專利名稱：病毒載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種依賴于蛋白酶增殖的病毒載體的改良的制備方法。
背景技術(shù)：
許多病毒的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)受到蛋白酶的加工之后方表現(xiàn)活性。為了以重組病毒的形式制備這種病毒載體，需要使病毒在這種蛋白酶的存在下增殖。例如負鏈RNA病毒的包膜中包含的F蛋白質(zhì)就是一種這樣的蛋白質(zhì)，F(xiàn)蛋白質(zhì)(F0)通過被由宿主來源的蛋白酶切割為F1和F2之后才顯示出感染性。
負鏈RNA病毒仙臺病毒(SeV)具有基因?qū)胄?感染性)高，搭載基因表達量高等特點，因此可期望其成為一種有效的基因?qū)胗幂d體。此外，未發(fā)現(xiàn)其對人有病原性，而且也沒有其基因整合到基因組等的遺傳毒性，因此被認為具有較高的安全性(Lamb，R.A.&Kolakofsky，D.ParamyxoviridaeThe Virus And TheirReplication.P.1177-1204.In B.N.Fields，D.M.Knipe，and P.M.Howley(ed.)，F(xiàn)ieldsVirology.Lippincott-Raven，Philadelphia，Pa(1996))。從這些方面考慮，仙臺病毒作為“細胞質(zhì)型基因?qū)胼d體”，作為與常規(guī)的載體不同的新型載體正處于研究和開發(fā)的階段中。特別地，以人類的基因治療為目的，正在嘗試通過使病毒基因組的一部分基因從基因組中缺失來改變病毒，以獲得具有高度安全性的病毒載體。
例如F基因缺失型SeV等基因缺失型仙臺病毒的情況，為了可以高效價地回收，需要包裝細胞以反式供給所缺失的蛋白，制得所述包裝細胞是最重要的因素之一。迄今為止，已經(jīng)開發(fā)了F基因缺失型SeV載體(SeV/ΔFLi，H.-O.et al.，J.Virol.74，6564-6569(2000))或M基因缺失型SeV載體(SeV/ΔMInoue，M.et al.，J.Virol.77，6419-6429(2003))等生產(chǎn)系統(tǒng)，制備了可以反式供給F蛋白質(zhì)或M蛋白質(zhì)的包裝細胞。通過從基因組中缺失感染和融合必需的F基因，感染性粒子不會從感染細胞中釋放出，由此載體被修飾成非傳播型載體。通過從基因組中缺失粒子形成所必需的M基因，可以將從感染細胞中釋放的粒子抑制到檢測界線以下。尤其是，SeV/ΔF在導(dǎo)入細胞內(nèi)其基因組可以自主復(fù)制，因此成為非傳播型而仍然維持有高表達搭載基因的能力，該技術(shù)現(xiàn)已形成劃時代的技術(shù)。
SeV盡管利用細胞中普遍存在的唾液酸作為其受體，但在其宿主動物(嚙齒類等)的體內(nèi)顯示出范圍非常狹窄的組織趨向性。例如，僅在小鼠的呼吸道或雞受精卵的絨膜尿囊液中有效增殖。這種趨向性的限制依賴于F蛋白質(zhì)的活化所必需的特異性蛋白酶的定位(Nagai，Y.Trends Microbial1，81-87(1993))，在受精卵的尿囊絨膜中血液凝集因子Xa(Gotoh，B.et al.EmboJ 9，4189-4195(1990))起作用，在小鼠呼吸道的上皮細胞中類胰蛋白酶Clara起作用(Kido，H，et al.J Boil Chem.267，13573-13579(1992))。對于這些蛋白酶，F(xiàn)蛋白(F0蛋白)的切割基序為Q-S-R。由于在大部分的細胞類型的培養(yǎng)系統(tǒng)中不表達活化F蛋白(切割F0蛋白的Q-S-R基序)的蛋白酶，為了在體外增加SeV，需要添加低濃度的胰蛋白酶以替代天然蛋白酶(7.5μg/ml)(Homma，M.&Ouchi，M.J Virol 12，1457-1465(1973))。
即使在制備F基因缺失型SeV載體(SeV/ΔF)時，同樣也需要F蛋白的活化，需要在載體產(chǎn)生時添加胰蛋白酶，并且為了使胰蛋白酶起作用需要在無血清條件下培養(yǎng)。這種在無血清條件的胰蛋白酶存在下的培養(yǎng)對細胞來說是極為苛酷的條件，對于大部分細胞可以維持細胞的期間非常短，無法發(fā)揮作為包裝細胞的功能。實際上可以作為包裝細胞使用的細胞僅限于猴腎細胞LLC-MK2細胞或倉鼠腎細胞BHK-21細胞等數(shù)種細胞。也就是說，在無血清條件下的胰蛋白酶存在的培養(yǎng)條件下，只有極少數(shù)種類的細胞可以用作包裝細胞使用。
非專利文獻1Lamb，R.A.&Kolakofsky，D.ParamyxoviridaeThe Virus AndTheir Replication.P.1177-1204.In B.N.Fields，D.M.Knipe，andP.M.Howley(Ed.)，F(xiàn)ields Virology.Lippincott-Raven，Philadelphia，Pa(1996)非專利文獻2Li，H.-O.et al.，J.Virol.74，6564-6569(2000)非專利文獻3Inoue，M.et al.，J.Virol.77，6419-6429(2003)非專利文獻4Nagai，Y.Trends Microbiol 1，81-87(1993)非專利文獻5Gotoh，B.et al.Embo J 9，4189-4195(1990)非專利文獻6Kido，H，et al.J Boil Chem.267，13573-13579(1992)非專利文獻7Homma，M.&Ouchi，M.J Virol 12，1457-1465(1973)
發(fā)明的公開發(fā)明要解決的問題本發(fā)明提供了一種制備依賴于蛋白酶增殖的病毒的方法，該方法不依賴于所述蛋白酶，而是使用其它蛋白酶。本發(fā)明的方法可以有效制備病毒載體。
用于解決問題的方法如上所述，在病毒生產(chǎn)時需要蛋白酶的情況下，存在如下問題為了使該蛋白酶起作用，細胞的存活力就會下降，因此在病毒生產(chǎn)中可以使用的細胞被限于極少數(shù)種類。在生產(chǎn)病毒載體時，通過從病毒生產(chǎn)細胞(包裝細胞)中出芽和被釋放，來產(chǎn)生具有感染性的子代粒子。此時，可以預(yù)想到子代粒子中混入肌動蛋白等包裝細胞來源的細胞質(zhì)成分(和細胞膜成分)。實際上，一般認為在考慮對人類的基因治療時，例如在需要大量給藥病毒載體時，混入粒子中的細胞質(zhì)成分(和細胞膜成分)，優(yōu)選不是猴細胞來源或倉鼠細胞來源而是人細胞來源。但是，例如仙臺病毒等情況，由于需要使用可以在上述這種“無血清條件下的胰蛋白酶存在下的培養(yǎng)條件”下生存的細胞，因此可以作為包裝細胞利用的細胞種類僅限于極少數(shù)種類，難以應(yīng)用于人類細胞。于是本發(fā)明人嘗試開發(fā)了可以在大部分細胞中應(yīng)用的培養(yǎng)條件的病毒制備的方法。
細胞的反式高爾基網(wǎng)(trans-Golgi network)、細胞表面和內(nèi)含體中存在一種稱為弗林蛋白酶(furin)的膜結(jié)合型絲氨酸內(nèi)切蛋白酶。弗林蛋白酶的表達是比較普遍的，幾乎在所有的組織細胞中表達，而且不僅參與細胞內(nèi)蛋白，而且還參與膜蛋白和分泌蛋白的加工(Seidah，N.G&Chretien，M.BrainRes.845，45-62(1999)，Bergeron，F(xiàn).et al.，J.Mol.Endocrinol.24，1-22(2000)，SteinerD.F.Curr.Opin.Chem..Boil.231-39(1998))。有的病毒的膜蛋白也受到弗林蛋白酶的加工，在副粘病毒科的病毒F蛋白質(zhì)中，全臟器趨向性病毒或部分強毒株多具有弗林蛋白酶識別序列(Toyoda，T et al.，Virology157，242-247(1987))。例如，NDV的強毒株(Nagai，Y.Virology 72，494-5-8(1976))，麻疹病毒和腮腺炎病毒，或HRSV和HPIV-3(Nagai，Y.TrendsMicrobiol 1，81-87(1993))等都具有弗林蛋白酶識別序列。另一方面，典型的局部感染型SeV和HPIV-1則不具有弗林蛋白酶識別序列(病毒學(xué)，畑中正一編輯，東京，朝倉書店，1997.pp.247-248)。
本發(fā)明人認為，如果利用不取決于細胞種類而普遍表達的弗林蛋白酶的活性，就可以使與細胞株無關(guān)的方式制備病毒成為可能。也就是說，如果可以制備導(dǎo)入了插入有弗林蛋白酶識別序列的F基因的包裝細胞，則不需要在培養(yǎng)基中添加用于使F蛋白質(zhì)活化的胰蛋白酶，進而，也不需要造成無血清狀態(tài)。由于在培養(yǎng)條件上沒有限制，因此可以作為包裝細胞使用的細胞的可選范圍擴大了，尤其是可以利用人類細胞制備包裝細胞。
同樣的方法也可以應(yīng)用于副粘病毒科以外的病毒載體的生產(chǎn)。例如，對于其它科的病毒，膜融合活性的表達以病毒前體糖蛋白質(zhì)的經(jīng)蛋白酶的切割加工為前提，例如人流感病毒A是具有局部感染型的序列(沒有弗林蛋白酶識別序列)，而包括艾滋病毒在內(nèi)的許多病毒則具有全臟器趨向性的序列(有弗林蛋白酶識別序列)。如此，對于許多病毒來說，由于病毒糖蛋白質(zhì)前體的通過宿主蛋白酶的活化是控制病毒趨向性的重要因素，因此可以認為本發(fā)明的方法不限于副粘病毒，可以應(yīng)用于多種制備病毒載體的包裝細胞。
也就是說，本發(fā)明涉及一種制備依賴于蛋白酶增殖的病毒，而不依賴于所述蛋白酶的方法，更為具體的是涉及權(quán)利要求的各項中記載的發(fā)明。并且，本發(fā)明還涉及由權(quán)利要求的各項中記載的發(fā)明的一種或多種(或全部)所希望的組合構(gòu)成的發(fā)明，尤其是涉及由引用同一獨立權(quán)利要求項(與不包括于其它項中記載的發(fā)明的發(fā)明相關(guān)的權(quán)利要求)的權(quán)利要求項(從屬權(quán)利要求)中記載的發(fā)明的1種或多種(或全部)所希望的組合構(gòu)成的發(fā)明。各獨立權(quán)利要求中記載的發(fā)明還指由這些從屬權(quán)利要求的任意組合構(gòu)成的發(fā)明。也就是說，本發(fā)明涉及，[1]一種制備依賴于通過蛋白酶對病毒蛋白質(zhì)的切割而增殖的病毒的方法，該方法包括在(i)所述病毒蛋白質(zhì)的由該蛋白酶識別的切割序列被改變?yōu)槠渌鞍酌傅那懈钚蛄械慕?jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)，以及(ii)其它蛋白酶的存在下使該病毒產(chǎn)生的過程，產(chǎn)生的病毒含有被切割的所述經(jīng)改變的蛋白質(zhì)，不含有編碼所述經(jīng)改變的蛋白質(zhì)的基因；[2]根據(jù)[1]中記載的方法，所制備的病毒攜帶有編碼具有野生型切割序列的所述病毒蛋白質(zhì)的基因；[3]根據(jù)[1]中記載的方法，所制備的病毒是缺失了編碼所述病毒蛋白質(zhì)的基因的非傳播性病毒；[4]根據(jù)[1]至[3]任一項中記載的方法，所述其它蛋白酶是在生產(chǎn)病毒的細胞中內(nèi)源性表達的蛋白酶；[5]根據(jù)[1]至[4]任一項中記載的方法，所述其它蛋白酶是弗林蛋白酶；[6]根據(jù)[1]至[5]任一項中記載的方法，所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg；[7]根據(jù)[1]至[5]任一項中記載的方法，所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Arg-Arg-Arg；[8]根據(jù)[1]至[7]任一項中記載的方法，所述病毒為負鏈RNA病毒；[9]根據(jù)[8]中記載的方法，所述負鏈RNA病毒為副粘病毒科病毒；[10]根據(jù)[8]中記載的方法，所述負鏈RNA病毒為仙臺病毒；[11]一種載體，該載體編碼經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)，在該經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)中，蛋白酶切割序列被改變?yōu)槠渌鞍酌傅那懈钚蛄校龅鞍酌盖懈钚蛄惺瞧湓鲋骋蕾囉谠摰鞍酌笇Σ《镜鞍踪|(zhì)的切割的病毒中病毒蛋白質(zhì)的蛋白酶切割序列，其中，該載體是在該病毒的生產(chǎn)細胞中無法增殖的病毒載體或非病毒載體；[12]根據(jù)[11]中記載的載體，其為質(zhì)粒；[13]根據(jù)[11]或[12]中記載的載體，其中所述經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)可以通過重組酶誘導(dǎo)表達；[14]根據(jù)[13]中記載的載體，其中所述重組酶為Cre或Flp；[15]根據(jù)[11]至[14]任一項中記載的載體，其中所述其它蛋白酶為在生產(chǎn)病毒的細胞中內(nèi)源性表達的蛋白酶；[16]根據(jù)[11]至[15]任一項中記載的載體，其中所述其它蛋白酶是弗林蛋白酶；[17]根據(jù)[11]至[16]任一項中記載的載體，其中所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg；[18]根據(jù)[11]至[16]任一項中記載的載體，其中所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Arg-Arg-Arg；[19]根據(jù)[11]至[18]任一項中記載的載體，其中所述病毒蛋白質(zhì)為負鏈RNA病毒的F蛋白質(zhì)；[20]根據(jù)[19]中記載的載體，其中所述負鏈RNA病毒為副粘病毒科病毒；[21]根據(jù)[19]中記載的載體，其中所述負鏈RNA病毒為仙臺病毒；[22]含有[11]至[21]任一項中記載的載體的哺乳動物細胞；[23]根據(jù)[22]中記載的細胞，其中所述細胞為用于生產(chǎn)依賴于蛋白酶對病毒蛋白質(zhì)的切割而增殖的病毒的細胞；[24]根據(jù)[22]或[23]中記載的細胞，其中所述編碼經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的基因整合于該細胞的染色體中；[25]根據(jù)[22]至[24]任一項中記載的細胞，其為人類細胞；[26]一種依賴于通過蛋白酶對病毒蛋白質(zhì)的切割而增殖的病毒的改變的病毒，其含有被改變?yōu)槠渌鞍酌傅那懈钚蛄械慕?jīng)修飾的蛋白質(zhì)，但不含有編碼所述經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的基因；[27]根據(jù)[26]中記載的經(jīng)修飾的病毒，其中所制備的病毒攜帶編碼具有野生型切割序列的所述病毒蛋白質(zhì)的基因；[28]根據(jù)[26]中記載的經(jīng)修飾的病毒，所述病毒是缺失了編碼所述病毒蛋白質(zhì)的基因的非傳播性病毒；[29]根據(jù)[26]至[28]任一項中記載的經(jīng)修飾的病毒，其中所述其它蛋白酶是在生產(chǎn)病毒的細胞中內(nèi)源性表達的蛋白酶；[30]根據(jù)[26]至[29]任一項中記載的經(jīng)修飾的病毒，其中所述其它蛋白酶是弗林蛋白酶；[31]根據(jù)[26]至[30]任一項中記載的經(jīng)修飾的病毒，其中所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg；[32]根據(jù)[26]至[30]任一項中記載的經(jīng)修飾的病毒，其中所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Arg-Arg-Arg；[33]根據(jù)[26]至[32]任一項中記載的經(jīng)修飾的病毒，其中所述病毒為負鏈RNA病毒；[34]根據(jù)[33]中記載的經(jīng)修飾的病毒，所述負鏈RNA病毒為副粘病毒科病毒；[35]根據(jù)[33]中記載的經(jīng)修飾的病毒，所述負鏈RNA病毒為仙臺病毒。
所謂本發(fā)明中的病毒載體是指具有感染力的病毒粒子，用于在細胞中導(dǎo)入基因的載體。這里所稱的“感染力”是指通過病毒載體與細胞的接觸能夠?qū)⑤d體中所含基因?qū)氲郊毎麅?nèi)部的能力。此外，本發(fā)明中的病毒載體中包括帶有外來基因的載體，也包括不帶有外來基因的載體。本發(fā)明的病毒的制備方法可以應(yīng)用于具有傳播能力的病毒載體的制備，以及沒有傳播能力的缺陷型載體的制備這兩方面。這里所稱的“具有傳播能力”是指在病毒載體感染宿主細胞時，病毒在該細胞中復(fù)制，產(chǎn)生感染性病毒粒子。
所謂重組病毒是指以重組多核苷酸介導(dǎo)生成的病毒，或者這種病毒的擴增產(chǎn)物。所謂重組多核苷酸是指兩端或一個末端不以與自然的狀態(tài)相同的方式結(jié)合的多核苷酸。具體的是，重組多核苷酸是多核苷酸鏈的結(jié)合被人為改變(切割和/或結(jié)合)的多核苷酸。重組多核苷酸可以通過多核苷酸合成、核酸酶處理、連接酶處理等進行組合，通過公知的基因重組方法來構(gòu)建?？梢酝ㄟ^表達編碼有通過基因操作構(gòu)建的病毒載體的多核苷酸，并重建病毒，來生成重組病毒。
本發(fā)明中所稱基因是指遺傳物質(zhì)，是指編碼轉(zhuǎn)錄單位的核酸?；蚩梢允荝NA，也可以是DNA。本發(fā)明中編碼蛋白質(zhì)的核酸稱為該蛋白質(zhì)的基因。此外，一般來說該基因也可以不編碼蛋白質(zhì)，例如基因也可以編碼核酶或反義RNA等功能RNA。一般來說，基因可以是天然來源或人為設(shè)計的序列。此外，本發(fā)明中所謂“DNA”包括單鏈DNA和雙鏈DNA。此外，所謂編碼蛋白質(zhì)是指正義或反義地(例如負鏈RNA病毒中)含有編碼該蛋白質(zhì)的氨基酸序列的ORF，以使得多核苷酸在適當(dāng)條件下可以表達該蛋白質(zhì)。
附圖的簡要說明
圖1是仙臺病毒F蛋白質(zhì)的活化位點的序列的模式圖。
圖2是表示在F基因活化位點具有弗林蛋白酶識別序列(F(furin)R-Q-K-R)的F基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建圖解。
圖3是表示在F基因活化位點具有弗林蛋白酶識別序列(F(5R)(R)-R-R-R-R)的F基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建圖解。
圖4是表示pCAGGS(B型)和pCAGGS(BSX)的構(gòu)建步驟的圖。
圖5是表示pCALNdLWE-zeo-NP(Z)的構(gòu)建步驟的圖。
圖6是表示pCAGGS-P4C(-)的構(gòu)建步驟的圖。
圖7是表示pCAGGS-L(TDK)的構(gòu)建步驟的圖。
