通過加入消泡劑來提高無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的蛋白質(zhì)表達(dá)率的制作方法

專利名稱：通過加入消泡劑來提高無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的蛋白質(zhì)表達(dá)率的制作方法
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)合成是一種基礎(chǔ)生物過程，是開發(fā)多肽治療、診斷和催化劑的基礎(chǔ)。隨著重組DNA(rDNA)技術(shù)的出現(xiàn)，可以利用細(xì)胞的催化機(jī)制來產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)。這可利用衍生自細(xì)胞的提取物在細(xì)胞環(huán)境內(nèi)或體外實(shí)現(xiàn)。
在過去十年，無細(xì)胞系統(tǒng)的生產(chǎn)力提高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，從約5微克/毫升-小時(shí)提高到約500微克/毫升-小時(shí)。這一成就使得體外蛋白質(zhì)合成以成為實(shí)驗(yàn)室規(guī)模研究的實(shí)用技術(shù)并為高通量蛋白質(zhì)表達(dá)提供了一種技術(shù)平臺(tái)。也已開始提出利用無細(xì)胞技術(shù)的可行性作為體內(nèi)大規(guī)模制造蛋白質(zhì)藥物的一種替代方法。
無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的一些優(yōu)點(diǎn)優(yōu)于常規(guī)體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)方法。無細(xì)胞系統(tǒng)可使大多數(shù)(如果不是所有的)細(xì)胞代謝原料用于專門產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)。此外，在體外沒有細(xì)胞壁也具有優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)檫@能更好地控制合成環(huán)境。例如，可改變tRNA水平來反映待表達(dá)基因慣用的密碼子。由于無需考慮細(xì)胞的培養(yǎng)或存活，改變氧化還原潛能、pH或離子強(qiáng)度也可能比體內(nèi)更加易行。此外，可以容易地實(shí)現(xiàn)直接回收純化的、適當(dāng)折疊的蛋白質(zhì)。
認(rèn)為體外翻譯還能夠摻入非天然的及同位素標(biāo)記的氨基酸，和能夠產(chǎn)生在體內(nèi)不穩(wěn)定、不溶或有細(xì)胞毒性的蛋白質(zhì)。此外，無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成對(duì)改革蛋白質(zhì)工程和蛋白質(zhì)組篩選技術(shù)可能起作用。無細(xì)胞方法繞過克隆和轉(zhuǎn)化細(xì)胞以在體內(nèi)表達(dá)新基因產(chǎn)物所需的艱苦費(fèi)力過程，成為該領(lǐng)域的技術(shù)平臺(tái)。
盡管無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成具有所有前途良好的特征，但一些障礙限制了它的實(shí)際應(yīng)用和大規(guī)模實(shí)施。其中最重要的是反應(yīng)時(shí)間短和蛋白質(zhì)產(chǎn)率低，這導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成產(chǎn)率低和試劑費(fèi)用過高。Spirin等(1988)Science2421162-1164的開拓性研究最初通過開發(fā)連續(xù)流動(dòng)系統(tǒng)來繞過反應(yīng)時(shí)間短。許多實(shí)驗(yàn)室重復(fù)并改進(jìn)了這種研究，但他們主要采用的方法都是將物質(zhì)恒定加入反應(yīng)室。與分批系統(tǒng)相比，這種方法增加了翻譯反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間和蛋白質(zhì)產(chǎn)率。然而，這種方法所用試劑昂貴，通常產(chǎn)生的是稀釋的產(chǎn)品而不能顯著提高產(chǎn)率，因此效率不佳。
