Hpv52l1在酵母中的優化表達的制作方法

專利名稱：Hpv52 l1在酵母中的優化表達的制作方法
技術領域：
一般而言，本發明涉及對人乳頭瘤病毒(HPV)感染的預防和/或治療。更具體地，本發明涉及編碼HPV 52L1蛋白的合成多核苷酸，涉及包含所述多核苷酸的重組載體和宿主。本發明還涉及HPV 52病毒樣顆粒(VLPs)，其中，所述VLPs是通過將重組HPV 52L1或L1+L2在酵母細胞中表達來產生的，本發明還涉及所述顆粒在用于預防和治療HPV感染的疫苗或藥物組合物中的用途。
背景技術：
目前有超過80種的人乳頭瘤病毒(HPV)，其中很多與多種不同的生物表型相關，從良性增生疣到惡性癌癥(綜述參見，McMurray etal.，Int.J.Exp.Pathol.82(1)15-33(2001))。HPV6和HPV11是與良性疣、非惡性尖銳濕疣和/或生殖器或呼吸道粘膜的低危性異常(low-grade dysplasia)最常見相關的種類。HPV16和HPV18則是與宮頸、陰道、外陰、肛管的原位和侵入性癌癥最頻繁相關的高風險種類。宮頸癌中超過90％都與HPV16、HPV18或較少流行的致癌(oncogenic)種類HPV 31、33、45、52和58相關(Schiffman et al.，J.Natl.CancerInst.85(12)958-64(1993))。在90-100％的宮頸癌中檢測到HPVDNA這一現象，為HPV導致宮頸癌提供了強有力的流行病學證據(見，Bosch et al.，J.Clin.Pathol.55244-265(2002))。
乳頭瘤病毒是小的(50-60nm)、無包被的、二十面體DNA病毒，其編碼多達八個早期基因和兩個晚期基因。病毒基因組的開放讀碼框(ORFs)被命名為E1至E7以及L1和L2，其中，“E”指早期，“L”指晚期。L1和L2編碼病毒衣殼蛋白，而E基因則與病毒復制和細胞轉化等功能相關。
L1蛋白是主要的衣殼蛋白，其分子量為55-60kDa。L2蛋白是次要的衣殼蛋白。免疫學數據表明，在病毒衣殼中，L2蛋白的大多數在L1蛋白內部。不同乳頭瘤病毒中，L1和L2蛋白都是高度保守的。
L1蛋白或L1和L2蛋白的組合在酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞或細菌中的表達導致了病毒樣顆粒(VLPs)的自裝配(綜述參見Schillerand Roden，in Papillomavirus Reviewscurrent Research onPapillomaviruses；Lacey，ed.Leeds，UKLeeds Medical Information，pp101-12(1996))。VLPs在形態上與真的病毒類似，施予動物或人時，其能誘導高效價的中和抗體。因為VLPs不含可能致瘤的病毒基因組，它們能安全地替代在HPV疫苗開發中使用活病毒的方法(綜述參見，Schiller and Hidesheim，J.Clin.Virol.1967-74(2000))。就該理由而言，L1和L2基因已被鑒定為用于開發針對HPV感染和疾病的預防和治療用疫苗的免疫目標。
HPV疫苗的開發和商業化被下述困難所阻礙，所述困難與在成功轉化的宿主生物中獲得衣殼蛋白的高表達水平相關，這限制了對純化蛋白的生產。因此，雖然鑒定出了編碼HPV L1蛋白(例如，HPV 52 L1蛋白)的野生型核苷酸序列，但人們仍非常需要開發出容易更新的粗制HPV L1蛋白來源，其能利用在目標宿主細胞中的表達被優化的、編碼HPV 52 L1蛋白的核苷酸序列。此外，制造出大量HPV 52 L1 VLPs用于疫苗開發也將是有用的，所述VLPs具有天然蛋白賦予免疫的性質。

發明內容
本發明涉及組合物和方法，用于誘導出或增強對HPV 52 L1基因表達的蛋白產物的免疫性。具體而言，本發明提供了編碼HPV 52 L1蛋白的多核苷酸，其中，已針對在酵母細胞中高水平的表達對所述多核苷酸進行了密碼子優化。在本發明的替代性實施方式中，該多核苷酸的核酸序列被改造，去掉了被酵母識別的轉錄終止信號。本發明還提供了HPV 52病毒樣顆粒(VLPs)，其中，所述VLPs是通過在酵母細胞中表達重組HPV 52 L1或L1+L2來制造的，本發明還公開了HPV 52 VLPs在用于預防和/或治療HPV疾病和HPV相關癌癥的免疫原性組合物和疫苗中的用途。
本發明涉及編碼HPV 52 L1蛋白的合成DNA分子。合成分子的密碼子被設計以使用酵母細胞優選的密碼子。在本發明的一種替代性實施方式中，合成分子的核苷酸序列被改造，去掉了被酵母識別的轉錄終止信號。合成分子可被用作為HPV 52 L1蛋白的來源，其可以自裝配為VLPs。所述VLPs可被用于基于VLP的疫苗。
本發明的一種示例性實施方式包含編碼如SEQ ID NO2所示的HPV 52 L1蛋白的合成核酸分子，所述核酸分子包含核苷酸序列，已針對在酵母細胞中的高水平表達對所述序列進行了密碼子優化。
本發明還提供了重組載體和原核及真核的重組宿主細胞，其中含有本說明書公開的核酸分子。在本發明的一種優選的實施方式中，宿主細胞是酵母細胞。
本發明還涉及一種在重組宿主細胞中表達HPV 52 L1蛋白的方法，所述方法包括(a)將包含編碼HPV 52 L1蛋白的核酸的載體引入到酵母宿主細胞中；以及(b)在能使所述HPV 52 L1蛋白表達的條件下培養所述酵母宿主細胞。
本發明進一步涉及一種在重組宿主細胞中表達HPV 52 L1蛋白的方法，所述方法包括(a)將包含編碼HPV 52 L1蛋白的核酸的載體引入到酵母宿主細胞中；其中，已針對在酵母宿主細胞中的最優表達對所述核酸分子進行了密碼子優化；(b)在能使所述HPV 52 L1蛋白表達的條件下培養所述酵母宿主細胞。
在優選的實施方式中，核酸分子包含如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列(在本文中被稱為“52 L1 R序列”)。
本發明還涉及HPV 52病毒樣顆粒(VLPs)，其被制造于酵母細胞中，本發明還涉及制造HPV 42 VLPs的方法以及使用HPV 52 VLPs的方法。
在本發明的一種優選的實施方式中，酵母選自由Saccharomycescerevisiae、Hansenula polymorpha、Pichia pastoris、Kluyvermycesfragilis、Kluyveromyces lactis和Schizosaccharomyces pombe所構成的組。
本發明的另一方面是HPV 52 VLP，其中，所述VLP是通過在酵母細胞中對HPV 52 L1或HPV 52 L1+L2進行重組表達來制造的。
本發明的又一方面是HPV 52 VLP，其包含由經過密碼子優化的HPV 52 L1基因生產的HPV 52 L1蛋白。在本發明的這方面的一種示例性實施方式中，經過密碼子優化的HPV 52 L1基因包含如SEQ IDNO1所示的核苷酸序列。
本發明還提供了一種方法，用于在動物中誘導免疫應答，所述方法包括將HPV 52病毒樣顆粒施予動物。在一種優選的實施方式中，HPV 52 VLPs是通過經過密碼子優化的基因制造的。