圖8是表示pCAGGS-F的構(gòu)建步驟的圖。
圖9是表示pCAGGS-T7的構(gòu)建步驟的圖。
圖10是表示pCAGGS-SeV和pCAGGS-SeV/ΔF-GFP的構(gòu)建步驟的圖。
圖11是表示pCAGGS-SeV和pCAGGS-SeV/ΔF-GFP的構(gòu)建步驟的圖(續(xù)自圖10)。
圖12是表示pCAGGS-SeV的構(gòu)建步驟的圖(續(xù)自圖11)。
圖13是表示通過CIU測試研究HamRbz法中使基因組DNA的量變化時的SeV/ΔF-GFP的回收效率的結(jié)果的圖。使用2μg或2μg以上的量時，回收效率幾乎沒有變化。
圖14是表示對通過HamRbz法在回收SeV/ΔF-GFP時pCAGGS-F和pCAGGS-F5R的回收效率進行研究的結(jié)果的圖。使用pCAGGS-F5R時回收效率大大提高。
圖15是表示通過pCAGGS-T7法回收的傳播型SeV(SeV(TDK)18+GFP)的HA測試的結(jié)果的照片。僅有用未稀釋的BHK-21，BHK/T7，293T接種雞卵時才檢測到了HA活性。
圖16是通過CIU測試研究pCAGGS-T7法中使基因組DNA的量變化時的SeV/ΔF-GFP的回收效率的結(jié)果的圖。使用0.5μg-5μg的量，回收效率幾乎沒有變化，但是使用5μg時回收效率最好。
圖17是通過CIU測試研究pCAGGS-T7法中使導(dǎo)入試劑變化時的SeV18+GFP/ΔF的回收效率的結(jié)果的圖。使用磷酸鈣時顯示出與TransIT-LT-1時同等的或更高的回收效率。
圖18是通過CIU測試研究pCAGGS-T7法中使細胞種類變化時的SeV/ΔF-GFP的回收效率的結(jié)果的圖。從試驗的所有細胞中回收到了病毒，回收效率依次為BHK/T7＞BHK-21＞293T＞LLC-MK2。(但是，使用BHK/T7時不添加pCAGGS-T7。)圖19是表示通過利用F1抗體的Western-印跡法檢測由克隆F5R2的包裝細胞生產(chǎn)的F基因缺失型SeV載體的病毒粒子中的F蛋白質(zhì)的結(jié)果的圖。
圖20是表示由克隆F5R2和克隆F5R2-F22的包裝細胞生產(chǎn)的F基因缺失型SeV載體(SeV/ΔF-GFP)的隨時間變化的感染性粒子生產(chǎn)量的圖。
圖21是表示通過利用F1抗體的Western-印跡法檢測由克隆F5R2和克隆F5R2-F22的包裝細胞生產(chǎn)的F基因缺失型SeV載體的病毒粒子中的F蛋白質(zhì)的圖。
用于實施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明提供了一種制備依賴于蛋白酶對病毒蛋白質(zhì)的切割而增殖的病毒的方法，且該方法不依賴于所述蛋白酶。本發(fā)明的病毒的制備方法包括使用反式地供給(也就是說在所生產(chǎn)的病毒的基因組之外表達)經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的細胞，在所述經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)中上述病毒蛋白質(zhì)的上述蛋白酶的切割序列被改變?yōu)槠渌鞍酌傅那懈钚蛄校徊⒃谒銎渌鞍酌复嬖谙庐a(chǎn)生病毒。例如，為了使依賴于宿主來源的蛋白酶增殖的病毒增殖，本來是需要將這種蛋白酶供給于病毒的。但是本發(fā)明的一個特征是，通過將作為該蛋白酶(姑且稱為原來的蛋白酶)的底物的病毒蛋白質(zhì)的切割序列改變成其它蛋白酶(稱為第二種蛋白酶)的切割序列，用第二種蛋白酶產(chǎn)生病毒，而不需要該原來的蛋白酶。
也就是說，在通過在所述病毒蛋白質(zhì)的由原來的蛋白酶識別的切割序列被改變?yōu)榈诙N蛋白酶的切割序列的經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)，以及第二種蛋白酶存在下產(chǎn)生病毒，具有第二種蛋白酶的切割序列的經(jīng)修飾的病毒蛋白受到第二種蛋白酶的切割而被活化，從而使病毒得以增殖。這里，所生產(chǎn)的病毒自身不表達第二種蛋白酶。也就是說，所生產(chǎn)的病毒不保持編碼第二種蛋白酶的基因。因此，該方法的特征之一在于，只要不反式地供給切割位點被改變的修飾型病毒蛋白質(zhì)，那么即使有第二種蛋白酶，所生產(chǎn)的病毒無也法增殖。
本發(fā)明的方法需要以反式地向病毒供給其蛋白酶切割序列被取代為其它序列的病毒蛋白質(zhì)的，但是無需改變所制備的病毒自身具有的病毒基因或病毒蛋白質(zhì)。因此，所生產(chǎn)的病毒與原來的病毒的基因型也可以完全相同。此外，經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)與野生型病毒蛋白質(zhì)只要蛋白酶切割位點不同就可以，因此可以將表型的變化控制到最小限度，可以認為對病毒的形成，增殖，基因表達等幾乎沒有影響。因此，本發(fā)明的方法通用性極高，可以認為該方法可以應(yīng)用于依賴于蛋白酶增殖的多種病毒的制備。
可以應(yīng)用本發(fā)明的方法的病毒中，最優(yōu)選下述病毒，其蛋白酶依賴性增殖不能用弗林蛋白酶互補，這樣的病毒包括，例如副粘病毒科病毒，包括本來不具有弗林蛋白酶識別序列而顯示出典型的局部感染性的仙臺病毒(SeV)和人副流感病毒-1(HPIV-1)；還有新城疫病毒(NDV)和HPIV-2等弱毒株。此外，即使是本來具有弗林蛋白酶識別序列的、全臟器趨向性的病毒，或一部分強毒株的病毒，也同樣地可以利用；本發(fā)明的方法還可以使用強毒株NDV和HPIV-2或HPIV-3，腮腺炎病毒，麻疹病毒，犬瘟熱病毒(canine distemper virus)(CDV)，牛瘟麻疹病毒(rinderpest virus)(RPV)，人呼吸道合胞體病毒(HRSV)等。進而，即使是副粘病毒科之外的病毒載體，例如呼吸道腸道過濾性病毒(Reovirus)科的輪狀病毒屬的病毒，病毒粒子上的刺突蛋白VP4蛋白通過被胰蛋白酶切割而活化(AriasCF，JVirol.70(9)5832-9(1996)，Konno T et al.，Clin Infect Dis.16 Suppl2S92-7(1993))，因此，可以根據(jù)本發(fā)明使用改變的VP4蛋白質(zhì)來制備輪狀病毒，所述改變的VP4蛋白質(zhì)中胰蛋白酶的切割序列被改變成弗林蛋白酶切割序列。此外，本方法還可以應(yīng)用于多種病毒，包括例如具有局部感染性序列(無弗林蛋白酶識別序列)的人流感病毒A，或者具有全臟器趨向性的序列(有弗林蛋白酶識別序列)的艾滋病毒等(Nagai，Y.Trends Microbiol1，81-87(1993)，Nagai，Y.Microbiol Immunol.39，1-9(1995)，Klenk HD，Garten W.Trends Microbiol 2，39-43(1994)，Lamb，R.A.&Kolakofsky，D.ParamyxoviridaeThe Virus And TheirReplication.P.1177-1204.In B.N.Fields，D.M.Knipe，and P.M.Howley(ed.)，F(xiàn)ieldsVirology.Lippincott-Raven，Philadelphia，Pa(1996)，病毒學(xué)，畑中正一編輯，東京，朝倉書店，247-248(1997))。例如，可以將所述弗林蛋白酶識別序列置換為更有效率的弗林蛋白酶識別序列，或置換成病毒生產(chǎn)細胞中表達的弗林蛋白酶之外的蛋白酶的識別序列。
本發(fā)明的方法在病毒生產(chǎn)細胞中難以充分供給病毒增殖所必需的蛋白酶的情況下特別有用。例如，該蛋白酶不在病毒生產(chǎn)細胞中內(nèi)源性表達(或者只有非常微量的表達)，該蛋白酶對病毒生產(chǎn)細胞具有有害作用等。按照本發(fā)明的方法，原本需要上述蛋白酶的病毒，可以利用該細胞內(nèi)源性表達的蛋白酶或?qū)υ摷毎麄π缘偷牡鞍酌竵碇苽洹Ｒ簿褪钦f，把病毒蛋白質(zhì)的蛋白酶切割位點改變成對細胞內(nèi)源性表達的蛋白酶或?qū)毎泻π缘偷牡鞍酌傅那懈钗稽c，讓這樣經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)在細胞中表達。當(dāng)使用這種細胞生產(chǎn)病毒時，由細胞供給的經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)被包入所形成的病毒中，并被第二種蛋白酶轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨?。如此，不需要原來的蛋白酶就可以生產(chǎn)病毒。
例如，本發(fā)明的方法優(yōu)選應(yīng)用于生產(chǎn)如下的病毒，該病毒的增殖需要病毒生產(chǎn)中經(jīng)常使用的細胞LLC-MK2(ATCC CCL-7)，Vero(ATCC CCL-81)，BHK-21(ATCC CCL-10)，HEK293(ATCC CRL-1573)，HT1080(ATCCCCL-121)，Hela(ATCC CCL-2)，NIH3T3(ATCC CRL-1658)，3Y1(JCRB 0734)，COS-1(ATCC CRL-1650)，COS-7(ATCC CRL-1651)，CHO(ATCC CRL-9606)，CHO-K1(ATCC CCL 61)或它們的衍生株等中非內(nèi)源性顯著表達的蛋白酶。本發(fā)明尤其對病毒產(chǎn)生中使用的哺乳動物細胞顯示有毒性的蛋白酶很有用。這樣的蛋白酶包括例如胰蛋白酶。胰蛋白酶抑制細胞粘附，而且由于血清會使其失活，為了使胰蛋白酶在細胞外作用，必須使用不含血清的培養(yǎng)基。如此，在使用胰蛋白酶的培養(yǎng)條件下，細胞的存活力(生存和/或增殖等)就會降低。通過使用胰蛋白酶之外的蛋白酶作為第二種蛋白酶，可以避免由胰蛋白酶造成的細胞傷害。蛋白酶對細胞是否顯示出毒性，可以通過測定在病毒產(chǎn)生時所必需的蛋白酶顯示活性的條件下，細胞的存活力是否比沒有該蛋白酶時降低來評估。細胞的存活力可以通過基于例如氧化還原色素刃天青被活細胞轉(zhuǎn)化為熒光產(chǎn)物試鹵靈的測試法(CellTiter-BlueTMCellViability Assay，Promega)來測定。或者，可以通過LDH(乳酸脫氫酶)活性測定，使用氧化還原色素Alamar Blue的Alama Blue熒光法，或者利用四唑化合物(MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5溴化四唑]和MTS[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑內(nèi)鹽])的被活細胞轉(zhuǎn)換為甲產(chǎn)物的MTT法和MTS法等測定。
通過將這些病毒的病毒蛋白質(zhì)的蛋白酶(即原來的蛋白酶)切割位點置換為病毒生產(chǎn)細胞內(nèi)源性表達的蛋白酶或細胞毒性更低的蛋白酶等(即第二種蛋白酶)的切割序列，可以在不存在原來需要的蛋白酶的條件下制備病毒。對于第二種蛋白酶的切割序列沒有特別的限制，但是優(yōu)選使用例如上述哺乳動物細胞(LLC-MK2，Vero，BHK-21，HEK293，HT1080或它們的衍生株)等內(nèi)源性表達的蛋白酶的切割序列。優(yōu)選使用弗林蛋白酶切割的序列。由于弗林蛋白酶是普遍表達的，幾乎在所有的組織和細胞中表達，通過取代為弗林蛋白酶切割序列可以有效生產(chǎn)病毒。作為弗林蛋白酶的切割序列的實例，可以例舉有Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg(Xaa為任意的氨基酸)。具體可以列舉有RTKR，RRRR，RHKR，RQR/KR，RHKR，RKRR等。例如，將原來具有被胰蛋白酶切割的切割序列(Xaa-Gln-Ser-Arg和Xaa-Gln-Gly-Arg)的病毒蛋白質(zhì)的上述切割序列轉(zhuǎn)變?yōu)楦チ值鞍酌盖懈钚蛄?Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg)，該蛋白質(zhì)就會被弗林蛋白酶切割轉(zhuǎn)變成為活化型。
除了弗林蛋白酶切割序列之外，切割序列還可以轉(zhuǎn)變成所希望的蛋白酶的切割序列(WO01/20989)。特別地，轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎袃?nèi)源性表達的蛋白酶切割序列，或者對細胞毒性小的蛋白酶的切割序列。通過使用具有由這種蛋白酶切割的序列的病毒蛋白質(zhì)基因，可以維持細胞的存活力，使病毒更有效地生產(chǎn)。包膜蛋白質(zhì)的切割優(yōu)選使用分泌到細胞外的蛋白酶和在膜表面表達的膜型蛋白酶等。此外，蛋白酶也可以存在于蛋白質(zhì)從細胞中翻譯到細胞表面分泌的輸送途徑上。
弗林蛋白酶之外的蛋白酶的切割序列可以使用例如特異于MMP(matrix metalloprotease，基質(zhì)金屬蛋白酶)和膠原蛋白酶的序列PLGMTS(序列號1)和PQGMTS(序列號2)的序列(特愿2002-129351)。此時，由MMP和膠原蛋白酶的切割發(fā)生于上述識別序列的第3個殘基的C末端，例如已經(jīng)確認，仙臺病毒的F蛋白中F1蛋白的N末端上添加了MTS時仍具有F蛋白的活性。此外還發(fā)現(xiàn)其F蛋白中由胰蛋白酶所識別的R116被轉(zhuǎn)變?yōu)镮的SeV變異株被胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)或彈性蛋白酶(elastase)所活化(Tashiro M et al.，J Gen Virol.73(Pt 6)1575-9(1992)，Itoh M，Homma M.J GenVirol.69(Pt 11)2907-11(1988))；也可以利用這種序列。由于胰凝乳蛋白酶或彈性蛋白酶在Y，F(xiàn)，W，L，I等疏水性氨基酸的C末端切割，因此可認為變異成為I以外的序列，即Y、F、W、L，也是可以的。
病毒生產(chǎn)細胞優(yōu)選高表達第二種蛋白酶的。例如，還可以在病毒生產(chǎn)細胞中外源地表達切割經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的第二種蛋白酶。通過高表達第二種蛋白酶，可以促進經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的切割，進而提高病毒生產(chǎn)的效率。為此，向該細胞中導(dǎo)入編碼第二種蛋白酶的表達載體。在第二種蛋白酶的表達中使用的啟動子可以使用所希望的用于在哺乳動物細胞中表達基因的啟動子。此外，還可以利用重組酶目的序列和誘導(dǎo)性啟動子進行構(gòu)建，使得第二種蛋白酶的表達可以被刺激誘導(dǎo)(下述)。
第二種蛋白酶的例子還有鈣蛋白酶，泛素蛋白酶體系統(tǒng)，中性溶酶，MMP，絲氨酸蛋白酶，氨肽酶等。鈣蛋白酶是通過與鈣結(jié)合而活化的蛋白酶，作為其切割序列，可以使用α-肌動蛋白，肌鈣蛋白，肌聯(lián)蛋白等蛋白質(zhì)的切割位點。作為鈣蛋白酶的切割序列(Karlsson，J.O et al.(2000)CellBiol.Int.24，235-243)，可以使用例如Leu-Leu-Val-Tyr。
此外，也可以使用分解細胞外基質(zhì)(excellular matrix；ECM)的MMP和其近緣基因家族的ADAM(一種解聚素(disintegrin)和金屬蛋白酶)的切割序列?，F(xiàn)在已知軟骨蛋白聚糖(agrican，聚集蛋白聚糖)的分解所必需的ADAMTS(有血小板凝血酶敏感蛋白(thrombospondin)基序的ADAM)的聚集蛋白聚糖的切割序列(Tortorella，M.D.et al.(2000)J.Biol.Chem.275，18566-18573)。通過使用這些蛋白酶的識別序列，可以使用該蛋白酶制備病毒載體。
此外，ECM分解性絲氨酸蛋白酶包括，例如，組織蛋白酶G，彈性蛋白酶，纖溶酶，纖溶酶原活化因子(plasminogen activator；PA)，腫瘤胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶樣中性蛋白酶，凝血酶等。纖溶酶通過對生物體內(nèi)以非活性狀態(tài)存在的纖溶酶原進行有限水解而產(chǎn)生。PA中存在與血液凝固相關(guān)的組織型PA(tPA)和與ECM分解相關(guān)的尿激酶型PA(uPA)(Blasi，F(xiàn).andVerde，P.Semin.Cancer Bio.1117-126，1990)。uPA，tPA的切割序列是熟知的(Rijken，D.C.et al.(1982)J.Biol.Chem..257，2920-2925；Wallen，P etal.(1982)Biochim.Biophys.Acta 719，318-328；Tate，K.M.etal.(1987)Biochemistry 26，338-343)。一般使用的底物序列為VGR(Dooijewaard，G.，and Kluft，C.(1983)Adv.Exp.Med.Biol.156，115-120)和Substrate S-2288(Lle-Pro-Arg)(Matsuo，O.etal.(1983)Jpn.J.Physiol.33，1031-1037)。Butenas采用54種熒光底物，提供了對tPA顯示高特異性的序列(Butenas，S.et al.(1997)Biochemistry36，2123-2131)；tPA顯示出對FPR，VPR的高度的分解活性。因此，這些序列是特別優(yōu)選使用的。纖溶酶可降解纖連蛋白，生腱蛋白，層粘連蛋白等。
此外，現(xiàn)在還知道了可分類于半胱氨酸蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶這兩類的ECM分解酶。具體包括，例如，以層粘連蛋白、蛋白多糖、纖連蛋白、膠原和原膠原酶(通過分解而活化)等為底物的組織蛋白酶B(Sloane，B.F.，Semin.Cancer Biol.1137-152，1990)，以彈性蛋白，蛋白多糖，纖連蛋白，層粘連蛋白和彈性蛋白酶(活化)等為底物的組織蛋白酶L(Kane，S.E.，andGottesman，M.M.，Semin.Cancer Biol.1127-136，1990)，以及以層粘連蛋白，纖連蛋白，蛋白多糖及組織蛋白酶B和L(活化)作為底物的組織蛋白酶D(Rochefort，H.，Semin.Cancer Biol.1153-160，1990)等。