常規(guī)的分批系統(tǒng)的一些優(yōu)點(diǎn)優(yōu)于這種連續(xù)和半連續(xù)方法，包括易于放大、可再現(xiàn)、蛋白質(zhì)產(chǎn)率提高、方便、適用于多種高通量表達(dá)模式、以及能更有效地利用物質(zhì)。這些優(yōu)點(diǎn)改進(jìn)了產(chǎn)業(yè)化利用無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成至關(guān)重要的分批系統(tǒng)的生產(chǎn)力。然而，當(dāng)放大反應(yīng)時(shí)，采用目前的方法效率低。在需要氧進(jìn)行氧化磷酸化的系統(tǒng)中特定蛋白質(zhì)產(chǎn)率的降低尤其嚴(yán)重。為滿足這種需要必需提高較大反應(yīng)的產(chǎn)率。
相關(guān)文獻(xiàn)美國(guó)專利6,337,191 B1，Swartz等，Kim和Swartz(2000)Biotechnol Prog.16385-390；Kim和Swartz(2000)Biotechnol Lett.221537-1542；Kim和Choi(2000)JBiotechnol.8427-32；Kim等，(1996)Eur J Biochem.239881-886；Tao和Levy(1993)Nature362755-758；Hakim等，(1996)J Immun.1575503-5511；Pratt(1984)《無原核細(xì)胞系統(tǒng)中偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄-翻譯》(Coupled transcription-translation in prokaryoticcell-free systems)，刊于Hames BD，Higgins SJ.編寫的《轉(zhuǎn)錄和翻譯的實(shí)踐方法》(Intranscription and translationa practical approach)，紐約，IRL出版社，179-209；Davanloo等，(1984)PNAS812035-2039；Cock等，(1999)Biochemistry25996-103；Gill和Hippel(1989)Anal.Biochem.182319-326；Kim等，(1999)Europ.J.Biochem.239881-886；Davanloo等，(1984)PNAS812035-2039發(fā)明概述本發(fā)明提供了在含有消泡劑的反應(yīng)混合物中體外合成生物分子的組合物和方法。在無細(xì)胞合成反應(yīng)中加入消泡劑提高了無細(xì)胞系統(tǒng)蛋白質(zhì)的特定產(chǎn)量。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述含有消泡劑的反應(yīng)混合物可以是放大規(guī)模的反應(yīng)，例如反應(yīng)體積大于至少約15微升。反應(yīng)可以在各種反應(yīng)器中進(jìn)行，如本領(lǐng)域所知的包括鼓泡式柱反應(yīng)器。
附圖簡(jiǎn)述

圖1描述了在含有不同消泡劑的反應(yīng)中的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。
圖2是鼓泡式反應(yīng)器(bubble reactor)的示意圖。
圖3描述了與15微升反應(yīng)相比，在總反應(yīng)體積為1500微升的鼓泡柱(bubblecolumn)中GMCSF-scFv蛋白的產(chǎn)量。
圖4描述了與200微升薄膜反應(yīng)和15微升離心管反應(yīng)相比，反應(yīng)體積為2000微升的鼓泡柱的產(chǎn)量。加入消泡劑時(shí)，各系統(tǒng)的特定產(chǎn)量相當(dāng)。
實(shí)施方式詳述提供了在含有消泡劑的反應(yīng)混合物中體外合成生物分子以提高無細(xì)胞系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的總產(chǎn)量、可溶性蛋白質(zhì)產(chǎn)量和活性蛋白質(zhì)產(chǎn)量的組合物和方法。加入消泡劑能提高小規(guī)模反應(yīng)的產(chǎn)量，但發(fā)現(xiàn)其對(duì)較大規(guī)模的反應(yīng)，尤其是需氧條件的反應(yīng)特別有益。
