用嵌入染料標(biāo)記的探針檢測(cè)dna擴(kuò)增的方法

專利名稱：用嵌入染料標(biāo)記的探針檢測(cè)dna擴(kuò)增的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用嵌入染料標(biāo)記的探針檢測(cè)核酸擴(kuò)增的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟i)制備含有核酸、擴(kuò)增所述核酸的一對(duì)引物、熒光探針、4種核苷酸和DNA聚合酶的水性緩沖液，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；ii)加熱步驟i)中制備的水性緩沖液至93-96℃使所述雙鏈核酸變性成為單鏈；iii)將步驟ii)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈與所述引物對(duì)退火；iv)將步驟iii)中獲得的溶液加熱至70-74℃從而復(fù)制所述單鏈核酸；v)加熱步驟iv)中獲得的溶液至93-96℃使所述復(fù)制的核酸變性成為單鏈；vi)將步驟v)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈核酸與所述熒光探針退火；vii)測(cè)量步驟vi)所得溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度；和viii)重復(fù)步驟iv)-vii)一次以上。
背景技術(shù)：
常規(guī)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)通過(guò)分析分離自瓊脂糖凝膠的PCR產(chǎn)物可提供一些僅與擴(kuò)增部分的大小有關(guān)的信息。擴(kuò)增部分的堿基序列信息僅能推測(cè)。
當(dāng)懷疑瓊脂糖凝膠中分離的PCR產(chǎn)物條帶的特異性時(shí)，需要分析對(duì)應(yīng)條帶的堿基序列或者用同位素標(biāo)記的探針進(jìn)行southern印跡分析。
然而，證實(shí)可疑條帶特異性的實(shí)驗(yàn)需要花費(fèi)2或3天以上。
此外，在不同條件下需要控制探針退火所需的嚴(yán)謹(jǐn)性。
因此，為克服常規(guī)終點(diǎn)檢測(cè)的缺點(diǎn)開(kāi)發(fā)了實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，其中，通過(guò)分析由每輪PCR循環(huán)獲得的信號(hào)可精確計(jì)算樣品中存在的核酸的濃度?，F(xiàn)在，通過(guò)采用特定探針的實(shí)時(shí)PCR技術(shù)可獲得精確、即時(shí)、靈敏的結(jié)果。
在常規(guī)PCR方法中加入定量分析功能的實(shí)時(shí)PCR是一種新的方法，它能夠自動(dòng)完成一些常規(guī)程序，并且能夠通過(guò)降低可能誤差提供精確結(jié)果。
在這種實(shí)時(shí)PCR技術(shù)中，采用熒光報(bào)告染料來(lái)監(jiān)測(cè)整個(gè)反應(yīng)的所有過(guò)程。
擴(kuò)增樣品發(fā)出的熒光強(qiáng)度與每輪PCR積累的擴(kuò)增產(chǎn)物的量成比例增加。即便檢測(cè)器無(wú)法檢測(cè)PCR早期階段的熒光，但隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的累積，則可檢測(cè)累積的熒光。
循環(huán)閾值(threshold cycle)(C(T))是當(dāng)熒光強(qiáng)度可檢測(cè)時(shí)該時(shí)間點(diǎn)上的擴(kuò)增頻率。
建立了核酸初始量的對(duì)數(shù)值和循環(huán)閾值之間的比例關(guān)系。
因此，通過(guò)測(cè)量已知核酸初始量的樣品的循環(huán)閾值可建立標(biāo)準(zhǔn)校正曲線。通過(guò)參照所述標(biāo)準(zhǔn)校正曲線可正確計(jì)算未知核酸初始量的樣品中的核酸初始量。
同時(shí)，可通過(guò)分析獲自每輪實(shí)時(shí)PCR的樣品計(jì)算樣品中核酸正確濃度的方法是例如以下方法采用Taqman探針的方法(Holland等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA887276-7280；Lee等，1993，Nucleid Acids Res.213761-3776)，采用Molecular Beacon探針的方法(Tyagi & Kramer 1996，Nature Biotech.14303-309，US 5,119,801，USP5,312,728)，采用SYBR Green I等嵌入劑的方法和采用相鄰雜交探針的方法(USP5,210,015)。
TaqMan探針是一種5’末端連接有報(bào)告染料(6-FAM、JOE、VIC、HEX、TET、熒光素、Cy-染料)同時(shí)3’末端連接有猝滅劑(TAMRA)的探針。
由于該探針的3’末端被封閉因此它不能起引物作用，所以DNA合成不能從探針的3’末端開(kāi)始。天然Taq酶具有5’核酸酶活性，它具有除去與模板DNA雜交的下游DNA的功能。
當(dāng)下游DNA的5’末端是雙鏈DNA同時(shí)Taq酶結(jié)合在上游DNA的3-OH上時(shí)可激活Taq酶的5’核酸酶功能(Livak，K.J.，J.Marmaro和S.Flood.1995.Guidelines fordesigning Taqman fluorescent probes for 5’nuclease assays(5’核酸酶試驗(yàn)的Taqman熒光探針設(shè)計(jì)指南)，Research news.PE Applied Biosystems，F(xiàn)oster city，CA)。
當(dāng)DNA復(fù)制開(kāi)始時(shí)，Taq酶的5’核酸酶活性將探針的5’末端除去。
TaqMan探針的熒光強(qiáng)度(FI)與報(bào)告染料和猝滅劑之間距離(R)與6的乘積成反比。在探針的5’末端被Taq酶除去之前，報(bào)告染料的信號(hào)受到熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的中斷。然而，該探針的5’末端被除去后猝滅劑染料從探針的5’末端釋放出來(lái)，報(bào)告染料即可發(fā)射光。
當(dāng)合成了一個(gè)靶DNA分子時(shí)，一個(gè)探針?lè)肿拥?’末端被除去，使報(bào)告染料與猝滅劑染料分離(USP 5,763,181，USP 5,691,146等)。因此，報(bào)告染料的信號(hào)與擴(kuò)增的DNA的量成比例增加。
即便采用TaqMan法無(wú)法獲得擴(kuò)增的DNA的大小信息，采用具有非常高特異性的TaqMan探針也能知道有關(guān)堿基序列和擴(kuò)增的DNA的量的信息。
然而，由于探針由至少20個(gè)堿基構(gòu)成，TaqMan探針?lè)o(wú)法很好地猝滅報(bào)告染料。此外，TaqMan探針的制造困難且昂貴。
采用Molecular Beacon探針的方法被用于分析特定DNA和檢測(cè)活細(xì)胞中的RNA。Molecular Beacon探針具有發(fā)夾形結(jié)構(gòu)。Molecular Beacon探針的根部是與至少部分靶核酸互補(bǔ)的單鏈核酸。Molecular Beacon探針的莖部通過(guò)退火探針兩端的互補(bǔ)臂序列形成(Tyagi，S.和F，R，Kramer.1996，Molecular beacons that fluoresce uponhybridization(雜交時(shí)發(fā)出熒光的Molecular beacon)，Nat.，Biotechnol.，1649)。
Molecular Beacon探針5’末端的報(bào)告染料選自得克薩斯紅(Texas Red)、若丹明紅(Rodamin Red)、FAM、HEX、TET、ROX、TAMRA、熒光素或俄勒岡綠(Oregon green)等，Molecular Beacon探針3’末端的猝滅劑是DABSYL[4-(4′-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸]。
當(dāng)Molecular Beacon探針未與靶核酸雜交時(shí)不能發(fā)出熒光。因此可簡(jiǎn)化探針的檢測(cè)過(guò)程。
當(dāng)莖部的報(bào)告染料和猝滅劑染料相互接近時(shí)，報(bào)告染料的熒光被猝滅。然而，當(dāng)接觸靶核酸時(shí)，與靶核酸形成了更加長(zhǎng)久且穩(wěn)定的雜交而不是與其自身的臂序列雜交。因此，報(bào)告染料不接近猝滅劑，可檢測(cè)出熒光。
然而，由于要將探針與靶核酸分離，采用Molecular Beacon探針的方法不方便(Matsuo，T.1998.In situ visualization of messenger RNA for basic fibroblast growth factorin livingcells(在活細(xì)胞中原位顯示堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的信使RNA).Biochim.Biophys.Acta 1379178-184)。此外，由于Molecular Beacon探針由至少30-40個(gè)堿基構(gòu)成，其制造困難且昂貴。
另一種分析方法是使用相鄰雜交探針的方法。該方法采用了設(shè)計(jì)與靶核酸雜交的頭-尾排列的兩個(gè)探針。
在該方法中，探針的3’末端結(jié)合熒光供體，另一探針的5’末端結(jié)合熒光受體。因此，當(dāng)熒光供體和熒光受體靠近時(shí)發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移，同時(shí)供體的發(fā)射光作為受體的激發(fā)光。
來(lái)自受光源激發(fā)的供體的能量被轉(zhuǎn)移到受體，同時(shí)受體發(fā)出熒光。熒光強(qiáng)度與和擴(kuò)增的核酸雜交的探針的量成比例。該方法被用來(lái)檢測(cè)DNA和核酸的單堿基修飾。
然而，由于該方法需要4種引物因此該方法的過(guò)程復(fù)雜。此外，這種方法的特異性水平低(Heller，M.J.和L.E.Morrison.1985.Chemiluminescent and fluorescence probesfor DNA hybridization(DNA雜交的化學(xué)發(fā)光和熒光探針)，刊于D.T.Kinsbury和S.Flakow編的Rapid Detection and Identification of Infectious Agents(感染劑的快速檢測(cè)和鑒定)一書(shū)第245-256頁(yè)，Academic Press，紐約)。
再其它的分析方法是采用SYBR Green I、Foerst 33228、溴化乙錠(EtBr)等嵌入染料的方法。
該方法可用于多種樣品，只要該方法的嵌入染料能夠結(jié)合無(wú)特定靶序列的雙鏈DNA。
在采用嵌入染料的方法中，由于易于制造探針以及將探針與核酸分離，因此其過(guò)程簡(jiǎn)單。同時(shí)，由于過(guò)程易于控制，因此容易獲得特定步驟的信號(hào)。
然而，該方法的缺點(diǎn)在于，容易產(chǎn)生引物的擴(kuò)增產(chǎn)物、非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物等。由于所述背景噪音，需要測(cè)量擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度并通過(guò)分析解鏈曲線證實(shí)PCR獲得的產(chǎn)物(Higuchi，R.，Dollinger，G.，Walsh，P.S.和Griffith，R.1992.Simultaneousamplication and detection of specific DNA sequences(同時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)特定DNA序列)，Biotechnology 10413，Higuchi，R.，F(xiàn)ockler，C，Dollinger，G.和Watson，R.1993，kinetic PCRReal monitoring of DNA amplication reactions(實(shí)時(shí)監(jiān)控DNA擴(kuò)增反應(yīng)的動(dòng)態(tài)PCR).Biotechnology 111026)。