本發明的又一個方面是預防或治療HPV相關宮頸癌的方法，所述方法包括，向哺乳動物施予包含HPV 52 VLPs的疫苗。在本發明的這方面的一種優選實施方式中，HPV 52 VLPs是在酵母中制造的。
本發明還涉及一種疫苗，其中包含HPV 52病毒樣顆粒(VLPs)，其中，所述HPV 52 VLPs是在酵母中制造的。
在本發明的這方面的一種替代性實施方式中，所述疫苗還包含至少一種其它HPV類型的VLPs。所述至少一種其它HPV類型可以是任何感興趣的HPV類型，包括本領域中已描述的或今后鑒定出來的任何HPV類型。在一種優選的實施方式中，HPV類型是臨床表型，例如疣或宮頸癌相關的類型。在另一種優選的實施方式中，所述至少一種其它HPV類型選自由HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59和HPV68所構成的組。
本發明還涉及包含HPV 52病毒樣顆粒的藥物組合物，其中，HPV52 VLPs是在酵母中制造的。此外，本發明涉及包含HPV 52 VLPs和至少一種其它HPV類型的VLPs的藥物組合物。在一種優選的實施方式中，所述至少一種其它HPV類型選自由HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59和HPV68所構成的組。
如無其它明確說明，本說明書和所附權利要求中使用的單數形式的詞語“a”、“an”和“the”包括復數形式。
在本說明書和所附權利要求中，應用了下述定義和縮寫術語“啟動子”指，DNA鏈上結合RNA聚合酶的識別位點。啟動子與RNA聚合酶形成起始復合體，用于起始并驅動轉錄活性。通過稱為“增強子”或“上游激活序列”的激活序列，或稱為“沉默子”的抑制序列，可對該復合體加以修飾。
術語“載體”指一些工具(means)，通過其可將DNA片段引入到宿主生物或宿主組織中。有多種類型的載體，包括質粒、病毒(包括腺病毒)、細菌噬菌體和粘粒。
術語“盒”指，將從載體中表達的核苷酸或基因序列，例如，編碼HPV 52 L1蛋白的核苷酸或基因序列。通常，所述的盒包含插入到載體中的基因序列，在一些實施方式中，所述載體提供用于表達核苷酸或基因序列的調控序列。在其它實施方式中，所述核苷酸或基因序列為其自己的表達提供調控序列。在另外的實施方式中，載體提供一些調控序列，所述核苷酸或基因序列提供其它調控序列。例如，載體可以提供用于轉錄核苷酸或基因序列的啟動子，所述核苷酸或基因序列提供轉錄終止序列。可由載體提供的調控序列包括但不限于，增強子、轉錄終止序列、剪接受體和供體序列、內含子、核糖體結合序列和poly(A)添加序列。
名稱“52 L1野生型序列”和“52 L1 wt序列”指本文中作為SEQID NO3公開的HPV 52 L1序列。雖然HPV 52 L1野生型序列以前已被描述過，但是發現從臨床分離物中獲得的DNA之間的細微序列差異并不罕見。因此，從以前顯示含有HPV 52 DNA的臨床樣品中分離出了具有代表性的HPV 52 L1野生型序列(見實施例1)。HPV 52 L1野生型序列被用作為對照序列，以對本文公開的經過密碼子優化的HPV 52 L1序列加以比較(見圖1)。
名稱“HPV 52 L1 R”和“52 L1 R”指，本文公開的示例性的合成HPV52 L1核苷酸序列(SEQ ID NO1)，其中，所述序列被重構(rebuilt)，使得其中包含酵母細胞高水平表達所優選的密碼子。
術語“有效量”指，足夠的疫苗組合物被引入，以產生足夠水平的多肽，使得產生免疫應答。本領域技術人員知道，該水平是可以變化的。
“保守氨基酸序列”指，一個氨基酸殘基被另一個化學上相近的氨基酸殘基代替。此類保守取代的例子是一個疏水殘基(異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸或甲硫氨酸)取代另一個；一個極性殘基取代另一個具有相同電荷的極性殘基(例如，精氨酸取代賴氨酸；谷氨酸取代天冬氨酸)。
術語“哺乳動物”指，任何哺乳動物，包括人。
“VLP”或“VLPs”指病毒樣顆粒或多種病毒樣顆粒。
“合成”指，制造HPV 52 L1基因，使得其含有的核苷酸序列與指定的天然存在的野生型HPV 52 L基因(52 L1 wt，SEQ ID NO3)中存在的核苷酸序列不相同。如上所述，本文中提供了合成分子，其中包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含針對酵母細胞表達優選的密碼子。本文提供的合成分子編碼與野生型HPV 52 L1基因(SEQ IDNO2)相同的氨基酸序列。


圖1展示了序列比對情況，其中比較了本發明的合成HPV 52 L1基因(SEQ ID NO1，被表示為“52 L1 R”)(見實施例2)中改變的核苷酸。對照序列是52 L1野生型序列(SEQ ID NO3，被表示為“52 L1 wt”，見實施例1)。被改變的核苷酸在其相應位置被示出。圓括號中包含了核苷酸編號。在52 L1重構序列中相同的核苷酸以圓點表示。
圖2展示了重構的合成HPV 52 L1雙鏈核酸(SEQ ID NO1和7)和單字母密碼氨基酸序列(SEQ ID NO2)。核苷酸編號被表示在左邊。
圖3展示了HPV 52 L1 wt和HPV 52 L1 R轉錄子的Northern雜交印跡(見實施例4)。該印記是用針對52 L1 wt和52 L1 R序列制造的DNA探針來檢測的。右邊的箭頭顯示了全長52 L1轉錄子的預測位置。在52 L1 wt RNA的5和10μg泳道上，沒有探測到任何長度的轉錄子。全長轉錄子在5和10μg泳道的52 L1 R上是明顯的。
圖4展示了HPV 52 L1 wt(52wt)和52 L1 R(52R)蛋白的Western雜交印跡。HPV 16 L1被包括進去，用作為對照(16)。使10、5和2.5微克的總酵母蛋白提取物變性，將其應用到10％SDS-PAGE凝膠上。蛋白是通過Western轉移的。用酵母吸收的(yeast-absorbed)抗-trpE-HPV 31 L1山羊多克隆抗血清(與HPV 52 L1和HPV 16 L1交叉反應)，在得到的雜交印跡上探測到了HPV 52 L1蛋白。分子量標記以kDa表示在左邊。箭頭表示了～55kDa的HPV 52 L1蛋白的位置。
圖5展示了本文所述的HPV 52 L1 R蛋白分子組成的HPV 52VLPs代表性樣品，可通過透射電子顯微鏡(見實施例7)看到。該粗制樣品中球形顆粒的直徑在40至70nm的范圍內，一些顆粒展示出衣殼體的有序排列。橫線代表大約0.1μm。
發明詳述大部分宮頸癌與人乳頭瘤病毒(HPV)的特定致癌類型的感染相關。本發明涉及組合物和方法，用于誘導出或增強對致癌HPV類型的基因表達的蛋白產物的免疫性。具體而言，本發明提供了編碼HPV 52L1的多核苷酸，其中，已針對在酵母細胞中高水平的表達對所述多核苷酸進行了密碼子優化。本發明還提供了HPV 52病毒樣顆粒(VLPs)，其是在酵母中制造的，本發明公開了所述多核苷酸和VLPs在用于預防和/或治療HPV相關癌癥的免疫原性組合物和疫苗中的用途。