體外合成在本文中指在含有生物提取物和/或所述試劑的反應(yīng)混合物中無細(xì)胞合成生物大分子。所述反應(yīng)混合物含有產(chǎn)生大分子如DNA、mRNA等的模板；待合成大分子的單體，如氨基酸、核苷酸等；以及輔因子、酶和合成必需的其它試劑，如核糖體、tRNA、聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子等。這種合成反應(yīng)系統(tǒng)是本領(lǐng)域熟知的，在文獻(xiàn)中已有描述。多肽合成反應(yīng)的許多化學(xué)物質(zhì)可用于本發(fā)明的方法。例如，2002年1月8日出版的美國(guó)專利第6,337,191號(hào)以及2001年1月2日出版的美國(guó)專利第6,168,931號(hào)中描述的反應(yīng)化學(xué)物質(zhì)，此二專利納入本文作為參考。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，反應(yīng)化學(xué)物質(zhì)如待批專利申請(qǐng)US 10/643,683中所描述，該申請(qǐng)納入本文作為參考。氧化磷酸化的激活可增加(蛋白質(zhì))產(chǎn)量并提高能源的利用。將以下因素聯(lián)合能提高產(chǎn)量，包括采用衍生自培養(yǎng)在含葡萄糖培養(yǎng)基上的細(xì)菌的生物提取物；缺乏聚乙二醇；和優(yōu)化鎂濃度。這樣提供了一種即使缺乏次級(jí)能源也能發(fā)生合成的內(nèi)穩(wěn)系統(tǒng)。
本領(lǐng)域熟知，生物反應(yīng)器的性能可能隨規(guī)模(大小)而顯著變化。難以維持大系統(tǒng)的均一性、面積體積比的變化以及由于時(shí)間增加反應(yīng)本身的變化。除了這些問題，激活氧化磷酸化的體外蛋白質(zhì)合成反應(yīng)需要增加氧氣(供應(yīng))以優(yōu)化其性能，隨著反應(yīng)體積的增加氧氣輸送將變得更加困難。
最常見的反應(yīng)器類型包括但不限于攪拌釜反應(yīng)器；依賴于氣體鼓泡進(jìn)行攪拌的鼓泡柱反應(yīng)器和氣升式反應(yīng)器；等等。鼓泡柱反應(yīng)器為Cytomim反應(yīng)條件所優(yōu)選。
工業(yè)發(fā)酵中經(jīng)常遇到的問題是產(chǎn)生氣泡，出于各種原因，其中包括污染的細(xì)胞會(huì)進(jìn)入發(fā)酵罐，這是不利的。已經(jīng)通過加入表面活性化學(xué)試劑來控制細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的氣泡，但這種消泡劑的KLa值通常較低，會(huì)降低反應(yīng)器提供氧氣和其它氣體的能力，并且還可能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。對(duì)于體外合成，由于催化劑和細(xì)胞內(nèi)的新生產(chǎn)物不會(huì)像例如用常規(guī)重組表達(dá)方法在體內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)那樣受到保護(hù)，預(yù)計(jì)消泡劑的疏水組分可能會(huì)干擾蛋白質(zhì)的合成和折疊。因此本文提供的結(jié)果是令人意想不到的。
消泡劑本發(fā)明的體外蛋白質(zhì)合成反應(yīng)物中包括了消泡劑。按重量計(jì)，消泡劑的存在濃度至少約0.00007％，可以至少約0.0001％，不超過約0.001％，通常不超過約0.007％?？刹捎貌煌目刂品椒?，包括固定等份(fixed aliquot)，請(qǐng)求式控制，按比例、積分和/或微分控制，或是它們的組合，來調(diào)節(jié)連續(xù)補(bǔ)料反應(yīng)中消泡劑的流速。消泡劑添加的最佳量取決于反應(yīng)條件、消泡劑類型等變量。消泡劑添加的最佳量以及兩次添加之間合適的時(shí)間間隔可在試驗(yàn)運(yùn)行中根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。
消泡劑在本文中指一種加入到反應(yīng)混合物中能促進(jìn)氣泡破裂和氣體釋放以及能消除因混合、噴射或攪拌所產(chǎn)生的泡沫的表面活性化學(xué)物質(zhì)。消泡劑可以預(yù)防、消除和/或減少泡沫。消泡劑還可賦予有利的輔助表面特性，如潤(rùn)濕、分散、乳化、增溶、助流和勻化、粘附以及賦予光澤。
