Dna克隆載體質粒的動態載體裝配方法

專利名稱：Dna克隆載體質粒的動態載體裝配方法
背景技術：
0001總體上說，本發明涉及克隆載體質粒領域，特別地，涉及用克隆載體質粒快速裝配DNA構建物或轉基因的方法。
0002分子生物學的基礎是重組DNA技術，在這里，重組DNA技術可以被概括為為研究核酸及其蛋白產物的結構和功能而進行的核酸修飾與增殖。
0003單個基因、基因調控區、基因亞群和包含它們的完整的染色體都是由腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤和胞嘧啶核苷酸的雙鏈反向平行序列構成的，這些核苷酸通常分別用首字母A、T、G和C表示。這些DNA序列，以及來源于mRNA(信使RNA)分子的雙鏈DNA拷貝——cDNA序列，可以切割成不同的片段、分離并插入載體如細菌質粒中，從而研究基因產物。質粒是最初來源于細菌的染色體外DNA片段，可以對它進行操作并重新導入宿主細菌中，用于研究或制備基因產物。質粒DNA與所有染色體DNA相似，這是因為質粒DNA是由相同的A、T、G和C核苷酸構成的，編碼基因和基因調控區，然而它是相對較小的分子，包含大約30,000以下個堿基對或者30千堿基(kb)以下。此外，雙鏈質粒的核苷酸堿基對形成連續的環狀分子，并將質粒DNA與染色體DNA區別開來。
0004質粒增強了細菌生物間遺傳物質的快速交換，并使其能夠快速適應環境的變化如溫度、食物供應或其它挑戰。任何所獲得的質粒必定表達有助于其宿主存活的一個或一些基因，否則將會被該生物破壞或丟棄，這是因為保留非必需質粒將是對資源的浪費使用。細胞的克隆群落含有相同的遺傳物質，包括它可能含有的任何質粒。在這樣的宿主細胞克隆群落中使用帶有DNA插入片段的克隆載體質粒將擴增可獲得的感興趣DNA的量。然后，可以分離這樣克隆得到的DNA并回收之，用于隨后在構建DNA構建物所需的步驟中進行操作。因此，應當認識到，克隆載體質粒是研究基因功能的有用工具，它提供了快速制備大量感興趣的DNA插入片段的能力。
0005盡管在質粒中發現的一些元件是天然存在的，已經人工改造了其它一些元件以增強質粒作為DNA載體的效用。這些元件包括抗生素-或化學品-抗性基因和多克隆位點(MCS)，和其他元件。這些元件中的每一個在本發明以及現有技術中發揮作用。對每個元件所起作用的描述將凸顯出現有技術的局限性并證明本發明的用途。
0006宿主能夠獲得的特別有用的質粒產生的基因是賦予抗生素抗性的基因。在重組DNA技術的日常實踐中，抗生素抗性基因被開發作為陽性或陰性選擇元件，以優先增強期望質粒的培養和擴增，使其超過其它質粒。
0007為了能被宿主細菌所維持，質粒還必須含有指導宿主復制該質粒的序列片段。被稱為復制起點(ORI)元件的序列指導宿主使用其自身的細胞酶產生該質粒的拷貝。當這樣的細菌分裂時，每個子代細胞將保留一個或多個拷貝的任何這樣的質粒。已經衍生得到某些大腸桿菌(E.coli)菌株以使這種復制最大化，從而每個細菌產生高達300個拷貝。按照這種方式，可以增強期望質粒的培養。
0008在任何克隆載體中的另一個基本元件是用于插入感興趣的遺傳物質的位置。這是已經被人工改造入“野生型”質粒的合成元件，因此賦予了作為克隆載體的效用。任何典型的商業上可獲得的克隆載體質粒含有至少一個這樣的區域，稱為多克隆位點(MCS)。MCS一般包括被一種內切核酸酶或一系列內切核酸酶切割的核苷酸序列，每一種內切核酸酶都有不同的識別序列和切割方式。DNA分子中編碼的限制性內切核酸酶(RE)位點的所謂的識別序列包括雙鏈回文序列。盡管一些RE酶需要8個或者更多個核苷酸的序列，然而對于一些RE酶來說，少至4-6個核苷酸就足以提供識別位點。例如RE酶EcoR1識別雙鏈六聚體核苷酸序列5’G-A-A-T-T-C3’，其中5’表示習慣上稱為“上游”末端的分子末端，同樣地3’表示“下游”末端。識別序列的互補鏈將是其反向平行鏈，3’G-A-A-T-T-C5’。由于每一個內切核酸酶位點都是雙鏈核苷酸序列，所以6核苷酸的識別位點實際上是6個堿基對(bp)。因此雙鏈識別位點可以在其所在的較大雙鏈分子中表示出，如下所示5’......G-A-A-T-T-C......3’3’......C-T-T-A-A-G......5’。
0009如同許多其它RE酶，EcoR1不是在二重對稱軸上準確切割，而是在兩條DNA鏈中相距4個核苷酸的位置上切割，其間的核苷酸用“/ ”表示出5’......G/A-A-T-T-C......3’3’......C-T-T-A-A/G......5’這樣，雙鏈DNA分子被切割并且在新形成的“末端”獲得如下核苷酸構型5’......G3’5’A-A-T-T-C......3’3’......C-T-T-A-A5’3’G......5’。
0010這種交錯的切割方式產生了具有突出的5’末端的DNA片段。因為當相互接近時，A-T和G-C對會自發形成，所以諸如這樣的突出末端被稱為粘性末端或粘末端。這些末端中任何一個可以與用相同限制性酶切割的任何其它互補末端形成氫鍵。由于含有特定識別序列的任何DNA將以與含有相同序列的任何其它DNA相同的方式被切割，那些被切割的末端將是互補的。因此，用相同RE酶切割的任何DNA分子的末端以鄰近片段七巧板“匹配”的方式相互配對，并可以酶促連接在一起。正是這種特性使得能夠形成重組DNA分子，并使外源DNA片段能夠引入細菌質粒或引入任何其它DNA分子中。
0011當構建重組DNA分子時還要考慮的一般原則是分子中出現的所有內切核酸酶位點都將被特定的RE酶切開，而不僅僅是感興趣的位點。DNA分子越大，任何內切核酸酶位點越有可能重復出現。假設任何內切核酸酶位點是沿DNA分子隨機分布的，按平均值計算，四聚體核苷酸位點將每44(即256)個核苷酸或bp出現一次，而六聚體核苷酸位點將每46(即4096)個核苷酸或bp出現一次，八聚體核苷酸位點將每48(即114,688)個核苷酸或bp出現一次。因此，可以容易地認識到較短的識別序列將頻繁出現，而較長的識別序列將很少出現。在計劃構建轉基因或其它重組DNA分子時，這是個至關重要的問題，因為這樣的方案經常需要裝配幾個不同大小的DNA片段。這些片段越大，希望使用的位點越有可能在DNA組分的幾個片段中出現，從而最大限度地給操作制造困難。
0012經常出現的內切核酸酶位點在本文中是指常見位點，切割這些位點的內切核酸酶是指常見內切核酸酶。具有6個bp以上同源限制性位點的限制性酶是指罕見限制性酶，且它們的同源限制性位點是指罕見限制性位點。然而，一些6bp的內切核酸酶位點的出現頻率比統計學預測的要低，這些位點以及切割它們的內切核酸酶也是罕見的。因此，名稱“罕見的”和“常見的”不是指任何特定限制性酶的相對豐度或有效性，而是指任何DNA分子或分離的DNA分子片段、或者任何基因或其DNA序列中構成其同源識別位點的核苷酸序列的出現頻率。
0013近來，已經分離出第二類內切核酸酶，稱為歸巢內切核酸酶(HE)。HE酶具有大的非回文不對稱識別位點(12-40個堿基對)。HE識別位點極其罕見。例如，稱為I-SceI的HE具有18bp的識別位點，(5’...TAGGGATAACAGGGTAAT...3’)，預計在每7×1010bp的隨機序列中僅出現一次。這一出現頻率等同于在20個哺乳動物大小的基因組中僅有一個位點。如果HE識別位點包含在克隆載體質粒的合適位置中，那么HE識別位點的罕見性特征就極大地增加了遺傳工程師可以切割最終轉基因產物的可能性，而不破壞轉基因的完整性。
0014因為來自任何生物來源的DNA分子都將被內切核酸酶以相同的方式切割，所以來自任何物種的外源DNA片段都可以用內切核酸酶切割，插入到用相同內切核酸酶切割的細菌質粒載體中，并在合適的宿主細胞中擴增。例如，如果人類基因可以用稱為EcoR1的RE酶在兩個部位切割，那么就可以分離帶有EcoR1末端的期望片段，并與同樣用EcoR1切割的質粒在通常稱作連接混合物的體系中混合。在適當條件下，于連接混合物中，一些分離的人類基因片段將與質粒分子的末端相匹配。這些新結合的末端可以連接在一起(被連接)從而酶促重新環化該質粒，該質粒現在含有其新的DNA插入片段。然后將該連接混合物導入大腸桿菌或另一種合適的宿主中，當細菌分裂時該新的工程質粒將被擴增。以這種方式，可以從細菌中獲得并收獲相對大量的人類基因拷貝。然后可以進一步操作這些基因拷貝，用于研究、分析或制備該基因產物蛋白。
0015重組DNA技術經常是以產生所謂的“轉基因”的方式來實施的。轉基因通常包括來源于一種或多種供體生物并被導入宿主生物的各種遺傳物質。一般地，轉基因是使用克隆載體作為實驗方案的起點或“骨架”來構建的，并設計一系列復雜的克隆步驟從而在該載體內裝配最終產物。轉基因的元件——包含核苷酸序列，包括但不限于1)調控啟動子和/或增強子元件，2)將表達為mRNA分子的基因，3)賦予mRNA信息穩定性的DNA元件，4)模擬哺乳動物內含子基因區域的核苷酸序列，和5)mRNA加工的信號，如添加在天然發生的mRNA末端的多聚-A尾巴。在一些情況下，實驗設計可能要求添加定位信號，以將基因產物運輸到特定的亞細胞位置。
0016轉基因的每一個元件可以作為較大DNA分子的片段獲得，其是從供體基因組中切割而來的，或者在一些情況下是在實驗室合成的。盡管本發明將內切核酸酶應用于本文中要求保護的方法，但是應當理解的是，每一個較小的元件——其包含例如在本文的方法中所使用的插入片段或模塊，都可以通過從頭合成、重組工程、和/或PCR末端突出端克隆方法來產生。合成轉基因組成元件的一種這樣的方法包括Jarrell等在美國專利6,358,712中公開的方法，該專利在此作為參考以其全文并入本文。盡管Jarrell公開了將轉基因元件“焊接”在一起的方法，但只有本發明的方法公開了一旦這些元件被裝配之后可將其“解焊接”并重新裝配的方式。根據本發明的一個方面，每一個片段都是以精確的順序和5’-3’方向與其它片段一起被裝配入克隆載體質粒中。