野生型HPV 52 L1核苷酸序列已被報道過(Genbank編號NC001592)。本發明提供了編碼HPV 52 L1蛋白的合成DNA分子。在本發明的一個方面，合成分子包含密碼子序列，其中，對密碼子中的至少一些進行了改造，使用了酵母細胞高水平表達的優選密碼子。在本發明的另一方面，合成分子的核苷酸序列被改造，去掉了被酵母細胞識別的轉錄終止信號。合成分子可被用作為編碼序列，用于表達HPV52 L1蛋白，所述蛋白可以自裝配為VLPs。所述VLPs可以用于基于VLP的疫苗，以通過中和抗體和細胞介導的免疫性，提供針對乳頭瘤病毒感染的有效免疫預防。此類基于VLP的疫苗還可用于治療已經發生的HPV感染。
HPV VLPs在酵母細胞中的表達提供了如下優點具有成本效益，并且容易在發酵罐中進行大規模培養。此外，可以容易地對酵母基因組加以改造，以確保選出生長和表達潛能被提高的重組轉化酵母。但是，很多HPV L1蛋白，包括HPV 52 L1，在酵母細胞中表達的水平低于商業規模需要的水平(見實施例2)。
因此，本發明涉及針對在酵母細胞內環境高水平表達“優化”過的HPV 52 L1基因序列。
四種可能的核苷酸堿基的“三聯”密碼子可以以超過60種不同的形式存在。因為這些密碼子僅針對20種不同的氨基酸(以及轉錄起始和終止)提供信息，一些氨基酸可被超過一種密碼子所編碼，這種現象被稱為密碼子冗余。因為未能完全理解的原因，在不同種類細胞的內源DNA中，可互相代替的密碼子卻不是呈平均狀態存在的。事實上，在某些類型的細胞中存在對某些密碼子不同的自然序位(hierarchy)或“偏好”。例如，氨基酸亮氨酸就可由六種DNA密碼子所代表，包括CTA、CTC、CTG、CTT、TTA和TTG。對微生物基因組密碼子使用頻率的詳細分析揭示，E.coli的內源DNA最通常含有CTG亮氨酸指定密碼子，而酵母和粘菌的DNA則最通常包括TTA亮氨酸指定密碼子。從該序位的角度，通常相信，通過E.coli宿主獲得富含亮氨酸的多肽的高水平表達的可能性將在一定程度上取決于密碼子使用頻率。例如，富含TTA密碼子的基因可能在E.coli中很少表達，而富含CTG的基因將可能在該宿主中高度表達。類似地，用于在酵母宿主細胞中表達富含亮氨酸的多肽的優選密碼子是TTA。
密碼子偏愛現象對于重組DNA技術的意義是明顯的，該現象可以用于解釋以前在成功轉化的宿主生物中獲得高水平表達的外源基因的很多失敗——“優選”程度更低的密碼子可能重復出現于插入基因之中，而宿主細胞用于表達的機制卻可能無法有效操作。該現象暗示，對于重組蛋白質表達的實踐來說，被設計為包括進預計宿主細胞的優選密碼子的合成基因提供了外源遺傳材料的最優形式。因此，本發明的一個方面是針對在酵母細胞中高水平表達進行過密碼子優化的HPV52 L1基因。在本發明的一種優選實施方式中，已經發現，使用編碼相同蛋白序列的替代性密碼，可以去除通過酵母細胞表達HPV 52 L1蛋白的障礙。
根據本發明，HPV 52 L1基因片斷被轉化為具有相同翻譯后序列，但是具有如Sharp and Cowe(synonymous Codon Usage inSaccharomyces cerevisiae.Yeast 7657-678(1991))所述的替代性密碼子使用的序列，該文獻通過引用并入本文。該方法通常包括鑒定出野生型序列中通常與高度表達的酵母基因不相關的密碼子，用用于在酵母細胞中高度表達的優化密碼子代替它們。然后針對這些密碼子替換產生的不想要序列，對新的基因序列加以檢查(例如，“ATTTA”序列，無意中產生的內含子剪接識別位點，不想要的限制性酶位點，高GC含量，被酵母識別的轉錄終止信號的存在等)。通過用編碼同樣氨基酸的不同密碼子去取代現有的密碼子，來去除不想要的序列。然后針對表達的增加對合成基因片斷加以檢驗。
上述方法被用于制造HPV 52 L1的合成基因片斷，得到了包含針對高水平表達優化過的密碼子的基因。雖然上述方法提供了對我們所用的、設計用于HPV疫苗的密碼子優化基因的方法的概述，但是本領域技術人員應當理解，對該過程的小改動或序列的小改動，也能獲得類似的疫苗效果或增加的基因表達。
因此，本發明涉及一種合成多核苷酸，其中包含編碼HPV 52 L1蛋白或者HPV 52 L1蛋白的具有生物活性的片段或突變形式的核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含針對在酵母宿主細胞中表達進行過優化的密碼子。HPV 52 L1蛋白的所述突變形式包括但不限于，保守氨基酸取代、氨基末端截短、羧基末端截短、刪除或添加。任何此類具有生物活性的片段和/或突變都能編碼下述蛋白或蛋白片段，所述蛋白或片段至少能基本模擬如SEQ ID NO2示出的HPV 52 L1蛋白的免疫性質。本發明的合成多核苷酸編碼表達功能性HPV 52 L1蛋白的mRNA分子，因此可用于開發治療或預防用的HPV疫苗。
本發明的一個方面是經過密碼子優化的核酸分子，其編碼如SEQID NO2所示的HPV 52 L1蛋白，所述核酸分子包含針對在酵母細胞中高水平表達進行過密碼子優化的核苷酸序列。在本發明的這方面的一種優選的實施方式中，所述核酸分子包含如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
本發明還涉及重組載體和原核及真核重組宿主細胞，其中含有本說明書公開的核酸分子。在本發明的一種優選的實施方式中，宿主細胞是酵母宿主細胞。
通過本文所述的方法構建的合成HPV 52 L1 DNA、其功能等同物及其片段可以重組表達，這是通過分子克隆進表達載體來實現的，所述表達載體中含有合適的啟動子和其它合適的轉錄調控元件。所述表達載體可以被轉移到原核或真核宿主細胞中，產生重組的HPV 52 L1蛋白。用于此類操作的技術在本領域內有完善的描述(Sambrook et al.Molecular CloningA Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1989)；Current Protocolsin Molecular Biology，Ausubel et al，Green Pub.Associates and Wiley-Interseience，New york(1988)；Yeast GeneticsA Laboratory CourseManual，Rose et al.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York，(1990)，上述文獻通過引用被全部并入本文)。
因此，本發明涉及在重組宿主細胞中表達HPV 52 L1蛋白的方法，所述方法包括(a)將包含編碼HPV 52 L1蛋白的核酸的載體引入到酵母宿主細胞中；以及(b)在能使所述HPV 52 L1蛋白表達的條件下培養所述酵母宿主細胞。
本發明還涉及一種在重組宿主細胞中表達HPV 52 L1蛋白的方法，所述方法包括(a)將包含編碼HPV 52 L1蛋白的核酸的載體引入到酵母宿主細胞中；其中，已針對在酵母宿主細胞中的最優表達對所述核酸進行了密碼子優化；(b)在能使所述HPV 52 L1蛋白表達的條件下培養所述酵母宿主細胞。
