專利名稱：通過抑制具有毛囊形成抑制能力的基因或通過活化具有毛囊形成誘導能力的基因而再生 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及策劃抑制具有毛囊形成抑制能力的基因的表達而再生和形成毛囊的方法，并涉及特征在于使所述基因的表達受到抑制的毛乳頭細胞的培養方法。進一步地，本發明涉及策劃增強具有毛囊形成誘導能力的基因的表達而再生和形成毛囊的方法，并涉及特征在于使所述基因的表達受到增強的毛乳頭細胞的培養方法。
背景技術：
為了補救隨著年齡增長等的頭發減少，高度需要的通常不僅是使用育毛料，而且也在進行植毛等在醫療機構等中實施手術。一方面，隨著近年干細胞研究的進展帶來的技術上的突破，以及以組織適合性等問題為原因的深刻的供體不足和腦死亡判定問題等來自倫理方面的要求，可以說高度期待代替現有器官移植的作為先端醫療的再生醫療技術，對作為再生醫療的模型器官的毛囊再生研究也受到了前所未有的關注。
對發育階段的毛囊形成機制進行了比較好的研究，了解到通過上皮系細胞(表皮細胞)和緊鄰其下的間葉系細胞(毛乳頭細胞或DPC)之間的信號轉導等復雜相互作用的結果，形成了毛囊(R.Pause等人，N.Engl.J.Med.341，491-497，1999；K.S.Stenn等人，Physiol.Rev.81，449-494，2001；S.E.Miller等人，J.Invest.Dermatol.118，216-225，2002)。此外，雖然明白了一旦所形成的毛囊為進行重復的生長期、退化期、靜止期的周期性再生的器官，許多生長因子、細胞因子、激素、神經肽等生理活性物質參與其調節，但這些生理活性物質作為參與發育階段的毛囊形成機制的物質不一定一致。
通過使用裸小鼠的小鼠毛囊重建實驗，了解到上皮系細胞和間葉系細胞這兩者為毛囊再生所必需，并且如果沒有一定量或以上的細胞數，則不能誘導毛囊再生(J.Kishimoto等人，Proc.Natl.Acad.Sci.96，7336-7341，1999)。進一步地，雖然已公開了可再生包含小鼠DPC和人上皮細胞的嵌合毛囊(特愿2004-048322；江浜等人，第26屆日本分子生物學年會演講要旨集2PC-024，2003)，但還沒有再生完全的人毛囊。其原因之一是得到充分量的可用來移植的具有毛囊誘導能力的人DPC是困難的。
已公開了在特定條件下，如表達多功能蛋白聚糖的DP等細胞能特異性地誘導毛囊(J.Kishimoto等人，Proc.Natl.Acad.Sci.96，7336-7341，1999)，但在分子水平上對誘導毛囊形成的現象尚有諸多不明白的地方。
發明公開本發明旨在確定通過控制調節毛囊形成或毛囊再生的分子的作用，從而促進人毛囊再生的方法，為了探索能活化人DPC的因子，將鑒定已知具有毛囊誘導能力的小鼠DPC中調節毛囊誘導的因子為目的。
本發明者們發現在培養毛乳頭細胞時，其毛囊誘導能力消失，而當在一定或以上的高密度培養時，其傾向于保留其誘導能力；在高密度(具體地為3～7×105個/cm2)和低密度(具體地為5～9×104個/cm2)條件下培養毛乳頭細胞，研究表達的基因時，發現由于在低密度條件下培養而不能形成毛囊的毛乳頭細胞中，以下的特定基因的表達被特異性增強，又由于在高密度條件下培養而形成毛囊的毛乳頭細胞中，以下的特定基因的表達被特異性增強。
(1)由于在低密度條件下培養而不能形成毛囊的毛乳頭細胞中，表達被特異性增強的基因·S100鈣結合蛋白A6基因(S100a6)·結締組織生長因子基因(Ctgf).谷胱甘肽S轉移酶ω1基因(Gsto1)
·生長停滯特異性基因6(Gas6)·克魯佩爾樣因子2(Klf2)·血小板結合蛋白1基因(Thbs1)·凝血調節蛋白基因(Thbd)因此，得出這類特定基因與抑制毛囊的形成和再生密切相關，為具有毛囊形成抑制能力的基因的結論，從而完成了本發明。
因此，在本發明的第一方面，提供了通過使選自S100a6、Ctgf、Gsto1、Gas6、Klf2、Thbs1和Thbd的具有毛囊形成抑制能力的一個或多個基因的表達受到抑制而再生毛囊的方法。
在該第一方面的其他實施方案中，本發明提供了培養毛乳頭細胞的方法，其特征在于使選自S100a6、Ctgf、Gsto1、Gas6、Klf2、Thbs1和Thbd的具有毛囊形成抑制能力的一個或多個基因的表達受到抑制。由此培養的毛乳頭細胞可有利地用于通過向頭皮進行細胞移植的毛發再生手術或植毛。
(2)由于在高密度條件下培養而形成毛囊的毛乳頭細胞中，表達被特異性增強的基因·轉化生長因子β誘導型68kDa基因(Tgfbi)·生長停滯特異性基因1(Gas1)·血小板結合蛋白2基因(Thbs2)·干擾素活化的基因202A(Ifi202A)·骨形態發生蛋白7基因(Bmp7)·肝配蛋白A1基因(Efna1)·肝配蛋白A3基因(Efna3)·誘導細胞死亡的DNA片斷化因子，α亞基樣效應子A基因(Cidea)·絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制物，分化體G(C1抑制物)，成員1基因(Serping1)·半胱氨酸蛋白酶抑制物1基因(MS1)·干擾素調節因子6基因(Irf6)
·纖調蛋白聚糖基因(Fmod)·含有FXYD結構域的離子轉運調節物4基因(Fxyd4)因此，得出這類特定基因與誘導毛囊的形成和再生密切相關，為具有毛囊形成誘導能力的基因的結論，從而完成了本發明。