許多化合物可用作消泡劑，包括但不限于烷基聚氧化乙烯亞烷基乙二醇醚(alkylpolyoxyalkylene glycol ether)；酯、醇、硅氧烷、聚硅氧烷、亞硫酸鹽、磺酸鹽、脂肪酸及其衍生物等。已知有多種此類試劑可通過商業(yè)從例如Sigma Chemicals、J.T.Baker等購得。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，消泡劑不是去污劑。
感興趣的消泡劑有嵌段共聚物，它們可在泡沫的空氣/水界面上形成不溶性單層從而提供抗泡/消泡作用。嵌段共聚物的消泡活性是該共聚物的濁點(diǎn)和所用溫度的函數(shù)。為選擇有效的消泡劑，應(yīng)選擇濁點(diǎn)低于預(yù)期使用溫度的嵌段共聚物。具有低氧化乙烯含量的嵌段共聚物是最有效的消泡劑。PLURONIC表面活性劑已廣泛用作消泡劑。反向結(jié)構(gòu)的PLURONICR表面活性劑也可有效用于消泡。其它感興趣的消泡劑包括硅氧烷聚合物、有機(jī)非聚硅氧烷聚丙烯基聚醚分散體混合物、有機(jī)脂肪酸酯型消泡劑等。
反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的模板可以是mRNA或DNA。穩(wěn)定的mRNA翻譯或者轉(zhuǎn)錄和翻譯的組合可將其儲(chǔ)存的信息轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)。通常用于大腸桿菌系統(tǒng)的這種組合系統(tǒng)是從含有可識(shí)別啟動(dòng)子的DNA模板連續(xù)產(chǎn)生mRNA。無論采用內(nèi)源性RNA聚合酶還是采用外源性噬菌體RNA聚合酶，通常是在反應(yīng)混合物中直接加入T7或SP6?；蛘?，可將信使插入QB復(fù)制酶(一種依賴于RNA的RNA聚合酶)的模板中以連續(xù)擴(kuò)增mRNA。純化的mRNA在加入反應(yīng)混合物之前通常要通過化學(xué)修飾才能穩(wěn)定?？沙ヌ崛∥镏械暮怂崦敢詭椭€(wěn)定mRNA水平。模板可編碼任何感興趣的特定基因。
也可加入其它的鹽，尤其是那些生物學(xué)相關(guān)的鹽，如錳鹽。鉀鹽的加入量通常為50-250mM，銨鹽為0-100mM。反應(yīng)的pH通常在pH 6-9之間。反應(yīng)的溫度通常在20-40℃之間。可以超出這些范圍。
可在反應(yīng)混合物中加入不需要的酶活性的代謝抑制劑?；蛘呖芍苯映ヌ崛∥镏胸?fù)責(zé)不需要活性的酶或因子。第三，可滅活或從染色體中刪除編碼不需要的酶的基因。
也可在該系統(tǒng)中加入從宿主生物純化的載體或合成載體?？衫盟鼈儊碓鰪?qiáng)蛋白質(zhì)的合成和折疊。這種cytomim技術(shù)已顯示可激活利用含有負(fù)責(zé)活化氧化磷酸化呼吸鏈組分的膜載體的過程。本發(fā)明的方法可用于無細(xì)胞表達(dá)以激活其它組的膜蛋白。
感興趣的合成系統(tǒng)包括DNA的復(fù)制，可包括擴(kuò)增DNA、從DNA或RNA模板轉(zhuǎn)錄RNA、將RNA翻譯成多肽以及從單糖合成為復(fù)合糖。
這類反應(yīng)可以是大規(guī)模、小規(guī)模、或者可以是多元的以同時(shí)進(jìn)行多種合成?？杉尤胩砑觿﹣硌娱L(zhǎng)活躍合成的時(shí)間。合成產(chǎn)物通常累積在反應(yīng)器中，然后在該系統(tǒng)操作完成后按照蛋白質(zhì)純化的常用方法分離和純化。
特別感興趣的是翻譯mRNA而產(chǎn)生蛋白質(zhì)，此種翻譯可與從DNA模板體外合成mRNA結(jié)合。這種無細(xì)胞系統(tǒng)將含有mRNA翻譯所需的全部因子，如核糖體、氨基酸、tRNA、氨?；铣擅?、延伸因子和起動(dòng)因子。本領(lǐng)域已知的無細(xì)胞系統(tǒng)包括大腸桿菌提取物等，可用合適的核酶處理以除去內(nèi)源活性mRNA。
除了上述無細(xì)胞提取物、遺傳模板和氨基酸等組分外，也可將蛋白質(zhì)合成所特別需要的物質(zhì)加入此反應(yīng)。這些物質(zhì)包括鹽、聚合化合物、環(huán)狀A(yù)MP、蛋白質(zhì)或核酸降解酶的抑制劑、蛋白質(zhì)合成的抑制劑或調(diào)節(jié)劑、氧化/還原調(diào)節(jié)劑、非變性表面活性劑、緩沖組分、精胺、亞精胺等。