為克服上述問(wèn)題，本發(fā)明的發(fā)明人者試圖開(kāi)發(fā)一種新型探針和檢測(cè)擴(kuò)增核酸的方法，該方法能迅速分析擴(kuò)增的核酸，同時(shí)探針制造和分析過(guò)程簡(jiǎn)單易行。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)解決方案本發(fā)明的主要目的是提供用于實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增核酸的熒光探針，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種核酸擴(kuò)增的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟i)制備含有核酸、擴(kuò)增所述核酸的一對(duì)引物、熒光探針、4種核苷酸和DNA聚合酶的水性緩沖液，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；ii)加熱步驟i)中制備的水性緩沖液至93-96℃使所述雙鏈核酸變性成為單鏈；iii)將步驟ii)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈與所述引物對(duì)退火；iv)將步驟iii)中獲得的溶液加熱至70-74℃從而復(fù)制所述單鏈核酸；v)加熱步驟iv)中獲得的溶液至93-96℃使所述復(fù)制的核酸變性成為單鏈；vi)將步驟v)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈核酸與所述熒光探針退火；vii)測(cè)量步驟vi)所得溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度；和viii)重復(fù)步驟iv)-vii)一次以上。
本發(fā)明的其它目的是提供一種樣品中核酸初始量的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟i)制備含有核酸、擴(kuò)增所述核酸的一對(duì)引物、熒光探針、4種核苷酸和DNA聚合酶的水性緩沖液，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；ii)加熱步驟i)中制備的水性緩沖液至93-96℃使所述雙鏈核酸變性成為單鏈；iii)將步驟ii)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈與所述引物對(duì)退火；iv)將步驟iii)中獲得的溶液加熱至70-74℃從而復(fù)制所述單鏈核酸；v)加熱步驟iv)中獲得的溶液至93-96℃使所述復(fù)制的核酸變性成為單鏈；vi)將步驟v)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈核酸與所述熒光探針退火；vii)測(cè)量步驟vi)所得溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度；viii)重復(fù)步驟iv)-vii)一次以上；ix)利用已知核酸初始量的樣品建立表明核酸初始量的對(duì)數(shù)值和實(shí)施上述步驟i)-ix)所顯示的循環(huán)閾值之間相關(guān)性的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線；和x)參照步驟ix)中獲得的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，根據(jù)與實(shí)施步驟i)-ix)所獲得的循環(huán)閾值相對(duì)應(yīng)的對(duì)數(shù)值檢測(cè)核酸的初始量。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種擴(kuò)增核酸的組合物，該組合物包含i)擴(kuò)增所述核酸的一對(duì)引物；ii)熒光探針，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；iii)DNA聚合酶，和iv)4種核苷酸。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種核酸擴(kuò)增的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟i)制備含有核酸、擴(kuò)增所述核酸的一對(duì)引物、反轉(zhuǎn)錄引物、熒光探針、4種核苷酸、DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶的水性緩沖液，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；ii)將步驟i)中制備的水性緩沖液加熱至42-50℃從而復(fù)制單鏈cDNA；iii)將所述步驟ii)中獲得的溶液加熱至93-96℃從而使所述單鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄引物和反轉(zhuǎn)錄酶變性；iv)將所述步驟iii)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈核酸與所述引物對(duì)退火；v)將所述步驟iv)中獲得的溶液加熱至70-74℃從而復(fù)制所述單鏈核酸；vi)加熱所述步驟v)中獲得的溶液至93-96℃使所述復(fù)制的核酸變性成為單鏈；vii)將所述步驟vi)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈核酸與所述熒光探針退火；viii)測(cè)量步驟vii)所得溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度；和ix)重復(fù)步驟v)-viii)一次以上。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種樣品中核酸初始量的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟i)制備含有核酸、擴(kuò)增所述核酸的一對(duì)引物、反轉(zhuǎn)錄引物、熒光探針、4種核苷酸、DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶的水性緩沖液，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；ii)將步驟i)中制備的水性緩沖液加熱至42-50℃從而復(fù)制單鏈cDNA；iii)將所述步驟ii)中獲得的溶液加熱至93-96℃從而使所述單鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄引物和反轉(zhuǎn)錄酶變性；iv)將所述步驟iii)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈核酸與所述引物對(duì)退火；v)將所述步驟iv)中獲得的溶液加熱至70-74℃從而復(fù)制所述單鏈核酸；vi)加熱所述步驟v)中獲得的溶液至93-96℃使所述復(fù)制的核酸變性成為單鏈；vii)將所述步驟vi)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈核酸與所述熒光探針退火；viii)測(cè)量步驟vii)所得溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度；ix)重復(fù)步驟v)-viii)一次以上；x)利用已知核酸初始量的樣品建立表明核酸初始量的對(duì)數(shù)值和實(shí)施上述步驟i)-ix)所顯示的循環(huán)閾值之間相關(guān)性的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線；和xi)參照步驟ix)中獲得的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，根據(jù)與實(shí)施步驟i)-ix)所獲得的循環(huán)閾值相對(duì)應(yīng)的對(duì)數(shù)值檢測(cè)核酸的初始量。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種擴(kuò)增核酸的組合物，該組合物包含i)擴(kuò)增所述核酸的一對(duì)引物；ii)反轉(zhuǎn)錄引物iii)熒光探針，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；iv)DNA聚合酶；v)反轉(zhuǎn)錄酶，和iv)4種核苷酸。
本發(fā)明的上述目的可通過(guò)提供用于實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增核酸的熒光探針實(shí)現(xiàn)，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化。
該熒光探針由10-40個(gè)堿基構(gòu)成，其3’末端被封閉從而不能從3’末端開(kāi)始復(fù)制。
優(yōu)選地，所述探針包含選自Seq.ID Nos.1-22的堿基序列。
同時(shí)，探針的嵌入染料起熒光染料作用，所述嵌入染料宜選自吖啶同型二聚體及其衍生物、吖啶橙及其衍生物、7-氨基放線菌素D及其衍生物、放線菌素D及其衍生物、ACMA(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)及其衍生物、DAPI及其衍生物、二氫乙錠(Dihydroethidium)及其衍生物、溴化乙錠及其衍生物、EthD-1及其衍生物、EthD-2及其衍生物、單疊氮乙錠(Ethidium monoazide)及其衍生物、碘化己錠(Hexidium iodide)及其衍生物、雙苯酰亞胺(Hoechst 33258)及其衍生物、Hoechst 33342及其衍生物、Hoechst 34580及其衍生物、羥蔗脒(hydroxystilbamidine)及其衍生物、LDS 751及其衍生物、碘化丙錠(PI)及其衍生物或Cy-染料(Cy-dyes)衍生物。
熒光染料可與探針寡核苷酸5’末端區(qū)域、3’末端區(qū)域和中間區(qū)域至少之一相連，并通過(guò)通過(guò)使所述熒光染料結(jié)合或取代所述寡核苷酸中的堿基而標(biāo)記所述寡核苷酸。
本發(fā)明的另一個(gè)目的可通過(guò)提供一種核酸擴(kuò)增的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)，該方法包括以下步驟i)制備含有核酸、擴(kuò)增所述核酸的一對(duì)引物、熒光探針、4種核苷酸和DNA聚合酶的水性緩沖液，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；ii)加熱步驟i)中制備的水性緩沖液至93-96℃使所述雙鏈核酸變性成為單鏈；iii)將步驟ii)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈與所述引物對(duì)退火；iv)將步驟iii)中獲得的溶液加熱至70-74℃從而復(fù)制所述單鏈核酸；v)加熱步驟iv)中獲得的溶液至93-96℃使所述復(fù)制的核酸變性成為單鏈；vi)將步驟v)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈核酸與所述熒光探針退火；vii)測(cè)量步驟vi)所得溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度；viii)重復(fù)步驟iv)-vii)一次以上.