因此，在本發明的第二方面，提供了通過使選自Tgfbi、Gas1、Thbs2、Ifi202A、Bmp7、Efna1、Efna3、Cidea、Serping1、MS1、Irf6、Fmod和Fxyd4的具有毛囊形成誘導能力的一個或多個基因的表達受到增強而再生毛囊的方法。
在該第二方面的其他實施方案中，本發明提供了培養毛乳頭細胞的方法，其特征在于使選自Tgfbi、Gas1、Thbs2、Ifi202A、Bmp7、Efna1、Efna3、Cidea、Serping1、MS1、Irf6、Fmod和Fxyd4的具有毛囊形成誘導能力的一個或多個基因的表達受到增強。由此培養的毛乳頭細胞可有利地用于通過向頭皮進行細胞移植的毛發再生手術或植毛。
另外，在本發明的第三方面，提供了通過使選自S100鈣結合蛋白A6基因(S100a6)、結締組織生長因子基因(Ctgf)、谷胱甘肽S轉移酶ω1基因(Gsto1)、生長停滯特異性基因6(Gas6)、克魯佩爾樣因子2(Klf2)、血小板結合蛋白1基因(Thbs1)和凝血調節蛋白基因(Thbd)的具有毛囊形成抑制能力的一個或多個基因的表達受到抑制并通過使選自轉化生長因子β誘導型68kDa基因(Tgfbi)、生長停滯特異性基因1(Gas1)、血小板結合蛋白2基因(Thbs2)、干擾素活化的基因202A(Ifi202A)、骨形態發生蛋白7基因(Bmp7)、肝配蛋白A1基因(Efna1)、肝配蛋白A3基因(Efna3)、誘導細胞死亡的DNA片斷化因子，α亞基樣效應子A基因(Cidea)、絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制物，分化體G(C1抑制物)，成員1基因(Serping1)、半胱氨酸蛋白酶抑制物1基因(MS1)、干擾素調節因子6基因(Irf6)、纖調蛋白聚糖基因(Fmod)和含有FXYD結構域的離子轉運調節物4基因(Fxyd4)的具有毛囊形成誘導能力的一個或多個基因的表達受到增強而再生毛囊的方法。
在該第三方面的其他實施方案中，本發明提供了培養毛乳頭細胞的方法，其特征在于使選自S100a6、Ctgf、Gsto1、Gas6、Klf2、Thbs1和Thbd的具有毛囊形成抑制能力的一個或多個基因的表達受到抑制并使選自Tgfbi、Gas1、Thbs2、Ifi202A、Bmp7、Efna1、Efna3、Cidea、Serping1、MS1、Irf6、Fmod和Fxyd4的具有毛囊形成誘導能力的一個或多個基因的表達受到增強。由此培養的毛乳頭細胞可有利地用于通過向頭皮進行細胞移植的毛發再生手術或植毛。
附圖簡述
圖1顯示移植了高密度(a)和低密度(b)培養的毛乳頭細胞的小鼠毛囊形成的比較。
圖2顯示Ctgf皮內注射對小鼠發毛的影響。(a)第+8天；(b)第+7天。
實施發明的最佳方案本發明者發現下述基因在毛囊形成和再生誘導能力消失的毛乳頭細胞中特異性表達，正如由后述實施例的結果可明確的那樣。
·S100a6(S100鈣結合蛋白A6，別名“鈣細胞周期蛋白”)S100a6是一種作為鈣結合蛋白的S100蛋白或鈣應答蛋白、鈣感應蛋白，在核膜上表達，認為其調節細胞周期且有助于細胞增殖(A.Tomas等人，J.Biol.Chem.，278，20210-20216，2003；E.C.Breen等人，J CellBiochem.，88，848-854，2003)。
·Ctgf(結締組織生長因子)據報導Ctgf作為液體生長因子分泌至細胞外基質中，具有促進細胞接合的作用，是由TGFβ引起的纖維化誘導的靶基因(A.Leask等人，J.Biol.Chem.，278，13008-13015，2003)·Gsto1(谷胱甘肽S轉移酶ω1)已暗示了Gsto1具有谷胱甘肽依賴性硫醇轉移酶活性、二氫抗壞血酸還原酶活性，是應激防御基因(R.Kodym等人，J.Biol.Chem.，274，5131-5137，1999)。
·Gas6(生長停滯特異性6)Gas6為間葉系細胞的細胞生長因子，也報導了其具有β連環蛋白穩定作用(S.Goruppi等人，Mol.Cell Biol.，21，902-915，2001；K.Nagai等人，J.Biol.Chem.，278，18229-18234，2003)。
·Klf2(克魯佩爾樣因子2)Klf2屬于Sp1家族的轉錄因子，據報導對脂肪細胞等具有分化抑制功能(S.S.Banerjee等人，J.Biol.Chem.，278，2581-2584，2003；J.Kaczynski等人，Genome Biology，4，206.1-206.8，2003)。
·Thbs1(血小板結合蛋白1)Thbs1為接合性的糖蛋白，調節細胞間和細胞-細胞外基質間的相互作用，特別是已知其為內源性抗血管新生物質。另外，據報導在毛周期中，Thbs1在退化期被特異地誘導(K.Yano，J.Invest Dermatol.，120，14-9，2003)。
·Thbd(凝血調節蛋白)Thbd與凝血酶形成1∶1的復合體，顯示通過C蛋白活化的抗凝固作用和通過羧肽酶原B活化的抗纖維化作用。另據報導通過抑制炎性細胞與血管內皮細胞的接合而具有抗炎效果(E.M.Conway等人，J.Exp.Med.，196565-577，2002)。