優(yōu)選的鹽包括乙酸和硫酸的鉀鹽、鎂鹽、銨鹽和錳鹽，其中一些可含有氨基酸作為抗衡陰離子。聚合物可以是聚乙二醇、葡聚糖、二乙基氨基乙基葡聚糖、季銨基乙基葡萄糖和氨基乙基葡萄糖等。氧化/還原調(diào)節(jié)劑可以是二硫蘇糖醇、抗壞血酸、谷胱甘肽和/或它們的氧化物。也可采用非變性表面活性劑如Triton X-100，濃度為0-0.5M?？刹捎镁泛蛠喚芬蕴岣叩鞍踪|(zhì)合成能力，并可用cAMP作為基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑。
當(dāng)反應(yīng)介質(zhì)的某特定組分濃度變化時(shí)，其它組分也應(yīng)相應(yīng)變化。例如，核苷酸和能源化合物之類組分的濃度可根據(jù)其它組分濃度的變化同時(shí)控制。反應(yīng)器中諸組分的濃度水平也可隨時(shí)間而改變。
優(yōu)選將該反應(yīng)維持在pH 5-10和溫度20-50℃的范圍內(nèi)，更優(yōu)選維持在pH 6-9和溫度25-40℃的范圍內(nèi)。
可用各種方式測(cè)定翻譯反應(yīng)中所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)量。一種方法依靠可利用的測(cè)定翻譯的特定蛋白質(zhì)活性的試驗(yàn)。測(cè)定蛋白質(zhì)活性的試驗(yàn)的例子有螢光素酶測(cè)定系統(tǒng)和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶測(cè)定系統(tǒng)。這些試驗(yàn)可測(cè)定翻譯反應(yīng)所產(chǎn)生的功能活性蛋白質(zhì)的量?；钚栽囼?yàn)不測(cè)定由于蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊或者缺乏蛋白質(zhì)活性必需的其它翻譯后修飾而失活的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)。
另一種測(cè)定體外轉(zhuǎn)錄和翻譯組合反應(yīng)中所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)量的方法是，用已知量的放射性同位素標(biāo)記的氨基酸如35S-甲硫氨酸或14C-亮氨酸進(jìn)行反應(yīng)，然后測(cè)定摻入到新翻譯蛋白質(zhì)中的放射性同位素標(biāo)記氨基酸的量。摻入試驗(yàn)將測(cè)定體外翻譯反應(yīng)所產(chǎn)生的所有蛋白質(zhì)，包括截短的蛋白質(zhì)產(chǎn)物中放射性同位素標(biāo)記氨基酸的量。還可進(jìn)一步在蛋白質(zhì)凝膠上分離放射性同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)，并通過放射自顯影證實(shí)產(chǎn)物大小合適且沒有產(chǎn)生次級(jí)蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
反應(yīng)的體積和幾何學(xué)雖然這些反應(yīng)可以是任何體積，但該方法對(duì)于放大反應(yīng)特別有利，此時(shí)的反應(yīng)體積至少為約15微升，通常至少約50微升，更經(jīng)常至少約100微升，可以是500微升，1000微升，5000微升或更多。許多例子中，盡管可平行運(yùn)行多個(gè)反應(yīng)，但各反應(yīng)將不超過約10毫升。然而，還考慮本發(fā)明能夠放大到很大體積，如采用市售的生物反應(yīng)器，其體積可以是1升、10升、100升、1000升或更大。盡管反應(yīng)混合物中可包含脂質(zhì)，例如反向載體(inverted vesicle)，但脂雙層通常不會(huì)結(jié)合在表面上。
術(shù)語“小規(guī)?！痹诒疚闹兄阜磻?yīng)體積約為或小于約15微升。如上所述，本發(fā)明的方法如上所述能夠“放大”反應(yīng)而維持相當(dāng)于小規(guī)模反應(yīng)的基本上一致的產(chǎn)量。產(chǎn)量可通過任何常規(guī)方法計(jì)算，只要該方法可在各反應(yīng)之間相一致地使用，例如，合成的總蛋白質(zhì)/毫升反應(yīng)混合物；合成的可溶性蛋白質(zhì)/毫升反應(yīng)混合物；合成的生物活性蛋白質(zhì)/毫升反應(yīng)混合物等。與相當(dāng)?shù)男∫?guī)模反應(yīng)(即包含有同反應(yīng)物僅體積不同的反應(yīng))相比，放大反應(yīng)的產(chǎn)量通常是其產(chǎn)量的至少約90％，更通常至少約95％；可以是至少約99％。一些情況下，已觀察到本發(fā)明放大反應(yīng)混合物的產(chǎn)量實(shí)際上提高了。