在所述擴(kuò)增核酸的檢測(cè)方法中，步驟vii)可與步驟vi)同時(shí)進(jìn)行。同時(shí)，所述熒光探針可與至少部分區(qū)域雜交，所述區(qū)域距離結(jié)合有所述引物3’末端的堿基1-15個(gè)堿基本發(fā)明的另一個(gè)目的可通過(guò)提供一種樣品中核酸初始量的檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)，該方法包括以下步驟i)制備含有核酸、擴(kuò)增所述核酸的一對(duì)引物、熒光探針、4種核苷酸和DNA聚合酶的水性緩沖液，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；ii)加熱步驟i)中制備的水性緩沖液至93-96℃使所述雙鏈核酸變性成為單鏈；iii)將步驟ii)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈與所述引物對(duì)退火；iv)將步驟iii)中獲得的溶液加熱至70℃-74℃從而復(fù)制所述單鏈核酸；v)加熱步驟iv)中獲得的溶液至93-96℃使所述復(fù)制的核酸變性成為單鏈；vi)將步驟v)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈核酸與所述熒光探針退火；vii)測(cè)量步驟vi)所得溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度；viii)重復(fù)步驟iv)-vii)一次以上；ix)利用已知核酸初始量的樣品建立表明核酸初始量的對(duì)數(shù)值和實(shí)施上述步驟i)-ix)所顯示的循環(huán)閾值之間相關(guān)性的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線；和x)參照步驟ix)中獲得的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，根據(jù)與實(shí)施步驟i)-ix)所獲得的循環(huán)閾值相對(duì)應(yīng)的對(duì)數(shù)值檢測(cè)核酸的初始量。
循環(huán)閾值(C(T))是當(dāng)熒光強(qiáng)度可檢測(cè)時(shí)該時(shí)間點(diǎn)上的擴(kuò)增頻率。
建立了核酸初始量的對(duì)數(shù)值和循環(huán)閾值之間的比例關(guān)系。
線性(R_2)表示靶核酸初始量的對(duì)數(shù)值與獲自實(shí)時(shí)PCR的循環(huán)閾值之間有比例關(guān)系。
當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)校正曲線的線性(R_2)接近1.0時(shí)便可正確計(jì)算未知樣品中的核酸初始量。參考標(biāo)準(zhǔn)校正曲線可知未知樣品中的核酸初始量。
通過(guò)測(cè)量已知樣品中核酸初始量的對(duì)數(shù)值和通過(guò)上述步驟i)-ix)的表現(xiàn)顯示的循環(huán)閾值可獲得標(biāo)準(zhǔn)校正曲線。
本發(fā)明的另一個(gè)目的通過(guò)提供一種擴(kuò)增核酸的組合物實(shí)現(xiàn)，所述組合物包含i)擴(kuò)增所述核酸的一對(duì)引物；ii)熒光探針，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；iii)DNA聚合酶；和iv)4種核苷酸。
上述擴(kuò)增核酸的組合物可在真空中干燥。
本發(fā)明的另一個(gè)目的可通過(guò)提供一種核酸擴(kuò)增的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)，該方法包括以下步驟i)制備含有核酸、擴(kuò)增所述核酸的一對(duì)引物、反轉(zhuǎn)錄引物、熒光探針、4種核苷酸、DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶的水性緩沖液，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；ii)將步驟i)中制備的水性緩沖液加熱至42-50℃從而復(fù)制單鏈cDNA；iii)將所述步驟ii)中獲得的溶液加熱至93-96℃從而使所述單鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄引物和反轉(zhuǎn)錄酶變性；iv)將所述步驟iii)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈核酸與所述引物對(duì)退火；v)將所述步驟iv)中獲得的溶液加熱至70-74℃從而復(fù)制所述單鏈核酸；vi)加熱所述步驟v)中獲得的溶液至93-96℃使所述復(fù)制的核酸變性成為單鏈；vii)將所述步驟vi)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈核酸與所述熒光探針退火；viii)測(cè)量步驟vii)所得溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度；和ix)重復(fù)步驟v)-viii)一次以上。
本發(fā)明的另一個(gè)目的可通過(guò)提供一種樣品中核酸初始量的檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)，該方法包括以下步驟i)制備含有核酸、擴(kuò)增所述核酸的一對(duì)引物、反轉(zhuǎn)錄引物、熒光探針、4種核苷酸、DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶的水性緩沖液，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；ii)將步驟i)中制備的水性緩沖液加熱至42-50℃從而復(fù)制單鏈cDNA；iii)將所述步驟ii)中獲得的溶液加熱至93-96℃從而使所述單鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄引物和反轉(zhuǎn)錄酶變性；iv)將所述步驟iii)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈核酸與所述引物對(duì)退火；v)將所述步驟iv)中獲得的溶液加熱至70-74℃從而復(fù)制所述單鏈核酸；vi)加熱所述步驟v)中獲得的溶液至93-96℃使所述復(fù)制的核酸變性成為單鏈；vii)將所述步驟vi)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈核酸與所述熒光探針退火；viii)測(cè)量步驟vii)所得溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度；ix)重復(fù)步驟v)-viii)一次以上；x)利用已知核酸初始量的樣品建立表明核酸初始量的對(duì)數(shù)值和實(shí)施上述步驟i)-ix)所顯示的循環(huán)閾值之間相關(guān)性的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線；和xi)參照步驟ix)中獲得的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，根據(jù)與實(shí)施步驟i)-ix)所獲得的循環(huán)閾值相對(duì)應(yīng)的對(duì)數(shù)值檢測(cè)核酸的初始量。
本發(fā)明的再一個(gè)目的可通過(guò)提供一種擴(kuò)增核酸的組合物實(shí)現(xiàn)，該組合物包含i)擴(kuò)增所述核酸的一對(duì)引物；ii)反轉(zhuǎn)錄引物；iii)熒光探針，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；iv)DNA聚合酶；v)反轉(zhuǎn)錄酶，和iv)4種核苷酸。
本發(fā)明的反轉(zhuǎn)錄酶指依賴于RNA的DNA聚合酶。該酶從RNA模板合成cDNA(互補(bǔ)DNA)。
反轉(zhuǎn)錄酶通常在造成腫瘤的RNA病毒內(nèi)或在被RNA病毒感染的細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)。這種酶通常用于合成與mRNA相對(duì)應(yīng)的DNA的基因?qū)嶒?yàn)。
本發(fā)明的反轉(zhuǎn)錄酶宜選自MMLV(Moloney鼠白血病病毒)反轉(zhuǎn)錄酶、AMV(禽成髓細(xì)胞瘤病毒)反轉(zhuǎn)錄酶、RAV-2(2型Rous相關(guān)病毒)反轉(zhuǎn)錄酶或TTH(嗜熱棲熱菌(Thermus Thermophilus))反轉(zhuǎn)錄酶。
當(dāng)本發(fā)明的靶核酸是RNA時(shí)應(yīng)首先從RNA合成cDNA。可使引物與所述cDNA雜交并開(kāi)始復(fù)制。
在核酸解離成單鏈之后，可通過(guò)嵌入熒光染料檢測(cè)熒光強(qiáng)度。
因此，當(dāng)靶核酸是RNA時(shí)，可定量檢測(cè)核酸擴(kuò)增。
本發(fā)明是一種新的方法，它可檢測(cè)并定量分析通過(guò)實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增的核酸。當(dāng)本發(fā)明探針的嵌入染料被嵌入雙鏈核酸時(shí)，可檢測(cè)染料的熒光。熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增的DNA的量成比例，因此可定量分析擴(kuò)增的核酸。
本發(fā)明的方法可用于在體外或體內(nèi)監(jiān)測(cè)各種形式的核酸。例如，該方法可用于PCR、雜交、連接、剪切、重組、合成、測(cè)序、突變檢測(cè)、以及評(píng)估鉛(lead)、DNA、RNA和蛋白質(zhì)濃度的生物傳感器。
有益效果如上所述，與SYBR Green I、Foerst 33228、溴化乙錠(EtBr)等實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增核酸的方法不同，通過(guò)采用本發(fā)明可更加準(zhǔn)確地檢測(cè)PCR擴(kuò)增的核酸，同時(shí)，由于該方法不需要測(cè)量各種產(chǎn)物的解鏈溫度，因此節(jié)約了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
下文將參照以下實(shí)施例更加詳細(xì)地描述本發(fā)明。給出這些實(shí)施例只是為了闡述本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。
附圖簡(jiǎn)述通過(guò)詳細(xì)描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案和參照附圖將更容易明白本發(fā)明的上述目的和其它優(yōu)點(diǎn)，附圖中

圖1-2是本發(fā)明較佳實(shí)施方案過(guò)程的示意圖。
圖3顯示了通過(guò)質(zhì)譜儀測(cè)得的5’末端用DNA綠亞磷酰胺(DAN GREENphosphoramidite)標(biāo)記的寡核苷酸的分子量。
圖4顯示了通過(guò)質(zhì)譜儀測(cè)得的中間區(qū)域用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸的分子量。
圖5顯示了5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸與互補(bǔ)寡核苷酸雜交之后，通過(guò)熒光分光光度計(jì)在500-650nm下測(cè)得的熒光強(qiáng)度。
圖6顯示了5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸與互補(bǔ)寡核苷酸雜交之后，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR測(cè)得的解鏈曲線的熒光值。
圖7顯示了對(duì)5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行PCR之后，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度變化和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
圖8顯示了對(duì)陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行PCR之后，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度變化和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
圖9顯示了對(duì)中間區(qū)域用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行PCR之后，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度變化和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
圖10顯示了對(duì)5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行定量PCR之后，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度變化和標(biāo)準(zhǔn)校正曲線。
圖11顯示了對(duì)5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行定量PCR之后，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
圖12顯示了對(duì)中間區(qū)域用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行定量PCR之后，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度變化和標(biāo)準(zhǔn)校正曲線。
圖13顯示了對(duì)中間區(qū)域用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行定量PCR之后，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