本發明還涉及一種在重組宿主細胞中表達HPV 52 L1蛋白的方法，所述方法包括(a)將包含如SEQ ID NO1所示的核酸的載體引入到酵母宿主細胞中；以及(b)在能使所述HPV 52 L1蛋白表達的條件下培養所述酵母宿主細胞。
本發明的合成基因可被裝配進包含下述序列的表達盒，所述序列被設計為能提供宿主細胞中HPV 52 L1蛋白的高效表達。所述的盒優選含有合成基因，以及與其可操作地相連的轉錄和翻譯控制序列，例如，啟動子和終止序列。在一種優選的實施方式中，啟動子是S.cerevisiae GAL1啟動子，雖然本領域技術人員將知道，大量的其它已知酵母啟動子(例如GAL10、GAL7、ADH1、TDH3或PGK啟動子)或其它真核基因啟動子中的任何啟動子都可以使用。一種優選的轉錄終止子是S.cerevisiae ADH1啟動子，雖然其它已知的轉錄終止子也可以使用。GAL1啟動子-ADH1終止子的組合是特別優選的。
本發明的另一方面是HPV 52病毒樣顆粒(VLP)、制造HPV 52VLPs的方法以及使用HPV 52 VLPs的方法，所述顆粒是通過在酵母細胞中重組表達HPV 52 L1或L1+L2基因來制造的。當L1，人和動物乳頭瘤病毒的主要衣殼蛋白在酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞或細菌中表達時，VLPs可以自裝配(綜述參見，Schiller and Roden，inPapillomavirus ReviewsCurrent Research on Papillomaviruses；Laceyed.Leeds，UKLeeds Medical Information，pp 101-12(1996))。形態上無區別的(morphologically indistinct)HPV VLPs還可以通過表達L1和L2衣殼蛋白的組合來制造。VLPs由72個L1的五聚體組成，是T＝7的二十面體結構(Baker et al.，Biophys.J.60(6)1445-56(1991))。
VLPs在形態上與真的病毒例子相近，施予動物時，其能誘導高效價的中和抗體。用VLPs對兔(Breitburd et al.，J.Virol.69(6)3959-63(1995))和狗(Suzich et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(25)11553-57(1995))免疫顯示，其既能誘導中和抗體，又能提供針對實驗性乳頭瘤病毒感染的保護。此外，用HPV 16 VLPs對成年女性進行的免疫顯示出，其能提供對于抵抗HPV感染和HPV 16宮頸上皮內瘤形成的保護(Koutsky et al.N.Engl.J.Med.3471645-51(2002))。因為VLPs不合可能致癌的病毒基因組，并能在從單基因表達的時候自裝配，因此，它們成為使用活病毒開發HPV疫苗的安全替代(綜述參見Schillerand Hidesheim，J.Clin.Virol.1967-74(2000))。
因此，本發明涉及由HPV 52的重組L1蛋白或重組L1+L2蛋白組成的病毒樣顆粒，其中，所述重組蛋白在酵母細胞中表達。
如上所述，在本發明的一種優選的實施方式中，HPV 52 VLPs是在酵母中制造的。在另一種優選的實施方式中，酵母選自由Saccharomyces cerevisiae、Hansenula polymorpha、Pichia pastoris、Kluyvermyces fragilis、Kluyveromyces lactis和Schizosaccharomycespombe構成的組。
本發明的另一方面是包含HPV 52 L1蛋白的HPV 52 VLP，所述蛋白是由經過密碼子優化的HPV 52 L1基因制造的。在本發明的這方面的一種優選的實施方式中，經過密碼子優化的HPV 52 L1基因包含SEQ ID NO1示出的核苷酸序列。
本發明的另一方面是生產HPV 52 VLPs的方法，所述方法包括(a)用編碼HPV 52 L1蛋白或HPV 52 L1+L2蛋白的重組DNA分子去轉化酵母；(b)在允許所述重組DNA分子表達的條件下培養經過轉化的酵母，生產重組HPV 52蛋白；以及(c)分離出重組HPV 52蛋白，制造HPV 52 VLPs。
在本發明的這方面的一種優選的實施方式中，酵母是用經過密碼子優化的HPV 52 L1基因轉化的，以生產HPV 52 VLPs。在一種特別優選的實施方式中，經過密碼子優化的HPV 52 L1基因包含如SEQ IDNO1所示的核苷酸序列。
本發明還提供了一種方法，用于在動物中誘導免疫應答，所述方法包括將HPV 52病毒樣顆粒施予動物。在一種優選的實施方式中，HPV 52 VLPs是通過重組表達經過密碼子優化的基因來制造的，所述基因編碼HPV 52 L1或HPV 52 L1+L2。
本發明的另一方面是預防和/或治療HPV相關宮頸癌的方法，所述方法包括向哺乳動物施予包含HPV 52 VLPs的疫苗。在本發明的這方面的一種優選的實施方式中，HPV 52 VLPs是在酵母中制造的。
本發明還涉及包含HPV 52病毒樣顆粒(VLPs)的疫苗。
在本發明的這方面的一種替代性實施方式中，疫苗還包含至少一種其它HPV類型的VLPs。在一種優選的實施方式中，所述至少一種其它HPV類型選自由HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59和HPV68所構成的組。
在本發明的這方面的一種優選的實施方式中，所述疫苗還包含HPV 16 VLPs。
在本發明的另一種優選的實施方式中，所述疫苗還包含HPV 16VLPs和HPV 18 VLPs。
在本發明的又一種優選的實施方式中，所述疫苗還包含HPV 6VLPs、HPV 11 VLPs、HPV 16 VLPs和HPV 18 VLPs。
本發明還涉及包含HPV 52病毒樣顆粒的藥物組合物。此外，本發明涉及包含HPV 52 VLPs和至少一種其它HPV類型的VLPs的藥物組合物。在一種優選的實施方式中，所述至少一種其它HPV類型選自由HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59和HPV68所構成的組。
本發明的疫苗組合物可以以合適的劑量單獨使用，該劑量是允許用最小的可能毒性進行對HPV感染的最優抑制的劑量。此外，與其它試劑共同施予或者按照順序施予也是令人期望的。
將被引入到疫苗接受者中的病毒樣顆粒的量將取決于被表達的基因產物的免疫原性。通常，大約10μg至100μg的免疫或預防有效劑量，優選為大約20μg至60μg的VLPs被直接施予肌肉組織中。皮下注射、皮內導入、通過皮膚壓入(impression)和其它施予方式，例如腹膜內、靜脈內或吸入運送方式都可包括進來。可以提供強化免疫，這也包括進本發明。非腸道施予，例如靜脈內、肌肉內、皮下或用其它方式與佐劑例如明礬或Merck明礬佐劑一同施用，在非腸道引入本發明的疫苗之后或同時，也是有好處的。
為了描述和公開與本發明的方法相關的方法和材料，本文提到的所有公開文獻都通過引用被并入本文。本文中無任何一處能被解釋為本發明不能通過發明在先而早于此類公開。