該系統(tǒng)可在有氧和無氧條件下運(yùn)行，優(yōu)選在有氧條件下運(yùn)行。為防止反應(yīng)物干燥，頂部空間可充滿濕氣，通常在工作溫度下至少約80％飽和，更通常在工作溫度下至少約90％飽和濕度。在實(shí)驗(yàn)室條件下，這通常足以密閉反應(yīng)室的頂部空間?？稍诜磻?yīng)室的頂部空間充入氧氣，或者將氧氣注入反應(yīng)混合物中。氧氣可連續(xù)供給，或者，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)可在蛋白質(zhì)表達(dá)階段在反應(yīng)室的頂部空間重新充入氧氣。除氧氣外，也可為已經(jīng)誘導(dǎo)了合適呼吸途徑的細(xì)胞提取物提供其它電子受體，如硝酸鹽。
可為鼓泡柱涉及提供充氣反應(yīng)條件。在鼓泡柱中，氣體被鼓入或噴射入裝有液體的容器中?？稍诶绻呐葜鶅?nèi)的液相中噴射氣體以使氣體分散成氣泡。氣體，例如氧氣或含有氧氣的混合氣，可通過覆蓋鼓泡柱以及氣升式反應(yīng)器所有區(qū)域的分布板分散成氣泡，其中，空氣通過設(shè)計(jì)成能賦予整個(gè)容器以某種類型整體循環(huán)模式的環(huán)管或?qū)Я鞴芏拗圃谕ǖ乐小１绢I(lǐng)域已知有許多柱式構(gòu)造，其大小、塔板、頂部空間等可以不同。例如可見《鼓泡柱反應(yīng)》(Bubble Column Reactions)，第一版；Wolf-Dieter Deckwer(Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH，Braunschweig，德國(guó))ISBN0471918113；Oldshue(1983)Biotechnol Adv.1(1)17-30；Poulsen和Iversen(1999)Biotechnol Bioeng.64(4)452-8；Poulsen和Iversen(1998)Biotechnol Bioeng.58(6)633-41；等等；在此納入本文作為參考。
應(yīng)理解，本發(fā)明不限于上述具體的方法、方案、細(xì)胞系、動(dòng)物的種或?qū)?、?gòu)建物和試劑，這些當(dāng)然都可以改變。還應(yīng)該理解，本文所用的術(shù)語只是為了描述具體的實(shí)施方式而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由附加的權(quán)利要求限制。
除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的意義相同。雖然可采用與本文所述相似或等價(jià)的任何方法、裝置和材料來實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明，當(dāng)本發(fā)明所述的是優(yōu)選的方法、裝置和材料。
本文述及的所有出版物為了描述和公開的目的而納入本文作為參考，例如出版物中所述可能與本文所述發(fā)明聯(lián)合使用的細(xì)胞系、構(gòu)建物和方法。提供以上和本文中述及的出版物僅是因?yàn)樗鼈兊墓_早于本申請(qǐng)的提交日期。本文沒有什么可認(rèn)為是由于在先發(fā)明而使本發(fā)明人不具先于這些公開的資格。
提供以下實(shí)施例是為向本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員完全公開并描述如何制造和使用本發(fā)明，而非要限制本發(fā)明的范圍。我們努力保證使用數(shù)值(例如，量、溫度、濃度等)的精確性，但應(yīng)該允許有一些實(shí)驗(yàn)失誤和偏差。除非另有指出，部分是以重量計(jì)的部分，分子量是平均分子量、溫度是攝氏度、壓力是大氣壓或接近大氣壓。
實(shí)施例實(shí)施例1