金屬蛋白酶(metalloproteinase)是含有Zn等金屬元素的金屬酶，現(xiàn)已報道了caspase，氨肽酶，血管緊張肽I型轉(zhuǎn)換酶，膠原酶等。作為分解ECM的金屬蛋白酶，現(xiàn)已報道了16種或16種以上的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases；MMP)。代表性的MMP，包括，例如，膠原酶-1、2、3(MMP-1、8、13)，白明膠酶A、B(MMP-2、9)，基質(zhì)溶素(stromelysin)1、2、3(MMP-3、10、11)，間質(zhì)溶素(matrilysin)(MMP-7)，和膜型金屬蛋白酶(MT1-MMP和MT2-MMP)等。此外，ECM分解性的金屬蛋白酶包括例如分解ECM構(gòu)成蛋白質(zhì)之類的氨肽酶N/CD13和氨肽酶B等。
其中，膠原酶(collagenase)(MMP-1、8、13)在特異性位點切割纖維性膠原I，II，III型膠原分子。白明膠酶(gelatinase)已知有白明膠酶A(MMP-2)和白明膠酶B(MMP-9)兩種類型。白明膠酶也被稱為IV型膠原酶，其分解基底膜的主要成分IV型膠原，但是也分解V型膠原和彈性蛋白。此外，現(xiàn)已知MMP-2在與MMP-1相同位點切割I(lǐng)型膠原。MMP-9不分解層粘連蛋白和纖連蛋白，但是MMP-2分解這些物質(zhì)?；|(zhì)溶素(stromelysin)(MMP-3，10)的底物范圍寬，其分解蛋白多糖，III、IV、IX型膠原，層粘連蛋白，纖連蛋白等。間質(zhì)溶素(matrilysin)(MMP-7)是不具有血液結(jié)合素區(qū)域的分子，底物特異性與MMP-3相同，尤其是對蛋白多糖和彈性蛋白的分解活性高。膜型基質(zhì)金屬酶(membrane-typeMMP；MT-MMP)(MT1，2，3，4，5，6-MMP)是具有跨膜結(jié)構(gòu)的MMP。MT-MMP在前肽區(qū)域與活性位點之間具有插入序列(約10個氨基酸)。這種插入序列含有Arg-Xaa-Lys-Arg(Xaa為任意的氨基酸)，其在輸送到細胞膜的過程中，在細胞內(nèi)被加工切割而活化。作為MT-MMP，已知有MT1-MMP(MMP-14)，MT2-MMP(MMP-15)，MT3-MMP(MMP-16)、MT4-MMP(MMP-17)，MT5-MMP(MMP-23)，和MT6-MMP(MMP-25)等。例如，MT1-MMP降解I，II和III型膠原，MT3-MMP降解III型膠原。
MMP的切割底物多數(shù)是已知的。所有MMP都分解的底物序列，有PLGLWAR(序列號3)(Bickett，D.M.等，(1993)Anal.Biochem.212，58-64)，GPLGMRGL(序列號4)(Deng，S.J.等(2000)，J.BIOL.CHEM.275，31422-31427)，PQGLEAK(序列號5)(Beekman，B.等，(1996)FEBS Lett.390，221-225)，RPKPVEWREAK(序列號6)(Beekman，B.等，(1997)FEBS Lett.418，305-309)，和PLALWAR(序列號7)(Jacobsen，E.J等，(1999)，J.Med.Chem.42，1525-1536)。作為MMP2，9的分解底物有PLGMWS(序列號8)(Netzel-Arnett，S.等，(1991)Anal.Biochem.195，86-92)和PLGLG(序列號9)(Weingarten，H.等，(1985)Biochemistry 24，6730-6734)。
最近，通過噬菌體展示肽文庫篩選，現(xiàn)已確認了對于MMP-9(Kridel，S.J.等，(2001)，J.Biol.Chem.276，20572-20578)，MMP-2(Chen，E.1.等，(2002)，J.Biol.Chem.277，4485-4491)，和MT1-MMP(Kridel，S.J等，J.Biol.Chem.In JBC Papers In Press，April 16，2002，ManuscriptM111574200)的分解底物序列。在這些論文中，特定的氨基酸序列根據(jù)3個MMP對其分解能力可被分為4組。組IV是被MT1-MMP特異性分解的序列，沒有Arg的序列VFSIPL(序列號10)和IKYHS(序列號11)不可被MMP9、MMP2分解，而只可被MT-MMP分解。
例如，作為MMP9的切割序列，可以例舉有Pro-XX-Hy(其中，X代表任意殘基；Hy代表疏水性殘基)，尤其優(yōu)選Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr)。更具體的，可以例舉Pro-Arg-(Ser/Thr)-Hy-(Ser/Thr)(切割發(fā)生在X和Hy殘基之間)。Hy(疏水性殘基)包括，例如，Leu，Val，Tyr，Ile，Phe，Trp，Met，但不限于此。或者，還鑒定了其它切割序列(例如，參見下列文獻中的組I，II，IIIA，IIIB；如Kridel，S.J.等，(2001)，J.Biol.Chem.276，20572-20578所述)，可以使用這些序列中所希望的序列。此外，對于MMP2也可以是上述的Pro-X-X-Hy，此外，還包括(Ile/Leu)-X-X-Hy，Hy-Ser-X-Leu，和His-X-X-Hy等(參見例如以下文獻的組I，II，III和IVChen，E.I等，(2002)J.Biol.Chem.227，4485-4491)等。MMP家族的切割序列，包括MMP-7，MMP-1，MMP-2，MMP-9，MMP-3，和MT1-MMP(MMP-14)等，可以通過例如參考天然底物蛋白的序列或者篩選肽文庫之類手段來適當(dāng)?shù)剡x擇(Turk，B.E等，Nature Biotech.19，661-667，(2001)；Woessner，J.F.and Napase，H，Matrix metalloprotelnases and TIMPs.(Oxford UniversityPress，Oxford，UK，2000)；Fernandez-Patron，C.等，Circ.Res.85906-911，1999；Nakamura，H.等，J.Biol.Chem.27538885-38890，2000；McQuibban，G.A.等，Science 2891202-1206，2000；Sasaki，T.等，J.Biol.Chem.2729237-9243，1997)。例如，切割位點的8個氨基酸P4-P3-P2-P1-P1’-P2’-P3’-P4’(于P1-P1’間被切割)的例子包括，但不限于對MMP-1，有VPMS-MRGG(序列號12)；對MMP-3有RPFS-MIMG(序列號13)；對MMP-7，有VPLS-LTMG(序列號14)；對MT1-MMP，有IPES-LRAG(序列號15)等。對MMP-8的此類序列包括，例如，PLAYWAR(序列號16)(Nezel-Amett，S.et al.，Anal.Biochem.19586，1991)?？梢垣@得MMP的各種合成底物，并且還可以比較這些序列(參照，例如Merk Calbiochem目錄的“各種MMP底物”一節(jié))。
通過將病毒蛋白質(zhì)的蛋白酶切割位點的序列取代為上述蛋白酶的切割位點，更換切割病毒蛋白質(zhì)的蛋白酶。病毒蛋白質(zhì)是否被第二種蛋白酶有效切割，可以通過在細胞中表達這種經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)，然后用Western印跡法來評估。此外，還可以通過檢測被切割活化的病毒蛋白質(zhì)的功能來確認(PCT/JP03/05528)。例如，如果是具有細胞膜融合作用的病毒蛋白質(zhì)，將表達經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染細胞，在第二種蛋白酶存在下培養(yǎng)，而后檢測合胞體形成。通過測定合胞體，可以確認經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)通過被第二種蛋白酶切割而被活化。
本發(fā)明中制備的病毒不編碼病毒基因組中切割位點被修飾的蛋白質(zhì)。該病毒包括具有編碼病毒蛋白質(zhì)的基因的病毒，所述病毒蛋白質(zhì)具有切割序列被修飾前的原來的切割序列。也就是說，這種病毒含有經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)，但是該病毒的基因組中保持有編碼具有野生型切割序列的病毒蛋白質(zhì)的基因。因此，病毒(當(dāng)其具有病毒增殖所必須的病毒基因時)依賴于切割野生型切割序列的蛋白酶而增殖。在制備帶有具有野生型的切割序列的病毒基因的病毒時，除了在第二種蛋白酶存在下在病毒生產(chǎn)細胞中表達經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)之外，還可以在病毒生產(chǎn)細胞中添加或表達切割野生型切割序列的蛋白酶(即原來的蛋白酶)。通過使用經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)，可以預(yù)計增加的病毒生產(chǎn)量(參照實施例5)。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，要制備的病毒是缺陷型病毒，其缺失了作為改變切割序列的對象的病毒基因。由于該病毒缺失了上述病毒基因，即使病毒感染目的細胞，也無法在該細胞中表達功能性的病毒蛋白質(zhì)，(與有沒有蛋白酶無關(guān))也無法增殖。也就是說，這種病毒是非傳播性的。本發(fā)明的方法特別地具有如下優(yōu)點其可以使用包括人類細胞在內(nèi)的各種細胞類型高效地制備一般難以高效價制備的、無傳播能力的缺陷型載體。
在本發(fā)明的病毒制備中，如上所述反式(即從病毒基因組之外)地提供切割位點被改變?yōu)榈诙N蛋白酶切割序列的經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)。為此，優(yōu)選另外構(gòu)建表達經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的載體，將其導(dǎo)入到病毒生產(chǎn)細胞中表達。用于表達經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的載體可以使用所希望的載體，但是如果使用病毒載體，理所當(dāng)然地，為了防止該載體與欲制備的病毒混雜，應(yīng)使用在該病毒生產(chǎn)細胞中不增殖的病毒載體。此外，為了防止編碼改變的蛋白質(zhì)的基因被包入到制備的病毒中，應(yīng)使用其它種類的病毒的載體，或者如果使用同種病毒的載體，則預(yù)先除去包入到病毒中所必須的信號序列。例如，優(yōu)選使用增殖能力被失活的病毒載體、與要制備的病毒不同種類的非傳播性病毒、或者非病毒載體。具體地，優(yōu)選使用缺失復(fù)制能力的異種病毒載體和質(zhì)粒載體。
更優(yōu)選的用于表達經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的載體包括例如質(zhì)粒載體。用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞可以使用例如磷酸鈣法(Graham，F(xiàn).L.and Van Der Eb，J.，1973，Virology 52456；Wigler，M.and Silverstein，S.，1977，Cell 11223)，或者使用各種轉(zhuǎn)染試劑的方法，或電穿孔法之類。對于磷酸鈣法，按照例如Chen和Okayama(Chen and Okayama，H.，1987，Mol.Cell.boil.72745)所述方法，可以在2-4％CO2，沉淀混合液中的DNA濃度為20-30μg/ml的條件下，35℃下進行15-24小時。對于轉(zhuǎn)染試劑，DEAE-葡聚糖(Sigma#D-9885M.W.5×105)，DOTMA(Roche)，Superfect(QIAGEN#301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Roche#1811169)，TransIT-LT1(Mirus，Product No.MIR 2300)之類。為了預(yù)防轉(zhuǎn)染試劑與DNA的復(fù)合體在核內(nèi)體中被分解，可以加入氯喹(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 803015)。此外，電穿孔法由于沒有細胞選擇性而通用性很高，可以通過優(yōu)化脈沖電流的持續(xù)時間，脈沖的形狀，電場(電極間的間隙，電壓)的強度，緩沖液的導(dǎo)電率，DNA濃度，細胞密度進行應(yīng)用。對于向細胞中導(dǎo)入DNA以重新構(gòu)建載體，比較適宜使用轉(zhuǎn)染試劑的方法，因為其操作簡便而且便于使用大量細胞研究多種試樣。優(yōu)選的，可以使用Superfect Transfection Reagent(Qiagen，CatNo.301305)，Dosper Liposomal Transfection Reagent(Roche，Cat No.1811169)，TransIT-LT1(Mirus，Product No.MIR 2300)等，但是不限于此。
用于表達經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)的啟動子可以使用所希望的用于哺乳動物細胞表達的啟動子，例如，可以使用巨細胞病毒(CMV)的啟動子，魯斯(氏)肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)(RSV)LTR啟動子，胸苷激酶(TK)啟動子，α-或β-肌動蛋白啟動子，SV40早期基因啟動子，EF1α啟動子，SRα啟動子，或者上述啟動子的雜合啟動子等((Kim DW et al.，1990，Use of the humanelongation factor 1 alpha promoter as a versatile and efficient expression system.Gene 91(2)217-23；Chapman BS et al.，1991，Effect of intron A from humancytomegalovirus(Towne)immediate-early gene on heterologous expression inmammalian cells，Nucleic Acids Res.143979-3986；Takebe Y et al.，1988，SRalpha promoteran efficient and versatile mammalian cDNA expression systemcomposed of the simian virus 40 early promoter and the R-U5 segment of humanT-cell leukemia virus type 1 long terminal repeat.Mol.Cell Biol.1466-472))。
用于表達經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)的特別優(yōu)選的啟動子包括含有巨細胞病毒增強子和雞β-肌動蛋白啟動子的啟動子(稱為CA啟動子)。所謂CA啟動子是指含有(i)巨細胞病毒(CMV)的IE(immediate early，立即早期)基因的增強子序列和(ii)雞β-肌動蛋白啟動子序列的雜合啟動子。通過使用CA啟動子表達經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)，可以生產(chǎn)高效價的病毒。作為CMV IE增強子，可以使用希望的CMV株的立即早期基因的增強子，例如，可以使用含有序列號17的核苷酸序列的DNA。
此外，作為雞β-肌動蛋白啟動子，可以使用含有雞β-肌動蛋白基因的基因組DNA的轉(zhuǎn)錄起始位點和TATA盒(Ann.Rev.Biochem.50，349-383，1981)和CCAAT盒(Nud.Acids Res.8，127-142，1980)，并具有啟動子活性的DNA片段。雞β-肌動蛋白基因啟動子的核苷酸序列已被例如T.A.Kost等人(Nucl.Acids Res.11，8287-8286，1983)報道。人們認為雞β-肌動蛋白基因啟動子的核苷酸序列中，從原來的β-肌動蛋白結(jié)構(gòu)基因的翻譯起始密碼子(ATG)的上游-909位置的G(鳥嘌呤)起至-7位置的G(鳥嘌呤)的區(qū)域是內(nèi)含子。由于該內(nèi)含子有促進轉(zhuǎn)錄的活性，優(yōu)選使用含有該內(nèi)含子的至少一部分的基因組DNA片段。作為該雞β-肌動蛋白啟動子具體包括，例如，含有序列號18的核苷酸序列的DNA。內(nèi)含子接納序列(intron acceptorsequence)可以使用適當(dāng)?shù)钠渌虻男蛄校?，可以使用家兔?球蛋白的剪切接納序列。更具體地，可以使用位于家兔β-球蛋白的起始密碼子的前方緊鄰的第二個內(nèi)含子的接納位點。具體可以例舉有含有序列號19中記載的核苷酸序列的DNA。本發(fā)明中的CA啟動子優(yōu)選是如下的DNA在CMV IE增強子序列的下游連接了含有一部分內(nèi)含子的雞β-肌動蛋白啟動子，在其下游添加了希望的內(nèi)含子接納序列。其中，例如序列號20所示。為了表達蛋白質(zhì)，可以以該序列的最后的ATG作為起始密碼子，再添加經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的編碼序列。
CA啟動子中使用的CMV增強子序列和雞β-肌動蛋白基因啟動子，根據(jù)分離株或分離個體的不同，其序列可能有多樣性。此外，可以對這些序列進行輕微改變以添加或刪除限制性酶識別位點或插入接頭(Molecularcloninga laboratory manual.，3rd ed.，Joseph Sambrook，David W.Russell.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，2001)。也就是說，即使這些序列不是與序列號20所示序列完全相同的序列，只要具有同等或以上(例如70％或以上，優(yōu)選80％或以上，90％或以上，或100％或以上)的啟動子活性，就可以適當(dāng)使用。作為CMV增強子序列和雞β-肌動蛋白基因啟動子序列的變異體，可以使用例如Genbank登錄號AF334827，AY237157，AJ575208和X00182等中記載的序列。為了從這些序列中確定在CA啟動子的構(gòu)建中所必需的序列，可以與序列號17與18進行比對，選擇匹配的區(qū)域。此外，可以從pCAGGS(Niwa，H.et al.(1991)Gene.108193-199，特開平3-168087)或pCALNdLw(Arai，T.et al.J.Virology 72，1998，p1115-1121)中切出DNA，用于CA啟動子的構(gòu)建。