已經參考附圖對本發明的優選實施方式進行了描述，但是應當理解，本發明并不局限于這些細致的實施方式，在不超出所附權利要求確定的本發明的范圍或原則的情況下，本領域技術人員可以做出多種改變和改動。
下述實施例用于描述而非限制本發明。
實施例1確定有代表性的HPV 52 L1序列此前已有對HPV 52 L1序列的描述(Genbank編號NC 001592)。但是，人們經常發現從臨床分離物中獲得的DNA之間的細微序列差別。為確定具有代表性的HPV 52 L1野生型序列，從以前顯示出含有HPV 52 DNA的三份臨床樣品中分離出DNA。用Taq DNA聚合酶和以下引物5′L15’-ATGTCCGTGTGGCGGCCTAGT-3’(SEQ ID NO4)和3′52 Bgl II5’-GAGATCTCAATTACACAAAGTG-3’(SEQ ID NO5)，以聚合酶鏈式反應(PCR)對HPV 52 L1序列進行擴增。在瓊脂糖凝膠上對擴增產物進行電泳，通過溴化乙啶染色進行觀察。切下大約1500bp的L1條帶，用Geneclean Spin Kit(Q-Bio Gene，Carlsbad，CA)對DNA進行純化。然后將DNA連接到TA克隆載體，pCR 2.1(Invitrogen)上。用連接混合物轉化TOP10F’E.coli細胞，涂布到具有卡納霉素加IPTG和X-gal(用于藍/白菌落選擇)的LB瓊脂平板上。將平板倒轉，在37℃培養16小時。
針對從擴增的三份臨床分離物的每份獲得的五個白色菌落，進行菌落PCR。5’L1和3’52 Bgl II引物被用于兩步PCR，其中，第一步包含10個循環，每個循環包括在96℃ 15秒(變性)、55℃ 30秒(退火)和68℃ 2分鐘(延伸)，第二步包含35個循環，每個循環采用基本相似的程序，除了退火步驟是在50℃進行30秒。在瓊脂糖凝膠上對PCR產物進行電泳，通過溴化乙啶染色進行觀察。來自每份臨床分離物的若干菌落都含有大約1500bp條帶的擴增產物。將這些菌落在具有卡納霉素的LB培養基中于37℃振蕩下培養16小時。用Minipreps提取質粒DNA，用限制性內切酶對其進行消化，展示出質粒中L1基因的存在。通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色對得到的限制性片段加以觀察。
對含有來自三份臨床分離物中每份的克隆的L1插入物的質粒進行DNA測序。將DNA與翻譯的氨基酸序列互相比較，以及與之前公開的Genbank HPV 52 L1序列進行比較。對三份臨床分離物的序列分析揭示，沒有序列與Genbank序列(編號NC 001592)相同。pCR2.1 HPV52 L1克隆#2C被選為代表性HPV 52 L1序列，在本文中其被稱為“52L1野生型序列”(SEQ ID NO3，見圖1)。被選作為52 L1野生型(wt)的序列較之Genbank序列含有一處點突變，其由核苷酸1308位的沉默突變(腺苷酸→鳥嘌呤)組成。HPV 52 L1 wt序列的氨基酸序列與52 L1 Genbank序列相同。
用前文所述3’52 Bgl II引物和5’L1 Bgl II引物(5’-GAGATCTCACAAAACAAAATGTCCGTGTGGC-3’(SEQ ID NO6))，對HPV 52 L1野生型序列進行擴增，以加上Bgl II延伸。用Taq聚合酶進行PCR。在瓊脂糖凝膠上對PCR產物進行電泳，通過溴化乙啶染色進行觀察。切下大約1500bp的L1條帶，用Geneclean Spin Kit(Q-Bio Gene，Carlsbad，CA)對DNA進行純化。然后將PCR產物連接到pCR 2.1載體上，用連接混合物轉化TOP10F’細胞。在具有卡納霉素的LB培養基中，于37℃振蕩下對白色菌落進行16小時的培養。用Minipreps來提取質粒DNA。用Bgl II限制性內切酶消化，從載體序列中釋放出HPV 52 L1基因。用經過消化的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，通過溴化乙啶染色進行觀察。用GeneClean試劑盒來純化L1條帶，將其連接到去磷酸化的、BamHI消化過的pGAL110載體上。用連接混合物轉化TOP10F’E.coli細胞。為篩選出以正確方向定位的HPV 52 L1插入，對來自菌落的質粒DNA進行PCR擴增。進行DNA測序，以驗證插入物的序列和定位方向。選出的克隆被命名為pGAL110-HPV 52 L1 #5。制備來自選出的克隆的Maxiprep DNA。通過用glusulase原生質球化將Saccharomyces cerevisiae細胞制備為感受態的，用pGAL110-HPV52 L1 #5進行轉化。將酵母轉化混合物涂布到Leu-山梨糖醇平板上的Leu-山梨糖醇頂部瓊脂上，在30℃倒轉培養3-5天。撿出菌落，在Leu-山梨糖醇平板劃線進行分離。隨后，在30℃將經過分離的菌落培養于旋轉試管培養(rotating tube cultures)中的5ml 5X Leu-Ade-山梨糖醇中，其中含有1.6％葡萄糖和4％半乳糖，用于誘導HPV 2 L1轉錄和蛋白質表達。
實施例2酵母密碼子優化已有對酵母偏愛的密碼子的描述(Sharp，Paul M and Cowe，Elizabeth.Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiaeYEAST 7657-678(1991))。可探測到HPV 52 L1 wt蛋白的表達，但是其轉錄水平非常之低，無法通過Northern雜交印跡探測到。假定，不成熟的轉錄終止可能導致了HPV 52 L1基因的低水平表達。為增加該基因的轉錄以及確保全長轉錄子產生，用酵母偏愛的密碼子對HPV52 L1基因加以重構。針對是否存在能被酵母識別的酵母轉錄終止信號，對序列加以檢查，通過用替代性密碼子進行取代，除去這些序列，同時保留了相同的氨基酸序列。包含經過酵母密碼子優化序列的重構HPV 52 L1序列較之HPV 52 L1 wt序列含有379處核苷酸改變。得到的序列在本文中被稱為“52 L1 R”(R＝重構，見圖1)。52 L1 wt(SEQ ID NO3)和52 L1 R(SEQ ID NO1)序列之間的核苷酸改變被展示于圖1中。58 L1 R的翻譯氨基酸序列并無改變(SEQ ID NO2，見圖2)。該重構序列提供了增加的HPV 52 L1蛋白表達，在疫苗開發中，這相對野生型來說具有明顯的優點。
用于制造優化基因的策略是，設計出覆蓋基因的長的重疊正義和反義寡聚物，用酵母偏愛的密碼子序列取代核苷酸，同時保持氨基酸序列不變。這些寡聚物被用作為模板DNA，用于用Pfu DNA聚合酶進行的PCR反應。設計額外的擴增引物，將它們用于從模板寡聚物擴增重構序列。
用于擴增的最佳條件是片段特異性的(section-specific)；但是，大多數反應都采用如下類似程序，94℃ 5分鐘(變性)之后是25個循環，每個循環包括95℃ 30秒(變性)、50-55℃ 30秒(退火)、72℃ 1.5分鐘(延伸)，接著是72℃ 7分鐘最終延伸，以及4℃的保持。通過瓊脂糖凝膠電泳來檢查PCR產物。具有合適大小的條帶被切下，從凝膠切片來純化DNA。然后將擴增片段用作為模板，裝配1512nt的重構HPV 52 L1基因。