因此，嘗試通過抑制上述基因的表達，從而誘導毛囊形成和再生并對頭部等育毛成為可能。可通過向頭部等施用具有抑制所述基因表達的作用的藥物達到抑制所述基因的表達。因此，預期包含以這樣的藥物作為活性成分的組合物，特別是皮膚外用藥，對以人為代表的哺乳動物具有良好的育毛和發毛促進作用，作為頭發護理用醫藥品、準醫藥品或化妝品是有用的。
通過多種基因工程學技術，如RNA干涉法、反義RNA和反義DNA法、肽和RNA或DNA適體、位點特異性缺失、同源重組、顯性失活對立基因、胞內抗體等多種技術可實現對毛乳頭細胞中上述基因表達的抑制。
另一方面，本發明者進一步發現下述基因在具有毛囊形成和再生誘導能力的毛乳頭細胞中特異性表達，正如由后述實施例的結果可明確的那樣。
·Tgfbi(轉化生長因子β誘導的，681Da)也以別名βig-h3(TGF-β-induced gene-human，clone 3；轉化生長因子β誘導的基因-人類，克隆3)、big-h3稱呼Tgfbi，是分泌蛋白，暗示了其通過整合蛋白與微原纖維和細胞表面的膠原蛋白等細胞外基質(ECM)結合，調節細胞間的接合等的同時，也參與細胞間的信號轉導(JMFerguson等人，Mech Dev.120，851-64，2003)。雖然已報導其在包含皮膚和血管等的結締組織中廣泛表達(RG LeBaron等人，J.Invest Dermatol.，104，844-849，1995以外)，但本發明首次顯示其在毛囊細胞中表達。
·Gas1(生長停滯特異性1)作為在饑餓狀態或接觸抑制的3T3細胞中表達提高的一系列基因(gas)之一的gas1，其為在細胞膜上表達的GPI(糖基磷脂酰肌醇)固著性膜糖蛋白，抑制細胞周期的進行(G.Del Sal等人，Cell，70，595-607，1992)。另外，也報導了其對參與四肢形態形成等的FGF10的表達調節功能(Y.Liu等人，Development 129，5289-5300，2002)以及通過與ECM的相互作用參與軟骨形成(K.K.Lee等人，Dev.Biol.，234，188-203，2001)。
·Thbs2(血小板結合蛋白2)已知Thbs2為結合纖維蛋白原、纖連蛋白、層粘連蛋白、V型膠原蛋白等的糖蛋白，參與細胞間或細胞-基質間的相互作用，也已知其具有細胞增殖調節功能(N Lopes等人，Mol.Cell.Biol.，23，5401-5408，2003)。
·Ifi202A(干擾素活化的基因202A，干擾素誘導性p202a)已知Ifi202A為由干擾素誘導的一系列p200相關蛋白質中的一種，在細胞質內表達并移向核內，抑制MyoD等轉錄因子并誘導分化(H.Xin等人，Oncogene，22，4775-4785，2003；C.Liu等人，Mol.Cell.Biol.，20，7024-7036，2000)。
·Bmp7(骨形態發生蛋白7)通常已知Bmp7屬于調節骨形成外的形態形成的TGF-β家族的分泌蛋白，雖然已確認其在毛囊發育階段表達，但并未公開其與毛囊誘導能力的直接關系。通過BMP受體及其多種內源性拮伉劑調節細胞增殖和細胞分化(V.A.Botchkarev，J.Invest.Dermatol.，120，36-47，2003)。
·Efna1(肝配蛋白A1)Efna1為受體酪氨酸激酶EphA(特別是EphA2)的配體，為在細胞膜上表達的GPI固著性蛋白，調節細胞接合和細胞形態(C.Deroanne等人，J.Cell Sci.，116，1367-1376；N.Carter等人，Nat.Cell Biol.，4，565-73，2002)。
·Efna3(肝配蛋白A3)Efna3為屬于肝配蛋白類的GPI固著性蛋白，是受體酪氨酸激酶EphA2、EphA4的配體。據報導參與脊柱形態形成(KK Murai等人，Nat.Neurosci.，6，153-60，2003)。
·Cidea(誘導細胞死亡的DNA片斷化因子，α亞基樣效應子A)Cidea在作為已分化的脂肪細胞即棕脂肪組織(BAT)的線粒體膜上等表達，調節脂質代謝和能量平衡(Z.Zhou等人，Nat.Genet.，35，49-56，2003)。顯示在基因工程化的高表達Cidea的小鼠中，誘導天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶非依賴性的細胞死亡(N.Inohara等人，EMBO J.，17，2526-2533，1998)。
·Serping1(絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制物，分化體G(C1抑制物)，成員1)Serping1為絲氨酸蛋白酶抑制物超家族的Serping中的一種，為分泌性蛋白質。與C1r和C1s蛋白酶形成復合體，抑制所述的蛋白酶活性。另外，認為其在活化補體、凝血、纖維蛋白溶解、激肽誘導中也發揮重要作用(M.Lener等人，Eur.J.Biochem.，254，117-122，1998)。
·MS1(半胱氨酸蛋白酶抑制物)別名為StefinA1，是半胱氨酸蛋白酶抑制物A亞型中的一種，具有半胱氨酸蛋白酶抑制功能(特別是組織蛋白酶B、H、L)，在表皮和淋巴組織中穩定表達(F.W.Inohara等人，Genomics，15，507-514，1993；T.A.Korolenko等人，Bull.Exp.Biol.Med.，136，46-48，2003)。