上述CMV IE增強子序列和雞β-肌動蛋白啟動子的變異體包括這樣的序列，其含有序列號17中記載的CMV IE增強子序列和序列號18中例示的雞β-肌動蛋白啟動子中取代，缺失，和/或插入了30％或30％以下，優(yōu)選20％或20％以下，更優(yōu)選15％或15％以下，更優(yōu)選10％或10％以下，更優(yōu)選5％或5％以下，更優(yōu)選3％或3％以下的核苷酸，并且顯示出同等啟動子活性。這些序列顯示出分別與序列號17中記載的核苷酸序列或序列號18中記載的核苷酸序列均具有高同源性。高同源性的核苷酸序列包括，例如，具有70％或以上，更優(yōu)選75％或以上，更優(yōu)選80％或以上，更優(yōu)選85％或以上，更優(yōu)選90％或以上，更優(yōu)選93％或以上，更優(yōu)選95％或以上，更優(yōu)選96％或以上的同一性的核苷酸序列。核苷酸序列的同一性可以使用例如BLAST程序(Altschul，S.F.et al.，1990，J.Mol.Biol.215403-410)來確定。例如，在NCBI(National Center for Biothchnology Information)的BLAST的網(wǎng)頁中將含有低復(fù)雜度(low complexity)的濾器(filter)完全置于OFF，用默認的參數(shù)進行檢索(Altschul，S.F.et al.(1993)Nature Genet.3266-272；Madden，T.L.et al.(1996)Meth.Enzymol.266131-141；Altschul，S.F.et al.(1997)Nucleic AcidsRes.253389-3402；Zhang，J.& Madden，T.L.(1997)Genome Res.7649-656))。例如，使用比較兩條序列的blast2sequence程序，可以進行兩條序列的比對，以確定序列的同一性。缺口(Gap)與錯配同樣地處理，例如對于序列號17中記載的所有核苷酸序列或序列號18中記載的所有的核苷酸序列計算同一性的值。具體地，計算比對中的序列號17或18的總堿基數(shù)(包括缺口)中一致的堿基數(shù)的比例。從計算中排除比對中的序列號1或2的外側(cè)的缺口。
此外，CMV增強子序列和雞β-肌動蛋白啟動子序列也可以通過雜交分別從CMV的基因組核酸和雞基因組DNA中分離。本發(fā)明中使用的CMV增強子和雞β-肌動蛋白啟動子是在嚴緊條件下分別與序列號17中記載的核苷酸序列或序列號18中記載的核苷酸序列或其互補序列雜交的DNA，也可以是與其具有同等啟動子活性的DNA。在雜交中，可以通過例如從包括序列號17中記載的核苷酸序列或序列號18中記載的核苷酸序列或它們的互補序列的核酸中制備探針，或者從作為雜交對象的DNA中制備探針，然后檢測它們是否與其它DNA雜交來鑒定。嚴緊雜交條件是例如以下條件在5×SSC，7％(W/V)SDS，100μg/ml變性鮭精DNA，并含有5×Denhardt’s液(1×Denhardt’s溶液含有0.2％聚乙烯吡咯烷酮，0.2％牛血清白蛋白和0.2％Ficoll)的溶液中，于60℃，優(yōu)選65℃，更優(yōu)選68℃進行雜交，然后在2×SSC中，優(yōu)選在1×SSC中，更優(yōu)選在0.5×SSC中，更優(yōu)選在0.1×SSC中，在與雜交相同的溫度下，一邊振蕩一邊清洗兩小時。
在用于表達經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的載體中，如果使用可以應(yīng)答于特定刺激而誘導(dǎo)表達的表達系統(tǒng)，就可以在生產(chǎn)病毒時特異性地誘導(dǎo)經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的表達。由于有時病毒蛋白質(zhì)顯示出對細胞的毒性，使用該誘導(dǎo)表達系統(tǒng)是有利的。為了達到該目的，可以使用例如采用大腸桿菌的四環(huán)素抗性操縱子的表達系統(tǒng)(Gossen，M.，et al.(1995)Science 2681766-1769；Tet Expression Systems and Cell LinesGuly 1996)CLONTECHniquesXI(3)2-5)，采用蛻皮素受體，RXR和蛻皮素受體應(yīng)答序列的蛻皮素誘導(dǎo)表達系統(tǒng)(pVgRXR，pIND；Ecdysone-inducible Mammalian Expression Kit，Invitrogen公司)，或者采用Cre/loxP或FLP/FRT等序列特異的重組酶的表達系統(tǒng)。特別地，采用序列特異的重組酶的誘導(dǎo)表達系統(tǒng)容易與各種啟動子組合使用，可以非常嚴格地控制表達的開/關(guān)，因此可應(yīng)用于經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的表達系統(tǒng)。
Cre是噬菌體P1具有的約38kDa的環(huán)化重組酶，特異性地在loxP位點間進行重組(Sauer B，Henderson N.1988.Site-specific DNA recombination inmammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1.Proc Natl AcadSci USA 855166-70；Sternberg N，Hamilton D.1981.Bacteriophage P1site-specific recombination.I.Recombination between loxP sites.J Mol Biol150467-86；Brian Sauer，Methods of Enzymology；1993，Vol.225，890-900；Nagy A.2000.Cre recombinasethe universal reagent for genome tailoring.Genesis 2699-109)。loxP是13bp的不對稱的反向重復(fù)序列，具有8bp的間隔序列(ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT；下劃線為反向重復(fù)；序列號21)。例如，使用Cre/loxP誘導(dǎo)型表達質(zhì)粒pCALNdlw(Arai，T.et al.，J.Virology 72，1998，p1115-1121)，可以構(gòu)建能被Cre誘導(dǎo)表達的載體。為了表達Cre，例如，按照齊藤等人的方法(Saito et al.，Nucl.Acids Res.233816-3821(1995)；Arai，T.et al.，J.Virol 72，1115-1121，(1998))，以例如moi(感染復(fù)數(shù))＝3-5的腺病毒AxCANCre感染細胞。
FLP重組酶是源于酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的2微米質(zhì)粒的約49kDa的翻轉(zhuǎn)酶(flippase)重組酶，其以FLP重組酶目標(biāo)(FRT)序列作為目標(biāo)產(chǎn)生重組(Utomo AR，Nikitin AY，Lee WH.1999.Temporal，spatial，and cell type-specific control of Cre-mediated DNA recombination in transgenicmice.Nat Biotechnol 171091-6；Broach，J.R.，Guarascio，V.R.& Jayaram，M.(1982)Cell 29，227-34；Cox，M.M.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，4223-227；Vetter，D.，Andrews，B.J.，Roberts-Beatty，L.& Sadowski，P.D.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，7284-288；Abremski，K.& Hoess，R.(1984)J.Biol.Chem.259，1509-514；Stark，W.M.，Boocock，M.R.& Sherratt，D.J.(1992)Trends Genet.8，432-39；Kilby，N.J.，Snaith，M.R.& Murray，J.A.H.(1993)Trends Genet.9，413-21)。與loxP相同，F(xiàn)RT序列也是由13bp的重復(fù)序列構(gòu)成，包含8bp的間隔序列(GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC；序列號22)(Andrews，B.J.et al.(1985).The FLP Recombinase of the 2 Micron Circle DNA of YeastInteraction with its Target Sequences.Cell 40，795-803)。此外，也可以利用上述loxP位點和FRT位點的變異序列進行目標(biāo)特異的重組(Baszczynski，Christopher L.et al，美國專利申請20040003435)。
為了構(gòu)建重組酶依賴性誘導(dǎo)表達的載體，將夾在重組酶靶序列間的DNA片段插入啟動子與改變的病毒蛋白質(zhì)編碼序列之間。這種狀態(tài)下，改變的病毒蛋白質(zhì)受插入的DNA片段妨礙而不表達。但是，如果使重組酶作用，就能切出夾在目標(biāo)序列間的DNA，使啟動子得以表達重組酶。這樣一來，通過重組酶，可以誘導(dǎo)由啟動子啟動的表達。優(yōu)選預(yù)先設(shè)計使夾在重組酶的目標(biāo)序列間的DNA中含有轉(zhuǎn)錄終止信號和/或終止密碼子，以使重組酶不作用時，下游連接的基因的表達可以被確實地抑制。此外，可以預(yù)先在夾在重組酶的目標(biāo)序列間的DNA中插入適當(dāng)?shù)臉?biāo)記基因。
經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的表達載體，根據(jù)該載體的種類，使用轉(zhuǎn)染或感染等適當(dāng)?shù)姆椒▽?dǎo)入到哺乳動物細胞中使之表達。轉(zhuǎn)染可以使用各種轉(zhuǎn)染試劑。例如，優(yōu)選使用DOTMA(Roche)，Superfect(QIAGEN#301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Roche#1811169)，TranslT-LT1(Mirus，Product No.MIR 2300)等陽離子脂質(zhì)。經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的表達載體既可以在病毒制備時一過性的導(dǎo)入，使之在病毒生產(chǎn)細胞中游離表達，也可以建立導(dǎo)入到病毒生產(chǎn)細胞的染色體中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。穩(wěn)定地導(dǎo)入了經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的表達載體的細胞可以作為輔助細胞用于制備病毒。這樣的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體可以通過預(yù)先在載體中整合藥物抗性標(biāo)記基因并選擇藥物抗性株來獲得。優(yōu)選通過Western印跡分離高表達經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的細胞克隆。此外，使這些細胞實際地生產(chǎn)病毒載體，以選擇具有生產(chǎn)高效價病毒的能力的細胞。
對導(dǎo)入經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的表達載體的細胞種類沒有特別的限制，只要是病毒可以增殖的哺乳動物細胞。例如，可以使用小鼠，大鼠，猴，和人類來源的細胞株。具體地，可以例舉有NIH3T3，3Y1，LLC-MK2，Vero，CV-1，HeLa，HEK293，COS-1，COS-7，CHO，CHO-K1，HT1080或者它們的衍生株。在制備用于向人類細胞導(dǎo)入基因的病毒載體時，優(yōu)選使用人類細胞生產(chǎn)病毒。其原因是，如上所述，由病毒生產(chǎn)細胞釋放的子代病毒粒子中，可能混入來源于病毒生產(chǎn)細胞的細胞質(zhì)和細胞膜成分。因此如果使用人類細胞之外的細胞制備病毒時，這些成分在人體中會造成有害作用，或者還存在引起免疫反應(yīng)的可能性。這些問題可以通過使用與病毒載體的給藥對象同種的細胞來生產(chǎn)病毒來解決。
能夠表達經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的表達載體的細胞株，不僅可用于制備與該蛋白質(zhì)同種來源的病毒，還可用于制備用該經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)假型化(pseudotype)的其它種類病毒。例如，通過在負鏈RNA病毒的經(jīng)修飾的F蛋白質(zhì)和HN蛋白質(zhì)的存在下產(chǎn)生腺病毒，也可以構(gòu)建被修飾的F蛋白質(zhì)假型化(pseudotype)的腺病毒載體(Galarns，E.et al.，Hum.Gene Ther.12，811-821(2001))。進而，例如，該細胞可以用于經(jīng)修飾的F蛋白質(zhì)和HN蛋白質(zhì)假型化逆轉(zhuǎn)錄病毒(Spiegel，M.et al.，J Virol.72(6)5296-5302(1998))。取決于制備的病毒，細胞中也可以進一步整合表達其它病毒蛋白質(zhì)和/或病毒基因組RNA的載體。
具有經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的病毒載體的制備，可以通過在各種病毒的制備過程中使用上述細胞(和切割該改變的病毒蛋白質(zhì)的蛋白酶)來實施。具體地，在表達經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的細胞中，在切割經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的蛋白酶的存在下，轉(zhuǎn)錄病毒載體的基因組RNA。在需要反式提供病毒蛋白質(zhì)以形成病毒粒子時，表達該病毒蛋白質(zhì)。被轉(zhuǎn)錄的病毒基因組RNA與病毒蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，從而形成包入了經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的病毒粒子。通過從細胞的培養(yǎng)上清或細胞中回收該病毒粒子，可以制備含有經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的病毒載體。
本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于制備依賴于蛋白酶的所希望的病毒載體，下面以負鏈RNA病毒載體的制備方法為例進行更為詳細地說明。所謂負鏈RNA病毒是含有負鏈(與有義編碼病毒蛋白質(zhì)的鏈互補的反義鏈)RNA作為基因組的病毒。負(minus)鏈RNA也稱為負(negative)鏈RNA。負鏈RNA是優(yōu)良的基因?qū)胼d體，因為其僅在宿主細胞的細胞質(zhì)中進行轉(zhuǎn)錄復(fù)制，不具有DNA階段，因此不發(fā)生向染色體的整合(integration)(Lamb，R.A.and Kolakofsky，D.，ParamyxoviridaeThe viruses and their replication.InFields BN，Knipe DM，Howley PM，(eds).Fields of virology.Vol.2.Lippincott-Raven PublishersPhiladelphia，1996，pp.1177-1204)。因此，不發(fā)生染色體異常所導(dǎo)致的癌變和惡化等安全方面的問題。負鏈RNA病毒的這種特征對將其載體化時的安全性方面大有貢獻。在異種基因表達的結(jié)果中，即使連續(xù)多代傳代負鏈RNA病毒中的仙臺病毒(SeV)，也幾乎沒有發(fā)現(xiàn)基因的變異，顯示出基因組的高穩(wěn)定性，插入的異種基因在長時間內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定地表達(Yu，D.et al.，Genes Cells 2，457-466(1997))。此外，由于其不具有衣殼結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，因此在導(dǎo)入基因的大小或包裝的靈活性(flexbility)等方面的性質(zhì)上具有優(yōu)點。如上所述，提示負鏈RNA病毒載體可成為用于人類的基因治療的新型高效率轉(zhuǎn)導(dǎo)載體。
作為可以在本發(fā)明中使用的負鏈RNA病毒，特別地包括在基因組中具有單鏈負(negative)鏈[即負(minus)鏈]RNA的單鏈負鏈RNA病毒(也稱為非分節(jié)型(non-segmented)負鏈RNA病毒)。作為這種病毒，包括屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae；包括副粘病毒屬(Paramyxovirus)，麻疹病毒屬(Morbillivirus)和腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)等)，彈狀病毒科(Rhabdoviridae；包括水泡性病毒屬(Vesiculovirus)，狂犬病毒屬(Lyssavirus)和短暫熱病毒屬(Ephemerovirus)等)，纖絲病毒科(Filoviridae)，正粘病毒科(Orthomyxoviridae；包括流感病毒A，B，C，和索戈托樣病毒(Thogoto-like viruses)等)，布尼亞病毒科(Bunyaviridae；包括布尼亞病毒屬(Bunyavirus)，漢坦病毒屬(Hantavirus)，內(nèi)羅病毒(Nairovirus)和白蛉病毒屬(Phlebovirus)等)，和沙粒病毒科(Arenaviridae)等科的病毒。