重構之后，對1512nt的條帶進行凝膠純化，連接至pCR4平末端載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。連接之后，用連接混合物來轉化感受態E.coli TOP10細胞。在4ml含有氨芐青霉素的LB中培養菌落，通過微量制備(miniprep)技術從菌落提取質粒DNA。對質粒DNA加以測序，驗證想要的HPV 52 L1重構改變的存在。為將BamHI延伸加入到兩個末端，從pCR4Blunt-52 L1 R重新擴增52 L1 R(重構)。按照上文所述對擴增片段進行克隆，對得到的質粒DNA進行測序。用BamHI去消化質粒pCR4 Blunt-52 L1 R(Bam)，在瓊脂糖凝膠上對得到的DNA片段插入物進行電泳。對大約1530bp的HPV 52 L1 R(Bam)片段進行凝膠純化，并將其連接到用BamHI消化過的pGAL110上。用連接混合物轉化TOP10F’E.coli(Invitrogen)細胞。
通過PCR，對得到的菌落加以篩選，選出以正確方向定位的HPV52 L1 R。通過DNA測序來驗證序列和定向。制備Maxiprep質粒DNA。通過原生質球化將S.cerevisiae細胞制備為感受態，并對其進行轉化。酵母轉化物被涂布到Leu-山梨糖醇瓊脂平板的Leu-山梨糖醇頂部瓊脂上，倒轉培養7天。撿出菌落，在Leu-山梨糖醇瓊脂平板劃線用于克隆分離。隨后在30℃，將分離的菌落培養于旋轉試管培養中、具有1.6％葡萄糖和4％半乳糖的5ml 5X Leu-Ade-山梨糖醇中，以誘導L1轉錄和蛋白質表達。48和/或72小時后，對等同于OD600＝10的培養物體積進行沉淀，移走上清液，將沉淀冷凍，貯藏于-70℃。
實施例3RNA制備將通過半乳糖誘導，被誘導為表達HPV 52 L1的轉化酵母細胞的沉淀在冰上解凍，懸浮于0.8ml Trizol試劑(Life Technologies，GibcoBRL)中，在室溫培養5分鐘，將1/5體積的氯仿加入到小管中。然后劇烈震蕩15秒以混合，并在室溫下培養3分鐘。在13krpm下進行5分鐘離心之后，收集上層，并將其轉移到新的小管中。向小管中加入0.4ml異丙醇。在室溫下對混合物進行10分鐘的培養。為沉淀RNA，在13krpm下進行10分鐘的離心。輕輕倒出上清液，用75％EtOH來洗RNA沉淀，重復離心步驟。輕輕倒出上清液，令RNA沉淀空氣干燥15分鐘，然后懸浮在不含RNase的水中。用分光光度法來測定樣品中RNA的濃度，其中利用下述假設當A260/280為1.7-2.0時，A260讀數為1＝40μg/ml RNA。
實施例4Northern雜交印跡分析制備(cast)1.1％的瓊脂糖甲醛凝膠。將5和10微克的RNA與變性緩沖液(終濃度6％甲醛、50％甲酰胺和0.1×MOPS)組合，加熱至65℃，10分鐘。加入1/10體積的凝膠上樣緩沖液，將樣品上樣至凝膠。在75伏下，1×MOPS緩沖液中進行大約3小時的電泳。在10×SSC中對凝膠進行60分鐘的漂洗。
通過毛細作用，在10×SSC中進行16小時，將RNA轉移到Hybond-N+尼龍膜(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)上。然后使用Stratagene UV Stratalinker自動交聯功能(Stratagene，LA Jolla，CA)，通過交聯將RNA固定到尼龍膜上。固定之后，令尼龍膜空氣干燥。
Roehe DIG High Prime DNA Labeling and Detection Kit I(Hoffmann-La Roche Ltd.，Basel，Switzerland)被用于標記52 L1 wt和52 L1 R DNA序列，而DIG將被用作為探針在Northern雜交印跡中探測52 L1 wt和52 L1 R RNA。按照廠商推薦，進行預雜交、雜交以及用抗DIG堿性磷酸酶綴合的抗體進行的免疫顯色。簡言之，在輕微震蕩下，于37℃對雜交印跡進行30分鐘的預雜交。通過加熱到95℃ 5分鐘對探針進行變性，隨后在冰上淬火(quench)。將探針加入到雜交溶液中，在輕微震蕩下于44.6℃應用到膜上，4小時。然后移出雜交溶液，在室溫下，用含有0.1％SDS的2×SSC沖洗兩次雜交印跡，每次5分鐘，接著在65℃用0.5×SSC和0.1％SDS再洗一次。然后對雜交印跡進行30分鐘的封閉，并將抗-DIG堿性磷酸酶綴合的抗體以1∶5000的稀釋率應用30分鐘。洗雜交印跡，通過用NBT/BCIP底物探測堿性磷酸酶綴合的抗-DIG結合抗體，來測定與探針結合的RNA的存在。
對表達HPV 52 L1 wt的酵母的最初分析表明，HPV 52 L1蛋白被表達；但是，其水平很低。對來自被誘導表達HPV 52 L1 wt的培養物的酵母提取物的RNA進行的Northern雜交印跡分析沒有揭示任何可被探測到的HPV 52 L1 RNA。因為探測到了一些合適大小的蛋白質，所以清楚知道制造出了一些全長RNA轉錄子。用酵母優選密碼子序列重構了HPV 52 L1基因，將其工程改造為省略了任何可能的成熟前轉錄終止位點，以確保高強度的轉錄。對HPV 52 L1 R轉錄子的Northern雜交印跡分析揭示，全長轉錄子產生，并可被Northern雜交印跡分析探測到(圖3)。
實施例5HPV 52 L1蛋白表達將等同于OD600＝10的半乳糖誘導的培養物的冷凍酵母細胞沉淀在冰上解凍，并懸浮于300μl含有2mM PMSF的PC緩沖液(100mMNa2HPO4和0.5M NaCl，pH 7.0)中。加入濃度為大約0.5g/管的用酸洗過的0.5mm玻璃珠。在4℃下對管進行3個循環的渦旋(vortex)，每個循環5分鐘，之間間隔1分鐘。加入7.5μl 20％TritonX100，在4℃重復5分鐘的渦旋步驟。將管放置到冰上，15分鐘，接著在4℃離心10分鐘。將上清液轉移到滅菌的微離心管中，其被標記為總酵母蛋白提取物，寫上日期，貯藏于-70℃。
實施例6Western雜交印跡分析通過Western雜交印跡，對來自每個HPV 52 L1構建體的20個分離的酵母菌落的總酵母蛋白提取物進行分析，以驗證半乳糖誘導后HPV 52 L1蛋白的表達。
將10、5、2.5微克總酵母蛋白提取物與SDS-PAGE上樣緩沖液組合，加熱至95℃，10分鐘。將大約55kDa的HPV 16 L1蛋白包括進去，作為陽性對照，用不含HPV L1的總酵母蛋白提取物作為陰性對照(數據未示出)。將蛋白質上樣至10％SDS-PAGE凝膠上，在Tris-甘氨酸緩沖液中進行電泳。蛋白質分離之后，將蛋白質通過Western從凝膠轉移到硝酸纖維素上，將得到的雜交印跡在1x稀釋緩沖液(Kirkegaard and Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)中于室溫搖晃下封閉1小時。對雜交印跡洗三次，在室溫下應用能與HPV 16和HPV 52 L1蛋白交叉反應的酵母吸收的山羊抗trpE-HPV 31 L1血清，16小時。然后再洗三次雜交印跡，與1∶2500稀釋的抗山羊HRP綴合的抗體孵育1小時。再對雜交印跡洗三次，應用NBT/BCIP探測底物(Kirkegaard and Perry Laboratories)。免疫反應性蛋白質作為雜交印跡上的紫色條帶被探測到。