測(cè)試了在無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中加入消泡劑(的作用)。在PANOx(Kim和Swartz2001 Biotechnol.Bioengineer.74309-316)無細(xì)胞系統(tǒng)中加入5種不同的消泡劑，發(fā)現(xiàn)這5種消泡劑能夠提高總的、可溶性和活性大腸桿菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)的產(chǎn)量(圖1)。圖2顯示了鼓泡式反應(yīng)器的基本輪廓。圖3和4比較了大規(guī)模鼓泡式反應(yīng)器和小規(guī)模離心管內(nèi)的GMCSF-VL-VH哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)構(gòu)建物和CAT的產(chǎn)量。試劑列于表1，反應(yīng)組分列于表2和3。
對(duì)于cytomim系統(tǒng)，以標(biāo)示濃度(Jewett和Swartz，待批申請(qǐng)10/643,683)混合表2所列的組分。對(duì)于PANOx系統(tǒng)，按Swartz和Kim(“無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成從糖酵解中間產(chǎn)物再生腺苷三磷酸”(Regeneration of Adenosine Triphosphate from GlycolyticIntermediates for Cell-Free Protein Synthesis”，Biotechnology and Bioengineering，74(4)，2001/8/20)所述濃度混合物表3所列組分。
為表達(dá)CAT蛋白，該系統(tǒng)中用作模板的DNA是含有T7啟動(dòng)子和之后的大腸桿菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶蛋白編碼基因的pK7-CAT環(huán)狀質(zhì)粒。該結(jié)構(gòu)基因之后是T7終止子。
為表達(dá)GMCSF-scFv蛋白，該系統(tǒng)中用作模板的DNA是pK7-GMCSF-VL-VH環(huán)狀質(zhì)粒，它含有T7啟動(dòng)子和之后的GMCSF蛋白(Mi-Hua Tao，1993)編碼基因，并通過一個(gè)5氨基酸接頭(甘氨酸4-絲氨酸)融合于鼠淋巴瘤抗體38C13(Hakim，1996)scFv片段的編碼基因。該結(jié)構(gòu)基因之后是T7終止子。
按照Pratt(1984)的方法制備了大腸桿菌K12(A19菌株)的S30細(xì)胞提取物。勻漿后在細(xì)胞溶解產(chǎn)物中不加入DL-二硫蘇糖醇。按照Davanloo等(1984)的方法制備了大腸桿菌菌株BL21(pAR1219)培養(yǎng)物中的T7 RNA聚合酶。
為表達(dá)GMCSF-VL-VH，用以下添加物修飾該表達(dá)系統(tǒng)以增強(qiáng)蛋白質(zhì)折疊和二硫鍵形成。無細(xì)胞提取物在室溫用0.85mM碘乙酰胺(IAM)預(yù)處理30分鐘然后再加入反應(yīng)混合物中。大腸桿菌DsbC以50微克/毫升的濃度加入。在反應(yīng)混合物中加入濃度分別為4mm和1mm的氧化和還原的谷胱甘肽。
大腸桿菌DsbC通過過度表達(dá)菌株BL21(DE3)(pETDsbC)制備，并用鈷IMAC柱純化。選擇的組分用含有5mMDTT的S30緩沖液(Pratt，1984)透析以還原DsbC的活性位點(diǎn)。
消泡劑購自上述廠商，按標(biāo)示量加入。一些情況下，消泡劑用水稀釋，如在每15微升無細(xì)胞反應(yīng)物中加入1微升消泡劑/水混合物。
對(duì)于離心管法，用移液管將適量混合物加到離心管底部。37℃培育試管試管適當(dāng)時(shí)間(PANOx培育3小時(shí)，Cytomim系統(tǒng)培育6小時(shí))。
表1
表2Cytomim無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的試劑構(gòu)成和濃度
表3PANOx無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的試劑構(gòu)成和濃度
鼓泡柱反應(yīng)器由內(nèi)徑1厘米、高5厘米的圓柱構(gòu)成。用移液管將無細(xì)胞反應(yīng)混合物(表1和2)加入該柱中(圖2)。通過柱底部與壓縮空氣罐相連的小噴嘴(直徑小于1毫米)鼓入氣體氣泡。