0017任何基因的啟動子都可以作為DNA片段分離得到，并置于合成的分子如質粒中，以指導期望基因的表達，假定可以提供激活感興趣的啟動子所必需的條件的話。例如，可以分離胰島素基因的啟動子序列，并與報告基因一起置于克隆載體質粒中，用于研究在適當的細胞類型中表達胰島素基因所需的條件。可選地，該胰島素基因的啟動子可以與克隆載體質粒中任何感興趣基因的蛋白質編碼序列相連，并用于引發感興趣的基因在胰島素-表達細胞中表達，假定在如此構建的DNA轉基因中存在所有必需的元件。
0018報告基因是某些類型的轉基因中特別有用的組分。報告基因包括編碼蛋白的核苷酸序列，該蛋白將在轉基因中與之連接的感興趣的特定啟動子的指導下表達，從而給出針對該啟動子活性的可測量的生物化學應答。相對于內源細胞蛋白背景，報告基因一般是易于檢測或測量的。通常使用的報告基因包括但不限于LacZ、綠色熒光蛋白和螢光素酶，以及其它報告基因，其中許多報告基因都是本領域的普通技術人員所熟悉的。
0019內含子，是哺乳動物基因中的非編碼區，在細菌基因組中沒有被發現，但卻是哺乳動物細胞中mRNA分子正確形成所需要的。因此，用于哺乳動物系統中的任何DNA構建物必需含有至少一個內含子。內含子可以從任何哺乳動物基因中分離并連同合適剪接信號一起被插入到DNA構建物中，該剪接信號使哺乳動物細胞能夠切除內含子并將剩余的rnRNA末端剪接在一起。
0020mRNA穩定性元件是為保護一些mRNA免于降解的結合蛋白所識別的DNA序列。包含有mRNA穩定性元件通常將增強該mRNA在一些哺乳動物細胞類型中的基因表達水平，因此在一些DNA構建物或轉基因中可能是有用的。mRNA穩定性元件可以從天然發生的DNA或RNA中分離，或者合成產生，用于包含在DNA構建物中。
0021定位信號是編碼負責感興趣蛋白亞細胞途經的蛋白質信號的DNA序列。例如，核定位信號將指導蛋白質到細胞核；質膜定位信號將指導它到質膜，等等。因此，定位信號可以整合入DNA構建物中以幫助其蛋白產物易位至期望的亞細胞位置。
0022標簽序列可以在DNA構建物中被編碼，以便蛋白質產物連接有獨特的區域。此獨特區域作為可以與其內源對應物相區別的蛋白質標簽。可選地，它可以作為鑒定物，其可以通過本領域所熟悉的大量的各種技術，包括但不限于RT-PCR、免疫組織化學術或原位雜交，來加以檢測。
0023使用復合轉基因，或使用包括特別大的DNA區域的轉基因，將增加在這些DNA片段中含有多個內切核酸酶識別位點的可能性。回想一下，編碼任何一個六聚體核苷酸位點的識別序列每4096bp(46)出現一次。如果3000bp的啟動子序列和1500bp的感興趣基因要裝配進一個3000bp的克隆載體，那么在統計學上很可能許多6核苷酸或更少核苷酸的位點都將不能使用，因為任何可用的位點必須只能在片段中出現兩次。而且，該位點必須出現在待被組裝的合適分子的合適區域內。此外，大多數克隆方案將要求含有添加的額外DNA元件，因而增加生長分子的復雜性以及任何特定限制性位點不適當重復的可能性。由于任何限制性酶將在分子中其所有位點上進行切割，如果內切核酸酶限制性位點重復出現，那么所有不合適的位點連同期望的位點一起都將被切割，從而破壞了該分子的完整性。因此，必須小心設計每一步克隆步驟，以免不會因使用已用于整合前面的元件的內切核酸酶進行切割而破壞了該生長分子。最后，當研究者希望將完成的轉基因導入哺乳類生物時，完全裝配的轉基因構建物經常必須在該轉基因的至少一個末端的獨特識別位點上被線性化，因此還需要另外一個在該構建物中無法找到的獨特識別位點。因為大多數DNA構建物都是為單一目的設計的，很少考慮到將來可能需要做出的任何修飾，這進一步增加了將來實驗變化的難度。
0024傳統上，由于若干原因，轉基因的設計和構建要耗費大量的時間和精力，原因包括如下00251.盡管有大量可利用的各種內切核酸酶能產生一大批末端，但是這些末端中的大多數相互間都是不相容的。許多內切核酸酶如EcoR1能生成帶有突出的5’粘性末端或“尾”的DNA片段；其它內切核酸酶(如Pst1)能生成帶有3’突出尾的片段；而還有其他的內切核酸酶(如Bal1)能在對稱軸處切割而產生平末端片段。這些片段中的一些將與由其它內切核酸酶切割形成的末端相匹配，但是有用的末端中的大多數將不相匹配。在設計DNA構建物時，必須仔細考慮每一種DNA片段分離物的末端。
00262.裝配DNA構建物或轉基因所需的DNA片段首先必須從其來源基因組分離出來，放入質粒克隆載體，并擴增以獲得有用的數量。此步驟可以使用任何數量的商業途經獲得或單獨改變的克隆載體來進行。通過商業途經獲得的每一種不同的克隆載體質粒很大程度上都是獨立開發的，因此含有針對感興趣基因或遺傳元件的DNA片段的不同序列及內切核酸酶位點。所以基因必須單獨裁剪以適應任何特定的一組實驗所需要的每一種這樣的載體。相同的DNA片段將經常需要進一步改變用于隨后的實驗或克隆入其它組合中，以獲得新DNA或轉基因。由于每一種DNA構建物或轉基因都是為特定應用而制備的，沒有考慮或了解其下一步將如何使用，因此通常為了隨后的應用必須進行“逆裝配”。
00273.另外，任何特定基因或遺傳元件的DNA序列可變化并可以包含使其與目前可用的載體不相匹配的內部內切核酸酶位點，從而使操作復雜化。當把幾個DNA片段裝配進單個DNA構建物或轉基因時，情況尤其如此。
0028因此，盡管在DNA片段的末端及DNA片段中發現有冗余的內切核酸酶位點，但仍存在對于某種系統的需求，該系統將使用戶能夠將大量DNA片段快速組裝進一個分子。這樣的系統可能還會提供快速改變片段末端的簡便方法，以便將其它內切核酸酶序列加入這些片段中。包含單個或反向HE位點對將會增強具備獨特克隆位點的可能性。系統還將使得能夠容易地取代或去除一個或多個片段，這將增加其多功能性水平，這對于用戶來說是目前無法得到的。因此，“模塊”系統，即使得使用者能夠在克隆載體中將DNA片段或“插入片段”插入側翼與罕見內切核酸酶位點相接的“盒”區中或從“盒”區去除的系統，將會非常有用并且受到重組DNA技術領域的歡迎。
發明簡述0029因此，本發明提供了使用克隆載體質粒快速裝配DNA構建物或轉基因的方法。本發明還提供了將多個DNA片段，也稱為“插入片段”或“模塊”如啟動子核苷酸序列、表達核苷酸序列和3’調控核苷酸序列之中的每一個，在單一步驟中整合入克隆載體質粒的方法，而不必按順序的方式導入每一個插入片段。本文中，這樣的方法被稱為“動態載體裝配(Dynamic Vector Assembly)”。
0030在一種實施方案中，本發明提供了構建轉基因的方法，包括以下步驟提供帶有能夠接受順序排列的插入片段的骨架的克隆載體質粒，提供欲被包括在該轉基因中的至少第一插入片段和第二插入片段，和在單一反應中將第一插入片段和第二插入片段轉入該骨架中。
0031在另一種實施方案中，本發明提供了制備轉基因的方法，包括以下步驟提供包含第一停泊點和第二停泊點的克隆載體質粒；將欲被包括在轉基因中的第一核苷酸序列導入第一穿梭載體；將欲被包括在轉基因中的第二核苷酸序列導入第二穿梭載體；和將第一核苷酸序列和第二核苷酸序列同時從穿梭載體轉入克隆載體質粒的第一和第二停泊點之間。
0032本發明還提供了制備轉基因的方法，包括以下步驟提供包含第一和第二停泊點的克隆載體質粒；將欲被包括在轉基因中的啟動子核苷酸序列導入啟動子穿梭載體；將欲被包括在轉基因中的表達核苷酸序列導入表達穿梭載體；將欲被包括在轉基因中的調控核苷酸序列導入調控穿梭載體；和將啟動子核苷酸序列、表達核苷酸序列和調控核苷酸序列同時從啟動子、表達和調控穿梭載體轉入克隆載體質粒的第一和第二停泊點之間。
0033在另一種實施方案中，本發明提供了同時合成大批轉基因的方法，包括以下步驟提供包含第一和第二停泊點的初級克隆載體質粒；將欲被包括在轉基因中的至少一個啟動子核苷酸序列導入相應的啟動子穿梭載體；將欲被包括在轉基因中的至少一個表達核苷酸序列導入相應的表達穿梭載體；將欲被包括在轉基因中的至少一個調控核苷酸序列導入相應的調控穿梭載體；和將啟動子、表達和調控核苷酸序列從啟動子、表達和調控穿梭載體同時轉入克隆載體質粒的第一和第二停泊點間之，其中一個啟動子模塊、一個表達模塊和一個調控模塊的至少兩種組合被轉入兩個不同的初級克隆載體分子中。
0034又在另一種實施方案中，本發明提供了制備用于合成轉基因或其它復雜DNA構建物的模塊克隆載體質粒方法，包括以下步驟提供包含骨架的克隆載體質粒，該骨架包括第一和第二停泊點，每一停泊點被安裝在該骨架中并包含內切核酸酶的至少一個非可變的罕見內切核酸酶位點；用與第一停泊點的至少一個非可變的罕見限制性位點相對應的第一內切核酸酶切割第一停泊點，留下帶有3’末端的經切割的第一停泊點；用與第二停泊點的至少一個非可變的罕見限制性位點相對應的第二核酸酶切割第二停泊點，留下帶有5’末端的經切割的第二停泊點；提供至少第一和第二插入片段，每一插入片段包括5’末端、感興趣的核苷酸序列和3’末端，其中第一插入片段的5’末端與經切割的第一停泊點的3’末端相匹配，第二插入片段的3’末端與經切割的第二停泊點的5’末端相匹配，第一插入片段的3’末端與第二插入片段的5’末端相匹配以形成第三內切核酸酶的第三非可變的罕見內切核酸酶位點；將插入片段和切割后的克隆載體質粒放入適當的反應混合物中，引起第一插入片段和第二插入片段在骨架中的第一停泊點和第二停泊點之間同時進行連接反應和自我定向，重新形成第一停泊點和第二停泊點，并形成模塊克隆載體質粒。
0035在另一種實施方案中，本發明提供了制備用于合成轉基因或其它復雜DNA構建物的模塊克隆載體質粒的方法，該方法包括以下步驟提供包含骨架的初級克隆載體質粒，該骨架包括至少第一停泊點和第二停泊點，每一停泊點被安裝在該骨架中并包含非可變的罕見限制性酶的至少一個罕見限制性位點；用與第一停泊點的罕見限制性位點的其中一個相對應的第一非可變罕見限制性酶切割第一停泊點，留下帶有3’末端的被切割的骨架；用與第二停泊點的限制性位點的其中一個相對應的第二非可變的罕見限制性酶切割第二停泊點，留下帶有5’末端的被切割的骨架；提供啟動子插入片段，其中包括感興趣的啟動子序列、與第一停泊點3’末端相匹配的5’末端、和3’末端；提供表達插入片段，包括感興趣的表達序列、與啟動子插入片段3’末端相匹配而形成第三非可變的罕見限制性酶的罕見限制性位點的5’末端、和3’末端；提供調控插入片段，包括感興趣的調控序列、與表達插入片段3’末端相匹配而形成第四非可變的罕見限制性酶的罕見限制性位點的5’末端、和與在步驟‘c’中被切割的第二停泊點的5’末端相匹配的3’末端；將啟動子插入片段、表達插入片段、調控插入片段和切割后的克隆載體質粒放入適當的反應混合物中，引起啟動子插入片段、表達插入片段和調控插入片段在第一停泊點和第二停泊點之間同時進行連接、自我定向和順序放置，重新形成第一停泊點和第二停泊點，和形成模塊初級克隆載體質粒。