·Irf6(干擾素調節因子6)Irf6為DNA結合區很保守的核內轉錄因子家族中的一員，對其詳細功能尚不明確。在上顎中表達最高，也在皮膚和毛囊中表達。顯示表現出上顎畸形和皮膚等異常的范德沃德綜合征、腘翼狀胬肉癥是Irf6基因的DNA結合部位或蛋白質結合部位的SMIR結構域(Smad-干擾素調節因子結合結構域)變異引起的，暗示了Smad-TGF-β信號轉導的調節功能。
·Fmod(纖調蛋白聚糖)為非膠原蛋白性分泌蛋白，是ECM構成物質。已知其作用于I和II型膠原蛋白，調節適當的纖維化定向，以及通過TGF-β抑制纖維化作用(S.Chakravarti，Glycoconj.J.，19，287-293，2003；C.Soo等人，Am.J.Pathol.，157，423-433，2000)。
·Fxyd4(含有FXYD結構域的離子轉運調節物4)Fxyd4在腎臟上皮細胞的細胞膜上特異性表達，在調節Na+、K+離子轉運，維持電解質穩定方面發揮作用(R.Aizman等人，Am.J.Pathol.，283，F569-77，2002)。
因此，嘗試通過增強上述基因的表達，從而誘導毛囊形成和再生，并對頭部等育毛成為可能。可通過向頭部等施用具有增強所述基因表達的作用的藥物達到增強所述基因的表達。因此，預期包含以這樣的藥物作為活性成分的組合物，特別是皮膚外用藥，對以人為代表的哺乳動物具有良好的育毛和發毛促進作用，作為頭發護理用醫藥品、準醫藥品或化妝品是有用的。
通過多種基因工程學技術均可實現對毛乳頭細胞中上述基因表達的增強。例如，上述基因在毛乳頭細胞中缺失、存在缺陷時，可以策劃通過將上述基因本身導入毛乳頭細胞中，增強其表達。另外，在毛乳頭細胞中雖然存在上述基因，但由于處于非活性狀態或沉默狀態而致上述基因處于缺陷狀態時，可以設計通過使上述基因的表達增強的調節序列如啟動子和增強子置于對這些基因可作用的位置。
作為將上述基因以及啟動子、增強子導入細胞內的方法，可使用利用病毒載體的基因導入方法、或非病毒性的基因導入方法(日経サイエンス，1994年4月號，20-45頁；實驗醫學增刊，12(15)(1994)；實驗醫學別冊“基因治療的基礎技術”，羊土社(1996))中的任一方法。作為通過病毒載體的基因導入方法，可例舉將上述基因整合入DNA病毒或RNA病毒而導入的方法，其中所述DNA病毒或RNA病毒為例如逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰質炎病毒、辛德比斯病毒等。其中特別優選使用逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、痘苗病毒的方法。作為非病毒性基因導入方法，可例舉直接施與表達質粒的方法(DNA疫苗法)、脂質體法、脂轉染法、顯微注射法、磷酸鈣法、電穿孔法等，特別優選DNA疫苗法、脂質體法。另外，為了使上述基因實際上作為藥物發揮作用，有將DNA直接導入毛乳頭細胞的直接體內(invivo)法和從人體取出毛乳頭細胞，在體外將DNA導入所述細胞，再將所述細胞返回體內的間接體內(ex vivo)法(日経サイエンス，1994年4月號，20-45頁；月刊藥事，36(1)，23-48(1994)；實驗醫學增刊，12(15)(1994))。更優選直接體內法。通過直接體內法施與時，施用部位可以是例如直接施與期望促進毛發的部位。施與可以是例如皮下、皮內施與等。通過直接體內法施與時，一般使用注射劑等，根據需要也可加入常用的載體。此外，在采用脂質體或膜融合脂質體(仙臺病毒(HVJ)-脂質體等)的方案時，可使用懸浮劑、冷凍劑、離心分離濃縮冷凍劑等的脂質體制劑。
可通過例如自細胞提取mRNA并測定其量來確定細胞中具有毛囊形成抑制能力的基因或具有毛囊形成誘導能力的基因的表達。mRNA的提取、測定方法為本領域眾所周知，例如RNA的定量使用定量聚合酶鏈反應法(PCR)進行。另外，可通過直接測定毛乳頭細胞中上述基因的表達產物的量而確定上述基因的表達。例如，所述測定可使用對上述基因的表達產物特異的抗體，通過本領域公知的方法如利用熒光物質、色素、酶等的免疫染色法、Western印跡法、免疫測定法如ELISA法、RIA法等多種方法實施。此外，除以上所述方法之外，還可通過測定上述基因表達產物的已知生物活性而測定上述基因的表達量。另外，可通過原位(in situ)雜交法和測定其生物活性而確定上述基因的表達。
本發明進一步地提供了培養毛乳頭細胞的方法。所述方法的特征在于將毛乳頭細胞在使上述具有毛囊形成抑制能力的基因的表達受到抑制或在使上述具有毛囊形成誘導能力的基因的表達受到增強的條件下培養，由于如此培養的毛乳頭細胞的毛囊再生和形成能力增強，所以可以有利地用于通過細胞移植的毛囊和毛發再生以及植毛。如開頭所述，在現有技術中獲得充分量的能用于移植的具有毛囊誘導能力的人毛乳頭細胞是困難的，但是如果培養根據本發明的毛乳頭細胞，即使從少量的毛乳頭細胞開始，也可制備充分量的用于移植的具有毛囊誘導能力的毛乳頭細胞。抑制具有毛囊形成抑制能力的上述基因的表達可如上所述，例如在抑制上述基因表達的藥物的存在下培養而實施，或者培養通過上述的基因工程轉化而使上述基因的表達受到抑制的毛乳頭細胞。此外，提高具有毛囊形成誘導能力的上述基因的表達可如上所述，例如在提高上述基因表達的藥物的存在下培養而實施，或者培養通過上述的基因工程轉化而使上述基因的表達受到提高的毛乳頭細胞。培養在合適的培養基如DMEM中，優選地在CO2環境下，于常溫～約37℃，優選地于約37℃進行1～7天。