圖14顯示了對(duì)5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行λDNA交叉污染PCR(lambda DNA cross-contamination PCR)之后，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度變化和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
圖15顯示了對(duì)中間區(qū)域用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行λDNA交叉污染PCR之后，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度變化和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
圖16顯示了對(duì)3’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行λDNA交叉污染PCR之后，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度變化和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
圖17顯示了對(duì)兩個(gè)末端(5’末端和3’末端)都用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行λDNA交叉污染PCR之后，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度變化和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
最佳實(shí)施方式實(shí)施例1.提取基因組DNA采用AccuPrep基因組DNA提取試劑盒提取結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的基因組DNA，如下所述。
在Ogawa培養(yǎng)基(谷氨酸鈉1g，KH2PO43g，蒸餾水100ml，雞蛋200ml，甘油6ml，2％孔雀綠溶液6ml)中培養(yǎng)結(jié)核桿菌(tubercle bacillus)，將5ml痰液加入含1ml TE(8.0)和300μl蛋白酶K(20μg/μl)的混合物中。
然后在混合物中加入4ml裂解緩沖液(4M尿素)。65℃攪拌所得混合物20分鐘。在混合物中加入結(jié)合緩沖液(7M鹽酸胍)。65℃再攪拌混合物20分鐘。在溶液中加入2.75ml異丙醇，2500rpm離心混合物5分鐘。
將上面獲得的750μl上層溶液倒入各個(gè)裝有玻璃濾器的結(jié)合柱試管，12,000rpm離心柱中所含的溶液1分鐘以除去流出液。然后在結(jié)合柱中倒入750μl洗滌緩沖液I(5M鹽酸胍)并將如此制得的混合物在13,000rpm再離心1分鐘以除去流出液。
在上面獲得的結(jié)合柱中所含的混合物中加入750μl洗滌緩沖液II(20mM NaCl)，然后12,000rpm離心1分鐘除去流出液。再將該柱12,000rpm離心2分鐘除去留在結(jié)合柱試管中的洗滌緩沖液。
將裝有玻璃濾器的結(jié)合柱放入1.5ml試管中。在裝有結(jié)合柱和玻璃濾器的所述1.5ml試管中倒入100μl洗脫緩沖液(10mM TrisHCl)。將試管在室溫靜置5分鐘。然后再將如此制得的混合物在12,000rpm離心2分鐘以除去流出液。實(shí)施例1中收集的DNA被用于實(shí)施例4-9。
實(shí)施例2.合成DNA綠亞磷酰胺按照美國(guó)專利No.6348596和No.6080868描述的方法制備含有具有化學(xué)式1的熒光物質(zhì)的亞磷酰胺。在本說(shuō)明書(shū)中，用于本發(fā)明的含有熒光物質(zhì)的亞磷酰胺是DNA綠亞磷酰胺。用于本發(fā)明的探針在所需位置用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記制成。
化學(xué)式1 式中，n是2、3、4或5。R1是-CH3、-CH2CH2CH2OH、-CH2CH2CH2CH2CH2CH2OH、-CH2CH2CO2H和-CH2CH2Br之一。R2是H、OH或NO2。CEP表示氰基乙氧基亞磷酰胺，DMT表示二甲氧基三苯甲基。
實(shí)施例3.設(shè)計(jì)引物和探針該實(shí)施例采用結(jié)核分枝桿菌的RpoB基因來(lái)制造本發(fā)明的引物和探針。
采用設(shè)計(jì)引物和探針的程序Beacon Designer 2.1(PREMIER Biosoft Internationalco.)來(lái)設(shè)計(jì)可與上述RpoB基因雜交的寡核苷酸(Seq.ID Nos.1-5，Seq.ID Nos.8-17，Seq.ID Nos.19-22)。制備的寡核苷酸示于表1和表2。
表1和表2的Seq.ID Nos.8-12是5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的熒光探針，“內(nèi)容”一欄中的數(shù)字表示堿基數(shù)。例如，29表示該寡核苷酸總共由29個(gè)堿基構(gòu)成，并在距離3’末端第28個(gè)堿基的5’末端通過(guò)在第29位堿基上的化學(xué)取代或加成用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記。
Seq.ID Nos.13-17包括在堿基序列的中間區(qū)域用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸，表1“內(nèi)容”一欄中的數(shù)字表示堿基數(shù)。例如，28表示該寡核苷酸總共由28個(gè)堿基構(gòu)成，并在距離探針3’末端的第10個(gè)堿基上通過(guò)化學(xué)取代或加成用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記。
Seq.ID No.21是3’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸，表2“內(nèi)容”一欄中的數(shù)字表示堿基數(shù)。例如，23表示該寡核苷酸總共由23個(gè)堿基構(gòu)成，并在距離5’末端第22個(gè)堿基的3’末端通過(guò)化學(xué)取代或加成用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記。
Seq.ID No.22是5’末端和3’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸，“內(nèi)容”一欄中的數(shù)字表示堿基數(shù)。例如，24表示該寡核苷酸總共由24個(gè)堿基構(gòu)成，其中，在22個(gè)堿基的5’末端和3’末端通過(guò)結(jié)合或取代第1個(gè)和第24個(gè)堿基而用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記。
同時(shí)，核酸擴(kuò)增需要兩個(gè)寡核苷酸作為引物。該寡核苷酸被成為正向引物和反向引物。在表1和表2中，F(xiàn)表示正向引物，R表示反向引物。在表1和表2中，Seq.ID Nos.1-2、Seq.ID Nos.3-4、Seq.ID Nos.6-7和Seq.ID Nos.19-20被用作引物。
Seq.ID Nos.8-17、Seq.ID No.20、Seq.ID No.21和Seq.ID No.22中的至少一個(gè)被用作熒光探針。所述探針包含其堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸。所述探針可與至少部分區(qū)域雜交，所述區(qū)域距離結(jié)合有所述引物3’末端的堿基1-15個(gè)堿基。其示意圖見(jiàn)圖1。
在Seq.ID Nos.13-17中，從寡核苷酸的3’末端開(kāi)始的第10個(gè)堿基被DNA綠亞磷酰胺取代，且該寡核苷酸可與擴(kuò)增DNA中的互補(bǔ)堿基序列雜交。求示意圖見(jiàn)圖2。
在Seq.ID No.21和Seq.ID No.22中，Seq.No.21的3’末端以及Seq.No.22的3’末端和5’末端被DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記，所述堿基序列被設(shè)計(jì)成與擴(kuò)增的DNA雜交。
同時(shí)，通過(guò)分析得自每輪實(shí)時(shí)PCR的樣品來(lái)檢測(cè)樣品中核酸精確量的常規(guī)方法例如有Taqman法(Holland等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887276-7280；Lee等，1993，Nucleid Acids Res.213761-3776)、Molecular Beacon法(Tyagi & Kramer1996，Nature Biotech.14303-309，US 5,119,801，USP 5,312,728)等。表1和表2中的Seq.ID No.5被用于MolecularBeacon法。
表3是按照波長(zhǎng)分類的熒光染料表。每種熒光染料都有特定的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。表3中的值表示最佳激發(fā)波長(zhǎng)。
寡核苷酸序列[表1]

寡核苷酸序列[表2]

按照波長(zhǎng)分類的熒光染料列表[表3]

實(shí)施例4.研究用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸通過(guò)核酸合成系統(tǒng)EXPEDITE(Perseptive Biosystems Co.)制備表1和表2的寡核苷酸序列。通過(guò)該系統(tǒng)制得的寡核苷酸的分子量用聚合物質(zhì)譜儀Axima-LNR(Maldi-Tof，SHIMADZU Co.)測(cè)量。
Maldi-Tof(襯質(zhì)輔助激光解吸與電離-飛行時(shí)間)是一種通過(guò)分析實(shí)測(cè)分子量和從寡核苷酸重量得到的預(yù)測(cè)分子量來(lái)測(cè)量脫嘌呤寡核苷酸修飾率、N-1失效的(failed)寡核苷酸以及各種修飾多核苷酸的裝置。
表1和表2中Seq.ID Nos.8-12所示寡核苷酸中的至少一種被用于本實(shí)施例。
如圖3所示，通過(guò)聚合物質(zhì)譜儀測(cè)得的Seq.ID No.8的分子量顯示，預(yù)測(cè)分子量(8941.2克/摩爾)和測(cè)量分子量(8914.6克/摩爾)類似。X軸表示測(cè)量分子量除以寡核苷酸電荷的結(jié)果。Y軸表示以百分?jǐn)?shù)為單位測(cè)得的寡核苷酸強(qiáng)度。
峰1指出了靶寡核苷酸的分子量。峰2指出了測(cè)量分子量除以電荷值2的結(jié)果。
表1和表2中Seq.ID Nos.13-17所示寡核苷酸中的至少一種被用于本實(shí)施例。如圖4所示，通過(guò)聚合物質(zhì)譜儀測(cè)得的Seq.ID No.16的分子量顯示預(yù)測(cè)分子量(6868.0克/摩爾)和測(cè)量分子量(6861.8克/摩爾)類似。X軸表示測(cè)量分子量除以寡核苷酸電荷的結(jié)果。Y軸表示以百分?jǐn)?shù)為單位測(cè)得的寡核苷酸強(qiáng)度。
峰1指出了靶寡核苷酸的分子量。峰2指出了測(cè)量分子量除以電荷值2的結(jié)果。
用熒光分光光度計(jì)(RF-5301PC，SHIMADZU Co.)再次測(cè)量用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，已通過(guò)聚合物質(zhì)譜儀測(cè)量該寡核苷酸的質(zhì)量和純度。
同時(shí)，用OpticonTM實(shí)時(shí)PCR(MJ Reasearch)測(cè)量當(dāng)將DNA綠亞磷酰胺嵌入雙鏈核酸時(shí)寡核苷酸熒光強(qiáng)度的變化。所述寡核苷酸的質(zhì)量和純度通過(guò)聚合物質(zhì)譜儀測(cè)量。
表1和表2中Seq.ID Nos.8-17所示寡核苷酸中的至少一種被用于本實(shí)施例。與靶核酸互補(bǔ)的Seq.ID No.18被用來(lái)測(cè)量當(dāng)將DNA綠亞磷酰胺嵌入雙鏈核酸時(shí)熒光強(qiáng)度的變化。
準(zhǔn)備兩個(gè)15ml的試管以用熒光分光光度計(jì)來(lái)測(cè)量用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。
在試管1內(nèi)混合2.9ml TEM緩沖液(10mM TrisHCl，1mM EDTA，pH8.0，最后3.5mM MgCl2)和100ml Seq.ID No.10(10皮摩爾/微升)。在試管2內(nèi)混合2.8ml TEM緩沖液(10mM TrisHCl，1mM EDTA，pH8.0，最后3.5mM MgCl2)、100μl Seq.ID No.10(10皮摩爾/微升)和100μl Seq.ID No.18(10皮摩爾/微升)。所述試管中溶液的最終體積應(yīng)為3ml，試管中的核酸分別在94℃變性5分鐘。之后將試管1置于冰上。
將試管2中的核酸緩慢冷卻至室溫以使其雜交。用熒光分光光度計(jì)在以下條件下掃描用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)475nm/450nm-800nm至475nm/500nm-600nm、480nm/450nm-800nm至480nm/500nm-600nm、485nm/450nm-800nm至485nm/500nm-600nm、490nm/450nm-800nm至490nm/500nm-600nm、495nm/450nm-800nm至495nm/500nm-600nm、500nm/450nm-800nm至500nm/500nm-600nm、505nm/450nm-800nm至505nm/500nm-600nm、510nm/450nm-800nm至510nm/500nm-600nm、515nm/450nm-800nm至515nm/500nm-600nm、520nm/450nm-800nm至520nm/500nm-600nm和525nm/450nm-800nm至525nm/500nm-600nm。
這些測(cè)量中，激發(fā)熒光強(qiáng)度隨發(fā)射波長(zhǎng)增加而增加，與加入互補(bǔ)物無(wú)關(guān)。當(dāng)加入互補(bǔ)寡核苷酸時(shí)，激發(fā)熒光強(qiáng)度大于未加入互補(bǔ)寡核苷酸時(shí)的強(qiáng)度。