在所有情況下，都探測到了HPV 52 L1蛋白，其出現為硝酸纖維素上相應于大約55kDa的明顯免疫反應條帶。(圖4)HPV 52 L1 R條帶(2.5μg道)的強度明顯高于HPV 52 L1 wt條帶(10μg)。這清楚表明，重構之后，經過密碼子優化的HPV 52 L1 R的表達水平增加到超過四倍，這是Western雜交印跡上直接比較的界限。
實施例7透射電子顯微鏡為展示出52 L1蛋白實際上能自裝配形成五聚L1衣殼再隨后自裝配為病毒樣顆粒，用部分純化的HPV 52 L1 R蛋白提取物進行透射電子顯微鏡試驗(TEM)。
小規模發酵培養酵母，并進行沉淀。對得到的沉淀進行純化處理。通過免疫雜交印跡來分析沉淀和澄清的酵母提取物，以顯示純化過程期間HPV 52 L1蛋白的表達和駐留。然后在45％蔗糖墊(cushion)下對澄清的酵母提取物進行離心，將得到的沉淀懸浮于緩沖液中，用于通過TEM對HPV 52 L1 VLPs進行分析。
圖5展示了制造的HPV 52 L1 R VLPs的代表性樣品。該粗制樣品中球形顆粒的直徑在40至70nm之間，一些顆粒展示出衣殼體的有序排列。
序列表<110>Merck & Co.，Inc.
<120>HPV 52 L1在酵母中的優化表達<130>21571 PCT<150>60/555926<151>2004-03-24<160>7<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1512<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV52L1R<400>1atgtccgtct ggagaccatc cgaagctact gtctacttgc caccagttcc agtctctaag 60gttgtctcta ccgacgaata cgtctccaga acctccatct actactacgc tggttcctct 120agattgttga ctgtcggtca cccatacttc tctatcaaga acacctcctc cggtaacggt 180aagaaggtct tggttccaaa ggtctctggt ttgcaataca gagtcttcag aatcaagttg 240ccagacccaa acaagttcgg tttcccagac actagtttct acaacccaga aactcaaaga 300ttggtctggg cttgtactgg tttggaaatc ggtagaggtc aaccattggg tgtcggtatc 360tctggtcacc cattgttgaa caagttcgac gacactgaaa cctctaacaa gtacgctggt 420aagccaggta tcgataacag agaatgtttg tctatggact acaagcaaac tcaattgtgt 480atcttgggtt gtaagccacc aatcggtgaa cactggggta agggtactcc atgtaacaac 540aactctggta acccaggtga ctgtccacca ttgcaattga tcaactccgt catccaagac 600ggtgacatgg tcgacactgg tttcggttgt atggacttca acaccttgca agcttctaag 660tccgacgtcc caatcgacat ctgttcctct gtctgtaagt acccagacta cttgcaaatg 720gcttctgaac catacggtga ctccttgttc ttcttcttga gaagagaaca aatgttcgtc 780agacacttct tcaacagagc tggtaccttg ggtgacccag ttccaggtga cttgtacatc 840caaggttcca actctggtaa cactgctact gtccaatcct ctgctttctt cccaactcca 900tctggttcca tggtcacctc cgaatcccaa ttgttcaaca agccatactg gttgcaaaga 960gctcaaggtc acaacaacgg tatctgttgg ggtaaccaat tgttcgtcac cgtcgtcgac 1020actactagat ctactaacat gaccttgtgt gctgaagtca agaaggaatc cacctacaag 1080aacgaaaact tcaaggaata cttgagacac ggtgaagaat tcgacttgca attcatcttc 1140caattgtgta agatcacctt gaccgctgac gtcatgactt acatccacaa gatggacgct 1200
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<223>PCR引物<400>4atgtccgtgt ggcggcctag t 21<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>5
gagatctcaa ttacacaaag tg22<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>6gagatctcac aaaacaaaat gtccgtgtgg c 31<210>7<211>1512<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>52L1R反義<400>7tacaggcaga cctctggtag gcttcgatga cagatgaacg gtggtcaagg tcagagattc 60caacagagat ggctgcttat gcagaggtct tggaggtaga tgatgatgcg accaaggaga 120tctaacaact gacagccagt gggtatgaag agatagttct tgtggaggag gccattgcca 180ttcttccaga accaaggttt ccagagacca aacgttatgt ctcagaagtc ttagttcaac 240ggtctgggtt tgttcaagcc aaagggtctg tgatcaaaga tgttgggtct ttgagtttct 300aaccagaccc gaacatgacc aaacctttag ccatctccag ttggtaaccc acagccatag 360agaccagtgg gtaacaactt gttcaagctg ctgtgacttt ggagattgtt catgcgacca 420ttcggtccat agctattgtc tcttacaaac