“毛乳頭細胞”是指作為間葉系細胞位于毛囊內毛球部內部的、構成毛乳頭的主要細胞，是為了毛囊自我再生而向毛囊上皮細胞等遞送活化信號的可以說是起到司令塔作用的細胞(特愿2003-346937)。僅含有活性化毛乳頭細胞的毛乳頭細胞制品可例如根據Kishimoto等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)，96卷，7336-7341頁所述，使用轉基因小鼠而制備。但是，從收獲量等點來看，優選地可通過例如自皮膚組織去除表皮組織，用膠原處理所得到的真皮組織部分而制備細胞懸浮物，然后將該細胞懸浮物冷凍保存以殺死毛囊上皮細胞而制備。
上述冷凍保存的方法具體而言可例如如下實施。
1.準備哺乳動物的表皮。
2.將所述表皮根據需要于蛋白質分解酶溶液如胰蛋白酶溶液中靜置合適的時間如一晚，然后將表皮部分使用鑷子等去除，留下的真皮使用膠原酶處理，制備細胞懸浮液。
3.根據需要，使用細胞濾過器過濾懸浮液，通過靜置去除沉淀物。
4.記數細胞數，使用冷凍保護液以合適的細胞密度，優選地以1×105至1×108個/ml進行重懸，根據需要分裝為小份，并按照常規的細胞保存方法進行冷凍保存。
5.經適當的保存期間后，融解并使用。
對冷凍方法沒有特定的限制，在-20℃或以下，優選地在-50℃或以下，更優選地在-80℃或以下的超低溫冷凍庫中或在液氮中保存。對冷凍保存期間也沒有特定的限制，為了殺死上皮細胞，冷凍保存期間可為例如1天或更長，優選地為3天或更長，更優選地為1周或更長的時間期間。而且，經證實即使在液氮中保存4個月，毛乳頭細胞可繼續生存。作為冷凍保護液，可使用在細胞保存中使用的常規保護液，例如セルバンカ-2細胞冷凍保存液(目錄號BLC-2)(日本全藥工業制)。
本發明的毛乳頭細胞可來自所有哺乳動物例如人、黑猩猩、其它靈長類、家畜動物如狗、貓、兔子、馬、綿羊、山羊、牛、豬、實驗用動物如大鼠、小鼠、豚鼠，更優選地為裸小鼠、SCID小鼠、裸大鼠的表皮。
由此獲得的毛乳頭細胞，根據本發明，在抑制具有毛囊形成抑制能力的上述基因表達的條件下，或在提高具有毛囊形成誘導能力的上述基因表達的條件下培養，然后與合適的上皮細胞混合，該培養毛乳頭細胞-上皮細胞混合物可用于植毛。
“上皮系細胞”是指構成皮膚的表皮或上皮的大部分的細胞，其自挨著真皮的1層基底細胞產生。以小鼠為例，作為上皮系細胞可優選使用來自新生仔(或胎兒)的上皮系細胞，但也可使用雖然是來自成熟的皮膚表皮的細胞，但具有角質形成細胞的形態的細胞培養物。這樣的細胞，可通過技術人員公知的方法自目的供體動物的皮膚制備。
在合適的方案中，上皮系細胞可如下制備。
1.準備哺乳動物的表皮。
2.將所述表皮根據需要于0.25％胰蛋白酶/PBS中4℃靜置一晚，由此進行胰蛋白酶處理。
3.通過鑷子等僅剝離表皮部分，細切后，于合適的培養液(如角質形成細胞用培養液)中4℃約1小時懸浮處理。
4.將該懸浮物通過具有合適孔徑的細胞濾過器，然后通過離心分離機回收上皮系細胞。
5.將該細胞制品在KGM或SFM培養基中以目的細胞密度懸浮，直至使用前于冰上靜置。
本發明的上皮系細胞與毛乳頭細胞同樣地可來源于所有哺乳動物例如人、黑猩猩、其它靈長類、家畜動物如狗、貓、兔子、馬、綿羊、山羊、牛、豬、實驗用動物如大鼠、小鼠、豚鼠，更優選地為裸小鼠、SCID小鼠、裸大鼠的表皮。此外，所述表皮部位可為有毛部位如頭皮，也可為無毛部位如周皮。
當欲形成毛囊時，培養毛乳頭細胞與上皮系細胞的細胞數之比為1∶3至10∶1，更優選地為1∶1至10∶1，進一步更優選地為1∶1至3∶1，最優選地為1∶1。
毛乳頭細胞與上皮系細胞的組合可為同種系和異種系。例如毛乳頭細胞制品為來自小鼠時，上皮系細胞可為小鼠來源(同種系)或者為其它種如大鼠、人來源(異種系)。因此，植毛用組合物可為例如培養毛乳頭細胞與上皮系細胞均來自小鼠的組合、均來自大鼠的組合、或均來自人的組合(上述的同種)；此外，培養毛乳頭細胞來自小鼠且上皮系細胞來自大鼠的組合、培養毛乳頭細胞來自大鼠且上皮系細胞來自小鼠的組合、培養毛乳頭細胞來自小鼠且上皮系細胞來自人的組合、培養毛乳頭細胞來自大鼠且上皮系細胞來自人的組合、培養毛乳頭細胞來自人且上皮系細胞來自小鼠的組合、培養毛乳頭細胞來自人且上皮系細胞來自大鼠的組合(上述的異種)等也可以。
下面例舉實施例進一步詳細說明本發明。
實施例制備毛乳頭細胞將新生ICR品系小鼠用乙醇和磷酸緩沖生理鹽水(下文中稱為PBS)洗凈后，切下背部皮膚，取出全層皮膚。于胰蛋白酶溶液上4℃漂浮靜置一晚后，通過鑷子去除表皮部分，將得到的真皮使用膠原酶處理，制備細胞懸浮液。使用細胞濾過器過濾上述懸浮液，然后通過靜置去除沉淀物，獲得DP部分。使用凍結保護液以1×105～1×108/ml的細胞密度進行重懸，分裝于冷凍管中，并按照常規的細胞保存方法于液氮中保存1周或以上。將細胞冷凍管于DMEM(10％FBS)中融解，在高密度(3～7×105個/cm2)或低密度(5～9×104個/cm2)下于37℃、CO2中，于DMEM中培養1～4天。
制備上皮細胞部分新生ICR品系小鼠用乙醇、PBS洗凈后，切下背部皮膚，取出全層皮膚。于胰蛋白酶溶液上4℃漂浮靜置一晚后，通過鑷子剝離表皮部分并細切，于角質形成細胞用培養液(以下表示為SFM)中，4℃攪拌懸浮約1小時。使用細胞濾過器去除固形物后，將通過離心機(×900g，10分鐘)得到的沉淀重懸于SFM培養基中，得到上皮細胞部分。直至使用之前于冰上靜置。