當(dāng)將DNA綠亞磷酰胺嵌入雙鏈核酸時(shí)檢測(cè)到熒光強(qiáng)度的變化和激發(fā)熒光波長(zhǎng)的位移效應(yīng)。還在505-515nm的發(fā)射波長(zhǎng)范圍內(nèi)檢測(cè)到較佳激發(fā)熒光強(qiáng)度。優(yōu)選的激發(fā)波長(zhǎng)為530-540nm。
圖5顯示了當(dāng)發(fā)射波長(zhǎng)為505nm、激發(fā)波長(zhǎng)范圍為500-650nm時(shí)Seq.ID No.10或Seq.ID No.10與18雜交的熒光強(qiáng)度。激發(fā)熒光強(qiáng)度在530nm-500nm之間升高，之后直到650nm之間下降。
圖5的X軸表示測(cè)量激發(fā)熒光強(qiáng)度的掃描波長(zhǎng)，Y軸表示每個(gè)掃描波長(zhǎng)下測(cè)得的熒光強(qiáng)度。峰1表示當(dāng)發(fā)射波長(zhǎng)為505nm時(shí)Seq.ID No.10的激發(fā)熒光強(qiáng)度。峰2是當(dāng)發(fā)射波長(zhǎng)為505nm時(shí)Seq.ID No.10與18雜交的激發(fā)熒光強(qiáng)度圖。
準(zhǔn)備兩個(gè)試管進(jìn)行實(shí)時(shí)DNA擴(kuò)增。測(cè)量當(dāng)將DNA綠亞磷酰胺嵌入雙鏈核酸時(shí)探針的熒光強(qiáng)度。
在試管1內(nèi)混合49μl TEM緩沖液(10mM TrisHCl，1mM EDTA，pH8.0，最后3.5mMMgCl2)和1μl Seq.ID No.10(10皮摩爾/微升)。在試管2內(nèi)混合48μl TEM緩沖液(10mM TrisHCl，1mM EDTA，pH8.0，最后3.5mM MgCl2)以及1μl Seq.ID No.10(10皮摩爾/微升)和Seq.ID No.18(10皮摩爾/微升)。這些試管中溶液的最終體積分別為50μl，操作實(shí)時(shí)DNA擴(kuò)增設(shè)備。
實(shí)時(shí)PCR條件為94℃預(yù)變性5分鐘，25℃預(yù)冷5分鐘，25-95℃ PCR期間以1℃為增量隨時(shí)掃描熒光強(qiáng)度。
測(cè)量中，在加入或不加入互補(bǔ)寡核苷酸兩種條件下，熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)溫度升高而降低。
同時(shí)，當(dāng)加入互補(bǔ)寡核苷酸時(shí)測(cè)得的熒光強(qiáng)度大于未加入互補(bǔ)寡核苷酸時(shí)測(cè)得的強(qiáng)度。它們之間的差異代表了嵌入造成的熒光強(qiáng)度變化效應(yīng)。
圖6顯示了通過(guò)實(shí)時(shí)PCR得到的25-94℃時(shí)Seq.ID No.10或Seq.ID Nos.10與18雜交的解鏈曲線。X軸表示反應(yīng)溫度，Y軸表示每個(gè)溫度下測(cè)得的熒光強(qiáng)度。峰1為反應(yīng)溫度下測(cè)得的Seq.ID No.10的熒光強(qiáng)度。峰2為反應(yīng)溫度下Seq.ID Nos.10與18雜交的熒光強(qiáng)度。
實(shí)施例5.采用5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針進(jìn)行的PCR反應(yīng)引物是實(shí)時(shí)PCR中用來(lái)擴(kuò)增靶核酸的特殊堿基序列。探針由與靶核酸互補(bǔ)并與引物附近的靶核酸雜交的堿基構(gòu)成。探針在堿基序列的5’末端、3’末端或中間區(qū)域至少之一用熒光染料標(biāo)記(表1和表2)。
在陽(yáng)性對(duì)照組中，Molecular Beacon法(這是一種通過(guò)分析獲自每輪實(shí)時(shí)PCR的樣品而計(jì)算樣品中核酸正確濃度的常規(guī)方法)的探針被用于實(shí)時(shí)PCR。因此，陽(yáng)性對(duì)照組的數(shù)據(jù)被用作建立使用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針的可用性的標(biāo)準(zhǔn)。
Clen Taq聚合酶一種刪除了Taq聚合酶的5’編碼基因而失去5’外切核酸酶活性從而活性和熱穩(wěn)定性顯著提高的聚合酶。在實(shí)時(shí)PCR中，Clen Taq聚合酶可除去由于Taq聚合酶對(duì)5’末端用熒光染料標(biāo)記的探針的5’外切核酸酶活性而產(chǎn)生的非特異性。
在該實(shí)施例中，表1和表2的Seq.ID No.1和2被用作引物，Seq.ID No.8-12至少之一被用作探針。在陽(yáng)性對(duì)照組中，Seq.ID No.3和4被用作引物，Seq.ID No.5被用作探針。
用所述引物和引物在各個(gè)試管中制備20μl反應(yīng)緩沖液以進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。
緩沖液按以下過(guò)程制備。
在試管中加入2μl 10x反應(yīng)緩沖液(200mM Tris-HCl，100mM KCl，pH9.0)、2μl10mM dNTP(分別為2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP)和20mMMgCl2。10x反應(yīng)緩沖液、dNTP和MgCl2的最終濃度分別為2mM、2.5mM和3mM。在試管中加入擴(kuò)增靶核酸的引物Seq.ID Nos.1和2。引物的最終濃度為0.5μM。
然后在試管中加入中間區(qū)域用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針Seq.ID Nos.8-12。探針的最終濃度分別為0.5μM、1.0μM、2.5μM和5.0μM。在每個(gè)試管中加入Clen Taq聚合酶(BIONEER Co.)使其濃度為0.2U(單位)。在各試管中加入2ml實(shí)施例1的精制的結(jié)核菌DNA，并在這些試管中加入蒸餾水至終體積為20μl。攪拌試管中的溶液，用微量離心機(jī)甩下。
對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照組，在試管中加入2μl 10x反應(yīng)緩沖液(200mM Tris-HCl，100mMKCl，pH9.0)、2μl 10mM dNTP(分別為2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP)和20mM MgCl2。10x反應(yīng)緩沖液、dNTP和MgCl2的最終濃度分別為2.5mM。然后加入擴(kuò)增靶核酸的引物Seq.ID Nos.3和4，使最終濃度為0.5μM。用熒光染料標(biāo)記的探針Seq.ID No.5的最終濃度為0.25μM。
在每個(gè)試管中加入Clen Taq聚合酶(BIONEER Co.)使其濃度為0.2U(單位)。在各試管中加入2μl實(shí)施例1的精制的結(jié)核菌DNA。然后在試管中加入蒸餾水至終體積為20μl并通過(guò)微量離心機(jī)甩下。
用PCR儀(OpticonTM，MJ Co.)進(jìn)行三步驟實(shí)時(shí)PCR。在上述PCR中，95℃預(yù)變性5分鐘，95℃變性30秒，50℃退火60秒，72℃延伸40秒，共進(jìn)行45輪。
測(cè)量每個(gè)退火步驟的熒光強(qiáng)度并用測(cè)得的數(shù)據(jù)建立實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線。
圖7顯示了當(dāng)核苷酸濃度為0.5μM、1.0μM、2.5μM和5.0μM時(shí)Seq.ID No.8的實(shí)時(shí)PCR結(jié)果。反應(yīng)結(jié)果顯示，隨著反應(yīng)循環(huán)的重復(fù)熒光強(qiáng)度增加。
圖7的X軸表示PCR反應(yīng)循環(huán)，Y軸是測(cè)得的熒光強(qiáng)度。峰1-峰4是當(dāng)5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸的濃度為0.5μM、1.0μM、2.5μM和5.0μM時(shí)各反應(yīng)循環(huán)的熒光強(qiáng)度圖。
如圖8所示，陽(yáng)性對(duì)照的熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)循環(huán)重復(fù)而增加。X軸是PCR反應(yīng)循環(huán)，Y軸是測(cè)得的熒光強(qiáng)度。峰1-2是當(dāng)探針濃度為0.25μM時(shí)各反應(yīng)循環(huán)的熒光強(qiáng)度圖。
上述反應(yīng)獲得的PCR產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳鑒定。在燒杯中加入2克瓊脂糖(BIONEER Co.)和0.5X TBE?；旌衔锏慕K體積為100ml。加熱并攪拌混合物直到完全熔解。
當(dāng)混合物冷卻至60℃時(shí)加入4μl EtBr(10mg/ml)。將混合物倒入具有梳子的模具中并在室溫放置30分鐘以使混合物硬化。將硬化的膠放入AgaroPowerTM(BIONEERCo.)電泳槽中。在電泳槽中加入0.5X TBE電泳緩沖液，使凝膠沒(méi)入其中。
將5μl PCR產(chǎn)物混合物和1ml加樣緩沖液混合并用移液管加入瓊脂糖凝膠的孔中。電泳后將凝膠放在UV透照燈上并用數(shù)碼照相機(jī)Imager IIITM拍照。在本發(fā)明中，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為127個(gè)堿基對(duì)(bp)，陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為150個(gè)堿基對(duì)(bp)。
凝膠電泳的結(jié)果示于圖7和圖8。在圖7中，泳道5是0.5μM 5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸的凝膠電泳結(jié)果，泳道6是1.0μM 5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸的凝膠電泳結(jié)果，泳道7是2.5μM 5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸的凝膠電泳結(jié)果，泳道8是5.0μM 5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸的凝膠電泳結(jié)果。
泳道9表示100bp大小的標(biāo)記。在圖8中，泳道3-4是陽(yáng)性對(duì)照的凝膠電泳結(jié)果，其中探針的濃度為0.25μM。泳道5表示100bp大小的標(biāo)記。
實(shí)施例6.采用中間區(qū)域用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針進(jìn)行的PCR反應(yīng)在該實(shí)施例中，表1和表2的Seq.ID No.1和2被用作引物，Seq.ID No.13-17所示的寡核苷酸至少之一被用作探針。
用所述引物和引物在各個(gè)試管中制備20μl反應(yīng)緩沖液以進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。
緩沖液按以下過(guò)程制備。
在試管中加入2μl 10x反應(yīng)緩沖液(200mM Tris-HCl，100mM KCl，pH9.0)、2μl10mM dNTP(分別為2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP)和20mMMgCl2，混合物的最終濃度分別為1.5mM、2mM和2.5mM。加入擴(kuò)增靶核酸的引物Seq.ID Nos.1和2使其濃度為0.5μM。
然后在試管中加入中間區(qū)域用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針Seq.ID Nos.13-17，使其濃度為0.5μM、1.0μM、2.5μM和5.0μM。在每個(gè)反應(yīng)試管中加入Clen Taq聚合酶(BIONEER Co.)使其濃度為0.17U(單位)。在各試管中加入1.5ml實(shí)施例1的精制的結(jié)核菌DNA。在試管中加入蒸餾水至終體積為20μl，并用微量離心機(jī)甩下。
然后用PCR儀(OpticonTM，MJ Co.)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。在上述PCR中，94℃預(yù)變性5分鐘，95℃變性30秒，50℃退火50秒，72℃延伸40秒，共進(jìn)行46輪。
測(cè)量每個(gè)退火步驟的熒光強(qiáng)度并用測(cè)得的數(shù)據(jù)建立實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線。
圖9顯示了當(dāng)寡核苷酸濃度為0.5μM和1.0μM、MgCl2濃度為1.5mM時(shí)Seq.ID No.16的實(shí)時(shí)PCR結(jié)果。隨著反應(yīng)循環(huán)的重復(fù)熒光強(qiáng)度增加。
在圖9中，X軸表示PCR反應(yīng)循環(huán)，Y軸是測(cè)得的熒光強(qiáng)度。峰1是當(dāng)中間區(qū)域用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸濃度為0.5μM時(shí)各反應(yīng)循環(huán)的熒光強(qiáng)度圖。峰2是當(dāng)中間區(qū)域用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸濃度為1.0μM時(shí)各反應(yīng)循環(huán)的熒光強(qiáng)度圖。
PCR產(chǎn)物按實(shí)施例4的方法通過(guò)凝膠電泳鑒定。用中間區(qū)域用DNA亞磷酰胺標(biāo)記的引物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為127bp。
在圖8中，泳道3是0.5μM中間區(qū)域用DNA亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果，泳道4是1.0μM中間區(qū)域用DNA亞磷酰胺標(biāo)記的寡核苷酸實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果。泳道5表示100bp大小的標(biāo)記物。
