的非編碼核苷酸。將這些載體轉化到適當的宿主細胞中用于表達本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶。
在一個實例中，除去或用細菌序列替換軟骨聚集蛋白聚糖酶編碼序列側翼的哺乳動物調節序列以產生用于軟骨聚集蛋白聚糖酶分子的細胞內或細胞外表達的細菌載體。可進一步操縱編碼序列(例如，連接于其它已知接頭或者通過缺失其非編碼序列或通過其它已知技術改變其核苷酸進行修飾)。然后可使用本領域技術人員所了解的方法將軟骨聚集蛋白聚糖酶編碼序列插入到已知細菌載體中。可將細菌載體轉化到細菌宿主細胞中以表達本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶。對于在細菌細胞中產生軟骨聚集蛋白聚糖酶蛋白的胞外表達的策略，見，例如，歐洲專利申請177,343。
可進行類似操作用于構建在昆蟲細胞中表達的昆蟲載體(見，例如，在公開的歐洲專利申請155,476中所描述的方法)。也可使用酵母調節序列構建酵母載體，以用于本發明的蛋白在酵母細胞的胞內或胞外的表達(見，例如，在公開的PCT申請WO 86/00639和歐洲專利申請123,289中所描述的方法)。
在哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲宿主細胞系統中生產高水平軟骨聚集蛋白聚糖酶蛋白的方法可包括構建含有多拷貝異源軟骨聚集蛋白聚糖酶基因的細胞。可將異源基因連接于可擴增的標記，例如，二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，用其可選擇在遞增濃度的氨甲蝶呤(MTX)中繁殖的含有增加的基因拷貝的細胞。可使用該方法用于許多不同的細胞類型。
例如，通過包括磷酸鈣介導的轉染、電穿孔或原生質體融合的各種方法，可將含有與能使其表達的其它質粒序列可操作地連接的軟骨聚集蛋白聚糖酶的DNA序列的質粒和DHFR表達質粒(如，pAdA26SV(A)3)共同引入到DHFR-缺陷的CHO細胞(DUKX-BII)中。選擇在具有經透析的胎牛血清的α培養基中生長的表達DHFR的轉化體，并隨后通過在遞增濃度的MTX(例如，在0.02、0.2、1.0和5μM MTX的連續步驟)中的生長選擇用于擴增的表達DHFR的轉化體。克隆轉化體，并且通過上述測定中的至少一種監控有生物活性的軟骨聚集蛋白聚糖酶的表達。軟骨聚集蛋白聚糖酶蛋白的表達應隨MTX抗性的水平增加而增加。使用本領域已知的標準技術表征軟骨聚集蛋白聚糖酶多肽，如用35S甲硫氨酸或半胱氨酸的脈沖標記和聚丙烯酰胺凝膠電泳。可進行類似方法以生產其它軟骨聚集蛋白聚糖酶。
實施例6.表達載體的轉染
作為一個實例，將本發明的軟骨聚集蛋白聚糖酶核苷酸序列克隆到表達載體pED6中。通過脂質轉染(LF2000，Invitrogen)用軟骨聚集蛋白聚糖酶序列瞬時轉染COS和CHO DUKX B11細胞(Urlaub和Chasin，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA，774218-4220(1980))(在單獨的PED6質粒上PACE的+/-共轉染)。對每個目的分子進行一式兩份轉染(a)一個轉染組用于收獲條件培養基進行活性測定，以及(b)另一個轉染組用于35-S-甲硫氨酸/半胱氨酸代謝標記。
在第1天，將將要被收獲用于活性測定的(a)組孔上的培養基改變成加1％熱滅活的胎牛血清+/-100μg/ml肝素的DME(COS)或α(CHO)培養基。48小時后，收獲條件培養基用于活性測定。
在第3天，將(b)組的復制孔改變成加1％熱滅活的胎牛血清、100μg/ml肝素和100μCi/ml 35S-甲硫氨酸/半胱氨酸(Redivue Pro mix，Amersham)的MEM(無甲硫氨酸/無半胱氨酸)培養基。在37℃溫育6小時后，收獲條件培養基并在還原條件下在SDS-PAGE凝膠上進行電泳。蛋白可通過放射自顯影術顯現。
本發明的前面描述提供了例證和說明，但不打算是詳盡的或者將本發明限于準確公開的一個。修飾和變形可能與上述教導一致或者可從本發明的實踐中獲得。因此，應當注意到本發明的范圍是由權利要求和它們的同等方案確定的。
序列表<110>wyeth<120>截短的ADAMTS分子<130>01997.030500.