更具體的例子有仙臺病毒(SeV)，人副流感病毒-1(HPIV-1)，人副流感病毒-3(HPIV-3)，海豹瘟熱病毒(phocine distemper virus)(PDV)，犬瘟熱病毒(canine distemper virus)(CDV)，海豚麻疹病毒(dolphinmolbillivirus)(DMV)，小反芻動物瘟疫病毒(peste-des-petits-ruminantsvirus)(PDPR)，麻疹病毒(measles virus)(MV)，牛瘟麻疹病毒(rinderpest virus)(RPV)，亨德拉病毒(Hendra virus)(Hendra)，立百病毒(Nipah)，人副流感病毒-2(HPIV-2)，猿副流感病毒5(SV5)，人副流感病毒-4a(HPIV-4a)，人副流感病毒-4b(HPIV-4b)，腮腺炎病毒(mumps virus)(Mumps)，新城疫病毒(Newcastle disease virus)(NDV)等。
本發(fā)明的病毒制備方法的主要對象是增殖所必需的蛋白酶為弗林蛋白酶之外的蛋白酶的病毒，但是對于例如原來的F蛋白質(zhì)中含有弗林蛋白酶型切割序列的病毒，在制備因F蛋白質(zhì)變異而切割位點變化的弱毒株時，也可以由病毒生產(chǎn)細胞反式提供弗林蛋白酶切割型F蛋白質(zhì)。
改變負鏈RNA病毒的F蛋白質(zhì)的切割位點時，優(yōu)選如下設(shè)計切割序列，使得切割后的F1片段的N末端與野生型F蛋白質(zhì)的F1片段的末端相同。此外，為了發(fā)生有效的切割反應(yīng)而在切割位點插入接頭時，希望設(shè)計成在切割后的F1片段的N末端上與野生型F1相比只添加的最少數(shù)的氨基酸。例如，設(shè)法使切割后的N末端與野生型F1相比添加的5個氨基酸或更少，優(yōu)選4個氨基酸或更少，更優(yōu)選3個氨基酸或更少(例如1，2或3個氨基酸)。可以使原來的F蛋白質(zhì)的F2片段的C末端的氨基酸適當(dāng)缺失，缺失的氨基酸例如可以與插入的氨基酸數(shù)相同，或者可以在0-10個氨基酸左右的范圍內(nèi)選擇。只要不阻礙由蛋白酶進行的切割和膜融合的過程，F(xiàn)蛋白質(zhì)就可以如此制備，使得在切割序列的下游直接連接F1的N末端，或者，也可以通過適當(dāng)?shù)拈g隔序列連接切割序列和F1片段。
表達經(jīng)修飾的F蛋白質(zhì)的載體可以使用所希望的載體系統(tǒng)，但是優(yōu)選使用質(zhì)粒載體。載體可以在病毒產(chǎn)生時轉(zhuǎn)染到細胞中，或者也可以建立預(yù)先整合到細胞的染色體中的轉(zhuǎn)化細胞。用于表達經(jīng)修飾的F蛋白質(zhì)的啟動子，可以使用所希望的用于在哺乳動物細胞中表達的啟動子，但是優(yōu)選使用CA啟動子。優(yōu)選使用重組酶目標(biāo)序列使得表達可以被重組酶特異性地誘導(dǎo)(參照實施例9)。
本發(fā)明中制備的病毒，更優(yōu)選的是屬于副粘病毒亞科(包括呼吸道病毒屬，彈狀病毒屬和麻疹病毒屬)的病毒或其衍生物，更優(yōu)選的是屬于呼吸道病毒屬(genus respirovirus)(也稱為副粘病毒屬(Paramyxovirus))的病毒或其衍生物。衍生物中包括病毒基因以不損傷基于病毒的基因?qū)肽芰Φ姆绞奖恍揎椀牟《?。本發(fā)明可使用呼吸道病毒屬病毒，包括例如人副流感病毒1型(HPIV-1)，人副流感病毒3型(HPIV-3)，牛副流感病毒3型(BPIV-3)，仙臺病毒(Sendai virus也稱為小鼠副流感病毒1型)和猴副流感病毒10型(SPIV-10)等。本發(fā)明中制備的病毒最優(yōu)選的是仙臺病毒。病毒可以是來源于天然株，野生株，變異株，實驗室傳代株，以及人工構(gòu)建的毒株等的病毒。
特別地，已知仙臺病毒對于嚙齒類是有病原性的且可導(dǎo)致肺炎，但是對人是沒有病原性。此外，根據(jù)以往的如下報道，也支持了即野生型仙臺病毒經(jīng)鼻給藥于非人類靈長類中沒有顯示出嚴重的有害作用的觀點(Hurwitz，J.L.et al.，Vaccine 15533-540，1997；Bitzer，M.et al.，J.Gene Med，.5543-553，2003；Slobod，K.S.et al.，Vaccine 223182-3186，2004)。仙臺病毒的這些特征提示仙臺病毒載體可以應(yīng)用于人類的治療中。
負鏈RNA病毒的基因組RNA與負鏈RNA病毒的病毒蛋白質(zhì)一起形成核糖核蛋白(RNP)，通過該蛋白質(zhì)表達基因組中的基因，這種RNA是具有復(fù)制后可形成子RNP的功能的RNA。一般而言，RNA病毒的基因組中，病毒基因作為反義序列在3’前導(dǎo)區(qū)域和5’尾隨區(qū)域之間排列。各基因的ORF間存在轉(zhuǎn)錄終止序列(E序列)-插入序列(I序列)-轉(zhuǎn)錄起始序列(S序列)，因此編碼各基因的ORF的RNA作為單獨的順反子被轉(zhuǎn)錄?；蚪MRNA反義地編碼病毒蛋白質(zhì)N(核殼體(或也稱為核蛋白))，P(磷(phospho))和L(大)，它們是該RNA編碼的基因群的表達和RNA自身的自主復(fù)制所必需的?；蚪MRNA還可以進一步編碼包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)，但是也可以構(gòu)建缺失這些基因的缺失型載體。
例如，屬于副粘病毒亞科的各種病毒中的各基因，一般如以下方式表示。一般N基因也表示為“NP”。此外，HN在沒有神經(jīng)氨酸酶時也表示為H。
呼吸道病毒屬NP/C/V M F HN - L腮腺炎病毒屬NP/VM F HN (SH) L麻疹病毒屬 NP/C/V M F H - L例如，仙臺病毒的各基因的核苷酸序列的數(shù)據(jù)庫的登錄號，對于N基因，參照M29343，M30202，M30203，M30204，M51331，M55565，M69046，X17218；對于P基因，參照M30202，M30203，M30204，M55565，M69046，X00583，X17007，X17008；對于M基因，參照D11446，K02742，M30202，M30203，M30204，M69046，U31956，X00584，X53056；對于F基因，參照D00152，D11446，D17334，D17335，M30202，M30203，M30204，M69046，X00152，X02131；對于HN基因，參照D26475，M12397，M30202，M30203，M30204，M69046，X00586，X02808，X56131；對于L基因，參照D00053，M30202，M30203，M30204，M69040，X00587，X58886。此外，其它病毒編碼的病毒基因包括，例如，對于N基因，可以列舉有CDV，AF014953；DMV，X75961；HPIV-1，D01070；HPIV-2，M55320；HPIV-3，D10025；Mapuera，X85128；Mumps，D86172；MV，K01711；NDV，AF064091；PDPR，X74443；PDV，X75717；RPV，X68311；5eV，X00087；SV5，M81442；和Tupaia，AF079780；對于P基因，可列舉有CDV，X51869；DMV，Z47758；HPIV-1，M74081；HPIV-3，X04721；HPIV-4a，M55975；HPIV-4b，M55976；Mumps，D86173；MV，M89920；NDV，M20302；PDV，X75960；RPV，X68311；5eV，M30202；SV5，AF052755；和Tupaia，AF079780；對于C基因，可列舉有CDV，AF014953；DMV，Z47758，HPIV-1，M74081；HPIV-3，D00047；MV，AB016162；RPV，X68311；5eV，AB005796；和Tupaia，AF079780；對于M基因，可列舉有CDV，M12669；DMV Z30087；HPIV-1，S38067；HPIV-2，M62734；HPIV-3，D00130；HPIV-4a，D10241；HPIV-4b，D10242；Mumps，D86171；MV，AB012948；NDV，AF089819；PDPR，Z4797；PDV，X75717；RPV，M34018；5eV，U31956；和SV5，M32248；對于F基因，可列舉有CDV，M21849；DMV，AJ224704；HPN-1，M22347；HPIV-2，M60182；HPIV-3，X05303，HPIV-4a，D49821；HPIV-4b，D49822；Mumps，D86169；MV，AB003178；NDV，AF048763；PDPR，Z37017；PDV，AJ224706；RPV，M21514；5eV，D17334；和SV5，AB021962；對于HN(H或G)基因，可列舉有CDV，AF112189；DMV，AJ224705；HPIV-1，U709498；HPIV-2.D000865；HPIV-3，AB012132；HPIV-4A，M34033；HPIV-4B，AB006954；Mumps，X99040；MV，K01711；NDV，AF204872；PDPR，Z81358；PDV，Z36979；RPV，AF132934；5eV，U06433；和SV-5，S76876。但是，各病毒已知有多種毒株，由于毒株不同，也存在由上述例子之外的其它序列構(gòu)成的基因。
一般而言，具有N，P和L基因的負鏈RNA病毒載體在細胞內(nèi)自RNA基因組自主表達病毒基因，基因組RNA被復(fù)制。進而，在包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)存在下形成感染性病毒粒子，然后釋放到細胞外。如果在基因組中搭載編碼感染性病毒粒子形成所必需的包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因，這種病毒載體可以自主增殖，形成具有傳播能力的病毒載體。病毒載體從基因組中缺失任一種或所有包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)基因，就可在感染細胞中形成不具有感染性的病毒粒子的缺失型病毒載體。
所謂包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)是指成為病毒的包膜的成分的病毒蛋白質(zhì)，包括露出于包膜表面，在對細胞的粘附或感染中起作用的刺突蛋白質(zhì)和在形成包膜等中起作用的基質(zhì)蛋白質(zhì)。具體地，包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)包括，例如F(融合)，HN(血凝素-神經(jīng)氨酸酶)(或者H(血凝素))和M(基質(zhì))，根據(jù)病毒種類，具有H，M1和G等基因。刺突蛋白F基因缺失或HN(或H)基因缺失對使負鏈RNA病毒載體轉(zhuǎn)變?yōu)榉莻魅拘允怯行У?，包膜的基質(zhì)蛋白質(zhì)M基因缺失對使感染細胞不能形成粒子是有效的(WO00/70055 WO00/70070和W003/025570；Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000)；Hasan，M.K.et al.，1997，J.General Virology 782813-2820)。此外，缺失了F，HN(或H)和M的至少兩種基因的任意組合的載體可以保證具有更高的安全性。為了使基因缺損，可以通過導(dǎo)入變異(WO00/09700)使蛋白質(zhì)的功能喪失，或者通過除去蛋白質(zhì)的編碼序列使基因缺失。例如，缺失了M和F兩個基因的負鏈RNA病毒(ΔMΔF)將成為不具有傳播性并且不能形成粒子的載體。ΔMΔF病毒在體內(nèi)和體外都具有高水平的感染性和基因表達能力，該水平與野生型病毒同等。ΔMΔF病毒被認為有助于提高負鏈RNA病毒載體的安全性。使用共表達經(jīng)修飾的F蛋白質(zhì)和所缺失的蛋白質(zhì)的哺乳動物細胞，可以構(gòu)建缺失了包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)基因的病毒。在某些細胞中進行感染時不需要HN蛋白質(zhì)(Markwell，M.A.et al.，Proc.Natil.Acad.Sci.USA82(4)978-982(1985))，僅以F蛋白質(zhì)就可實現(xiàn)感染。為了在該細胞中導(dǎo)入基因，在制備病毒載體時，可以僅提供經(jīng)修飾的F蛋白質(zhì)。
此外，制備缺失型病毒時，也可以使用與病毒基因組所缺失的包膜蛋白質(zhì)不同種類的包膜蛋白質(zhì)來制備假型化的病毒載體。例如，在重新構(gòu)建病毒時，通過使作為骨骼病毒基因組原本編碼的包膜蛋白質(zhì)之外的包膜蛋白質(zhì)在細胞中表達，可以制備具有所希望的包膜蛋白質(zhì)的重組病毒。對于該蛋白質(zhì)沒有特別的限定?？梢允褂觅x予細胞感染能力的所希望的蛋白質(zhì)。例如，其它病毒的包膜蛋白質(zhì)，例如水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus；VSV)的G蛋白質(zhì)(VSV-G)。VSV-G蛋白質(zhì)可以是來源于任意VSV株。例如，可以使用來源于印第安納(Indiana)血清型株(J.Virology 39519-528(1981))的VSV-G蛋白質(zhì)，但是不限于此。此外，本發(fā)明的載體可以含有其它病毒來源的包膜蛋白質(zhì)的任意組合。例如，作為該蛋白質(zhì)，來源于感染人細胞的病毒的包膜蛋白質(zhì)是最佳的。作為該蛋白質(zhì)，沒有特別限定，但是可以列舉有逆轉(zhuǎn)錄病毒的雙嗜性包膜蛋白質(zhì)。作為逆轉(zhuǎn)錄病毒的雙嗜性包膜蛋白質(zhì)，可以使用例如來源于小鼠白血病病毒(MuLV)4070A株的包膜蛋白質(zhì)。此外，也可以使用來源于MuMLV 10A1的包膜蛋白質(zhì)(例如pCL-10A1(Imgenex)(Nayiaux，R.K.et al.，J.Virol.705701-5705(1996))。此外，皰疹病毒科(Herpesviridae)的蛋白質(zhì)包括例如單純皰疹病毒的gB，gD，gH，gp85蛋白質(zhì)，EB病毒的gp350，gp220蛋白質(zhì)等。作為嗜肝DNA病毒(Hepadnavirus)科的蛋白質(zhì)，可以例舉有乙型肝炎病毒的S蛋白質(zhì)等。該等蛋白質(zhì)，也可以作為細胞外區(qū)域與F蛋白質(zhì)或HN蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)區(qū)域結(jié)合的融合蛋白質(zhì)使用。如此，在本發(fā)明中，也可以制備含有來源于基因組來源的病毒之外的病毒的包膜蛋白質(zhì)，例如VSV-G蛋白質(zhì)的假型(pseudotype)病毒載體。如果設(shè)計成病毒的基因組RNA中基因組不編碼該等包膜蛋白質(zhì)，在病毒粒子感染細胞后，病毒載體就不會表達該等蛋白質(zhì)。
此外，在改變了蛋白酶切割序列的經(jīng)修飾的F蛋白質(zhì)中，除了切割位點之外，還可以在其它位點增加改變。例如，通過缺失F蛋白質(zhì)的細胞質(zhì)區(qū)域，可以提高細胞融合能力(PCT/JP03/05528)。例如，使細胞質(zhì)區(qū)域的一部分氨基酸缺失，使得細胞質(zhì)區(qū)域具有0-28個，更優(yōu)選1-27個，更優(yōu)選4-27個氨基酸的F蛋白質(zhì)，顯示出顯著高于野生型F蛋白質(zhì)的細胞融合能力。所謂細胞質(zhì)區(qū)域，就是膜蛋白質(zhì)的細胞質(zhì)側(cè)的區(qū)域，F(xiàn)蛋白質(zhì)中則是跨膜區(qū)域(TM)的C末端區(qū)域。例如，制備帶有F蛋白質(zhì)的病毒載體，其中該F蛋白質(zhì)具有6-20個，優(yōu)選10-16個，更優(yōu)選13-15個氨基酸作為細胞質(zhì)區(qū)域，就可以獲得具有比使用野生型F蛋白質(zhì)更高的細胞融合能力的載體。
此外，還可以構(gòu)建帶有兩種刺突蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的病毒。如果使起細胞融合作用的F蛋白質(zhì)與被認為對細胞的粘附起作用的HN蛋白質(zhì)(或H蛋白質(zhì))表達為融合蛋白質(zhì)，就可以顯示比在使它們分別表達的情況下更強的融合能力(PCT/JP03/05528)。上述融合蛋白質(zhì)是兩種蛋白質(zhì)通過二者的細胞質(zhì)區(qū)域部分結(jié)合的蛋白質(zhì)。具體的是，融合蛋白質(zhì)的N末端側(cè)含有F蛋白質(zhì)，C末端含有HN(或H)蛋白質(zhì)。在使這兩種蛋白質(zhì)融合時，可以使兩種全長蛋白質(zhì)融合，但是也可以使缺失了F蛋白質(zhì)的細胞質(zhì)區(qū)域的一部分或全部的蛋白質(zhì)與HN(或H)蛋白質(zhì)融合。
此外，負鏈RNA病毒載體可以是缺失了附加基因的病毒載體。例如，通過敲除V基因，SeV的附加基因的一種，在不損傷培養(yǎng)細胞中的基因表達和復(fù)制的同時，SeV對小鼠等宿主的病原性顯著減少(Kato，A.et al.，1997，J.Virol.717266-7272；Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16578-587；Curran，J.etal.，WO01/04272，EP1067179)。這種減毒化載體作為用于在體內(nèi)和回體導(dǎo)入基因的無毒性的病毒載體特別有用。
負鏈RNA病毒載體的制備方法，具體包括以下步驟的方法(a)在下列物質(zhì)的存在下在哺乳動物細胞中轉(zhuǎn)錄負鏈RNA病毒的基因組RNA或其互補鏈(i)F蛋白質(zhì)的蛋白酶切割序列被改變?yōu)槠渌牡鞍酌盖懈钚蛄械慕?jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)，(ii)所述其它的蛋白酶，和(iii)構(gòu)成含有負鏈RNA病毒的基因組RNA的RNP的蛋白質(zhì)；以及(b)回收生成的病毒。其中，基因組RNA不編碼該經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)。負鏈RNA病毒的基因組RNA或其互補鏈(反基因組(antigenome)RNA)，與負鏈RNA病毒的RNP的構(gòu)成蛋白質(zhì)共同形成RNP，表達基因組編碼的病毒蛋白質(zhì)的同時，使基因組RNA-反基因組(antigenome)RNA在細胞內(nèi)擴增，形成病毒粒子。通過回收，可以獲得病毒。