0036在還有另一種實施方案中，本發明提供了同時合成大批轉基因或其它復雜DNA構建物的方法，包括以下步驟提供包括骨架的至少一個初級克隆載體質粒，該骨架中可以插入帶有5’末端、感興趣的核苷酸序列和3’末端的插入片段，該骨架能夠可操作地接受順序排列的啟動子插入片段、表達插入片段、調控插入片段，并包括至少第一和第二停泊點，每一停泊點被安裝在該骨架中并包含非可變的罕見限制性酶的至少一個限制性位點；用與第一停泊點的限制性位點的其中一個相對應的第一非可變的罕見限制性酶切割第一停泊點；用與第二停泊點的限制性位點的其中一個相對應的第二非可變的罕見限制性酶切割第二停泊點；提供至少一個啟動子插入片段，其中已插入啟動子核苷酸序列，至少一個啟動子插入片段的5’末端與步驟‘b’中被切割的第一停泊點的3’末端相匹配；提供至少一個表達插入片段，其中已插入表達核苷酸序列，至少一個表達插入片段的5’末端與至少一個啟動子插入片段的3’末端相匹配，形成第三非可變的罕見限制性酶的限制性位點；提供至少一個調控插入片段，其中已插入調控核苷酸序列，至少一個調控插入片段的5’末端與至少一個表達插入片段的3’末端相匹配，形成第四非可變的罕見限制性酶的限制性位點，至少一個調控插入片段的3’末端與在步驟‘c’中被切割的第二停泊點的5’末端相匹配；然后將至少兩種不同類型的至少一個啟動子插入片段、表達插入片段和調控插入片段，每一剩余插入片段中的至少一個，和被切割的克隆載體質粒放置在合適的反應混合物中，引起啟動子插入片段、表達插入片段和調控插入片段中的每一種中的一個在所述骨架中的所述第一停泊點和所述第二停泊點之間同時進行連接、自我定向和順序放置，從而產生在其骨架中具有啟動子插入片段、表達插入片段和調控插入片段的不同組合的大批質粒。
0037通過下列附圖和詳細說明，將會更加充分地深入理解本發明的本質和優勢。
附圖簡述0038附圖被并入本說明書中并構成本說明書的一部分，舉例說明了本發明的實施方案，并與上文給出的本發明的一般描述及下文提供的詳細描述一起用于解釋本發明的原理。
0039

圖1是本發明模塊概念的線性圖，顯示了可插入PE3停泊站(docking station)的P穿梭載體，PE3停泊站可插入初級停泊站。
0040圖2是描述骨架載體裝配的圖示，該裝配是通過穿梭載體中限制性位點如啟動子、表達和3’調控模塊與初級克隆載體質粒上的停泊點之間的關系得以實現的。
0041圖3是描述圖2中裝配好的骨架載體的圖示。
發明詳述0042如本文中所使用的，術語“染色質修飾域”(CMD)指與保持和/或改變染色質結構的各種相關蛋白相互作用的核苷酸序列。
0043如本文中所使用的，術語“克隆”指將DNA分子連接到質粒中并將其轉入合適的宿主細胞中以便在宿主增殖時得以復制的過程。
0044如本文中所使用的，術語“克隆載體”和“克隆載體質粒”可以互換使用，指環狀DNA分子，最少包含復制起始區、用于對容納該質粒的宿主細胞進行陽性選擇的工具如抗生素-抗性基因；和多克隆位點。
0045如本文中所使用的，與內切核酸酶位點有關的術語“常見的”指基因組中相對頻繁出現的任何內切核酸酶位點。
0046如本文中所使用的，短語“與......相匹配”指DNA鏈的5’或3’末端或端，它可以與由相同限制性酶切割產生或通過某些其它方法產生的任何其它互補末端形成氫鍵。因為含有限制性酶特定識別序列的任何DNA將以與含相同序列的任何其它DNA相同的方式被切割，所以那些被切割的末端將是互補的，并且因此是相匹配的。所以，用相同限制性酶切割的任何DNA分子的末端以鄰近片段七巧板“匹配”的方式相互配對，并可以酶促連接在一起。當匹配的末端結合在一起時，它們將形成特定限制性酶的識別位點。
0047如本文中所使用的，術語“從頭合成”指通過連接互補單鏈DNA分子的相匹配的突出端合成任何長度的雙鏈DNA分子的過程，該相匹配的突出端代表了總的期望DNA分子的亞序列。
0048如本文中所使用的，術語“DNA構建物”指在克隆載體中通過連續的克隆步驟合成的DNA分子，通常用于在任何適當的細胞宿主如體外培養細胞或轉基因小鼠體內指導基因表達。用于制備這樣的小鼠的轉基因也可以稱為DNA構建物，尤其是在設計與合成該轉基因期間。
0049如本文中所使用的，術語“DNA片段”指任何分離的DNA分子，包括但不限于蛋白質編碼序列、報告基因、啟動子、增強子、內含子、外顯子、多聚A尾、多克隆位點、核定位信號、或mRNA穩定性信號、或者任何其它天然發生的或合成的DNA分子、或它們的任何部分。可選地，DNA片段完全可以是合成來源，體外產生的。而且，DNA片段可以包括分離的天然發生的片段和/或合成片段的任何組合。
0050如本文中所使用的，術語“停泊質粒”(“Docking Plasmid”)指本發明中用于將DNA片段裝配進DNA構建物的特異性克隆載體質粒。
0051如本文中所使用的，術語“內切核酸酶”或“內切核酸酶”指催化分子類別中的一個或多個成員，它們結合編碼在DNA分子中的識別位點，并在該序列中或該序列附近的準確位置上切割該DNA分子。
0052如本文中所使用的，術語“內切核酸酶識別位點”、“識別位點”、“同源序列”或“許多同源序列”，指限制性酶結合并切割DNA分子或基因所需的最小核苷酸片段。
0053如本文中所使用的，術語“增強子區”指并非靶基因表達所必需的，但是在適當條件下將提高基因表達水平的核苷酸序列。
0054如本文中所使用的，術語“基因表達的宿主選擇子基因”(GEH-S)指可以賦予宿主生物某一特征的遺傳元件，該特征可以通過光學傳感器、PCR擴增、生物化學分析，或通過細胞/生物存活試驗(當使用合適的抗生素或化學品時，細胞或生物的抗性或對細胞或生物的毒性)而被選擇、跟蹤或檢測。
0055如本文中所使用的，術語“基因啟動子”或“啟動子”指基因表達所必需的核苷酸序列，或全長啟動子的任何部分。
0056如本文中所使用的，術語“插入片段”和“模塊”基本可以互換使用，唯一的細微差別是“插入片段”是用于插入載體的，一旦被插入后則更通常地被稱為“模塊”。模塊然后也可以從載體中去除。同時，術語插入片段通常稱為分離的模塊，用作插入模塊接受載體的插入片段。
0057如本文中所使用的，術語“內含子”指哺乳動物細胞基因中兩個蛋白質編碼區或外顯子之間發現的非蛋白編碼區核苷酸序列。
0058如本文中所使用的，術語“定位信號”(LOC)指編碼感興趣蛋白亞細胞途經的信號的核苷酸序列。
0059如本文中所使用的，術語“多克隆位點”(MCS)指包括至少一個獨特的內切核酸酶位點，更典型地，包括一組獨特的內切核酸酶位點的核苷酸序列，用于將DNA片段克隆到克隆載體質粒。
0060如本文中所使用的，術語“mRNA穩定性元件”指結合蛋白所識別的DNA序列，該結合蛋白據認為能夠保護一些mRNA免受降解。
0061如本文中所使用的，術語“復制起點”(ORI)是指導質粒在宿主細胞中復制的核苷酸序列。
0062如本文中所使用的，短語“PCR末端突出端克隆技術”指使用聚合酶鏈式反應結合單鏈DNA引物擴增遺傳模塊的方法，該引物帶有受保護的5’突出核苷酸，此核苷酸可以用作與互補DNA突出端的接合位點。
0063如本文中所使用的，術語“多聚A尾”指通常在信使RNA(mRNA)分子末端發現的腺嘌呤(A)核苷酸序列。多聚A尾信號被整合進DNA構建物或轉基因的3’末端，以幫助感興趣基因表達。
0064如本文中所使用的，術語“引物位點”指充當DNA模板的核苷酸序列，單鏈DNA寡核苷酸可以在其上退火，用于起始DNA測序、PCR擴增、和/或RNA轉錄。
0065如本文中所使用的，術語“pUC19”指為本領域普通技術人員所熟悉的質粒克隆載體，并可以根據編號L09137在NCBI的Genbank數據庫中找到。
0066如本文中所使用的，術語“隨機核苷酸序列”指核苷酸序列的任何組合，該核苷酸序列并不復制編碼其它元件的序列，該其它元件指同一分子的組分。隨機序列中所要求的核苷酸數目是由位于該隨機序列側翼的內切核酸酶的要求來決定的。大多數內切核酸酶要求最少2-4個額外的隨機序列來穩定DNA結合作用。對應于組成密碼子的核苷酸數，隨機序列的數目優選是3的倍數。因此，隨機序列優先的最小數是6，不過也可以使用更少或更多個核苷酸。
0067如本文中所使用的，與內切核酸酶位點有關的術語“罕見的”指基因組中出現頻率相對較低的內切核酸酶位點。
0068如本文中所使用的，術語“重組臂”指幫助轉基因DNA與基因組DNA之間同源重組的核苷酸序列。成功的重組需要在轉基因DNA的側翼區同時存在左翼重組臂(LRA)和右翼重組臂(RRA)，以通過同源重組將該轉基因DNA整合進宿主基因組中。
0069如本文中所使用的，術語“重組工程”指使用隨機或位點選擇性重組酶結合DNA序列的方法，重組酶可以作用于該DNA序列上，從而使部分遺傳物質從一個DNA分子易位至不同的DNA分子上。
0070如本文中所使用的，術語“報告基因”指編碼蛋白的核苷酸序列，該蛋白用于監測感興趣的特定啟動子的活性。
0071如本文中所使用的，術語“穿梭載體”指本發明中用于制備中間分子的特異性克隆載體質粒，該中間分子將修飾DNA片段的末端。
0072如本文中所使用的，術語“標記序列”(TAG)指編碼獨特的蛋白質區的核苷酸序列，該蛋白質區使該蛋白可以被檢測，或者在有些情況下使其區別于任何內源性對應物。
0073如本文中所使用的，術語“非翻譯區”(UTR)指mRNA分子中包含非蛋白質編碼區的核苷酸序列。這些非翻譯區可以位于mRNA分子的5’末端(5’UTR)或3’末端(3’UTR)。