通過向裸小鼠背部皮膚的細胞移植的毛囊再生評價體系通過如上所述的4天培養而制備的DP部分(高密度培養或低密度培養5～10×106個)和上皮部分(2只，約1×107個)輕輕混合并離心，將除去了上清的沉淀物播種至預先外科埋入裸小鼠的硅制小室內的筋膜上。一周后切除硅制小室的上部，兩周后去除硅制小室。細胞移植后，通過3～4周后的外觀觀察和組織觀察判斷毛囊形成。其結果示于圖1。
如圖1明確顯示的那樣，證實使用高密度條件下培養的毛乳頭細胞進行移植時，可觀察到發毛和毛囊形成，但使用低密度條件下培養的毛乳頭細胞進行移植時，不能觀察到發毛，也無毛囊形成。因此明確了為了移植培養毛乳頭細胞并使毛囊形成，必須在一定或以上的高細胞密度條件下培養毛乳頭細胞。
微陣列實驗向通過上述培養1天或4天制備的DP部分(高密度培養或低密度培養5～10×106個)加入1ml ISOGEN(Nippongene)，根據操作手冊提取50～100μg總RNA。接下來，根據RNeasyMini(QIAGEN)的RNA純化方法，純化得到的總RNA，通過Bioanalyzer 2100體系(Agilent)確認不能觀察到分解物的混入。將得到的總RNA 500ng通過Low RNA ImputFluorescent Linear Amplification(Agilent)，按照操作手冊使用Cy5-CTP或Cy3-CTP(均來自Perkin-Elm er)制備分別的熒光色素標記化cRNA(如來自高密度培養DP的RNA用Cy5標記，來自低高密度培養DP的RNA用Cy3標記)。將分別的熒光色素標記cRNA各1μg使用雜交試劑盒Plus(Agilent)，按照操作手冊在小鼠發育Oligo(Agilent G4120A)或小鼠Oligo(Agilent G4121A)微陣列載玻片上于60℃進行17小時競爭性雜交。洗凈干燥后立即通過微陣列掃描儀(Agilent G2565AA)對微陣列進行圖像化。將得到的圖像通過Feature Extraction軟件(Agilent G2566AA)進行各點的熒光強度數值化，用于解析。各基因的表達量如下表所示。
表1
①使用小鼠發育Oligo微陣列②使用小鼠Oligo微陣列*無顯著性差異表2
①使用小鼠發育Oligo微陣列②使用小鼠Oligo微陣列*無顯著性差異表3
①使用小鼠發育Oligo微陣列②使用小鼠Oligo微陣列*無顯著性差異由以上結果可見，將毛乳頭細胞在可形成毛囊的高密度條件下培養時，以及在不能形成毛囊的低密度條件下培養時，特定基因的表達量會產生變化。即，明確了在不能形成毛囊的低密度條件下培養毛乳頭細胞時，與高密度條件下相比較，基因S100a6、Ctgf、Gsto1、Gas6、Klf2、Thbs和Thbd中每一基因的表達量提高，認為這些基因為具有抑制毛囊形成功能的基因。此外，明確了在能形成毛囊的高密度條件下培養毛乳頭細胞時，與低密度條件下相比較，基因Tgfbi、Gas1、Thbs2、Ifi202A、Bmp7、Efna1、Efna3、Cidea、Serping1、MS1、Irf6、Fmod和Fxyd4中每一基因的表達量提高，認為這些基因密切參與毛囊的形成和再生、為具有毛囊形成誘導能力的基因。
定量PCR實驗將制備的用于上述微陣列實驗用的純化總RNA經DNase處理(DNA-free RNA KitTM，ZymoResearch)去除基因組DNA后，使用隨機引物(Pharmacia)，通過SuperScript II(Invitrogen)合成cDNA。以該cDNA為模板，通過LightCycler使用LightCycle-FastStart DNA MasterSYBR Green I Kit(均來自Roche)，按照操作手冊使用CyberGreen，通過實時PCR進行定量(Mg2+終濃度為3mM，其它反應條件如下)。
GAPDH(PCR產物大小201bp)，終濃度0.25μM正向引物5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’(NM00204695-104)(序列號1)反向引物5’-TGGGATTTCCATTGATGACA-3’(NM002046295-276)(序列號2)變性95℃15秒，退火55℃10秒，延伸10秒；進行40個循環Serping1(PCR產物大小439bp，Lener M等人，1998)，終濃度0.5μM正向引物5’-GAATTCTTTGACTTCACTTA-3’(NM_0097761327-1346)(序列號3)反向引物5’-ATTTGTAGAGTTTGATAGGT-3’(NM_0097761765-1746)(序列號4)變性95℃15秒，退火55℃10秒，延伸72℃20秒；進行40個循環Efna1(PCR產物大小133bp，Pickles JO等人，2003)，終濃度0.5μM