實(shí)施例7.采用堿基序列5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針進(jìn)行的定量PCR在陰性對(duì)照中，在PCR中使用蒸餾水代替靶核酸。陰性對(duì)照顯示了一定水平的污染，這是由于PCR期間的外部原因間接造成的。
按照實(shí)施例4中反應(yīng)條件的濃度對(duì)結(jié)核菌DNA進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR。實(shí)施例2中制造的Seq.ID No.1和2被用作引物，Seq.ID No.8-12所示的寡核苷酸至少之一被用作探針。
用所述各引物和引物在各個(gè)試管中制備20μ1用于進(jìn)行PCR的反應(yīng)緩沖液。
緩沖液按以下過(guò)程制備。
在試管中加入2μl 10x反應(yīng)緩沖液(200mM Tris-HCl，100mM KCl，pH9.0)、2μl10mM dNTP(分別為2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP)和20mMMgCl2，混合物的最終濃度為2mM。在試管中加入擴(kuò)增靶核酸的引物Seq.ID Nos.1和2，其最終濃度為0.5μM。
在試管中加入5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針Seq.ID Nos.10，使其濃度為5.0μM。在每個(gè)反應(yīng)試管中加入Clen Taq聚合酶(BIONEER Co.)使其濃度為0.2U(單位)。在試管中加入蒸餾水至終體積為20μl，并用微量離心機(jī)甩下。蒸餾水用作陰性對(duì)照。
然后用PCR儀(OpticonTM，MJ Co.)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。在上述PCR中，94℃預(yù)變性5分鐘，95℃變性30秒，55℃退火60秒，72℃延伸40秒，共進(jìn)行45輪。
測(cè)量每個(gè)退火步驟的熒光強(qiáng)度并用測(cè)得的數(shù)據(jù)建立實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線。
之后對(duì)擴(kuò)增曲線進(jìn)行對(duì)數(shù)變化并確定循環(huán)閾值[C(T)]。建立標(biāo)準(zhǔn)校正曲線并確定定量PCR的線性。
PCR產(chǎn)物按實(shí)施例4的方法通過(guò)凝膠電泳鑒定。用5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的引物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為127bp。
如圖10所示，左圖為確定循環(huán)閾值(C(T))的所述對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線。右圖為根據(jù)循環(huán)閾值[C(T)]曲線得到的連續(xù)稀釋的結(jié)核菌DNA的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線。
與陰性對(duì)照相比，左圖顯示熒光強(qiáng)度隨PCR反應(yīng)重復(fù)而增加。右圖顯示線性(R_2)為0.997。
圖12的X軸表示PCR反應(yīng)循環(huán)，Y軸表示測(cè)得的熒光強(qiáng)度。峰1是PCR反應(yīng)中每管6ng結(jié)核菌DNA的熒光強(qiáng)度，峰2是PCR反應(yīng)中每管2ng結(jié)核菌DNA的熒光強(qiáng)度，峰3是PCR反應(yīng)中每管500pg結(jié)核菌DNA的熒光強(qiáng)度，峰4是PCR反應(yīng)中每管125pg結(jié)核菌DNA的熒光強(qiáng)度，峰5是PCR反應(yīng)中每管31.3pg結(jié)核菌DNA的熒光強(qiáng)度，峰6是PCR反應(yīng)中每管7.8pg結(jié)核菌DNA的熒光強(qiáng)度，峰7是PCR反應(yīng)中每管1.95pg結(jié)核菌DNA的熒光強(qiáng)度。
圖11顯示了連續(xù)稀釋的結(jié)核菌DNA的凝膠電泳結(jié)果。泳道1是PCR反應(yīng)中每管6ng結(jié)核菌DNA的凝膠電泳結(jié)果，泳道2是PCR反應(yīng)中每管2ng結(jié)核菌DNA的凝膠電泳結(jié)果，泳道3是PCR反應(yīng)中每管500pg結(jié)核菌DNA的凝膠電泳結(jié)果，泳道4是PCR反應(yīng)中每管125pg結(jié)核菌DNA的凝膠電泳結(jié)果，泳道5是PCR反應(yīng)中每管31.3pg結(jié)核菌DNA的凝膠電泳結(jié)果，泳道6是PCR反應(yīng)中每管7.8pg結(jié)核菌DNA的凝膠電泳結(jié)果，泳道7是PCR反應(yīng)中每管1.95pg結(jié)核菌DNA的凝膠電泳結(jié)果。泳道8是陰性對(duì)照的凝膠電泳結(jié)果，泳道9表示100bp大小的標(biāo)記物。
實(shí)施例8.采用中間區(qū)域用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針進(jìn)行的定量PCR按照實(shí)施例5中反應(yīng)條件的濃度對(duì)結(jié)核菌DNA進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR。實(shí)施例2中制造的Seq.ID No.1和2被用作引物，Seq.ID No.13-17所示的寡核苷酸至少之一被用作探針。
用所述各引物和引物在各個(gè)試管中制備20μl用于進(jìn)行PCR的反應(yīng)緩沖液。
緩沖液按以下過(guò)程制備。
在試管中加入2μl 10x反應(yīng)緩沖液(200mM Tris-HCl，100mM KCl，pH9.0)、2μl10mM dNTP(分別為2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP)和20mMMgCl2，混合物的最終濃度為1.4mM。在試管中加入擴(kuò)增靶核酸的引物Seq.ID Nos.1和2，其最終濃度為0.5μM。
在試管中加入中間區(qū)域用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針Seq.ID Nos.16，使其濃度為1.0μM。在每個(gè)反應(yīng)試管中加入Clen Taq聚合酶(BIONEER Co.)使其濃度為0.12U(單位)。在試管中加入蒸餾水至終體積為20μl，并用微量離心機(jī)甩下。蒸餾水用作陰性對(duì)照。
然后用PCR儀(OpticonTM，MJ Co.)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。在上述PCR中，94℃預(yù)變性5分鐘，95℃變性30秒，56℃退火50秒，72℃延伸40秒，共進(jìn)行46輪。
測(cè)量每個(gè)退火步驟的熒光強(qiáng)度并用測(cè)得的數(shù)據(jù)建立實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線。
之后對(duì)擴(kuò)增曲線進(jìn)行對(duì)數(shù)變化并確定循環(huán)閾值[C(T)]。建立標(biāo)準(zhǔn)校正曲線并確定定量PCR的線性。
PCR產(chǎn)物按實(shí)施例4的方法通過(guò)凝膠電泳鑒定。用中間區(qū)域用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的引物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為127bp。
如圖12所示，左圖為確定循環(huán)閾值(C(T))的所述對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線。右圖為根據(jù)循環(huán)閾值[C(T)]曲線得到的連續(xù)稀釋的結(jié)核菌DNA的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線。
與陰性對(duì)照相比，左圖顯示熒光強(qiáng)度隨PCR反應(yīng)重復(fù)而增加。右圖顯示線性(R_2)為0.993。
圖12的X軸表示PCR反應(yīng)循環(huán)，Y軸表示測(cè)得的熒光強(qiáng)度。峰1是PCR反應(yīng)中每管6ng結(jié)核菌DNA的熒光強(qiáng)度，峰2是PCR反應(yīng)中每管2ng結(jié)核菌DNA的熒光強(qiáng)度，峰3是PCR反應(yīng)中每管500pg結(jié)核菌DNA的熒光強(qiáng)度，峰4是PCR反應(yīng)中每管125pg結(jié)核菌DNA的熒光強(qiáng)度，峰5是PCR反應(yīng)中每管31.3pg結(jié)核菌DNA的熒光強(qiáng)度。
圖13顯示了連續(xù)稀釋的結(jié)核菌DNA的凝膠電泳結(jié)果。泳道1是PCR反應(yīng)中每管6ng結(jié)核菌DNA的凝膠電泳結(jié)果，泳道2是PCR反應(yīng)中每管2ng結(jié)核菌DNA的凝膠電泳結(jié)果，泳道3是PCR反應(yīng)中每管500pg結(jié)核菌DNA的凝膠電泳結(jié)果，泳道4是PCR反應(yīng)中每管125pg結(jié)核菌DNA的凝膠電泳結(jié)果，泳道5是PCR反應(yīng)中每管31.3pg結(jié)核菌DNA的凝膠電泳結(jié)果。泳道6是陰性對(duì)照的凝膠電泳結(jié)果，泳道7表示100bp大小的標(biāo)記物。
實(shí)施例9.采用5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針進(jìn)行的PCR交叉污染實(shí)驗(yàn)從被λ噬菌體(Ci857 Sam7)感染的熱誘導(dǎo)型溶源性大腸桿菌菌株(dam-，dcm-)分離并精制λDNA。
按照實(shí)施例4的反應(yīng)條件，采用5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針進(jìn)行交叉污染反應(yīng)。
Seq.ID No.8-12所示寡核苷酸至少之一在該實(shí)施例中被用作探針。Seq.ID No.1和2被用作結(jié)核菌DNA的PCR引物，Seq.ID No.6和7被用作λDNA的PCR引物。
用所述各引物和引物在各個(gè)試管中制備20μl用于進(jìn)行PCR的反應(yīng)緩沖液。
緩沖液按以下過(guò)程制備。
為對(duì)結(jié)核菌DNA進(jìn)行PCR，在試管中加入2μl 10x反應(yīng)緩沖液(200mM Tris-HCl，100mM KCl，pH9.0)、2μl 10mM dNTP(分別為2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mMdCTP、2.5mM dTTP)和20mM MgCl2，混合物的最終濃度分別為2mM。在試管中加入擴(kuò)增靶核酸的引物Seq.ID Nos.1和2，使其濃度分別為0.5μM。
之后在試管中加入5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針Seq.ID Nos.10，使其濃度為2.5μM。在每個(gè)反應(yīng)試管中加入Clen Taq聚合酶(BIONEER Co.)使其濃度為0.2U(單位)。在各試管中加入2μl實(shí)施例1的精制的結(jié)核菌DNA。在試管中加入蒸餾水至終體積為20μl，并用微量離心機(jī)甩下。
為對(duì)λDNA進(jìn)行PCR，在試管中加入2μl 10x反應(yīng)緩沖液(200mM Tris-HCl，100mMKCl，pH9.0)、2μl 10mM dNTP(分別為2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP)和20mM MgCl2，混合物的最終濃度為2mM。在試管中加入擴(kuò)增靶核酸的引物Seq.ID Nos.6和7，使其最終濃度分別為0.5μM。
在試管中加入5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針Seq.ID Nos.10，使其濃度為2.5μM。在每個(gè)反應(yīng)試管中加入Clen Taq聚合酶(BIONEER Co.)使其濃度為0.2U(單位)。在各試管中加入10pg λDNA。在試管中加入蒸餾水至終體積為20μl，并用微量離心機(jī)甩下。
然后進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。在上述PCR中，94℃預(yù)變性5分鐘，95℃變性30秒，55℃退火60秒，72℃延伸40秒，共進(jìn)行44輪。
測(cè)量每個(gè)退火步驟的熒光強(qiáng)度并用測(cè)得的數(shù)據(jù)建立實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線。PCR產(chǎn)物按實(shí)施例4的方法通過(guò)凝膠電泳鑒定。
圖14顯示了當(dāng)在兩個(gè)試管中加入Seq.ID No.10時(shí)結(jié)核菌DNA和λDNA的實(shí)時(shí)PCR結(jié)果。結(jié)核菌DNA的熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)循環(huán)重復(fù)而增加，而λDNA的熒光強(qiáng)度在反應(yīng)循環(huán)重復(fù)時(shí)不改變。圖14的X軸表示PCR循環(huán)，Y軸表示測(cè)得的熒光強(qiáng)度。
泳道1是結(jié)核菌DNA各反應(yīng)循環(huán)的熒光強(qiáng)度圖，泳道2是λDNA各反應(yīng)循環(huán)的熒光強(qiáng)度圖。
PCR產(chǎn)物按實(shí)施例4的方法通過(guò)凝膠電泳鑒定。用5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的引物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為127bp。λDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為100bp。