agatacctga tgttcgtttg agttaacaca 480tagaacccaa cattcggtgg ttagccactt gtgaccccat tcccatgagg tacattgttg 540ttgagaccat tgggtccact gacaggtggt aacgttaact agttgaggca gtaggttctg 600ccactgtacc agctgtgacc aaagccaaca tacctgaagt tgtggaacgt tcgaagattc 660aggctgcagg gttagctgta gacaaggaga cagacattca tgggtctgat gaacgtttac 720cgaagacttg gtatgccact gaggaacaag aagaagaact cttctcttgt ttacaagcag 780tctgtgaaga agttgtctcg accatggaac ccactgggtc aaggtccact gaacatgtag 840gttccaaggt tgagaccatt gtgacgatga caggttagga gacgaaagaa gggttgaggt 900agaccaaggt accagtggag gcttagggtt aacaagttgt tcggtatgac caacgtttct 960cgagttccag tgttgttgcc atagacaacc ccattggtta acaagcagtg gcagcagctg 1020tgatgatcta gatgattgta ctggaacaca cgacttcagt tcttccttag gtggatgttc 1080ttgcttttga agttccttat gaactctgtg ccacttctta agctgaacgt taagtagaag 1140gttaacacat tctagtggaa ctggcgactg cagtactgaa tgtaggtgtt ctacctgcga 1200tgatagaacc ttctgaccgt taagccaaac tgaggtggtg gtaggcgaag gaaccttctg 1260tgaatgtcta agcagtgaag gtgacgatag tggacagttt tcttgtgagg tggtttccca 1320
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1.一種核酸分子，其中包含編碼如SEQ ID NO2所示的HPV 52L1蛋白的核苷酸序列，已針對在酵母細胞中高水平表達對所述核酸序列進行了密碼子優化。
2.包含如權利要求1所述的核酸分子的載體。
3.包含如權利要求2所述的載體的宿主細胞。
4.如權利要求3所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是酵母細胞。
5.如權利要求4所述的宿主細胞，其中所述酵母細胞選自由Saccharomyces cerevisiae、Hansenula polymorpha、Pichia pastoris、Kluyvermyces fragilis、Kluyveromyces lactis和Schizosaccharomycespombe所構成的組。
6.如權利要求4所述的宿主細胞，其中所述酵母細胞是Saccharomyces cerevisiae。
7.如權利要求1所述的核酸分子，其中，所述核苷酸序列包含如SEQ ID NO1所示的核苷酸的序列。
8.病毒樣顆粒(VLPs)，包含HPV 52的重組L1蛋白或重組L1+L2蛋白，其中，所述重組L1蛋白或所述重組L1+L2蛋白是在酵母中產生的。
9.如權利要求8所述的VLPs，其中，所述重組L1蛋白或所述重組L1+L2蛋白是由經過密碼子優化的HPV 52 L1核酸分子編碼的。
10.如權利要求9所述的VLPs，其中，所述經過密碼子優化的核酸分子包含如權利要求1所示的核苷酸序列。
11.一種生產權利要求9所述的VLPs的方法，所述方法包括(a)用編碼HPV 52L1蛋白或HPV 52L1+L2蛋白的經過密碼子優化的DNA分子去轉化酵母；(b)在允許所述經過密碼子優化的DNA分子表達的條件下培養所述經過轉化的酵母，生產重組乳頭瘤病毒蛋白；以及(c)分離出所述重組乳頭瘤病毒蛋白，生產如權利要求9所述的VLPs。
12.包含如權利要求9所述的VLPs的疫苗。
13.包含如權利要求9所述的VLPs的藥物組合物。
14.一種預防HPV感染的方法，所述方法包括將如權利要求12所述的疫苗施予哺乳動物。
15.在動物中誘導免疫應答的方法，所述方法包括將如權利要求11所述的VLPs施予動物。
16.如權利要求9所述的病毒樣顆粒，其中，所述酵母選自由Saccharomyces cerevisiae、Hansenula polymorpha、Pichia pastoris、Kluyvermyces fragilis、Kluyveromyces lactis和Schizosaccharomycespombe所構成的組。
17.如權利要求16所述的病毒樣顆粒，其中所述酵母細胞是Saccharomyces cerevisiae。
18.如權利要求12所述的疫苗，還包含至少一種其它HPV類型的VLPs。
19.如權利要求18所述的疫苗，其中，所述至少一種其它HPV類型選自由HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59和HPV68所構成的組。
20.如權利要求19所述的疫苗，其中所述至少一種其它HPV類型包含HPV 16。
21.如權利要求20所述的疫苗，還包含HPV 18VLPs。
22.如權利要求21所述的疫苗，還包含HPV 6VLPs和HPV 11VLPs。
23.如權利要求22所述的疫苗，還包含HPV 31VLPs。
24.如權利要求21所述的疫苗，還包含HPV 31VLPs。
25.如權利要求23所述的疫苗，還包含HPV 45VLPs。
26.如權利要求24所述的疫苗，還包含HPV 45VLPs。
27.如權利要求26所述的疫苗，還包含HPV 58VLPs。
28.如權利要求25所述的疫苗，還包含HPV 58VLPs。
全文摘要
本發明提供了編碼HPV 52 L1蛋白的合成DNA分子。具體而言，本發明提供了編碼HPV 52 L1蛋白的多核苷酸，其中，針對在酵母細胞中的表達水平對所述多核苷酸進行了密碼子優化。在本發明的一種替代性實施方式中，合成分子的核苷酸序列被改造，去掉被酵母識別的轉錄終止信號。合成分子可被用于制造HPV 52病毒樣顆粒(VLPs)，以及制造包含HPV 52 VLP的藥物組合物和疫苗。本發明的疫苗提供了針對乳頭瘤病毒感染的有效免疫預防，這是通過中和抗體和細胞介導的免疫來實現的，本發明的疫苗還可用于治療已存在的HPV感染。
文檔編號C12N7/04GK1934131SQ200580009595
公開日2007年3月21日 申請日期2005年3月18日 優先權日2004年3月24日
發明者J·T·布賴, M·K·布朗勞, L·D·舒茨, K·U·詹森 申請人:默克公司