正向引物5’-TCTGGGCAGTATTGCTCCTAC-3’(NM_010107672-692)(序列號5)反向引物5’-CTTGTGGGTGTAGTGGGAGAG-3’(NM_010107804-784)(序列號6)變性95℃15秒，退火55℃10秒，延伸72℃10秒；進行40個循環Efna3(PCR產物大小171bp，Pickles JO等人，2003)，終濃度0.5μM正向引物5’-TATTTGTCCGCACTACAACAG-3’(MMU906668-28)(序列號7)反向引物5’-AATTTTTCGGAGAACTTGATG-3’(MMU90666178-158)(序列號8)變性95℃15秒，退火58℃5秒，延伸72℃10秒；進行40個循環Gas1(PCR產物大小205bp)，終濃度0.5μM正向引物5’-GGGGTCTTTCAAGTTCCAAT-3’(NM_0080861868-1887)(序列號9)反向引物5’-TCGGTAAGGGGAACTTTTCT-3’(NM_0080862072-2053)(序列號10)變性95℃15秒，退火55℃10秒，延伸72℃10秒；進行40個循環用GAPDH校正的目的基因量的換算將PCR循環的延伸反應時測定的SYBR Green的熒光光度值對循環數進行單對數繪圖，設定閾值水平，與各樣本的對數直線擴增區域的交點定義為信號的開始循環數(crossing point)，使用采取FitPoint法的定量法。
設定PCR產物量(即熒光光度)為Y，起始模板量為A，PCR效率相關的因子為B(條件是0.5＜B≤1)，循環數為X，則Y＝A×(B×2)X右項取對數時，則表示為Y＝log10[A(B×2)X]＝log10A+log10(B×2)X＝X×log10(B×2)+log10APCR在理論上進行的區域即對數繪圖為直線的區域中，B＝1，即使以不同的樣本為模板進行的PCR，斜率均為一定的，設定熒光值的閾值(噪聲帶(noise band))(設Y＝C)，求與該直線的交點(crossing point)，即可得到開始的循環數。
交點(X)＝(C-log10A)/log102A＝10(C-Xlog102)這反映了初始模板量。因此，如果PCR效率相同，不同樣本的模板量如何可這樣求得以一個樣本的模板量A0為基準，相對值A/A0自分別的開始循環數(X、X0)求得X0-X＝(C-log10A0)/log102-(C-log10A)/log102log102×(X0-X)＝(C-log10A0)-(C-log10A)＝log10A-log10A0log102(X0-X)=log10(A/A0)]]>A/A0=2(X0-X)]]>由此求得的目的基因(Fabp4、Fmod、Serg1、Efna1、Efna3)的起始模板量(A/A0)用各樣本的GAPDH的起始模板量(AG/AG0)標準化后的值((A/A0)/(AG/AG0)=2(X0-X)/2(XG0-XG))]]>在各反應條件(高密度或低密度條件下培養1天或4天)下分別比較，結果如下所示表4定量PCR結果總結(高密度培養/低密度培養的比)
研究具有毛囊形成抑制能力的因子對小鼠發毛的影響將通過以上實驗認為具有抑制毛囊形成能力的Ctgf注入小鼠皮膚，證實了對發毛的抑制。
實驗方法[第-2天]將8周齡C57BL/6小鼠12只(4只一組，共3組)的背部去毛，在背部中央周圍作上標記(入墨)。在標記部位皮內注射入溶解于0.1％BSA-PBS的結締組織生長因子(Ctgf)(Biovendor Laboratory Medicine，Inc.)0(對照)、100或333ng/100μl。
與第-2天同樣，向上述小鼠的標記部位皮內注射入溶解于0.1％BSA-PBS的Ctgf0(對照)、100或333ng/100μl。
向上述小鼠的標記部位實施蠟脫毛，然后與第-1天同樣，皮內注射入溶解于0.1％BSA-PBS的Ctgf0(對照)、100或333ng/100μl。
在上述實施蠟脫毛的部位，與第+1天同樣，皮內注射入溶解于0.1％BSA-PBS的Ctgf0(對照)、100或333ng/100μl。
目視觀察上述蠟脫毛部位的發毛狀態，另外，通過Mexameter(窄譜反射分光光度計(Mexameter160，COURAGE+KHAZAKA electricGmbH，德國科隆))測定背部皮膚的黑度而評價毛囊形成度。
實驗結果通過向實施蠟脫毛處理的小鼠背部直接皮內注射Ctgf，目視和Mexameter觀察到以注射量依賴性地顯著延遲發毛和毛囊形成。第+7天和第+8天的結果如圖2所示。因此，證實Ctgf具有毛囊形成抑制能力。
產業上的可利用性通過本發明，可提供新穎且與現有技術相比有利的育毛方法、植毛方法。
序列表<110>株式會社資生堂<120>通過抑制具有毛囊形成抑制能力的基因或通過活化具有毛囊形成誘導能力的基因而再生毛囊的方法<130>R748<150>JP 2004-175407<151>2004-06-14<150>JP 2004-175444<151>2004-06-14<160>10<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>正向引物<400>1gagtcaacgg atttggtcgt20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>反向引物<400>2tgggatttcc attgatgaca20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>反向引物<400>3gaattctttg acttcactta20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>正向引物<400>4atttgtagag tttgataggt20