在圖14，泳道3是結(jié)核菌DNA實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果，泳道4是λDNA實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果。泳道5表示100bp大小的標(biāo)記物。
實(shí)施例10.采用中間區(qū)域用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針進(jìn)行的PCR交叉污染實(shí)驗(yàn)按照實(shí)施例5的反應(yīng)條件，采用中間區(qū)域用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針進(jìn)行交叉污染反應(yīng)。
在本發(fā)明實(shí)施例2中制備的Seq.ID No.13-17至少之一被用作探針。Seq.ID No.1和2被用作結(jié)核菌DNA的PCR引物，Seq.ID No.6和7被用作λDNA的PCR引物。
用所述各引物和引物在各個(gè)試管中制備20μl用于進(jìn)行PCR的反應(yīng)緩沖液。
緩沖液按以下過(guò)程制備。
為對(duì)結(jié)核菌DNA進(jìn)行PCR，在試管中加入2μl 10x反應(yīng)緩沖液(200mM Tris-HCl，100mM KCl，pH9.0)、2μl 10mM dNTP(分別為2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mMdCTP、2.5mM dTTP)和20mM MgCl2，混合物的最終濃度分別為1.5mM。在試管中加入擴(kuò)增靶核酸的引物Seq.ID Nos.1和2，使其濃度分別為0.5μM。
在試管中加入中間區(qū)域用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針Seq.ID Nos.16，使其濃度為1.0μM。在每個(gè)反應(yīng)試管中加入Clen Taq聚合酶(BIONEER Co.)使其濃度為0.15U(單位)。在各試管中加入1.5μl實(shí)施例1的精制的結(jié)核菌DNA。在試管中加入蒸餾水至終體積為20μl，并用微量離心機(jī)甩下。
為對(duì)λDNA進(jìn)行PCR，在試管中加入2μl 10x反應(yīng)緩沖液(200mM Tris-HCl，100mMKCl，pH9.0)、2μl 10mM dNTP(分別為2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP)和20mM MgCl2，混合物的最終濃度為1.5mM。在試管中加入擴(kuò)增靶核酸的引物Seq.ID Nos.6和7，使其最終濃度分別為0.5μM。
之后在試管中加入中間區(qū)域用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針Seq.ID Nos.16，使其濃度為1.0μM。在每個(gè)反應(yīng)試管中加入Clen Taq聚合酶(BIONEER Co.)使其濃度為0.15U(單位)。在各試管中加入10pg λDNA。在試管中加入蒸餾水至終體積為20μl，并用微量離心機(jī)甩下。
然后用PCR儀(OpticonTM，MJ Co.)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。在上述PCR中，94℃預(yù)變性5分鐘，95℃變性30秒，56℃退火50秒，72℃延伸40秒，共進(jìn)行46輪。
測(cè)量每個(gè)退火步驟的熒光強(qiáng)度并用測(cè)得的數(shù)據(jù)建立實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線。
圖15顯示了當(dāng)在兩個(gè)試管中加入Seq.ID No.16時(shí)結(jié)核菌DNA和λDNA的實(shí)時(shí)PCR結(jié)果。結(jié)核菌DNA的熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)循環(huán)重復(fù)而增加，而λDNA的熒光強(qiáng)度在反應(yīng)循環(huán)重復(fù)時(shí)不改變。圖15的X軸表示PCR循環(huán)，Y軸表示測(cè)得的熒光強(qiáng)度。
泳道1是結(jié)核菌DNA各反應(yīng)循環(huán)的熒光強(qiáng)度圖，泳道2是λDNA各反應(yīng)循環(huán)的熒光強(qiáng)度圖。
PCR產(chǎn)物按實(shí)施例4的方法通過(guò)凝膠電泳鑒定。用中間區(qū)域用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的引物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為127bp。λDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為100bp。
在圖15，泳道3是結(jié)核菌DNA實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果，泳道4是λDNA實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果。泳道5表示100bp大小的標(biāo)記物。
實(shí)施例11.采用在堿基序列3’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針進(jìn)行的PCRVentR(exo-)DNA聚合酶是一種無(wú)VentR DNA聚合酶的3′5’校正外切核酸酶活性的聚合酶。通過(guò)采用所述聚合物，3’末端用熒光染料標(biāo)記的探針可發(fā)射出具有其特異性的光。
在該實(shí)施例中，表1和表2中的Seq.ID No.19和20被用作引物，Seq.ID No.21被用作探針。
用所述各引物和引物在試管中制備20μl用于進(jìn)行PCR的反應(yīng)緩沖液。
緩沖液按以下過(guò)程制備。
在試管中加入2μl 10x反應(yīng)緩沖液(100mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl(pH 8.8，25℃)，2mM MgSO4、0.1％Trition X-100，NEB Co.)、3μl 10mM dNTP(分別為2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP)和20mM MgSO4，使各自的最終濃度分別為2mM、3mM和4mM。
之后在試管中加入擴(kuò)增靶核酸的引物Seq.ID Nos.19和20，使其濃度分別為0.6μM。
然后在試管中加入3’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針Seq.ID No.21，使其最終濃度分別為1.0μM和2.5μM。然后在各反應(yīng)試管中加入VentR(exo-)DNA聚合酶(NEB Co.)，使其最終為0.25U。
在各試管中加入0.5ml實(shí)施例1的精制的結(jié)核菌DNA。然后在試管中加入蒸餾水至終體積為20μl，并用微量離心機(jī)甩下。
然后用PCR儀(OpticonTM，MJ Co.)進(jìn)行三步驟實(shí)時(shí)PCR。在上述PCR中，94℃預(yù)變性6分鐘，95℃變性30秒，53℃退火60秒，72℃延伸50秒，共進(jìn)行50輪。
測(cè)量每個(gè)退火步驟的熒光強(qiáng)度并用測(cè)得的數(shù)據(jù)建立實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線。
圖16顯示了1.0μM Seq.ID No.21和2mM MgCl2條件下的實(shí)時(shí)PCR結(jié)果。該結(jié)果顯示，熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)循環(huán)重復(fù)而增加。圖16的X軸表示PCR循環(huán)，Y軸表示測(cè)得的熒光強(qiáng)度。
泳道1是在采用結(jié)核菌DNA和1.0μM3’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針進(jìn)行的PCR各循環(huán)中測(cè)得的熒光強(qiáng)度圖。泳道2是是在采用蒸餾水和1.0μM3’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針進(jìn)行的PCR各循環(huán)中測(cè)得的熒光強(qiáng)度圖。
PCR產(chǎn)物按實(shí)施例4的方法通過(guò)凝膠電泳鑒定。用3’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的引物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為118bp。
如圖16所示，泳道3是泳道1的PCR產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果，泳道4是泳道2的PCR產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果。
實(shí)施例12.采用在兩個(gè)末端(5’末端和3’末端)用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針進(jìn)行的PCRVentR(exo-)DNA聚合酶是一種無(wú)VentR DNA聚合酶的3′5’校正外切核酸酶活性的聚合酶。通過(guò)采用所述聚合物，3’末端用熒光染料標(biāo)記的探針可發(fā)射出具有其特異性的光。
在該實(shí)施例中，表1和表2中的Seq.ID No.19和20被用作引物，Seq.ID No.22被用作探針。
用所述各引物和引物在試管中制備20μl用于進(jìn)行PCR的反應(yīng)緩沖液。
緩沖液按以下過(guò)程制備。
在試管中加入2μl 10x反應(yīng)緩沖液(100mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl(pH 8.8，25℃)，2mM MgSO4、0.1％Trition X-100，NEB Co.)、3μl 10mM dNTP(分別為2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP)和20mM MgSO4，使各自的最終濃度分別為2mM、3mM和4mM。
之后在試管中加入擴(kuò)增靶核酸的引物Seq.ID Nos.19和20，使其濃度分別為0.6μM。
然后在試管中加入在3’和5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針Seq.ID No.22，使其最終濃度分別為1.0μM和2.5μM。然后在各反應(yīng)試管中加入VentR(exo-)DNA聚合酶(NEB Co.)，使其最終為0.25U。
在各試管中加入0.5ml實(shí)施例1的精制的結(jié)核菌DNA。然后在試管中加入蒸餾水至終體積為20μl，并用微量離心機(jī)甩下。
然后用PCR儀(OpticonTM，MJ Co.)進(jìn)行三步驟實(shí)時(shí)PCR。在上述PCR中，94℃預(yù)變性6分鐘，95℃變性30秒，53℃退火60秒，72℃延伸50秒，共進(jìn)行50輪。
測(cè)量每個(gè)退火步驟的熒光強(qiáng)度并用測(cè)得的數(shù)據(jù)建立實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線。
圖17顯示了1.0μM Seq.ID No.22和2mM MgCl2條件下的實(shí)時(shí)PCR結(jié)果。該結(jié)果顯示，熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)循環(huán)重復(fù)而增加。圖17的X軸表示PCR循環(huán)，Y軸表示測(cè)得的熒光強(qiáng)度。
泳道1是在采用結(jié)核菌DNA和1.0μM在3’和5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針進(jìn)行的PCR各循環(huán)中測(cè)得的熒光強(qiáng)度圖。泳道2是是在采用蒸餾水和1.0μM在3’和5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的探針進(jìn)行的PCR各循環(huán)中測(cè)得的熒光強(qiáng)度圖。
PCR產(chǎn)物按實(shí)施例4的方法通過(guò)凝膠電泳鑒定。用在3’和5’末端用DNA綠亞磷酰胺標(biāo)記的引物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為118bp。
如圖17所示，泳道3是泳道1的PCR產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果，泳道4是泳道2的PCR產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增核酸的熒光探針，其特征在于，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化。
2.如權(quán)利要求1所述的熒光探針，其特征在于，所述熒光染料與寡核苷酸5’末端區(qū)域、3’末端區(qū)域和中間區(qū)域至少之一相連。
3.如權(quán)利要求1所述的熒光探針，其特征在于，所述熒光探針的3’末端被封閉從而不能從所述3’末端開(kāi)始復(fù)制。
4.如權(quán)利要求1所述的熒光探針，其特征在于，所述熒光染料選自吖啶同型二聚體及其衍生物、吖啶橙及其衍生物、7-氨基放線菌素D及其衍生物、放線菌素D及其衍生物、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)及其衍生物、DAPI及其衍生物、二氫乙錠及其衍生物、溴化乙錠及其衍生物、EthD-1及其衍生物、EthD-2及其衍生物、單疊氮乙錠及其衍生物、碘化己錠及其衍生物、雙苯酰亞胺(Hoechst 33258)及其衍生物、Hoechst 33342及其衍生物、Hoechst 34580及其衍生物、羥蔗脒及其衍生物、LDS751及其衍生物、碘化丙錠(PI)及其衍生物和Cy-染料衍生物。
5.如權(quán)利要求1所述的熒光探針，其特征在于，通過(guò)使所述熒光染料結(jié)合或取代所述寡核苷酸中的堿基而標(biāo)記所述寡核苷酸。