0074本發明提供了獲得含有模塊的新制造的轉基因并選擇性地去除一個或多個模塊以及用不同插入片段替換它的方法。這種方法在本文中被稱為“二次途經”(second pass)和“多重穿引”(multiplethreading)。本發明進一步提供了創造大批不同轉基因的方法，其中每一轉基因都具有不同的啟動子、表達和調控插入元件，這是通過在單一步驟中將多個不同的啟動子、表達和調控插入元件整合入克隆載體質粒而實現的。本發明還提供了包括以下步驟的方法提供含有組合在一起的新導入的啟動子、表達和調控插入元件的克隆載體質粒，去除作為骨架載體的整個組合，并將多重數量的骨架載體插入單個克隆載體質粒中。
0075本發明還提供了通過提供含有停泊點的骨架來產生用于合成轉基因或其它復雜DNA構建物的模塊克隆載體質粒的方法。每一個停泊點代表一個區域，其中優選地含有至少一個固定的非可變罕見內切核酸酶位點，更優選地含有固定的幾組兩個非可變罕見內切核酸酶位點，最優選地含有固定的幾組三個非可變罕見內切核酸酶位點。每一停泊點的特定限制性位點被其同源內切核酸酶切割。這將創造出期望的5’或3’末端，該末端與其中一個含有選擇的核苷酸序列如啟動子、表達或調控核苷酸序列的預構建的插入片段的互補5’或3’末端相匹配。至少兩個插入片段，其中每一個都具有和被切割的感興趣的停泊點相匹配的5’和3’末端，可以與被切割的克隆載體質粒一起加入到適當的反應混合物中，并且假定在合適的熱動力學環境中，該插入片段可以自發地，即在單一步驟中，被整合進克隆載體質粒。在此單一的添加及連接反應過程中，停泊點重新形成且克隆載體質粒成為模塊，這是因為停泊點以及兩模塊之間的連接可以用合適的限制性酶重新切割。接著該模塊可以被隨后去除，新模塊可以被放在原模塊的位置。
0076本發明的一項實施方案涉及構建轉基因的方法，該方法包括以下步驟提供帶有骨架的克隆載體質粒，該骨架能夠接受順序排列的插入片段；提供將要被包括在轉基因中的至少第一插入片段和第二插入片段；和在單一反應中將第一插入片段和第二插入片段轉入骨架中。更優選地該插入片段包括三個插入片段，具體來講就是至少一個啟動子、表達和調控模塊。
0077本發明的另一種實施方案是制備轉基因的方法，該方法包括以下步驟提供包括第一和第二停泊點的克隆載體質粒；將欲被包括在轉基因中的啟動子核苷酸序列導入啟動子穿梭載體；將欲被包括在轉基因中的表達核苷酸序列導入表達穿梭載體；將欲被包括在轉基因中的調控核苷酸序列導入調控穿梭載體；和將啟動子、表達和調控核苷酸序列同時從啟動子、表達和調控穿梭載體轉入克隆載體質粒的第一和第二停泊點之間。
0078優選的是每一停泊點和每一插入片段的5’和3’末端都與另一個停泊點或插入片段的對應末端相匹配。例如，如果第一停泊點含有非可變罕見限制性酶如SgrAI的限制性位點，且該停泊點隨后被切開，那么欲被插入切割的第一停泊點的3’末端的第一插入片段將含有相匹配的5’末端，從而在該插入片段與第一停泊點結合時產生SgrAI的限制性位點。質粒中的第二停泊點可以，例如具有非可變限制性酶如SwaI的限制性位點。任何第二插入片段在其3’末端將具有相匹配的核苷酸序列，從而與被切割的第二停泊點的切割的5’末端相結合，產生SwaI的限制性位點。此外，為了同時被插入模塊克隆載體質粒并且以后還在相同位點被去除，第一插入片段的3’末端與第二插入片段的5’末端，必須含有相匹配的末端從而產生第三非可變罕見限制性酶如PacI或SalI的第三限制性位點。
0079本發明編碼模塊結構的順序元件具體可以包括三個非可變的和獨特的常見限制性位點、5’寡核苷酸引物位點、正向獨特的HE位點、隨機核苷酸序列側翼的一對的非可變和獨特的、常見限制性位點、限定啟動子模塊5’部分的一組固定的非可變罕見限制性位點、隨機核苷酸序列、限定相對于啟動子/內含子模塊的3’部分和相對于表達模塊的5’部分之間的共有接頭的一組固定的非可變罕見限制性位點、隨機核苷酸序列、限定相對于表達模塊的3’部分和相對于3’調控模塊的5’部分的接頭的一組固定的非可變罕見限制性位點、隨機核苷酸序列、限定相對于3’調控模塊的3’部分的一組固定的非可變罕見限制性位點、隨機核苷酸序列側翼的一對非可變的和獨特的常見限制性位點、與置于5’寡核苷酸引物位點3’末端的HE位點相同的反向獨特的HE位點、反向3’寡核苷酸引物位點、和四個限定3’插入位點的非可變的和獨特的常見限制性位點。
0080本發明編碼模塊結構的其它順序元件具體地可以包括限定5’插入位點的兩個非可變和獨特的常見限制性位點、寡核苷酸引物位點、隨機核苷酸序列側翼的一對反向的獨特HE位點、使得能將穿梭載體模塊克隆在一對獨特的HE位點下游的非可變的和獨特的常見限制性位點、一組固定的非可變罕見限制性位點、隨機核苷酸序列、一組固定的非可變罕見限制性位點、正向獨特的HE位點、隨機核苷酸序列側翼的一對非可變的和獨特的常見限制性位點、寡核苷酸引物位點、一對反向獨特BstX I位點(其中BstX I識別位點中的可變核苷酸區是通過與非互補尾相同的核苷酸來限定的，該非互補尾是通過排列以反向互補方向排列的兩個相同HE識別位點而產生的)、隨機核苷酸序列側翼的一對反向獨特HE位點、反向寡核苷酸引物位點、隨機核苷酸序列側翼的一對非可變和獨特的常見限制性位點、反向獨特HE位點，該HE位點與正向HE位點相同、一組固定的非可變罕見限制性位點、隨機核苷酸序列、一組固定的非可變罕見限制性位點、非可變和獨特的常見限制性位點、隨機核苷酸序列側翼的一對反向獨特的HE位點、反向寡核苷酸引物位點，和三個非可變和獨特的常見限制性位點。
0081本發明是將各種DNA片段裝配入從頭DNA構建物或轉基因的一組方法，該方法是通過使用優化的克隆載體來減少通常需要的操作量實現的。
0082初級載體，本文中指停泊質粒，含有多克隆位點(MCS)，該MCS優選地攜帶以線性方式排列的3組罕見內切核酸酶位點。這樣的排列方式限定了模塊結構，該模塊結構使用戶能夠將多個插入片段裝配進單個轉基因構建物中，而不破壞在先前克隆步驟中已經整合入停泊質粒的DNA元件的完整性。
0083為了產生不能自我退火的基因盒受體位點，將至少三個HE的兩個識別位點以反向方式放在三個模塊區的側翼。因為HE位點是不對稱和非回文的，所以通過反向放置兩個HE識別位點，能夠產生非互補的突出3’粘性尾。因此，HE I-SceI切割其同源識別位點，如“/”所示5’...TAGGGATAA/CAGGGTAAT...3’，3’...ATCCC/TATTGTCCCATTA...5’。
0084將第二位點反向放置在MCS中，將產生兩個非互補的粘性突出尾5’...TAGGGATAA CCCTA...3’3’...ATCCCAATAGGGAT...5’。
0085當有必要將較大的轉基因亞克隆到載體中時，這是特別有用的。由于插入片段的大小的緣故，從熱力學角度講，更有利地是，載體自身退火而不是接納大的插入片段。通過放置限制性位點而產生的非互補尾，為抵消自身連接的熱力學傾向提供了化學力。
0086當與BstX I內切核酸酶位點(5’CCANNNNN/NTGG 3’，其中‘N’可以是任何核苷酸)結合使用時，大多數HE突出尾的不對稱性質也產生強大的克隆工具。BstX I的序列中性域(sequence-neutraldomain)可以用于產生與兩個反向HE突出尾相匹配的粘性末端，同時防止自身退火。
0087BstX I(I-Sce I Fwd.)I-Sce I正向I-Sce I反向BstX I(I-SceI Rev.)5’-CCAGATAACAGGGTAAT//ATTACCCTGTTATGTGG-3’3’-GGTCTATTGTCCCATTA//TAATGGGAC
AATACACC-5’0088按照出現的等次，來選擇本發明中使用的內切核酸酶位點。為了確定內切核酸酶位點出現的頻率，用Vector NTI軟件分析了對應于19個不同基因的DNA序列信息。此檢索覆蓋了總共110,530個核苷酸的DNA序列。根據所分析的110,530個核苷酸中出現的內切核酸酶位點的實例數，計算這些分析獲得的結果。然后按四個類別將內切核酸酶位點分配以等級名稱，其中“常見”位點每110,530個核苷酸出現25次以上，“較低頻率6bp位點”是每110,530個核苷酸出現6-24次，“罕見”位點是每110,530個核苷酸出現0-5次。因此根據它們的出現類別，列出“合適的”酶的部分清單。
0089常見內切核酸酶Ase I、BamH I、Bgl II、Blp I、BstX I、EcoR I、Hinc II、Hind III、Nco I、Pst I、Sac I、Sac II、Sph I、Stu I、Xba I。
0090具有6bp識別位點但出現頻率較低的內切核酸酶Aar I、Aat II、Afl II、Age I、ApaL I、Avr II、BseA I、BspD I、BspE I、BstB I、Cla I、Eag I、EcoO109 I、EcoR V、Hpa I、KpnI、Mfe I、Nar I、Nde I、NgoM IV、Nhe I、Nsi I、Pml I、SexA I、Sma I、Spe I、Xho I。
0091罕見內切核酸酶Acl I、Asc I、AsiS I、BsiW I、Fse I、Mlu I、Not I、Nru I、Pac I、Pme I、Pvu I、Rsr II、Sal I、Sbf I、Sfi I、SgrA I、SnaB I、Swa I、PI-Sce I、I-Sce I、I-Ceu I、PI-Psp I、I-Ppo I、I-Tli I。
0092也可以使用這些清單中未包括的其它內切核酸酶，它們具有了相同功能性和本發明的精神和內容。
本發明的二級載體，本文中稱為穿梭載體，含有多克隆位點，該MCS攜帶側翼分布有罕見內切核酸酶位點的常見內切核酸酶位點。該穿梭載體被設計用于將DNA片段克隆入罕見位點之間的常見內切核酸酶位點。隨后通過在罕見內切核酸酶一個位點或多個位點上進行切割，可以釋放被克隆的片段，并利用與穿梭載體中發現的相同的罕見內切核酸酶一個位點或多個位點，將其整合入停泊質粒中。
0093因此，不同于常規的克隆載體，MCS的設計使DNA片段的“盒”或模塊可以被插入到停泊質粒的模塊區。同樣，使用相同的罕見內切核酸酶位點可以容易地去除每一個DNA片段，并用任何其它感興趣的DNA片段來替代。這一特性讓使用者能夠方便快捷的改變實驗項目的方向，而不必重新建立整個DNA構建物。因此，本發明的克隆載體質粒讓使用者能夠利用常見內切核酸酶位點將DNA片段克隆進中間載體，創造出盒-接納模塊，并隨后利用罕見內切核酸酶位點將該片段轉入最終物構建的期望模塊位點。此外，它使得能夠進一步改變該分子，以用其它盒模塊來替換停泊質粒中的個別模塊。以下的描述突出了本發明與現有技術的差別。