對(duì)于Cytomim系統(tǒng)(如Jewett和Swartz的待批申請(qǐng)10/643,683所述)，使用純氧氣體，37℃持續(xù)反應(yīng)最多4小時(shí)。對(duì)于PANOx反應(yīng)，使用氬氣，37℃進(jìn)行反應(yīng)3小時(shí)。氣泡直徑約為0.5厘米，鼓泡速度約為每秒1個(gè)氣泡。不加入消泡劑時(shí)，無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的泡沫立即溢出該柱反應(yīng)器頂部。加入消泡劑(Sigma 204，1/1000-1/10000消泡劑體積/反應(yīng)體積)，蛋白質(zhì)合成反應(yīng)能以產(chǎn)生最小氣泡進(jìn)行約3.5-4小時(shí)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)量與15微升離心管反應(yīng)的相當(dāng)(見圖3和4)。
通過用液體閃爍計(jì)數(shù)器(LS3801，Beckman Coulter，Inc.)測(cè)量TCA沉淀物的放射性估計(jì)出合成的蛋白質(zhì)量。4℃以15,000 RCF離心樣品15分鐘后取出上清，用于TCA沉淀和閃爍計(jì)數(shù)測(cè)量可溶性蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。該過程先前已有詳細(xì)描述(Kim等，1996b)。
顯示了CAT和GM-CSF-scFv融合蛋白的結(jié)果。整個(gè)反應(yīng)以分批模式進(jìn)行，反應(yīng)開始后不再加入試劑。
這些數(shù)據(jù)證明，對(duì)于不同規(guī)模、不同反應(yīng)體積和不同的蛋白質(zhì)，加入消泡劑能提高體外蛋白質(zhì)的合成。具體地說，消泡劑能提高用鼓泡柱放大的反應(yīng)的產(chǎn)量。
權(quán)利要求
1.一種增強(qiáng)生物大分子體外合成的方法，所述方法包括在含有消泡劑的反應(yīng)混合物中合成所述生物大分子。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物大分子的合成包括翻譯mRNA以產(chǎn)生多肽。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述合成還包括從DNA模板轉(zhuǎn)錄mRNA。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)混合物的體積大于約15微升。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)混合物的體積大于約100微升。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)的產(chǎn)率至少相當(dāng)于相應(yīng)的小規(guī)模反應(yīng)產(chǎn)率的90％。
7.一種體外合成生物大分子的反應(yīng)混合物，其改進(jìn)之處在于，所述反應(yīng)混合物含有消泡劑。
8.如權(quán)利要求7所述的反應(yīng)混合物，其特征在于，所述反應(yīng)混合物的體積大于約15微升。
9.如權(quán)利要求7所述的反應(yīng)混合物，其特征在于，所述反應(yīng)混合物的體積大于約100微升。
10.如權(quán)利要求7所述的反應(yīng)混合物，其特征在于，所述反應(yīng)的產(chǎn)率至少相當(dāng)于相應(yīng)的小規(guī)模反應(yīng)產(chǎn)率的90％。
全文摘要
提供了在含有消泡劑的反應(yīng)混合物中體外合成生物分子的組合物和方法。所述含有消泡劑的反應(yīng)混合物可以是放大規(guī)模的反應(yīng)，例如其反應(yīng)體積大于至少約15微升。所述反應(yīng)可以在各種反應(yīng)器中進(jìn)行，如本領(lǐng)域所知，包括攪拌式反應(yīng)器、鼓泡式柱反應(yīng)器等。
文檔編號(hào)C12N15/00GK1934276SQ200580009464
公開日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2005年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月25日
發(fā)明者A·M·沃洛新, J·R·斯沃茨 申請(qǐng)人:利蘭·斯坦福青年大學(xué)托管委員會(huì)