構(gòu)成RNP的病毒蛋白質(zhì)，是指與負鏈RNA病毒的基因組RNA形成復(fù)合體，并且是基因組RNA的復(fù)制和由基因組編碼的基因的表達所必需的病毒蛋白質(zhì)群，具體的是N(核殼體(或也稱為核蛋白(NP)))，P(磷光體(phospho))和L(大)蛋白質(zhì)。根據(jù)病毒種類，表示也有不同，但是對應(yīng)的蛋白質(zhì)對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的(Anjeanette Robeft et al.，Virology 2471-6(1998))?？梢允褂门c基因組相同的負鏈轉(zhuǎn)錄負鏈基因組，或者也可以用正鏈(反基因組(antigenome)，基因組RNA的互補鏈)轉(zhuǎn)錄負鏈基因組，來重建病毒RNP。為了提高載體的重建效率，優(yōu)選生成正鏈。優(yōu)選使RNA的末端盡量準(zhǔn)確地與天然病毒基因組3’前導(dǎo)區(qū)域和5’尾隨區(qū)域的末端相同。為此，可以通過預(yù)先在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5’端添加自我切割型核酶，通過核酶正確地切割出負鏈RNA病毒基因組的末端來實現(xiàn)(Inoue，K.et al.J.Virol.Methods 107，2003.229-236)?；蛘?，在其它實施方式中，為了正確控制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5’端，利用噬菌體的RNA聚合酶識別序列作為轉(zhuǎn)錄起始位點，并在細胞內(nèi)表達該RNA聚合酶。作為噬菌體的RNA聚合酶，可以使用例如大腸桿菌T3噬菌體和T7噬菌體和沙門氏菌SP6噬菌體等(Krieg，P.A.and Melton，D.A.1987.Invitro RNA synthesis with 5P6 RNA polymerase.Methods Enzymol.155397-15；Milligan，J.F.，Groebe，D.R.，Witherell，G.W.，and Uhlenbeck，O.C.1987.Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNAtemplates.Nucleic Acids Res.158783-798；Pokrovskaya，I.D.and Gurevich，V.V.1994.In vitro transcriptionPreparative RNA yields in analytical scalereactions.Anal.Biochem.220420-23)。噬菌體的RNA聚合酶的表達，可以使用例如表達該酶的痘苗病毒(Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126(1986))，或者也可以使之從質(zhì)粒等非病毒載體中表達(參照實施例)。通過將RNA聚合酶基因整合到病毒生產(chǎn)細胞的染色體中，建立可以誘導(dǎo)表達噬菌體的RNA聚合酶的細胞株也是優(yōu)選的。作為啟動子，可以使用上述例示的哺乳動物細胞中表達基因的啟動子，但是優(yōu)選使用CA啟動子。
為了控制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’端，例如，可以使基因在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’端編碼自我切斷型核酶，通過該核酶正確地切出3’端(Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820，1997～Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16578-587～Yu，D.et al.，1997，Genes Cells 2457-466)。核酶可以使用來源于丁型肝炎病毒的反基因組鏈(antigenomic strand)的自我切割核酶。
病毒基因組可以編碼所希望的外源基因。含有外源基因的重組病毒載體可以通過在病毒載體的基因組中插入外源基因獲得(Yu，D.et al.，GenesCells 2457-466，1997；Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820，1997)。外源基因的插入位點，可以選擇例如病毒基因組的非編碼蛋白質(zhì)區(qū)域的所希望的位點，例如可以在基因組RNA的3’前導(dǎo)區(qū)域和最接近于3’端的病毒蛋白質(zhì)的ORF間，各病毒蛋白質(zhì)ORF間，和/或最接近于5’端的病毒蛋白質(zhì)的ORF與5’尾隨區(qū)域間插入。此外，在缺失了M，F(xiàn)或HN基因等包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)基因的基因組中，可以在其缺失區(qū)域插入編碼外源基因的核酸。在副粘病毒中導(dǎo)入外源基因時，最好使要插入基因組中的片段的多核苷酸的鏈長為6的倍數(shù)(Kolakofski，D.et al.，J.Virol.72891-899，1998；Calain，P.and Roux，L.，J.Virol.674822-4830，1993；Calain，P.and Roux，L.，J.Virol.674822-4830，1993)。應(yīng)當(dāng)使插入的外源基因與病毒ORF間構(gòu)成E-I-S序列(Tokusumi，T.et al.(2002)Virus Res 86(1-2)，33-8)?？梢酝ㄟ^E-I-S序列介導(dǎo)將2個或2個以上的外源基因串聯(lián)插入。
為了容易地插入外源基因，可以在編碼基因組RNA的cDNA中設(shè)計用于插入外源基因的克隆位點。該位點可以是例如基因組的非編碼蛋白質(zhì)區(qū)域中的所希望的位置，具體地，可以在3’前導(dǎo)區(qū)域和最接近于3’端的病毒蛋白質(zhì)的ORF間，各病毒蛋白質(zhì)ORF間，和/或最接近于5’端的病毒蛋白質(zhì)的ORF與5’尾隨區(qū)域間插入。在缺失了包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)基因的基因組中，可以在其缺失區(qū)域插入克隆位點?？寺∥稽c可以是，例如，限制性酶的識別序列。
載體中搭載的外源基因的表達水平可以通過添加在該基因的上游(負鏈(negative鏈))的轉(zhuǎn)錄起始序列的種類來調(diào)節(jié)(WO01/18223)。此外，可以通過基因組上的外源基因的插入位置控制，越靠近負鏈的3’端插入時表達水平越高，越靠近5’端插入表達水平越低。這樣，為了獲得該基因的所希望的表達量，并且為了與前后的編碼病毒蛋白質(zhì)的基因的組合為最佳，可以適當(dāng)調(diào)節(jié)外源基因的插入位置。
作為在基因組中插入編碼核酸的外源基因時添加的S序列，可以使用例如負鏈RNA病毒的所希望的S序列，但是如果是仙臺病毒，也可以優(yōu)選使用3′-UCCCWVUUWC-5′(W＝A或C；V＝A，C，或G)(序列號23)的序列。尤其是，優(yōu)選3′-UCCCAGUUUC-5′(序列號24)，3′-UCCCACUUAC-5′(序列號25)，和3′-UCCCACUUUC-5′(序列號26)。這些序列，如果以編碼正鏈的DNA序列表示，分別是5′-AGGGTCAAAG-3′(序列號27)，5′-AGGGTGAATG-3′(序列號28)，和5′-AGGGTGAAAG-3′(序列號29)。作為仙臺病毒載體的E序列，優(yōu)選的是例如3′-AUUCUUUUU-5′(序列號30)或5′-TAAGAAAAA-3′(序列號31))。I序列可以是例如任意的3個堿基，具體可以使用3′-GAA-5′(以正鏈DNA表示為5′-CTT-3′)。
制備負鏈RNA病毒的具體方法包括例舉一過性的進行病毒制備的方法。其中一種方法是用下面的載體共轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞(1)在哺乳動物啟動子的控制下轉(zhuǎn)錄編碼核酶與負鏈RNA病毒的基因組RNA或其互補鏈的DNA的載體；和(2)表達構(gòu)成含有負鏈RNA病毒的基因組RNA的RNP的病毒蛋白質(zhì)的載體。這時，使改變了蛋白酶切割序列的經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)和該蛋白酶也同時存在。在構(gòu)成RNP的病毒蛋白質(zhì)的存在下，通過由哺乳動物啟動子轉(zhuǎn)錄負鏈RNA病毒基因組RNA或反基因組RNA，形成功能性RNP，從而重建病毒。通過回收在細胞中生產(chǎn)的負鏈RNA病毒或其增殖產(chǎn)物，可以獲得負鏈RNA病毒載體。
此外，在其它的方法中，用下面的載體一起共轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞在哺乳動物啟動子的控制下，轉(zhuǎn)錄編碼噬菌體RNA聚合酶的DNA的載體；含有編碼連接在該RNA聚合酶的識別序列的下游的負鏈RNA病毒的基因組RNA或其互補鏈的DNA的載體；以及表達構(gòu)成含有負鏈RNA病毒的基因組RNA的RNP的病毒蛋白質(zhì)(N，L和P)的載體。在改變了蛋白酶切割序列的經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)以及該蛋白酶的存在下進行轉(zhuǎn)染。在構(gòu)成RNP的病毒蛋白質(zhì)的存在下，通過哺乳動物啟動子表達負鏈RNA病毒基因組RNA或反基因組RNA，形成功能性RNP，從而重建病毒。通過回收在細胞中生產(chǎn)的負鏈RNA病毒或其增殖產(chǎn)物，可以獲得負鏈RNA病毒載體。
轉(zhuǎn)染中使用的載體優(yōu)選例如質(zhì)粒。既可以設(shè)法使各質(zhì)粒分別表達一種蛋白質(zhì)，也可以使一個質(zhì)粒表達多個蛋白質(zhì)。為此，可以使一個質(zhì)粒中具有多個啟動子，或者也可以通過利用IRES等使一個啟動子生成多種蛋白質(zhì)。上述借助轉(zhuǎn)染的病毒生產(chǎn)方法的優(yōu)點在于即使不使用特別的細胞也可以迅速制備病毒。啟動子可以使用希望的哺乳動物細胞中表達基因所用的啟動子，但是優(yōu)選使用CA啟動子。
為了表達噬菌體的RNA聚合酶，也可以使用病毒載體。已知有，例如，使用經(jīng)紫外線(UV)照射處理20分鐘滅活的表達T7RNA聚合酶的重組痘苗病毒vTF7-3(Fuerst，T.R.et al.，Proc.Nati.Acad.Sci.USA 838122-8126，1986，Kato，A.et al.，Genes Cells 1569-579，1996)制備負鏈RNA病毒的方法(WO00/70055，WO00/70070，和WO03/025570；Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000)；Hasan，M.K.et al.，1997，J.General Virology 782813-2820)。通過重復(fù)進行3次左右的適當(dāng)稀釋病毒溶液(培養(yǎng)上清)再擴增的操作，可以完全除去所得的負鏈RNA病毒溶液中可能含有的痘苗病毒。
本發(fā)明的病毒制備方法的其它方式中，病毒生產(chǎn)必需的蛋白質(zhì)和/或RNA從病毒生產(chǎn)細胞的染色體表達。這種方法的一個例子是使用染色體中含有整合的表達經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)的DNA的哺乳動物細胞株的方法?；蛘?，還包括這樣的方法，其使用哺乳動物細胞株，該細胞株的染色體中含有整合的表達經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)的DNA，該DNA中由哺乳動物啟動子轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA或其互補鏈，或者該DNA中整合了噬菌體來源的RNA聚合酶。通過從轉(zhuǎn)化細胞的克隆中選擇高表達量的細胞，可以制備具有生產(chǎn)效價更高的病毒的能力的細胞。因此，這些細胞可用于穩(wěn)定地制備高效價的病毒。優(yōu)選地，設(shè)計使得這些細胞株中，哺乳動物啟動子在普通情況下不表達病毒基因組RNA和目的蛋白質(zhì)，但是可以應(yīng)答于刺激而誘導(dǎo)表達。通過使用上述loxP或FRT，可以使哺乳動物啟動子誘導(dǎo)性地表達基因。在制備病毒時表達Cre重組酶和FLP重組酶，以誘導(dǎo)由哺乳動物啟動子啟動的表達。啟動子可以使用希望的哺乳動物細胞中表達基因所用的啟動子，但是優(yōu)選使用CA啟動子。在表達病毒基因組RNA和RNA聚合酶的細胞中，可以在該其染色體中再導(dǎo)入經(jīng)修飾的F蛋白質(zhì)基因。
在該細胞中，通過在構(gòu)成含有負鏈RNA病毒的基因組RNA的RNP的病毒蛋白質(zhì)(N，L和P)的存在下，使負鏈RNA病毒的基因組RNA或其互補鏈轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)經(jīng)修飾的F蛋白質(zhì)的表達，可以進行負鏈RNA病毒的重建。RNP構(gòu)成蛋白質(zhì)可以編碼它們的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染來提供。
轉(zhuǎn)染中使用的各質(zhì)粒的量，在用核酶切出負鏈RNA病毒的基因組的方法(例如HamRbz法)中，可以使用0.1μg-2μg(更優(yōu)選為0.3μg)的NP表達質(zhì)粒，0.1μg-2μg(更優(yōu)選為0.5μg)的P表達質(zhì)粒，0.5μg-4.5μg(更優(yōu)選為2.0μg)的L表達質(zhì)粒，0.1μg-5μg(更優(yōu)選為0.5μg)的改變的F表達質(zhì)粒，0.5μg-5μg(更優(yōu)選為5μg)的編碼病毒基因組RNA(正鏈或負鏈)的質(zhì)粒。例如，為了制備SeV，可以在轉(zhuǎn)染中用以下的用量使用實施例中記載的各種質(zhì)粒。
pCAGGS-NP0.1μg-2μg(更優(yōu)選為0.3μg)pCAGGS-P 0.1μg-2μg(更優(yōu)選為0.5μg)pCAGGS-L(TDK)0.5μg-4.5μg(更優(yōu)選為2.0μg)pCAGGS-F5R 0.1μg-5μg(更優(yōu)選為0.5μg)pCAGGS-SeV 0.5μg-5μg(更優(yōu)選為5μg)(pCAGGS-SeV/ΔF-GFP)通過噬菌體的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄負鏈RNA病毒的基因組的方法中，可以使用0.1μg-2μg(更優(yōu)選為0.5μg)的NP表達質(zhì)粒，0.1μg-2μg(更優(yōu)選為0.5μg)的P表達質(zhì)粒，0.5μg-4.5μg(更優(yōu)選為2.0μg)的L表達質(zhì)粒，0.1μg-5μg(更優(yōu)選為0.5μg)的改變的F表達質(zhì)粒，0.5μg-5μg(更優(yōu)選為5μg)的編碼病毒基因組RNA(正鏈或負鏈)的質(zhì)粒。例如，為了制備SeV，可以在轉(zhuǎn)染中用以下的用量使用實施例中記載的各種質(zhì)粒。
pCAGGS-NP0.1μg-2μg(更優(yōu)選為0.5μg)pCAGGS-P 0.1μg-2μg(更優(yōu)選為0.5μg)pCAGGS-L(TDK)0.5μg-4.5μg(更優(yōu)選為2.0μg)pCAGGS-F5R 0.1μg-5μg(更優(yōu)選為0.5μg)pCAGGS-SeV 0.5μg-5μg(更優(yōu)選為5μg)(pCAGGS-SeV/ΔF-GFP)在編碼病毒基因組的DNA中，在使F基因之外的包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因(例如HN基因和/或M基因等)缺失時，雖不能形成感染性病毒粒子，但是在宿主細胞中，通過另外在細胞中導(dǎo)入這些被缺失的基因或編碼其它病毒的包膜蛋白質(zhì)的基因等并使之表達，可以在宿主細胞中形成感染性病毒粒子(wO00/70055和WO00/70070；Hirata，T.et al.，2002，J.Virol.Methods，104125-133；Inoue，M.et al.，2003，J.Virol.776419-6429)。在病毒生產(chǎn)細胞中表達包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)時，可以使用用于在哺乳動物細胞中表達基因的所希望的啟動子，但是優(yōu)選使用CA啟動子。
轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48-72小時左右后，回收細胞，重復(fù)進行3次冷凍融解來破碎細胞，然后用含有RNP的破碎物再次轉(zhuǎn)染細胞，然后培養(yǎng)?；蛘?，回收培養(yǎng)上清，添加到細胞的培養(yǎng)液中使之感染，進行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染可以例如使之與lipofectamine或聚陽離子脂質(zhì)體等一起形成復(fù)合體，然后導(dǎo)入細胞。具體地可以利用各種轉(zhuǎn)染試劑。例如DOTMA(Roche)，Superfect(QIAGEN#301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Roche#1811169)，TransIT-LT1(Mirus，Product No.MIR 2300)等。為了防止在核內(nèi)體中被分解，也可以添加氯喹(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA803015)。在導(dǎo)入了RNP的細胞中，進行RNP的病毒基因表達和RNP的復(fù)制過程，從而病毒擴增?；厥盏妮d體可以在-80℃保存。為了重建缺失了編碼包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因的不具有傳播能力的病毒，在轉(zhuǎn)染中可以使用表達包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的細胞(輔助細胞)，或者可以與包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。此外，也可以通過在進行了轉(zhuǎn)染的病毒生產(chǎn)細胞上用表達包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)的細胞進行疊層培養(yǎng)，來擴增包膜構(gòu)成蛋白質(zhì)基因缺失型病毒(參照WO00/70055和WO00/70070)。