<140>TBA<141>2005-04-18<150>60/562,685<151>2004-04-15<160>44<170>patentIn version 3.3<210>1<211>1686<212>PRT<213>智人(homo sapiens<400>1Met Pro Gly Gly Pro Ser Pro Arg Ser Pro Ala Pro Leu Leu Arg Pro1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Cys Ala Leu Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala20 25 30Pro Gly Arg Ala Thr Glu Gly Arg Ala Ala Leu Asp Ile Val His Pro35 40 45Val Arg Val Asp Ala Gly Gly Ser Phe Leu Ser Tyr Glu Leu Trp Pro50 55 60Arg Ala Leu Arg Lys Arg Asp Val Ser Val Arg Arg Asp Ala Pro Ala65 70 75 80Phe Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Gly Arg Glu Leu Arg Phe Asn Leu Thr85 90 95Ala Asn Gln His Leu Leu Ala Pro Gly Phe Val Ser Glu Thr Arg Arg100 105 110Arg Gly Gly Leu Gly Arg Ala His Ile Arg Ala His Thr Pro Ala Cys115 120 125His Leu Leu Gly Glu Val Gln Asp Pro Glu Leu Glu Gly Gly Leu Ala130 135 140Ala Ile Ser Ala Cys Asp Gly Leu Lys Gly Val Phe Gln Leu Ser Asn145 150 155 160
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權利要求
1.一種可通過從全長ADAMTS蛋白中缺失多個氨基酸殘基獲得的分離的或重組的軟骨聚集蛋白聚糖酶，其中所述全長ADAMTS蛋白包括富含半胱氨酸的結構域，且所述多個缺失的氨基酸殘基包括富含半胱氨酸結構域的重要部分，且其中所述全長ADAMTS蛋白不是全長ADAMTS-4蛋白。
2.根據權利要求1的軟骨聚集蛋白聚糖酶，其中所述全長ADAMTS蛋白包括位于富半胱氨酸結構域N-末端的血小板反應蛋白I型重復，以及位于血小板反應蛋白I型重復C-末端的保守的苯丙氨酸殘基，且其中所述多個缺失的氨基酸殘基包括位于保守的苯丙氨酸殘基C-末端的所有氨基酸殘基的重要部分。
3.根據權利要求2的軟骨聚集蛋白聚糖酶，其中所述保守的苯丙氨酸殘基是位于血小板反應蛋白I型重復C-末端的第一個保守的苯丙氨酸殘基。
4.根據權利要求3的軟骨聚集蛋白聚糖酶，其中所述的多個缺失的氨基酸殘基包括位于保守的苯丙氨酸殘基C-末端的所有氨基酸殘基。
5.根據權利要求1的軟骨聚集蛋白聚糖酶，進一步包括前結構域的重要部分的缺失。
6.根據權利要求1的軟骨聚集蛋白聚糖酶，其中所述全長ADAMTS蛋白選自ADAMTS-7、ADAMTS-9、ADAMTS-10、ADAMTS-16和ADAMTS-18。
7.根據權利要求1的軟骨聚集蛋白聚糖酶，由選自下列的氨基酸序列組成SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ IDNO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ IDNO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19和SEQ ID NO20。
8.根據權利要求9的軟骨聚集蛋白聚糖酶，由所述氨基酸序列的變體組成。
9.一種分離的或重組的蛋白，其包括權利要求1的軟骨聚集蛋白聚糖酶和共價連于所述軟骨聚集蛋白聚糖酶的多肽。
10.編碼權利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9中任何一項的軟骨聚集蛋白聚糖酶的多核苷酸。
11.一種試劑盒或測定系統，其包括權利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9中任何一項的軟骨聚集蛋白聚糖酶或者編碼所述酶的多核苷酸。
12.一種鑒定能調節軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的化合物的方法，其包括下列步驟(a)使含有權利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9中任何一項的截短的軟骨聚集蛋白聚糖酶的樣品與多個測試化合物之一接觸；(b)將接觸的樣品的活性與相應的未接觸測試化合物的蛋白樣品的活性進行比較，其中活性基本上降低將化合物鑒定為軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的調節劑。
13.根據權利要求12的方法，其中所述化合物抑制所述軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。
14.根據權利要求12的方法，其中所述化合物提高所述軟骨聚集蛋白聚糖酶活性。
15.對權利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9中的任何一項的軟骨聚集蛋白聚糖酶特異的抗體。
16.一種分離的或重組的軟骨聚集蛋白聚糖酶，其基本上由全長ADAMTS蛋白的催化結構域、解整連蛋白結構域以及中央血小板反應蛋白I型重復組成，其中所述全長ADAMTS蛋白不是ADAMTS-4蛋白。
17.包括權利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9中任何一項的純化的截短的軟骨聚集蛋白聚糖酶的組合物。
18.用權利要求10的核酸分子轉化或轉染的宿主細胞。
19.一種生產純化的截短的軟骨聚集蛋白聚糖酶的方法，其包括下列步驟(a)在使所述蛋白表達的條件下培養權利要求18的宿主細胞；和(b)從細胞或培養基中回收并純化所述蛋白。
20.一種在受試者中治療炎性狀況的方法，其包括施用通過權利要求12的方法所鑒定的化合物。
全文摘要
本發明提供截短的有生物活性的ADAMTS多肽，特別是具有hyalectenase活性的那些，且更特別地是具有軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的那些，其顯示比它們的全長對應物更高的穩定性和同質性以及更高的表達產量。本發明也提供編碼這種截短的有生物活性的ADAMTS多肽的核酸分子以及生產截短的有生物活性的ADAMTS多肽的方法。另外，本發明提供鑒定能調節有生物活性的ADAMTS多肽的化合物，特別是抑制軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的那些化合物的方法。
文檔編號C12P21/06GK1981049SQ200580019850
公開日2007年6月13日 申請日期2005年4月18日 優先權日2004年4月16日
發明者E·拉瓦利, L·A·科林斯－拉西, C·J·科爾科蘭, N·C·特溫, M·J·阿戈斯蒂諾 申請人:惠氏公司