<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>正向引物<400>5tctgggcagt attgctccta c 21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>反向引物<400>6cttgtgggtg tagtgggaga g 21<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>正向引物<400>7tatttgtccg cactacaaca g 21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>反向引物<400>8aatttttcgg agaacttgat g 21<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>正向引物<400>9ggggtctttc aagttccaat20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列
<223>反向引物<400>10tcggtaaggg gaacttttct20
權利要求
1.再生毛囊的方法，其是通過使選自S100鈣結合蛋白A6基因(S100a6)、結締組織生長因子基因(Ctgf)、谷胱甘肽S轉移酶ω1基因(Gsto1)、生長停滯特異性基因6(Gas6)、克魯佩爾樣因子2(Klf2)、血小板結合蛋白1基因(Thbs1)和凝血調節蛋白基因(Thbd)的具有毛囊形成抑制能力的一個或多個基因的表達受到抑制而再生毛囊的方法。
2.培養毛乳頭細胞的方法，其特征在于使選自S100a6、Ctgf、Gsto1、Gas6、Klf2、Thbs1和Thbd的具有毛囊形成抑制能力的一個或多個基因的表達受到抑制。
3.再生毛囊的方法，其是通過使選自轉化生長因子β誘導型68kDa基因(Tgfbi)、生長停滯特異性基因1(Gas1)、血小板結合蛋白2基因(Thbs2)、干擾素活化的基因202A(Ifi202A)、骨形態發生蛋白7基因(Bmp7)、肝配蛋白A1基因(Efna1)、肝配蛋白A3基因(Efna3)、誘導細胞死亡的DNA片斷化因子，α亞基樣效應子A基因(Cidea)、絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制物，分化體G(C1抑制物)，成員1基因(Serping1)、半胱氨酸蛋白酶抑制物1基因(MS1)、干擾素調節因子6基因(Irf6)、纖調蛋白聚糖基因(Fmod)和含有FXYD結構域的離子轉運調節物4基因(Fxyd4)的具有毛囊形成誘導能力的一個或多個基因的表達受到增強而再生毛囊的方法。
4.培養毛乳頭細胞的方法，其特征在于使選自Tgfbi、Gas1、Thbs2、Ifi202A、Bmp7、Efna1、Efna3、Cidea、Serping1、MS1、Irf6、Fmod和Fxyd4的具有毛囊形成誘導能力的一個或多個基因的表達受到增強。
5.再生毛囊的方法，其是通過使S100鈣結合蛋白A6基因(S100a6)、結締組織生長因子基因(Ctgf)、谷胱甘肽S轉移酶ω1基因(Gsto1)、生長停滯特異性基因6(Gas6)、克魯佩爾樣因子2(Klf2)、血小板結合蛋白1基因(Thbs1)和凝血調節蛋白基因(Thbd)的具有毛囊形成抑制能力的一個或多個基因的表達受到抑制并通過使選自轉化生長因子β誘導型68kDa基因(Tgfbi)、生長停滯特異性基因1(Gas1)、血小板結合蛋白2基因(Thbs2)、干擾素活化的基因202A(Ifi202A)、骨形態發生蛋白7基因(Bmp7)、肝配蛋白A1基因(Efna1)、肝配蛋白A3基因(Efna3)、誘導細胞死亡的DNA片斷化因子，α亞基樣效應子A基因(Cidea)、絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制物，分化體G(C1抑制物)，成員1基因(Serping1)、半胱氨酸蛋白酶抑制物1基因(MS1)、干擾素調節因子6基因(Irf6)、纖調蛋白聚糖基因(Fmod)和含有FXYD結構域的離子轉運調節物4基因(Fxyd4)的具有毛囊形成誘導能力的一個或多個基因的表達受到增強而再生毛囊的方法。
6.培養毛乳頭細胞的方法，其特征在于使選自S100a6、Ctgf、Gsto1、Gas6、Klf2、Thbs1和Thbd的具有毛囊形成抑制能力的一個或多個基因的表達受到抑制并使選自Tgfbi、Gas1、Thbs2、Ifi202A、Bmp7、Efna1、Efna3、Cidea、Serping1、MS1、Irf6、Fmod和Fxyd4的具有毛囊形成誘導能力的一個或多個基因的表達受到增強。
全文摘要
本發明提供了通過使選自S100a6、Ctgf、Gsto1、Gas6、Klf2、Thbs1和Thbd的具有毛囊形成抑制能力的一個或多個基因的表達受到抑制，或通過使選自Tgfbi、Gas1、Thbs2、Ifi202A、Bmp7、Efna1、Efna3、Cidea、Serping1、MS1、Irf6、Fmod和Fxyd4的具有毛囊形成誘導能力的一個或多個基因的表達受到增強而再生毛囊的方法。
文檔編號C12N5/071GK1968713SQ20058001934
公開日2007年5月23日 申請日期2005年6月10日 優先權日2004年6月14日
發明者江浜律子, 岸本治郎, 出田立郎, 相馬勤 申請人:株式會社資生堂