0094轉基因的各組分(啟動子增強子P、表達的蛋白E、和/或3’調控區3)可以作為被轉移的模塊從穿梭載體裝配入PE3停泊站質粒。如果需要復雜性更高的順序，裝配的轉基因，或者其它核苷酸序列，然后可以轉入初級停泊質粒。五類克隆載體質粒中的每一種將被更加詳細地解釋，從而理解整合入每種質粒中的組分，這將從較為復雜的PE3停泊站質粒和初級停泊質粒開始。
0095PE3停泊質粒包括帶有以下修飾的pUC19骨架，其中序列是按照pUC19的Genbank序列文件，編號L09137，來進行編號的00961.僅序列806至2617(Afl3-Aat2)用于停泊質粒中。
00972.pUC19中1729處的BspH 1位點由TCATGA突變為GCATGA。
00983.pUC19中1493處的Acl 1位點由AACGTT突變為AACGCT。
00994.pUC19中1120處的Acl 1位點從AACGTT突變為CACGCT。
001005.pUC19中的Ahd 1位點從GACNNNNNGTC突變為CACNNNNNGTC。
001016.上面列出的突變步驟2之后，將編碼BspH 1/I-Ppo1/BspH 1的序列插入pUC19中唯一留存的BspH 1位點中。
00102PE3停泊質粒中的多克隆位點(MCS)按照所列順序，包括以下順序元件001031.三個非可變和獨特的常見內切核酸酶位點，限定了上述突變的pUC19載體的5’插入位點(表示為，但不限于Aat II、Blp I、和EcoO109 I)；001042.T7引物位點；001053.獨特的HE位點(例如I-Sce I(正向))；001064.隨機核苷酸序列側翼的一對非可變和獨特的常見內切核酸酶位點，其可以作為染色質修飾域接納體模塊(RNAS-CMD-1)(例如Kpn I和Avr II)；001075.限定啟動子模塊5’部分的一組固定的非可變罕見內切核酸酶位點(例如AsiS I、Pac I、和Sbf I)；001086.可以作為啟動子/內含子接納體模塊的隨機核苷酸序列(RNAS-P)；001097.限定啟動子/內含子模塊3’部分和表達模塊5’部分之間共有接點的一組固定的非可變罕見內切核酸酶位點(例如SgrA I、AscI、和Mlu I)；001108.可以作為表達接納體模塊的隨機核苷酸序列(RNAS-E)；001119.限定表達模塊3’部分和3’調控模塊5’部分之間的接點的一組固定的非可變罕見內切核酸酶位點(例如SnaB I、Not I、和Sal I)；0011210.可以作為3’調控域接納體模塊的隨機核苷酸序列(RNAS-3)；0011311.限定3’調控模塊3’部分的一組固定的非可變罕見內切核酸酶位點(例如Swa I、Rsr II、和BsiW I)；0011412.隨機DNA核苷酸序列側翼的一對非可變和獨特的常見內切核酸酶位點，其可以作為染色質修飾域接納體模塊(RNAS-CMD-2)(例如Xho I和Nhe I)；0011513.與上面第3項相同的反向獨特的HE位點；0011614.反向T3引物位點；和0011715.限定上述突變的pUC19載體的3’插入位點的四個非可變和獨特的常見內切核酸酶位點(例如BspE I、Pme I、Sap I和BspHI)。
00118初級停泊質粒可以用于裝配首先構建在PE3停泊站質粒中的兩個完整的轉基因，或用于裝配構建基因-靶向轉基因，或導入兩類陽性或陰性選擇元件所需的兩條同源臂。初級停泊質粒中的多克隆位點按所列順序，包括以下順序元件001191.兩個非可變和獨特的常見內切核酸酶位點，它們限定了上述突變的pUC19載體的5’插入位點(例如Aat II和Blp I)；001202.M13反向引物位點；001213.隨機DNA核苷酸序列側翼的一對獨特的內切核酸酶位點，其可以作為基因組表達宿主選擇基因接納體模塊(RNAS-GEH-S1)；001224.使得能在HE對下游克隆穿梭載體模塊的非可變和獨特的常見內切核酸酶位點(例如EcoO109 I)；001235.限定左重組臂模塊5’部分的固定的一組非可變罕見內切核酸酶位點(例如AsiS I、Pac I、和Sbf I)；001246.可以作為左重組臂接納體模塊的隨機核苷酸序列(RNAS-LRA)；
001257.限定左重組臂接納體模塊3’部分的固定的一組非可變罕見內切核酸酶位點(例如SgrA I、Mlu I和Asc I)；001268.獨特的HE位點(例如I-Ceu I(正向))；001279.隨機DNA核苷酸序列側翼的一對非可變和獨特的常見內切核酸酶位點，其可以作為染色質修飾域接納體模塊(RNAS-CMD-1)(例如Kpn I和Avr II)；0012810.T7引物位點；0012911.隨機DNA核苷酸序列側翼的一對反向獨特的BstX I位點(其中BstX I識別位點中的可變核苷酸區是通過與非互補尾相同的核苷酸來限定的，該非互補尾是通過排列以反向互補方向排列的兩個相同HE識別位點而產生的；例如PI-Sce I(正向)和PI-Sce I(反向))，其可以作為復雜轉基因接納體模塊(RNAS-PE3-1)；0013012.隨機DNA核苷酸序列側翼的一對唯一的內切核酸酶位點，該隨機DNA核苷酸序列可以作為復雜轉基因接納體模塊(RNAS-PE3-2)；0013113.反向T3引物位點；0013214.隨機DNA核苷酸序列側翼的一對非可變和獨特的常見內切核酸酶位點，該隨機DNA核苷酸序列可以作為染色質修飾域接納體模塊(RNAS-CMD-2)(例如Xho I和Nhe I)；0013315.與上面第8項相同的反向獨特的HE位點；0013416.限定右側重組臂接納體模塊5’部分的固定一組非可變罕見內切核酸酶位點(例如SnaB I、Sal I、和Not I)；0013517.可以作為右側重組臂接納體模塊的隨機核苷酸序列(RNAS-RRA)；0013618.限定右側重組臂接納體模塊3’部分的固定一組非可變罕見內切核酸酶位點(例如Rsr II、Swa I、和BsiW I)；0013719.使得能用于克隆穿梭載體模塊的非可變和獨特的常見內切核酸酶位點(例如BspE I)；0013820.隨機DNA核苷酸序列側翼的一對獨特的內切核酸酶，該隨機DNA核苷酸序列可以作為基因組表達宿主選擇基因接納體模塊(RNAS-GEH-S2)；0013921.反向放置的M13正向引物位點；0014022.三個非可變和獨特的常見內切核酸酶位點，限定上述突變的pUC19載體的3’插入位點(例如Pme I、Sap I和BspH I)。
00141本發明的三種克隆載體質粒被稱為穿梭載體。該穿梭載體，如同PE3及初級停泊質粒，也是從pUC19構建而成的。正如PE3及初級停泊質粒，每一個穿梭載體都對pUC19骨架做了與上面1至6所列相同的修改。各穿梭載體(SV)分別命名為啟動子/內含子穿梭載體(P)、表達穿梭載體(E)、和3’調控穿梭載體(3)；此后稱為SVP、SVE、和SV3。下面對每個穿梭載體做了更充分的描述。
00142穿梭載體P(SVP)00143SVP是可以用于制備啟動子和內含子序列以裝配入轉基因構建物的克隆載體質粒。SVP質粒的例子在MCS中按所列順序可以包括以下順序元件001441.兩個非可變和獨特的常見內切核酸酶位點，其限定了上述突變的pUC19載體的5’插入位點(例如Aat II和Blp I)；001452.T7引物位點；001463.能有效地在T7引物位點下游克隆穿梭載體模塊的非可變和獨特的常見內切核酸酶位點(例如EcoO109 I)；001474.限定啟動子模塊5’部分的固定一組非可變罕見內切核酸酶位點(例如AsiS I、Pac I、和SbfI)。這些非可變罕見內切核酸酶位點提供了停泊位點，其由圖2中啟動子載體5’末端的星號來表示；
001485.可變的MCS，包括對于該穿梭載體來說獨特的任何組的常見或罕見內切核酸酶位點；001496.限定啟動子模塊3’部分的固定的一組非可變罕見內切核酸酶位點(例如SgrA I、Asc I、和Mlu I)。這些非可變罕見內切核酸酶位點提供了停泊點，其由圖2中啟動子載體3’末端的圓圈來表示；001507.能有效地在T3引物位點下游克隆穿梭載體模塊的非可變和獨特的常見內切核酸酶位點(例如BspE I)；001518.反向的T3引物位點；和001529.兩個非可變和獨特的常見內切核酸酶位點，限定了上述突變的pUC19載體的3’插入位點(例如Pmel I和Sap I)。
00153穿梭載體E(SVE)00154這是可以用于制備將被轉基因所表達的序列以裝配入轉基因構建物的克隆載體質粒。SVE質粒的例子在MCS中按所列順序可以包括以下順序元件001551.兩個非可變和獨特的常見內切核酸酶位點，其限定了上述突變的pUC19載體的5’插入位點(例如Aat II和Blp I)；001562.T7引物位點；001573.能有效地在T7引物位點下游克隆穿梭載體模塊的非可變和獨特的常見內切核酸酶位點(例如EcoO109 I)；001584.限定表達模塊5’部分的固定的一組非可變罕見內切核酸酶位點(例如SgrA I、Asc I、和Mlu I)。這些非可變罕見內切核酸酶位點提供了停泊位點，其由圖2中表達載體5’末端的圓圈來表示；001595.可變的MCS，包括對于該穿梭載體來說獨特的任何組的常見或罕見內切核酸酶位點；001606.限定表達模塊3’部分的固定的一組非可變罕見內切核酸酶位點(例如SnaB I、Not I、和Sal I)。這些非可變罕見內切核酸酶位點提供了停泊點，其由圖2中表達載體3’末端的三角形來表示；001617.能有效地在T3引物位點上游克隆穿梭載體模塊的非可變和獨特的常見內切核酸酶位點(例如BspE I)；001628.反向的T3引物位點；和001639.兩個非可變和獨特的常見內切核酸酶位點，其限定了上述突變的pUC19載體的3’插入位點(例如Pmel I和Sap I)。