對于負鏈RNA病毒的制備，更詳細的可以參照公知的方法。(Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820，1997，Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16578-587和Yu，D.et al.，1997，Genes Cells 2457-466；WO97/16539；WO97/16538；WO00/70055；WO00/70070；WO03/025570；Durbin，A.P.et al.，1997，Virology 235323-332；Whelan，S.P.et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 928388-8392；Schnell.M.J.et al.，1994，EMBO J.134195-4203；Radecke，F(xiàn).et al.，1995，EMBO J.145773-5784；Lawson，N.D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 924477-4481；Garcin，D.et al.，1995，EMBO J.146087-6094；Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1569-579；Baron，M.D.andBarrett，T.，1997，J.Virol.711265-1271；Bridgen，A.and Elliott，R.M.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9315400-15404)。通過在這些方法中應(yīng)用本發(fā)明的方法，可以從DNA以高效率重建包括副流感病毒，水泡性口炎病毒，狂犬病毒，麻疹病毒，牛瘟麻疹病毒，仙臺病毒等的負鏈RNA病毒。
回收的病毒的效價，可以通過例如CIU測定(Cell Infecting Unit)測定或紅血球凝集活性(HA)的測定來確定(WO00/70070；Kato，A.et al.，1996，GenesCells 1569-579；Yonemitsu，Y.& Kaneda，Y.，Hemaggulutinating virus ofJapan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells.Ed.by Baker AH.Molecular Biology of Vascular Diseases.Method in Molecular MedicineHumana Presspp.295-306，1999)。此外，對于搭載了GFP(綠色熒光蛋白質(zhì))等標(biāo)記基因的載體，可以通過以標(biāo)記為指標(biāo)對感染細胞直接計數(shù)來定量效價(例如，作為GFP-CIU)。這樣測定的效價，可以與CIU同等方式處理(WO00/70070)。
只要能重建出病毒，對重建中使用的宿主細胞沒有特別的限定。例如，在仙臺病毒載體等的重建中，可以使用猴來源的LLC-MK2細胞和CV-1細胞，倉鼠腎來源的BHK細胞等培養(yǎng)細胞，人源細胞等。尤其是，本發(fā)明的方法可以使用以往有困難的人細胞進行病毒的制備。此外，為了大量獲得仙臺病毒，使從上述宿主中獲得的病毒載體感染含胚雞卵，可以擴增病毒?，F(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了使用雞卵的病毒載體的制備方法(中西等編(1993)《神經(jīng)科學(xué)研究的前沿技術(shù)記錄III，分子神經(jīng)細胞生理學(xué)》，厚生社，大阪，pp.153-172)。具體地，例如，將受精卵置入培養(yǎng)器中，37-38℃培養(yǎng)，使胚發(fā)育。將病毒載體接種在尿囊腔，將卵培養(yǎng)數(shù)天(例如3天)使病毒載體增殖。培養(yǎng)期等條件可以根據(jù)使用的重組仙臺病毒而變化。然后，回收含有病毒的絨膜尿囊液。從絨膜尿囊液中分離純化仙臺病毒載體可以按照常規(guī)方法進行(田代真人，《病毒實驗規(guī)范操作》，永井，石浜監(jiān)修，Medical View社，pp.68-73(1995))。
按照本說明書中記載的病毒制備方法，可以使負鏈RNA病毒載體以例如1×105CIU/ml或以上，優(yōu)選1×106CIU/ml或以上，更優(yōu)選5×106CIU/ml或以上，更優(yōu)選1×107CIU/ml或以上，更優(yōu)選5×107CIU/ml以上，更優(yōu)選1×108CIU/ml或以上，優(yōu)選5×108CIU/ml或以上的效價釋放到病毒產(chǎn)生細胞的細胞外液中。病毒的效價可以通過本說明書和其它文獻記載的方法測定(Kiyotani，K.et al.，Virology 177(1)，65-74(1990)；WO00/70070)。
通過本發(fā)明的方法制備的病毒載體可以純化成基本純。純化方法可以通過包括過濾，離心分離，吸附和柱純化等公知的純化分離方法或它們的任意組合來進行。所謂“基本純”是指含有病毒載體的溶液中該病毒的成分占主要比例。例如，對于基本上純化的病毒載體組合物，可以根據(jù)下述確認溶液中所包含的所有蛋白質(zhì)(但是作為載體(carrier)和穩(wěn)定劑添加的蛋白質(zhì)除外)中作為病毒載體的成分的所含蛋白質(zhì)的比例占10％(重量/重量)或以上，優(yōu)選占20％或以上，更優(yōu)選50％或以上，優(yōu)選70％(重量/重量)或以上，更優(yōu)選80％(重量/重量)或以上，更優(yōu)選90％(重量/重量)或以上。例如，對副粘病毒載體，具體的純化方法可以例舉使用纖維素硫酸酯，或交聯(lián)多糖硫酸酯的方法(特公昭62-30752號公報，特公昭62-33879號公報和特公昭62-30753號公報)，以及使之吸附于含有巖藻糖硫酸的多糖和/或其分解物的方法(WO97/32010)等，但是不限于此。
在含有本發(fā)明的病毒載體的制備中，可以根據(jù)需要可以將載體與藥學(xué)上可接受的所希望的承運體或介質(zhì)組合。所謂“藥學(xué)上可接受的承運體或介質(zhì)”，可以與載體一起給藥，其不顯著抑制通過載體進行的基因?qū)氲牟牧?。作為這種承運體或介質(zhì)，可以例舉有，例如無菌水，氯化鈉溶液，葡萄糖溶液，含有乳酸的Ringer溶液，培養(yǎng)液，血清，磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)等，通過將它們與載體適當(dāng)組合而制劑化。此外，本發(fā)明的組合物也可以含有脂質(zhì)體的膜穩(wěn)定劑(例如，膽固醇等類固醇類)。此外，也可以含有抗氧化劑(例如生育酚或維生素E等)。進而，除此之外，還可以含有植物油，懸浮液，表面活性劑，穩(wěn)定劑，殺生物劑等。此外可以添加保存劑和其它的添加劑。本發(fā)明的組合物可以是水溶液，膠囊，懸浮液，糖漿等形態(tài)。此外本發(fā)明的組合物也可以是溶液，冷凍干燥物或氣霧劑形態(tài)的組合物。冷凍干燥物的情況，可以含有山梨醇，蔗糖，氨基酸和各種蛋白質(zhì)等作為穩(wěn)定劑。制備的病毒載體組合物可用作向包括人和非人哺乳動物在內(nèi)的所希望的哺乳動物和動物細胞中導(dǎo)入基因的試劑和藥物。特別地，通過本發(fā)明的方法制備的病毒載體優(yōu)選被用于對人的基因治療。
實施例以下，通過實施例對發(fā)明進行更詳細的說明，但是并不限于這些實施例。并且，本說明書中引用的文獻全部并入本文作為本說明書的一部分。
在F基因表達質(zhì)粒中導(dǎo)入弗林蛋白酶識別序列為制備使用LLC-MK2以外的細胞，可以回收F基因缺失型SeV載體(SeV/ΔF)的包裝細胞(尤其是利用人源細胞的包裝細胞)，在包裝細胞中表達的F蛋白質(zhì)中導(dǎo)入弗林蛋白酶識別序列。導(dǎo)入的序列，使用基于識別弗林蛋白酶的共有序列R-(X)-R/K-R的序列(Chambers，T.J.et al.，Annu.Rev.Microbiol.44，649-688(1990))的比原來的F蛋白質(zhì)的序列變異最少的R-Q-K-R的序列(F(furin))以及可預(yù)計切斷效率更好的(R)-R-R-R-R的序列(F(5R))這兩種序列(圖1)。此外，F(xiàn)基因的表達可以利用Cre/loxP表達誘導(dǎo)系統(tǒng)。為了構(gòu)建該系統(tǒng)，在與建立利用LLC-MK2的F蛋白的包裝細胞(LLC-MK2/F7細胞)(Li，H.-O.et al.，J.Virology 74，6564-6569(2000)，WO00/70070)時相同，利用被設(shè)計成由Cre DNA重組酶誘導(dǎo)表達基因產(chǎn)物的質(zhì)粒pCALNdLw(Arai，T.et al.，J.Virol.721115-1121(1988))。
首先，使用在具有Zeocin抗性基因的pCALNdLw中導(dǎo)入了F基因的質(zhì)粒(pCALNdLw-ZeoF特愿2001-283451)，將弗林蛋白酶識別序列導(dǎo)入F基因(R-Q-K-RF(furin))。亞克隆的步驟概要示于圖2中。以pCALNdLw-ZeoF作為模板，通過組合引物ploxF(5’-CATTTTGGCAAAGAATTGATTAATTCGAG-3’/序列號32)和pFfurinR(5’-TCACAGCACCCAAGAATCTCTTCTGGCGAGCACCGGCATTTTGTGTC-3’/序列號33)，使用Pfu Turbo(STRATAGENE，La Jolla，CA)進行PCR(步驟1)。此外，以相同的pCALNdLw-ZeoF作為模板，通過組合引物pFfurinF(5’-GACACAAAATGCCGGTGCTCGCCAGAAGAGATTCTTGGGTGCTGTGA-3’/序列號34)和pFXho2R(5’-GATCGTAATCACAGTCTCTCGAGAGTTGTACCATCTACCTAC-3’/序列號35)，進行PCR(步驟2)。通過在這時使用的pFfurinR和pFfurinF這兩條引物中導(dǎo)入用于在弗林蛋白酶識別序列(這時是R-Q-K-R)中引入變異的序列。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳后，分別切出步驟1的1470bp的條帶和步驟2的1190bp的條帶，使用GENE CLEAN KIT(フナコシ，東京)回收(分別為片段(i)，片段(ii))。將分別稀釋了10倍的純化的片段(i)和片段(ii)各1μl混合，進而通過組合ploxF和pFXho2R的引物使用Pfu Turbo進行PCR(步驟3)。對5μlPCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，結(jié)果檢測出預(yù)計的2.6kbp的條帶。于是，用Qiaquick PCR Extraction kit(QIAGEN，Bothell，WA)純化出余下的PCR產(chǎn)物。然后用DraIII和MfeI連續(xù)進行限制性酶處理，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，切出約2.0kbp的條帶(片段3)。另一方面，用DraIII和MfeI連續(xù)消化pCALNdLw-Zeo-F，通過瓊脂糖凝膠電泳分離，切出約6kbp的條帶，用GENE CLEAN KIT純化(片段4)。通過連接片段3和4，構(gòu)建出pCALNdLw-Zeo-F(furin)(也作pCALNdLw-Zeo-Ffurin)。
接著，在pCALNdLw-ZeoF上的F基因中導(dǎo)入更有效切斷的弗林蛋白酶識別序列(R)-R-R-R-R(F(5R))。亞克隆的步驟概要示于圖3中。以如上制備的pCALNdLw-Zeo-F(furin)作為模板，通過組合引物ploxF和pF5R-R(5’-TCACAGCACCGAAGAATCTCCTCCGGCGACGACCGGCATTTTGTGTCGTATC-3’/序列號36)，進行PCR(步驟5)。此外，以相同的pCALNdLw-Zeo-F(furin)作為模板，通過組合引物pF5R-F(5′-GATACGACACAAAATGCCGGTCGTCGCCGGAGGAGATTCTTCGGTGCTGTGA-3′/序列號37)和R5437(5’-GACACAAAATGCCGGTGCTCGCCAGAAGAGATTCTTGGGTGCTGTGA-3’/序列號38)，進行PCR(步驟6)。通過在這時使用的兩條引物pF5R-R和pF5R-F中導(dǎo)入用于在弗林蛋白酶識別序列(這時是(R)-R-R-R-R)引入變異的序列。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳分離后，分別切出步驟5的1470bp的條帶和步驟6的200bp的條帶，用Qiaquick PCR Extraction kit純化(分別為片段5，片段6。將分別稀釋了50倍的純化的片段5和片段6各1μl混合，進而通過組合ploxF和R5437的引物使用Pfu Turbo進行PCR(步驟7)。對5μlPCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分離后，染色，確認了約1.6kbp的條帶。于是，用Qiaquick PCR Purification kit純化剩余物，然后用ClaI和FseI消化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，切出約1kbp的條帶，用Qiaquick PCRPurification kit純化(片段7)。另一方面，用ClaI和FseI消化pCALNdLw-Zeo-F(furin)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，切出約8kbp的條帶，用Qiaquick PCR Purification kit純化(片段8)。通過連接片段7和8，構(gòu)建出pCALNdLw-Zeo-F(5R)(也記載為pCALNdLw-Zeo-F5R)。用XhoI消化pCALNdLw-Zeo-F5R，純化后進行連接，選擇不含有XhoI片段(含有Zeocin抗性基因)者，獲得pCAGGS-F5R。
其它質(zhì)粒的構(gòu)建·pCAGGS(B型)的構(gòu)建(圖4)用XhoI消化pCALNdLw(Arai，T.et al.J.Virology 72，1998，p1115-1121)，用Qiaquick PCR Purification kit純化，進行連接。選擇除去XhoI片段者，所得產(chǎn)物為pCAGGS(B型)。用SalI消化pCAGGS(B型)，用Pfu DNA聚合酶平末端化，用Qiaquick PCR Purification kit純化，進行連接。選擇SalI位點被破壞者，作為pCAGGS(BSX)。
·pCAGGS-NP的構(gòu)建(圖5)用SpeI和EcoT22I消化pCALNdLw，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離。切出2651bp片段和3674bp片段，用Qiaquick gel Extraction kit純化。進而用XhoI消化2651bp片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，純化出1761bp的條帶。以pcDNA3.1/Zeo(+)為模板，使用引物5’-TCTCGAGTCGCTCGGTACGATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCAC-3’(序列號39)和引物5’-AATGCATGATCAGTAAATTACAATGAACATCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTGCACGCAGTTG-3’(序列號40)通過PCR擴增出Zeocin抗性基因，用XhoI和EcoT22I消化，用瓊脂糖凝膠電泳分離，切出438bp的片段，用Qiaquick Gel Extraction kit純化。通過連接含有這種Zeocin抗性基因的條帶和上述3674bp和1761bp這3種片段，獲得pCALNdLw-Zeo。通過用SawI消化pCALNdLw-Zeo，插入EcoRI接頭(STRATAGENE)，獲得pCALNdLWE-Zeo。用NotI和EcoRI消化導(dǎo)入了多克隆位點的仙臺病毒cDNA(特開2002-272465)(以下稱為pSeV(TDK))，用瓊脂糖凝膠電泳分離，切出1669bp的條帶，用Qiaquick Gel Extraction kit純化。在經(jīng)NotI和EcoRI消化的pGEM 11 Zf(+)(Promega)中插入含有這種NP基因的片段，制成pGEM-NP(Z)PCR14-3。使用5’-CCGGAATTCAACAAATGGCCGGGTTGTTGAGCACCTTCGA-3’(序列號41)和5’-CCGGAATTCCTAGATTCCTCCTATCCCAGCTACTGCTGCTCG-3’(序列號42)通過PCR擴增，EcoRI消化后，導(dǎo)入pCALNdLWE-Zeo的EcoRI位點，獲得pCALNdLWE-Zeo-NP(Z)。接著，用XhoI消化pCALNdLWE-Zeo-NP(Z)，進行連接，構(gòu)建除去了XhoI片段的質(zhì)粒，以其作為pCAGGS-NP。