6.如權(quán)利要求1所述的熒光探針，其特征在于，所述熒光探針與至少一部分區(qū)域雜交，所述區(qū)域位于距離結(jié)合有所述引物3’末端的堿基1-15個(gè)堿基的范圍內(nèi)。
7.如權(quán)利要求1所述的熒光探針，其特征在于，所述寡核苷酸由10-40個(gè)堿基構(gòu)成。
8.如權(quán)利要求1所述的熒光探針，其特征在于，所述寡核苷酸含有選自Seq.IDNos.1-22的堿基序列。
9.一種核酸擴(kuò)增的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟i)制備含有核酸、擴(kuò)增所述核酸的一對(duì)引物、熒光探針、4種核苷酸和DNA聚合酶的水性緩沖液，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；ii)加熱步驟i)中制備的水性緩沖液至93-96℃使所述雙鏈核酸變性成為單鏈；iii)將步驟ii)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈與所述引物對(duì)退火；iv)將步驟iii)中獲得的溶液加熱至70-74℃從而復(fù)制所述單鏈核酸；v)加熱步驟iv)中獲得的溶液至93-96℃使所述復(fù)制的核酸變性成為單鏈；vi)將步驟v)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈核酸與所述熒光探針退火；vii)測(cè)量步驟vi)所得溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度；和viii)重復(fù)步驟iv)-vii)一次以上。
10.如權(quán)利要求9所述的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟vii)與步驟vi)同時(shí)進(jìn)行。
11.一種檢測(cè)樣品中核酸初始量的方法，所述方法包括以下步驟i)制備含有核酸、擴(kuò)增所述核酸的一對(duì)引物、熒光探針、4種核苷酸和DNA聚合酶的水性緩沖液，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；ii)加熱步驟i)中制備的水性緩沖液至93-96℃使所述雙鏈核酸變性成為單鏈；iii)將步驟ii)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈與所述引物對(duì)退火；iv)將步驟iii)中獲得的溶液加熱至70-74℃從而復(fù)制所述單鏈核酸；v)加熱步驟iv)中獲得的溶液至93-96℃使所述復(fù)制的核酸變性成為單鏈；vi)將步驟v)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈核酸與所述熒光探針退火；vii)測(cè)量步驟vi)所得溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度；viii)重復(fù)步驟iv)-vii)一次以上；ix)利用已知核酸初始量的樣品建立表明核酸初始量的對(duì)數(shù)值和實(shí)施上述步驟i)-ix)所顯示的循環(huán)閾值之間相關(guān)性的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線；和x)參照步驟ix)中獲得的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，根據(jù)與實(shí)施步驟i)-ix)所獲得的循環(huán)閾值相對(duì)應(yīng)的對(duì)數(shù)值檢測(cè)核酸的初始量。
12.如權(quán)利要求11所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟vii)與步驟vi)同時(shí)進(jìn)行。
13.一種擴(kuò)增核酸的組合物，所述組合物包含i)擴(kuò)增所述核酸的一對(duì)引物；ii)熒光探針，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；iii)DNA聚合酶；和iv)4種核苷酸。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述熒光染料與寡核苷酸5’末端區(qū)域、3’末端區(qū)域和中間區(qū)域至少之一相連。
15.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述熒光探針的3’末端被封閉從而不能從所述3’末端開(kāi)始復(fù)制。
16.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述熒光染料選自吖啶同型二聚體及其衍生物、吖啶橙及其衍生物、7-氨基放線菌素D及其衍生物、放線菌素D及其衍生物、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)及其衍生物、DAPI及其衍生物、二氫乙錠及其衍生物、溴化乙錠及其衍生物、EthD-1及其衍生物、EthD-2及其衍生物、單疊氮乙錠及其衍生物、碘化己錠及其衍生物、雙苯酰亞胺(Hoechst 33258)及其衍生物、Hoechst 33342及其衍生物、Hoechst 34580及其衍生物、羥蔗脒及其衍生物、LDS751及其衍生物、碘化丙錠(PI)及其衍生物和Cy-染料衍生物。
17.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，通過(guò)使所述熒光染料結(jié)合或取代所述寡核苷酸中的堿基而標(biāo)記所述寡核苷酸。
18.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述熒光探針與至少部分區(qū)域雜交，所述區(qū)域位于距離結(jié)合有所述引物3’末端的堿基1-15個(gè)堿基的范圍內(nèi)。
19.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述寡核苷酸由10-40個(gè)堿基構(gòu)成。
20.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述寡核苷酸含有選自Seq.IDNos.1-22的堿基序列。
21.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，真空干燥所述組合物。
22.一種核酸擴(kuò)增的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，所述方法包括以下步驟i)制備含有核酸、擴(kuò)增所述核酸的一對(duì)引物、反轉(zhuǎn)錄引物、熒光探針、4種核苷酸、DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶的水性緩沖液，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；ii)將步驟i)中制備的水性緩沖液加熱至42-50℃從而復(fù)制單鏈cDNA；iii)將所述步驟ii)中獲得的溶液加熱至93-96℃從而使所述單鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄引物和反轉(zhuǎn)錄酶變性；iv)將所述步驟iii)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈核酸與所述引物對(duì)退火；v)將所述步驟iv)中獲得的溶液加熱至70-74℃從而復(fù)制所述單鏈核酸；vi)加熱所述步驟v)中獲得的溶液至93-96℃使所述復(fù)制的核酸變性成為單鏈；vii)將所述步驟vi)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈核酸與所述熒光探針退火；viii)測(cè)量步驟vii)所得溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度；和ix)重復(fù)步驟v)-viii)一次以上。
23.如權(quán)利要求22所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟viii)與步驟vii)同時(shí)進(jìn)行。
24.一種檢測(cè)樣品中核酸初始量的方法，所述方法包括以下步驟i)制備含有核酸、擴(kuò)增所述核酸的一對(duì)引物、反轉(zhuǎn)錄引物、熒光探針、4種核苷酸、DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶的水性緩沖液，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；ii)將步驟i)中制備的水性緩沖液加熱至42-50℃從而復(fù)制單鏈cDNA；iii)將所述步驟ii)中獲得的溶液加熱至93-96℃從而使所述單鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄引物和反轉(zhuǎn)錄酶變性；iv)將所述步驟iii)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈核酸與所述引物對(duì)退火；v)將所述步驟iv)中獲得的溶液加熱至70-74℃從而復(fù)制所述單鏈核酸；vi)加熱所述步驟v)中獲得的溶液至93-96℃使所述復(fù)制的核酸變性成為單鏈；vii)將所述步驟vi)中獲得的溶液冷卻至50-57℃使所述單鏈核酸與所述熒光探針退火；viii)測(cè)量步驟vii)所得溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度；ix)重復(fù)步驟v)-viii)一次以上；x)利用已知核酸初始量的樣品建立表明核酸初始量的對(duì)數(shù)值和實(shí)施上述步驟i)-ix)所顯示的循環(huán)閾值之間相關(guān)性的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線；和xi)參照步驟ix)中獲得的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，根據(jù)與實(shí)施步驟i)-ix)所獲得的循環(huán)閾值相對(duì)應(yīng)的對(duì)數(shù)值檢測(cè)核酸的初始量。
25.如權(quán)利要求24所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟viii)與步驟vii)同時(shí)進(jìn)行。
26.一種擴(kuò)增核酸的組合物，其包含i)擴(kuò)增所述核酸的一對(duì)引物；ii)反轉(zhuǎn)錄引物iii)熒光探針，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；iv)DNA聚合酶；v)反轉(zhuǎn)錄酶，和iv)4種核苷酸。
27.如權(quán)利要求26所述的組合物，其特征在于，所述熒光染料與寡核苷酸5’末端區(qū)域、3’末端區(qū)域和中間區(qū)域至少之一相連。
28.如權(quán)利要求26所述的組合物，其特征在于，所述熒光探針的3’末端被封閉從而不能從所述3’末端開(kāi)始復(fù)制。
29.如權(quán)利要求26所述的組合物，其特征在于，所述熒光染料選自吖啶同型二聚體及其衍生物、吖啶橙及其衍生物、7-氨基放線菌素D及其衍生物、放線菌素D及其衍生物、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)及其衍生物、DAPI及其衍生物、二氫乙錠及其衍生物、溴化乙錠及其衍生物、EthD-1及其衍生物、EthD-2及其衍生物、單疊氮乙錠及其衍生物、碘化己錠及其衍生物、雙苯酰亞胺(Hoechst 33258)及其衍生物、Hoechst 33342及其衍生物、Hoechst 34580及其衍生物、羥蔗脒及其衍生物、LDS751及其衍生物、碘化丙錠(PI)及其衍生物和Cy-染料衍生物。
30.如權(quán)利要求26所述的組合物，其特征在于，通過(guò)使所述熒光染料結(jié)合或取代所述寡核苷酸中的堿基而標(biāo)記所述寡核苷酸。
31.如權(quán)利要求26所述的組合物，其特征在于，所述熒光探針與至少部分區(qū)域雜交，所述區(qū)域距離結(jié)合有所述引物3’末端的堿基1-15個(gè)堿基。
32.如權(quán)利要求26所述的組合物，其特征在于，所述寡核苷酸由10-40個(gè)堿基構(gòu)成。
33.如權(quán)利要求26所述的組合物，其特征在于，所述寡核苷酸含有選自Seq.IDNos.1-22的堿基序列。
34.如權(quán)利要求26所述的組合物，其特征在于，真空干燥所述組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及采用嵌入染料標(biāo)記的探針檢測(cè)核酸擴(kuò)增的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟i)制備含有核酸、擴(kuò)增所述核酸的一對(duì)引物、熒光探針、4種核苷酸和DNA聚合酶的水性緩沖液，其中，熒光探針中的熒光染料和堿基序列與所述核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸連接，當(dāng)熒光染料嵌入雙鏈核酸時(shí)其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；ii)加熱步驟i)中制備的水性緩沖液至93－96℃使所述雙鏈核酸變性成為單鏈；iii)將步驟ii)中獲得的溶液冷卻至50－57℃使所述單鏈與所述引物對(duì)退火；iv)將步驟iii)中獲得的溶液加熱至70－74℃從而復(fù)制所述單鏈核酸；v)加熱步驟iv)中獲得的溶液至93－96℃使所述復(fù)制的核酸變性成為單鏈；vi)將步驟v)中獲得的溶液冷卻至50－57℃使所述單鏈核酸與所述熒光探針退火；vii)測(cè)量步驟vi)所得溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度；和viii)重復(fù)步驟iv)－vii)一次以上。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1934275SQ200580009393
公開(kāi)日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2005年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月25日
發(fā)明者金鉉培, 池圣敏, 樸翰悟 申請(qǐng)人:株式會(huì)社百尼爾