00164穿梭載體3(SV3)00165這是可以用于制備3’調控序列以裝配入轉基因構建物的克隆載體質粒。SV3質粒的例子在MCS中按所列順序可以包括以下順序元件001661.兩個非可變和獨特的常見內切核酸酶位點，其限定了上述突變的pUC19載體的5’插入位點(例如Aat II和Blp I)；001672.T7引物位點；001683.能有效地在T7引物位點下游克隆穿梭載體模塊的非可變和獨特的常見內切核酸酶位點(例如EcoO109 I)；001694.限定3’調控模塊5’部分的固定的一組非可變罕見內切核酸酶位點(例如SnaB I、Not I、和Sal I)。這些非可變罕見內切核酸酶位點提供的停泊點，其由圖2中調控載體5’末端的三角形來表示；001705.可變MCS，包括對于該穿梭載體獨特的任何組的常見或罕見內切核酸酶位點；001716.限定3’調控模塊3’部分的固定組的非可變罕見內切核酸酶位點(例如Swa I、Rsr II、和BsiW I)。這些非可變罕見內切核酸酶位點提供了停泊點，其由圖2中調控載體3’末端的方框來表示；001727.能有效地在T3引物位點上游克隆穿梭載體模塊的非可變和獨特的非罕見內切核酸酶位點(例如BspE I)；001738.反向的T3引物位點；和
001749.兩個非可變和獨特的非罕見內切核酸酶位點，其限定了上述突變的pUC19載體的3’插入位點(例如Pmel I和Sap I)。
00175盡管本發明公開了在質粒克隆載體中構建轉基因的方法，使用相似的方法同樣可以在較大的染色體外DNA分子如粘粒或人工染色體，包括細菌人工染色體(BAC)中構建轉基因。為了用于植物中，也可以使用T1載體。可以整合入質粒克隆載體的廣泛種類的遺傳元件也允許將最終轉基因產物轉入廣泛種類的宿主生物中，而無需進一步的操作或者僅需很小的操作。
00176圖2和圖3是本發明模塊的一般圖示。如圖2中所示，有啟動子穿梭載體、表達穿梭載體、和3’調控穿梭載體中的每一個。在這些穿梭載體中的每一個插入元件的側翼都有專門用于產生停泊點的內切核酸酶限制性位點。更具體地，在圖2中，啟動子插入片段(P)的側翼在5’末端有用星號表示的第一組一種或多種內切核酸酶限制性位點，和在3’末端有用圓圈表示的第二組一種或多種內切核酸酶限制性位點；表達模塊的側翼在5’末端有用圓圈表示的第二組內切核酸酶限制性位點，和在3’末端有用三角表示的第三組一種或多種內切核酸酶限制性位點；和3’調控模塊(S)的側翼在5’末端有用三角表示的第三組內切核酸酶限制性位點，和在3’末端有用方框表示的第四組一種或多種內切核酸酶限制性位點。用對內切核酸酶識別位點特異性的內切核酸酶切割每一識別位點在每一個模塊的5’和3’末端產生粘性末端，如在圖2底部部分中通過虛線箭頭末端的插入片段所示。現在模塊可以與克隆載體質粒結合，該克隆載體質粒也已經在其兩個固定的停泊點被內切核酸酶切開，該內切核酸酶對第一組內切核酸酶限制性位點(以星號表示)和第四組內切核酸酶限制性位點(以方框表示)具有特異性。當模塊載體與克隆載體質粒一起放入適當的反應混合物時，每一個模塊載體的切割的粘性末端(以中空的星號、圓圈、三角和方框表示)將在質粒中自我定向，并且順序連接，切割的星號末端結合、切割的圓圈末端結合、切割的三角末端結合、以及切割的方框末端結合。這產生了圖3中所示的裝配成的骨架載體。進而，用星號、圓圈、三角和方框表示的組合的各組內切核酸酶位點中的每一組都可以再次用其相應的特異性內切核酸酶切開，這樣，以后特定的插入序列就可以被去除并用另一個感興趣的插入片段來替代。
00177多個骨架載體(例如PE3-1和PE3-2)可以被插入單個停泊質粒。當與BstX I內切核酸酶位點(5’CCANNNNN/NTGG 3’，其中‘N’可以是任何核苷酸)結合使用時，內切核酸酶如I-Sce I的突出尾的不對稱特性，如同與其它HE，產生強大的克隆工具。BstX I的序列-中性域可以用于生成與兩個反向的I-Sce I突出尾匹配的粘性末端，同時避免自我退火。用此方法，通過在BstX1/Sce1內切核酸酶位點切割質粒，第一插入片段，PE3-1，其末端具有I-Sce-1位點，可以被放入克隆載體質粒。然后使用者可以用I-Sce1將此質粒再次切開，并插入末端具有I-Sce-1位點的PE3-2。然后可以用PI-Sce I將此完整的骨架從其停泊質粒上切下，并插入到含有BstX I/PI-Sce I內切核酸酶位點的另一個停泊質粒中。該第二停泊質粒也含有PI-Sce I內切核酸酶的位點，在該位點中仍可以插入獨立的停泊質粒的另一個模塊，該模塊可能包含了PE3-3和PE3-4(未表示出)。以這種方式，研究者可以將更多信息導入一種細胞，即研究者可以將多個基因插入單個載體中，這之前未曾被本領域普通技術人員實現過。這樣的新方法可以為在本領域工作的研究人員節省費用和時間。
實施例00178實施例1PE3停泊質粒00179作為實踐本發明的方法的例子，可以構建含有這些元件的轉基因001801.表面活性蛋白C(SP-C)人類啟動子的核苷酸序列；
001812.編碼小鼠基因粒細胞-巨噬細胞集落-刺激因子受體βc(GMRβc)蛋白產物的序列；001823.兔β球蛋白內含子序列；和001834.SV40多聚A信號。
00184SP-C序列含有內部BamH 1位點，并可以僅用Not 1和EcoR1從其親本質粒中釋放出來。GMRβc具有內部Not 1位點，并可以用BamH 1和Xho 1從其親本質粒中切下來。兔β球蛋白內含子序列可以用EcoR 1從其親本質粒中切下來。SV-40多聚A尾可以用Xho 1和Sac 1從其親本質粒中切下來。因為幾種內切核酸酶位點的冗余，所以親本質粒中沒有一種可以用于裝配所有需要的片段。
00185在PE3停泊質粒發明中用于構建期望的轉基因的步驟如下001861.由于Not 1和PspOM 1產生相匹配的粘性末端，用Not 1和EcoR 1切割人類SP-C啟動子序列，并將其克隆入穿梭載體P的PspOM 1和EcoR 1位點。該反應的產物被稱為pSVP-SPC。
001872.經本領域普通技術人員所熟悉的擴增和回收步驟后，將兔β球蛋白內含子序列克隆入pSVP-SPC的EcoR 1位點中。通過對稱為pSVP-SPC-rβG的產物進行測序，來確定所產生的中間構建物中內含子的方向。
001883.作為一個連續片段，用AsiS 1和Asc 1從pSVP-SPC-rβG中切割并分離該啟動子及內含子。與此同時，PE3停泊質粒用AsiS 1和Asc 1切割，進行制備用于與該啟動子/內含子片段連接。將該啟動子/內含子片段連接入停泊質粒，擴增并回收。
001894.使用本領域普通技術人員所熟悉的技術，將GMRβc片段的Xho I位點補平以生成3’平末端。然后將其克隆入pSVP-SPC-rβG的BamH I位點和平末端的Pvu2位點。擴增和回收所得的質粒(pDP-SPC-GMRβc-rβG)。
001905.最后的克隆步驟是添加SV-40多聚A尾。用Xho1和Sac1切下SV-40多聚A片段，受體載體pDS1-SPC-GMRβc-rbβG用相同的酶切割。凝膠純化并回收兩種DNA片段。以10∶1摩爾比的SV-40多聚A與pDS1-SPC-GMRβc-rβG制備連接混合物。擴增并收集連接產物。新質粒pDS1-SPC-GMRββc-rβG-pA含有轉基因所需的所有元件，包括3’端獨特的內切核酸酶位點，用其可以將完整的pDS1-SPC-GMRβc-rβG-pA質粒線性化，以轉染入真核細胞或微注射入受精卵的原核中。
00191實施例2動態載體裝配00192以下實施例舉例說明了動態載體裝配001931.將來自人類細胞肥大病毒(CMV)的啟動子序列插入P穿梭載體(SVP)，該載體在5’和3’部分分別含有AsiS I和Ase I內切核酸酶位點。擴增質粒，并通過AsiS I和Asc I內切核酸酶消化反應從載體中切下該啟動子模塊并分離之。
001942.將編碼螢光素酶蛋白的序列插入表達穿梭載體(SVE)，該載體在5’和3’部分分別含有Asc I和Not I內切核酸酶位點。擴增質粒，并通過Asc I和Not I內切核酸酶消化反應從載體中切下該表達模塊并分離之。
001953.將編碼哺乳動物內含子和SV40多聚位點的序列插入3’調控穿梭載體(SV3)，該載體在5’和3’部分分別含有Not I和BsiWI內切核酸酶位點。擴增質粒，并通過Not I和BsiW I內切核酸酶消化反應從載體中切下該調控模塊并分離之。
001964.在啟動子模塊5’部分和調控模塊3’部分分別含有AsiS I和BsiW I內切核酸酶的停泊質粒中的內切核酸酶識別位點，用AsiS I和BsiW I內切核酸酶切割并分離之。
001975.該啟動子模塊、表達模塊和調控模塊與停泊載體質粒一起在連接反應混合物中結合。溫育2小時后，將連接反應混合物用于轉化大腸桿菌，然后將該大腸桿菌混合物涂布在帶氨芐青霉素的LB瓊脂平板上。將該培養板在37℃下溫育過夜。分離多個細菌菌落，并在各液體LB肉湯培養物中擴增。從每個LB肉湯培養物中分離該質粒DNA。通過內切核酸酶作圖分析該DNA，以確定來自每一菌落的質粒是否含有三種模塊插入片段(啟動子、表達和調控)。含三種模塊插入片段的質粒命名為轉基因pCMV-luc-SV40pA。它可以用I-Sce I內切核酸酶線性化，并注射入小鼠原核中以產生CMV-螢光素酶小鼠。在該實施例中的CMV啟動子指導螢光素酶基因在宿主生物如CMV-螢光素酶小鼠的所有組織中表達。
00198實施例3動態載體裝配的重新設計00199如果研究者現在希望優化表達模式以便螢光素酶僅在特定組織或細胞類型中表達，他或她可以快捷方便地用將提供限制性性表達模式的啟動子替換該CMV啟動子。下述實施例舉例說明了使用本發明來幫助快速重新設計pCMV-luc-pA002001.如同前面實施例中的啟動子模塊，將神經元-特異性啟動子，神經元-特異性烯醇化酶(NSE)插入P穿梭載體(SVP)并制備。
002012.用AsiS I和Asc I切割pCMV-luc-pA以去除CMV啟動子模塊。分離含有完整表達和調控模塊的剩余部分的停泊載體質粒。
002023.將NSE啟動子模塊與含完整表達和調控模塊的剩余部分的停泊載體質粒一起放入連接混合物。溫育2小時后，將新的連接混合物用于轉化大腸桿菌。將該大腸桿菌混合物涂布在帶氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，如同前面的實施例中所述的。第二天分離多個菌落，擴增，并從每個菌落分離質粒DNA。內切核酸酶作圖用于鑒定含期望NSE啟動子模塊的質粒。
00203實施例4大批轉基因
00204下列實施例是舉例說明了使用本發明來迅速裝配大批轉基因，其中每一轉基因包含啟動子模塊、表達模塊和調控模塊的不同組合。應用組合裝配，可以用一系列的六個穿梭載體和PE3停泊站載體產生八種不同的載體產物。這一系列六個穿梭載體由兩個P-穿梭載體(SVP)、兩個E-穿梭載體(SVE)和兩個3-穿梭載體(SV3)組成。兩個不連續的P-穿梭載體(SVP)含有人巨細胞病毒(VMV)啟動子或者小鼠SPC肺特異性啟動子，每一種啟動子分別在5’部分和3’部分具有AsiSI和Asc I內切核酸酶。兩個不連續的E-穿梭載體含有螢光素酶cDNA或EGFP cDNA，每一個分別在5’部分和3’部分具有Asc I和Not I內切核酸酶。兩個不連續的3-穿梭載體含有SV40多聚A信號或人生長激素(hGH)的3’調控區，每一個分別在5’部分和3’部分具有Not I和BsiW I內切核酸酶。
00205通過用AsiS I和Asc I內切核酸酶單獨消化合適的穿梭載體，啟動子模塊從它們各自的SVP穿梭載體中被釋放出來。對得到的限制性產物單獨進行凝膠電泳，對相應于合適的啟動子模塊的DNA條帶進行凝膠純化。此過程將產生CMV啟動子模塊或SCP啟動子模塊，它們在5’側連接有AsiS I突出端，在3’端連接有Asc I突出端。
00206通過用Asc I和Not I限制性內切核酸酶單獨消化合適的穿梭載體，表達模塊從它們各自的SVE穿梭載體中被釋放出來。對得到的限制性產物單獨進行凝膠電泳，對相應于合適的表達模塊的DNA條帶進行凝膠純化。此過程將產生螢光素酶表達模塊或EGFP表達模塊，它們在5’側連接有Asc I突出端，在3’端連接有Not I突出端。
00207通過用Not I和BsiW I限制性內切核酸酶單獨消化合適的穿梭載體，3’調控模塊從它們各自的SV3穿梭載體被釋放出來。對得到的限制性產物單獨進行凝膠電泳，對相應于合適的3’調控模塊的DNA條帶進行凝膠純化。此過程將產生SV40 3’調控模塊或hGH 3’調控模塊，它們在5’側連接有Not I突出端，在3’端連接有BsiW I突出端。
00208通過用AsiS I和BsiW I限制性核酸內切酶進行消化，制備PE3停泊站載體。為了幫助防止載體再次重新連接，將載體限制性消化物暴露于牛小腸磷酸酶(CIP)，37℃1小時。對得到的經CIP-處理的載體限制性產物進行凝膠電泳，對相應于線性化PE3載體骨架的DNA條帶進行凝膠純化。
00209通過在診斷性電泳凝膠上跑膠，分析來自7個生成的凝膠純化DNA片段的樣品的身份、完整性、純度和數量。有關純化的PE3停泊站載體和各個DNA模塊的相對豐度的定量數據被用來限定組合連接反應所需的每一組分的量。
00210當建立連接反應時，有兩種策略通常導致成功的結果。第一種策略是，建立連接反應混合物，其中插入片段與載體的比例約3∶1。第二種策略在將多于一個插入片段同時導入單個載體時應用，是導入欲被插入載體的等摩爾的每一遺傳組件。這可以通過將不同體積的模塊加入反應容器以便在連接反應混合物中獲得等量摩爾數來實現，或者也可以通過將中性緩沖液加入每一純化的模塊以便它們以摩爾比為基礎的濃度相等來實現。在本實施例中，經凝膠純化的載體和插入片段均已用緩沖液10mM Tris，pH8.0調節為摩爾等量。連接反應總體積設定為150微升。連接反應混合物由下列組分組成39微升的超純水、15微升的10×連接酶緩沖液、5微升純化的PE3載體骨架、15微升純化的CMV啟動子模塊、15微升純化的SPC啟動子模塊、15微升純化的螢光素酶表達模塊、15微升純化的EGFP表達模塊、15微升純化的SV40 3’調控模塊、15微升純化的hGH 3’調控模塊和1微升的連接酶。將得到的反應組分充分混合，隨后于16℃溫育過夜。
00211預測的載體連接產物包括下列
pCMV-EGFP-SV40pCMV-EGFP-hGHpCMV-螢光素酶-SV40pCMV-螢光素酶-hGHpSPC-EGFP-SV40pSPC-EGFP-hGHpSPC-螢光素酶-SV40pSPC-螢光素酶-hGH00212隨后用連接混合物轉化大腸桿菌，隨后將其鋪板在帶有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上。將平板在37℃溫育過夜。分離菌落并使其在單獨的液體LB肉湯培養物中繁殖。從每一LB肉湯培養物中分離質粒DNA。通過內切核酸酶繪圖分析DNA，以便確定整合入每一菌落的得到的載體的身份。
00213在前述實施例中，第一次組合過程期間不產生其中一種預測的載體產物(pCMV-EGFP-SV40)。然而，成功產生的一種載體(pCMV-螢光素酶-SV40)可以作為產生期望的pCMV-EGFP-SV40載體的載體骨架。這種技術稱為“二次途經裝配”。
00214實施例5二次途經裝配(Second Pass Assembly)00215為了構建期望的pCMV-EGFP-SV40載體，用Asc I和Not I消化實施例4中的pCMV-螢光素酶-SV40載體產物，用CIP處理，隨后進行凝膠純化。將該線性化的載體片段——其中螢光素酶模塊已經被去除——在含有EGFP模塊的連接混合物中溫育，EGFP模塊在前述組合載體裝配實施例中產生。
00216用連接混合物轉化大腸桿菌，隨后將其鋪板在帶有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上。將平板在37℃溫育過夜。分離菌落并將其在單獨的液體LB肉湯培養物中繁殖。從每一LB肉湯培養物中分離質粒DNA。通過內切核酸酶繪圖分析DNA，以便確定來自每一菌落的質粒是否含有EGFP插入片段。
00217在本發明的許多優勢中，可以容易地理解，可以在短時間內迅速地裝配大量轉基因，每一轉基因包括啟動子組件、表達組件和調控組件的不同組合，以及迅速地且容易地變化或重新設計新的裝配轉基因。在過去，用已知方法改變裝配的轉基因以創建大量不同的轉基因，每一轉基因具有不同的啟動子組件、表達組件和調控組件，這通常需要一年或更長的實驗室時間。應用本發明的方法，可以在數天或數周內制備出相同數目的期望的轉基因，隨后對每一轉基因進行期望的測試，從而為研究者節省了此前所需要的大量時間。進一步地，動態載體裝配以及上述的組合方法都可以被用于為研究者節省寶貴的時間和金錢，其中，在動態載體裝配中，每一啟動子插入片段、表達插入片段和調控插入片段可以被同時插入一個骨架中，而在上述的組合方法中，兩個P-穿梭載體、兩個E-穿梭載體和兩個調控穿梭載體全部組合起來，產生八種不同類型的轉基因。可以采用原來通過從頭合成、重組工程和PCR末端突出端克隆方法產生的穿梭載體，并與本發明的停泊點技術應用，以便迅速地將這些預先制備的元件組裝進大量的轉基因中。
00218雖然本發明已通過對實施方案的描述進行闡述，以及雖然對實施方案進行了詳細描述，但是這不意味著將所附權利要求的范圍約束或者以任何方式限制到如此詳細的范圍內。其它的優勢和修改對本領域技術人員將是顯而易見的。因此，本發明在其較寬方面不限于這些具體的細節、代表性的方法和結構，所示出和描述的示例性實施例。因此，可以對這些細節進行改變而不背離申請人總的發明思想的范圍和精神。
權利要求
1.構建轉基因的方法，包括步驟a.提供帶有骨架的克隆載體質粒，所述骨架能夠接受順序排列的插入片段；b.提供欲被包含在所述轉基因中的至少第一插入片段和第二插入片段；和c.在單一反應中將所述第一插入片段和所述第二插入片段轉入所述骨架中。
2.制備轉基因的方法，包括步驟a.提供包括第一停泊點和第二停泊點的克隆載體質粒；b.將欲被包含在所述轉基因中的第一核苷酸序列導入第一穿梭載體；c.將欲被包含在所述轉基因中的第二核苷酸序列導入第二穿梭載體；和d.將所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列同時從所述穿梭載體轉入所述克隆載體質粒中的所述第一停泊點和所述第二停泊點之間。
3.制備轉基因的方法，包括步驟a.提供包括第一停泊點和第二停泊點的克隆載體質粒；b.將欲被包含在所述轉基因中的啟動子核苷酸序列導入啟動子穿梭載體；c.將欲被包含在所述轉基因中的表達核苷酸序列導入表達穿梭載體；d.將欲被包含在所述轉基因中的調控核苷酸序列導入調控穿梭載體；和e.將所述啟動子核苷酸序列、所述表達核苷酸序列和所述調控核苷酸序列同時從所述啟動子穿梭載體、所述表達穿梭載體和所述調控穿梭載體轉入所述克隆載體質粒中的所述第一停泊點和所述第二停泊點之間。
4.同時合成大批轉基因的方法，包括步驟a.提供包含第一停泊點和第二停泊點的初級克隆載體質粒；b.將欲被包含在所述轉基因中的至少一個啟動子核苷酸序列導入相應的啟動子穿梭載體；c.將欲被包含所述在轉基因中的至少一個表達核苷酸序列導入相應的表達穿梭載體；d.將欲被包含在所述轉基因中的至少一個調控核苷酸序列導入相應的調控穿梭載體；和e.將所述啟動子核苷酸序列、所述表達核苷酸序列和所述調控核苷酸序列從所述啟動子穿梭載體、所述表達穿梭載體和所述調控穿梭載體同時轉入所述克隆載體質粒中的所述第一停泊點和所述第二停泊點之間；f.其中一個啟動子模塊、一個表達模塊和一個調控模塊的至少兩種組合被轉入兩個不同的初級克隆載體分子中。
5.制備用于合成轉基因或其它復雜DNA構建物的模塊克隆載體質粒的方法，所述方法包括步驟a.提供包含骨架的所述克隆載體質粒，所述骨架包含第一停泊點和第二停泊點，每一停泊點被安裝在所述骨架中并包含內切核酸酶的至少一個非可變的罕見內切核酸酶位點；b.用與所述第一停泊點的所述至少一個非可變的罕見限制位點相對應的第一內切核酸酶切割所述第一停泊點，留下帶有3’末端的經切割的第一停泊點；c.用與所述第二停泊點的所述至少一個非可變的罕見內切核酸酶位點相對應的第二核酸酶切割所述第二停泊點，留下帶有5’末端的經切割的第二停泊點；d.提供至少第一插入片段和第二插入片段，每一插入片段包括5’末端、感興趣的核苷酸序列和3’末端，其中所述第一插入片段的5’末端與所述經切割的第一停泊點的3’末端相匹配，所述第二插入片段的3’末端與所述經切割的第二停泊點的5’末端相匹配；所述第一插入片段的3’末端與所述第二插入片段的5’末端相匹配，形成第三內切核酸酶的第三非可變的罕見內切核酸酶位點；和e.將所述插入片段和所述被切割的克隆載體質粒放置在合適的反應混合物中，引起所述第一插入片段和所述第二插入片段在所述骨架中的所述第一停泊點和所述第二停泊點之間同時發生連接反應和自我定向，重新形成所述第一停泊點和所述第二停泊點，并形成所述模塊克隆載體質粒。
6.權利要求5所述的方法，其提供用于修飾所述模塊克隆載體質粒，還包括步驟f.隨后，通過用所述第一內切核酸酶和所述第三內切核酸酶在所述第一停泊點和所述第三非可變的罕見內切核酸酶位點對所述模塊克隆載體質粒進行切割，去除所述第一插入片段，在所述被切割的第一停泊點留下3’末端，在所述被切割的第三內切核酸酶位點留下5’末端；g.提供包括5’末端、感興趣的核苷酸序列和3’末端的第三插入片段，其中所述第三插入片段的5’末端與所述被切割的第一停泊點的3’末端相匹配，所述第三插入片段的3’末端與所述被切割的第三內切核酸酶位點的5’末端相匹配；和h.將所述第三插入片段和所述被切割的模塊克隆載體質粒放置在合適的反應混合物中，引起所述第三插入片段在所述第一停泊點和所述第三內切核酸酶位點之間同時發生連接反應和自我定向，并重新形成所述第一停泊點和所述第三內切核酸酶位點。
7.權利要求5所述的方法，其提供用于修飾所述模塊克隆載體質粒，還包括步驟i.隨后，通過用所述第二內切核酸酶和所述第三內切核酸酶在所述第一停泊點和所述第三非可變的罕見內切核酸酶位點對所述模塊克隆載體質粒進行切割，去除所述第二插入片段，在所述被切割的第三內切核酸酶位點留下3’末端，在所述被切割的第二停泊點留下5’末端；j.提供包括5’末端、感興趣的核苷酸序列和3’末端的第四插入片段，其中所述第四插入片段的5’末端與所述被切割的第三內切核酸酶位點的3’末端相匹配，所述第四插入片段的3’末端與所述被切割的第二停泊點的5’末端相匹配；和k.將所述第四插入片段和所述被切割的模塊克隆載體質粒放置在合適的反應混合物中，引起所述第四插入片段在所述第三內切核酸酶位點和所述第二停泊點之間同時發生連接反應和自我定向，并重新形成所述第三內切核酸酶位點和所述第二停泊點。
8.權利要求5所述的方法，其中所述插入片段是通過選自從頭合成、重組工程和PCR末端突出端克隆的方法產生的。
9.用于合成轉基因或其它復雜DNA構建物的方法，包括步驟a.提供包含骨架的初級克隆載體質粒，所述骨架包括至少第一停泊點和第二停泊點，每一停泊點被安裝在所述骨架中并包含非可變的罕見限制性內切核酸酶的至少一個罕見限制性位點；b.用與所述第一停泊點的其中一個所述罕見限制性位點相對應的第一非可變的罕見限制性內切核酸酶切割所述第一停泊點，留下帶有3’末端的被切割的骨架；c.用與所述第二停泊點的其中一個所述限制性位點相對應的第二非可變的罕見限制性酶切割所述第二停泊點，留下帶有5’末端的被切割的骨架；d.提供啟動子插入片段，其包括感興趣的啟動子序列、與所述第一停泊點的3’末端相匹配的5’末端，和3’末端；e.提供表達插入片段，其包括感興趣的表達序列、與所述啟動子插入片段的3’末端相匹配以形成第三非可變的罕見限制性酶的罕見限制性位點的5’末端，和3’末端；f.提供調控插入片段，其包括感興趣的調控序列、與所述表達插入片段的3’末端相匹配而形成第四非可變的罕見限制性酶的罕見限制性位點的5’末端，和與在步驟‘c’中被切割的所述被切割的第二停泊點的5’末端相匹配的3’末端；和g.將所述啟動子插入片段、所述表達插入片段和所述調控插入片段和所述被切割的克隆載體質粒放置在合適的反應混合物中，引起所述啟動子插入片段、所述表達插入片段和所述調控插入片段在所述第一停泊點和所述第二停泊點之間同時進行連接、自我定向和順序放置，重新形成所述第一停泊點和所述第二停泊點，和形成模塊式初級克隆載體質粒。
10.權利要求9所述的方法，其提供用于修飾所述模塊式初級克隆載體質粒，還包括步驟h.在所述啟動子插入片段、所述表達插入片段和所述調控插入片段中的至少其中之一的相應的一對罕見限制性位點對處，用一對罕見限制性酶切割所述模塊式初級克隆載體質粒，留下帶有3’末端和5’末端的被切割的載體質粒；i.提供選自啟動子插入片段、表達插入片段和調控插入片段的至少一個第五插入片段，所述第五插入片段具有與所述被切割的載體質粒的所述3’末端相匹配的5’末端，和與所述被切割的載體質粒的所述5’末端相匹配的3’末端；和j.將所述第五插入片段和所述被切割的載體質粒放置在合適的反應混合物中，引起所述第五插入片段以相同的順序同時連接入所述模塊式初級克隆載體質粒并自我定向，重新形成所述的一對罕見限制性位點。
11.權利要求10所述的方法，還包括重復步驟h、i和j的步驟，用于插入選自啟動子插入片段、表達插入片段和調控插入片段的一個或多個附加插入片段。
12.用于同時合成大批轉基因或其它復雜DNA構建物的方法，包括步驟a.提供至少一個包含骨架的初級克隆載體質粒，具有5’末端、感興趣的核苷酸序列和3’末端的插入片段可以被插入到所述骨架中，所述骨架可操作性地接受順序排列的啟動子插入片段、表達插入片段和調控插入片段，并且包含至少一個第一停泊點和第二停泊點，每一停泊點被安裝在所述骨架中并包含非可變的罕見限制性酶的至少一個限制性位點；b.用相應于所述第一停泊點的其中一個限制性位點的第一非可變的罕見限制性酶切割所述第一停泊點；c.用相應于所述第二停泊點的其中一個限制性位點的第二非可變的罕見限制性酶切割所述第二停泊點；d.提供已插入了啟動子核苷酸序列的至少一個啟動子插入片段，所述至少一個啟動子插入片段的5’末端與在步驟‘b’中被切割的所述第一停泊點的3’末端相匹配；e.提供已插入了表達核苷酸序列的至少一個表達插入片段，所述至少一個表達插入片段的5’末端與所述至少一個啟動子插入片段的3’末端相匹配，形成第三非可變的罕見限制性酶的限制性位點；f.提供已插入了調控核苷酸序列的至少一個調控插入片段，所述至少一個調控插入片段的5’末端與所述至少一個表達插入片段的3’末端相匹配，形成第四非可變的罕見限制性酶的限制性位點；所述至少一個調控插入片段的3’末端與在步驟‘c’中被切割的所述第二停泊點的5’末端相匹配；和g.然后將至少兩種不同類型的至少一個啟動子插入片段、表達插入片段和調控插入片段，每一剩余插入片段中的至少一個，和被切割的克隆載體質粒放置在合適的反應混合物中，引起啟動子插入片段、表達插入片段和調控插入片段中的每一種中的一個在所述骨架中的所述第一停泊點和所述第二停泊點之間同時進行連接、自我定向和順序放置，從而產生在其骨架中具有啟動子插入片段、表達插入片段和調控插入片段的不同組合的大批質粒。
13.權利要求12所述的方法，其中步驟‘g’包括，將至少兩種不同類型的至少兩個所述啟動子插入片段、表達插入片段和調控插入片段，每一剩余插入片段中的至少一個，和被切割的克隆載體質粒放置在合適的反應混合物中，引起所述啟動子插入片段、所述表達插入片段和所述調控插入片段中的每一種中的一個在所述骨架中的所述第一停泊點和所述第二停泊點之間同時進行連接、自我定向和順序放置，從而產生在其骨架中具有啟動子插入片段、表達插入片段和調控插入片段的不同組合的大批質粒。
14.權利要求12所述的方法，其中步驟‘g’包括，將至少兩種不同類型的每一所述啟動子插入片段、表達插入片段和調控插入片段，和被切割的克隆載體質粒放置在合適的反應混合物中，引起所述啟動子插入片段、所述表達插入片段和所述調控插入片段中的每一種中的一個在所述骨架中的所述第一停泊點和所述第二停泊點之間同時進行連接、自我定向和順序放置，從而產生在其骨架中具有啟動子插入片段、表達插入片段和調控插入片段的不同組合的大批質粒。
15.權利要求12、13或14所述的方法，其提供用于修飾模塊式初級克隆載體質粒，還包括步驟h.用高通量篩選分析步驟‘g’的產物；i.分離步驟‘g’的特定產物，所述產物是初級克隆載體質粒；j.用相應的罕見限制性酶對，在啟動子插入片段、表達插入片段和調控插入片段之一的5’末端和3’末端，切割來自步驟‘i’的初級克隆載體質粒的骨架；k.提供第六插入片段，所述第六插入片段的5’末端與在步驟‘j’中被切割的所述骨架的所述3’末端相匹配，所述第六插入片段的3’末端與在步驟‘j’中被切割的所述骨架的5’末端相匹配；和l.其后，將所述第六插入片段和在步驟‘j’中被切割的所述骨架放置在合適的反應混合物中，引起所述第六插入片段同時連接入所述骨架中并在其中自我定向。
16.權利要求13所述的方法，還包括重復步驟h、i、j、k和l的步驟，用于任意數目的插入片段，目的是用另一個插入片段順序替代一個插入片段進入所述骨架。
17.權利要求13所述的方法，其中所述插入片段是通過選自從頭合成、重組工程、PCR、末端突出端克隆技術和限制性內切核酸酶作圖的方法產生的。
18.權利要求5、9或12中的任一項所述的方法，其中所述骨架還包括位于所述第一停泊點的5’末端上游的正向獨特的HE位點和位于所述第二停泊點的3’末端下游的反向獨特的HE位點，所述方法還包括步驟m.用獨特的HE限制性酶在每一所述獨特HE位點處切割所述骨架；n.純化含有所述插入片段的所述被切割部分；和o.將所述被切割的部分插入感興趣的宿主基因組中。
全文摘要
使用克隆載體質粒，在單一步克隆步驟中制備DNA分子如轉基因的方法。該轉基因可用于基因表達和基因表達分析。根據載體的最終用戶和他們的使用方法，對該質粒克隆載體進行人工改造，以使DNA片段組分的操作量最小化。使用本發明制備的轉基因可用在一種生物或多種生物中，包括細菌、酵母、小鼠和其它經過微小的或沒有經過進一步修飾的真核生物。
文檔編號C12N15/09GK1981047SQ200580014945
公開日2007年6月13日 申請日期2005年5月18日 優先權日2004年5月18日
發明者托馬斯·D.·里德 申請人:英特拉克森公司