·pCAGGS-P4C(-)的構(gòu)建(圖6)用XhoI消化pCALNdLw-HygroM(Inoue，M.et al.J.Virology 77，2003，p6419-6429)，用Qiaquick PCR Purification kit純化后，切出含有潮霉素抗性基因的1679bp的條帶，用Qiaquick Gel Extraction kit純化。用XhoI消化pCALNdLw，切出經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后4864bp的條帶，用Qiaquick GelExtraction kit純化。用這兩條帶進行連接，構(gòu)建pCALNdLw-Hygro。通過用SwaI消化該pCALNdLw-Hygro，插入NheI接頭(STRATAGENE)，獲得pCALNdLWN-Hygro。以4C(-)SeV cDNA(Kurotani，Kato，Nagai，et al Genesto Cells 3，1998，p111-124)為模板，使用5’-CTAGCTAGCCCACCATGGATCAAGATGCCTTCATTCTAAAAGAAGATTCT-3’(序列號43)和5’-CTAGCTAGCCTAGTTGGTCAGTGACTCTATGTCCTCTTCTACGAGTTCCA-3’(序列號44)，通過KOD-PLUS DNA聚合酶(ToYoBo)進行PCR。使用geneclean kit純化，用NheI消化PCR產(chǎn)物，用gene clean kit純化。將其導(dǎo)入到pCALNdLWN-Hygro的NheI位點，獲得pCALNdLWN-hygro-P(Z)k4C(-)。用XhoI對其消化，用Qiaquick PCR Purification kit純化后，進行連接，選擇除去了XhoI(潮霉素抗性基因區(qū)域)片段者，獲得pCAGGS-P4C(-)。
·pCAGGS-L(TDK)的構(gòu)建(圖7)用FseI和SacI消化pSeV(TDK)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，切出6732bp的條帶，用Qiaquick gel Extraction kit純化。使用Pfu DNA聚合酶和dNTP，使之在72℃反應(yīng)10分鐘而平末端化。用Qiaquick PCR Purificationkit純化后，導(dǎo)入到pCAGGS(BSX)的SwaI位點中，獲得pCAGGS-L(TDK)。
·pCAGGS-F的構(gòu)建(圖8)用XhoI消化pCALNdLw/F(Li，H.-O.et al.J.Virology 74，2000，p6564-6569)后，進行連接，選擇除去XhoI(新霉素抗性基因區(qū)域)片段者，獲得pCAGGS-F。
·pCAGGS-T7的構(gòu)建(圖9)用BamHI消化pTF7-3(ATCC No.67202)后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收含有T7RNA聚合酶基因的2.65kbp片段，插入到pMW219(Nippon gene)的BamHI位點，獲得pMW219-T7。用SacI消化該pMW219-T7后，用DNABlunting kit(TaKaRa)平端化，導(dǎo)入EcoRI接頭(STRATAGENE)，獲得pMW219-T7-EcoRI。用EcoRI消化該pMW219-T7-EcoRI，純化含有T7RNA聚合酶的EcoRI片段，通過導(dǎo)入到上述的pCALNdLWE的EcoRI位點中，獲得pCALNdLWE-T7。
·pCAGGS-SeV和pCAGGS-SeV/ΔF-GFP的構(gòu)建(圖10-12)用NotI和KpnI消化pSeV(TDK)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，切出2995bp的條帶，用Qiaquick Gel Extraction kit純化。將MlinkerF55’-GGCCGCGTCGACATCGATGCTAGCCTCGAGCCGCGGTAC-3’(序列號45)，MlinkerR 5’-CGCGGCTCGAGGCTAGCATCGATGTCGACGC-3′(序列號46)各2μg(μl)與21μl H2O混合，使之在95℃下培養(yǎng)5分鐘，85℃下培養(yǎng)15分鐘，65℃下培養(yǎng)15分鐘，37℃下培養(yǎng)15分鐘，25℃下培養(yǎng)15分鐘，4℃下培養(yǎng)。連接這種混合液與pSeV(TDK)Not I-Kpn I純化液，獲得pSeV/Linker。以該SeV/Linker作為模板，使用pGEM-F55’-CTTAACTATGCGGCATCAGAGC-3’(序列號47)和pGEM-R15’-GCCGATTCATTAATGCAGCTGG-3’(序列號48)，采用KOD-Plus(TOYOBO)進行PCR，使用Qiaquick PCR Purification kit純化。以這種純化液作為模板，使用RibLF1 5’-CTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCACCAAACAAGAG-3’(序列號49)和pGEM-R1 5’-GCCGATTCATTAATGCAGCTGG-3’(序列號48)，采用KOD-Plus(ToYoBo)進行PCR，使用Qiaquick PCR Purification kit純化。以這種純化液作為模板，使用RibLF2 5’-GATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTC-3’(序列號50)和pGEM-R1 5’-GCCGATTCATTAATGCAGCTGG-3’(序列號48)，采用KOD-Plus(TOYOBO)進行PCR，使用Qiaquick PCR Purification kit純化。進而，以該純化液為模板，使用RibLF3 5’-GCGGGCCCTCTCTTGTTTGGTCTGATGAGTCCGTGAGGAC-3’(序列號51)和pGEM-R1 5’-GCCGATTCATTAATGCAGCTGG-3’(序列號48)，采用KOD-Plus(TOYOBO)進行PCR，使用Qiaquick PCR Purification kit純化。將純化的PCR產(chǎn)物導(dǎo)入到pCAGGS(BSX)的SwaI位點中，形成pCAGGS-SeV(m)。接著，用NotI和SalI消化pSeV 18+b(+)/ΔF-EGFP(Li，H.-O.et al.J.Virology 74，2000，p6564-6569)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，切出1972bp的條帶，用Qiaquick Gel Extraction kit純化，用NotI和SalI消化，與純化的pCAGGS-SeV(m)連接，獲得pCAGGS-SeV(m)A。pSeV(+)18/ΔF用NheI和KpnI消化，然后用瓊脂糖凝膠電泳分離，切出3325bp的條帶，用QiaquickGel Extraction kit純化，用NotI和SalI消化。所得片段與pCAGGS-SeV(m)連接，獲得pCAGGS-SeV(m)AC。
用SalI和NheI消化pSeV 18+b(+)(Li，H.-O.et al.J.Virology 74，2000，p6564-6569)，用Qiaquick PCR Purification kit純化。然后，導(dǎo)入LITMUS38(NEW ENGLAND BioLabs)的SalI-NheI位點，得到Litmus38/SeV SalI-NheI。用SalI和NheI消化Litmus38/SeV SalI-NheI，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，切出9886bp的條帶，用Qiaquick Gel Extraction kit純化，通過導(dǎo)入到pCAGGS-SeV(m)AC的SalI-NheI位點，獲得pCAGGS-SeV。
用SalI和NheI消化pSeV/ΔF-EGFP(Li，H.-O.et al.J.Virology 74，2000，p6564-6569)，用Qiaquick PCR Purification kit純化。然后，導(dǎo)入LITMUS38(NEW ENGLAND BioLabs)的SalI-Nhe位點，獲得Litmus38/SeV SalI-NheIΔF-GFP。用SalI和NheI消化Litmus38/SeV SalI-NheIΔF-GFP，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，切出8392bp的條帶，用Qiaquick Gel Extraction kit純化，通過導(dǎo)入到pCAGGS-SeV(m)AC的SalI-NheI位點，獲得pCAGGS-SeV/ΔF-GFP。
·pGEM-IRES-Luci的構(gòu)建將由用BamHI消化pMAMneo-Luci(Clontech)獲得的熒光素酶片段導(dǎo)入到PTM1(Nature，348，1，November，1990，91-92)的BamHI的位點中，獲得pGEM-IRES-Luci。
表達T7RNA聚合酶的BHK-21(以下為BHK/T7)的建立使用哺乳動物轉(zhuǎn)染試劑盒(mammalian transfection kit)(Stratagene)或SuperFect(Qiagen)以上述構(gòu)建的pCALNdLWE-T7進行對BHK-21細胞的轉(zhuǎn)染。在含有400μg/ml的G418的D-MEM中，37℃，5％CO2下培養(yǎng)2周，由單一的細胞獲得增殖的藥物抗性克隆。以Moi＝4用表達Cre DNA重組酶的重組腺病毒(AxCANCre)感染所得的藥物抗性克隆，24小時后，用PBS清洗細胞一次后，回收細胞，通過使用抗-T7RNA聚合酶兔多克隆抗體的western印跡分析確認T7RNA聚合酶的表達。
對于可確認表達的克隆，使用SuperFect以pGEM-IRES-Luci進行轉(zhuǎn)染。24小時后回收細胞，通過使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)(Promega)試劑盒的MiniLumat LB9506(EG&G BERTHOLD)測定熒光素酶的活性，確認T7RNA聚合酶的活性。
F缺失型SeV載體的回收通過使用轉(zhuǎn)錄添加了錘頭核酶的仙臺病毒的載體的病毒載體的制備方法(以下稱為HamRbz法)，回收F基因缺失型SeV。在轉(zhuǎn)染人胎兒腎來源的293T細胞的前一天，以1×106細胞/孔/2ml加入了10％FBS的D-MEM培養(yǎng)基接種于6孔板中。轉(zhuǎn)染按以下述方式進行。在30μl Opti-MEM中混合15μlTransIT-LT1(Mirus)，室溫下培養(yǎng)10-15分鐘。這期間制備DNA溶液。在20μl Opti-MEM中分別溶解0.3μg pCAGGS-NP，0.5μg pCAGGS-P4C(-)，2μgpCAGGS-L(TDK)，0.5μg pCAGGS-F5R，0.5-5μg pCAGGS-SeV/ΔF-GFP。10-15分鐘后，混合TransIT-LT1溶液和DNA溶液，室溫下靜置15分鐘。這期間除去細胞的培養(yǎng)基，輕柔地以1ml/孔添加新的加入了10％FBS的D-MEM培養(yǎng)基。15分鐘后，在DNA-TransIT-LT1混合物中加入500μlOpti-MEM(GIBCO)，將其全部添加到細胞中，然后培養(yǎng)。37℃，5％CO2下培養(yǎng)72小時后，除去培養(yǎng)液，用以1×106細胞/ml懸浮于含有7.5μg/ml胰蛋白酶(不含血清)的MEM(以下稱為Try-MEM)中的LLC-MK2/F7/A細胞(誘導(dǎo)F蛋白表達的細胞記載為LLC-MK2/F7/A；H.-O.et al.，J.Virology74.6564-6569(2000)，WO00/70070)以1ml/孔覆層，37℃，5％CO2下培養(yǎng)。自此24小時后，回收1ml培養(yǎng)液，加入1ml新的Try-MEM，37℃，5％CO2下培養(yǎng)。48小時后回收1ml培養(yǎng)液，加入1ml新的Try-MEM，37℃，5％CO2下培養(yǎng)。72小時后回收1ml培養(yǎng)液，在回收的培養(yǎng)液中加入133μl7.5％BSA(最終濃度1％BSA)，于-80℃保存直至測定CIU。
如下所述，通過對GFP表達細胞的計數(shù)實施CIU的測定(GFP-CIU)。CIU測試的2-3天前在12孔板上接種LLC-MK2細胞。兩天前時，以1.5×105細胞/孔的比例，以1ml/孔加入了10％FBS的MEM培養(yǎng)基接種，在三天前時，以8.0×104細胞/孔的比例，以1ml/孔加入了10％FBS的MEM培養(yǎng)基接種。在CIU測試當(dāng)天用不含血清的MEM清洗一次后，用MEM培養(yǎng)基制備覆層后第24，48，72小時回收的培養(yǎng)液的1/10稀釋系列，37℃感染1小時后，用MEM培養(yǎng)基清洗一次，添加1ml MEM培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)2天后，用熒光顯微鏡觀察細胞，對適度稀釋的孔的GFP陽性細胞計數(shù)。其結(jié)果是，覆層后72小時后，回收了1×105-1×107GFP-CIU/ml的病毒載體(圖13)。
F基因的供給在導(dǎo)入弗林蛋白酶識別序列的F(以下稱F5R)時與野生型F(以下稱F)時的生產(chǎn)能力的比較通過pCAGGS供給F蛋白質(zhì)時，進行使用野生型的F基因的情況與導(dǎo)入弗林蛋白酶識別序列的F5R的情況下的重建效率的比較。在轉(zhuǎn)染293T細胞前一天，以1×106細胞/孔/2ml加入了10％FBS的D-MEM培養(yǎng)基接種于6孔板中。轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染按以下述方式進行。在30μl Opti-MEM中混合15μlTransIT-LT1(Mirus)，室溫下培養(yǎng)10-15分鐘。這期間制備DNA溶液。在20μl Opti-MEM中分別溶解固定量的0.3μg pCAGGS-NP，0.5μgpCAGGS-P4C(-)，2μg pCAGGS-L，2μg pCAGGS-SeV/ΔF-GFP；和變化量0.1μg，0.3μg，0.5μg，0.7μg，0.9μg的pCAGGS-F或pCAGGS-F5R。10-15分鐘后，混合TransIT-LT1溶液和DNA溶液，室溫下靜置15分鐘。這期間除去細胞的培養(yǎng)基，輕柔地以1ml/孔添加新的加入了10％FBS的D-MEM。15分鐘后，在DNA-TransIT-LT1混合物中加入500μlOpti-MEM(GIBCO)，將其全部添加到細胞中，然后培養(yǎng)。37℃，5％CO2下培養(yǎng)72小時后，除去培養(yǎng)液，以1ml/孔使以1×106細胞/ml懸浮于含有7.5μg/ml胰蛋白酶(不含血清)的MEM(以下稱為Try-MEM)中的LLC-MK2/F7/A細胞(誘導(dǎo)F表達的細胞記載為LLC-MK2/F7/A；H.-O.et al.，J.Virology 74.6564-6569(2000)，WO00/70070)覆層，37℃，5％CO2下培養(yǎng)。自此24小時后，回收1ml培養(yǎng)液，加入1ml新的Try-MEM，37℃，5％CO2下培養(yǎng)。48小時后回收1ml培養(yǎng)液，加入1ml新的Try-MEM，37℃，5％CO2下培養(yǎng)。72小時后回收1ml培養(yǎng)液，在回收的培養(yǎng)液中加入133μl 7.5％BSA(最終濃度1％BSA)，于-80℃保存直至測定CIU?；厥账械脑嚇雍筮M行CIU測試。其結(jié)果是，pCAGGS-F為0.7μg時的重建效率最好，覆層后第24，48，72小時分別含有0CIU/ml，7.9×102CIU/ml，3.3×104CIU/ml的病毒載體。另一方面，使用pCAGGS-F5R時遠比pCAGGS-F時的重建效率好，覆層后第72小時時前者可以獲得比后者高373倍的病毒載體(圖14)。
傳播型SeV載體的制備通過使用pCAGGS-T7，經(jīng)T7RNA聚合酶使SeV基因組轉(zhuǎn)錄的病毒載體制備方法(以下稱為pCAGGS-T7)進行傳播型SeV的回收。轉(zhuǎn)染前一天，將各細胞接種于6孔板中(293T細胞1×106細胞/孔/2ml加入了10％FBS的D-MEM，LLC-MK2細胞5.0×105細胞/孔/2ml加入了10％FBS的D-MEM，BHK-21細胞2.5×105細胞/孔/2ml加入了10％FBS的D-MEM，BHK/T7細胞2.5×105細胞/孔/2ml加入了10％FBS的D-MEM)。轉(zhuǎn)染按以下述方式進行。在30μl Opti-MEM中混合15μl TransIT-LI1(Mirus)，室溫下培養(yǎng)10-15分鐘。這期間制備DNA溶液。在20μl Opti-MEM中分別溶解0.5μgpCAGGS-T7，0.5μg pCAGGS-NP，0.5μg pCAGGS-P4C(-)，2μgpCAGGS-L(TDK)，5μg pSeV(TDK)18+GFP。10-15分鐘后，混合TransIT-LT1溶液和DNA溶液，室溫下靜置15分鐘。這期間除去細胞的培養(yǎng)基，輕柔地以1ml/孔添加新的加入了10％FBS的D-MEM培養(yǎng)基。15分鐘后，在DNA-TransIT-LT1混合物中加入500μl Opti-MEM(GIBCO)，將其全部添加到細胞中，然后培養(yǎng)。37℃，5％CO2下培養(yǎng)3天。此時，對GFP陽性細胞計數(shù)的結(jié)果是293T細胞246個，LLC-MK2細胞16個，BHK-21細胞288個，BHK/T7細胞405個。然后，除去培養(yǎng)液，在細胞中添加1ml PBS(-)，用細胞刮刀刮下細胞并回收到eppendorf管中。冷凍融解1次后，將未稀釋的細胞懸浮液和100μl經(jīng)PBS稀釋10倍，100倍，1000倍的細胞懸浮液分別接種于10天的雞卵中。孵卵機中35℃下培養(yǎng)3天。然后，回收絨膜尿囊液，進行HA測試。其結(jié)果是，在接種了未稀釋的293T細胞，BHK-21細胞，BHK/T7細胞懸浮液的雞卵中可確認病毒的增殖(圖15)。
F缺失型SeV載體的制備在轉(zhuǎn)染293T細胞的前一天，以1×106細胞/孔/2ml加入了10％FBS的D-MEM培養(yǎng)基接種于6孔板中。轉(zhuǎn)染按以下述方式進行。在30μl Opti-MEM中混合15μl TransIT-LY1(Mirus)，室溫下培養(yǎng)10-15分鐘。這期間制備DNA溶液。在20μl Opti-MEM中分別溶解0.5μg pCAGGS-T7，0.5μg pCAGGS-NP，0.5μg pCAGGS-P4C(-)，2μg pCAGGS-L(TDK)，0.5μg pCAGGS-F5R，0.5-5μgSeV/ΔF-GFP(WO00/70070)。10-15分鐘后，混合TransIT-LT1溶液和DNA溶液，室溫下靜置15分鐘。這期間除去細胞的培養(yǎng)基，輕柔地以1ml/孔添加新的加入了10％FBS的D-MEM。15分鐘后，在DNA-TransIT-LT1混合物中加入500μlOpti-MEM(GIBCO)，將其全部添加到細胞中，然后培養(yǎng)。37℃，5％CO2下培養(yǎng)72小時后，除去培養(yǎng)液，用以1×106細胞/ml懸浮于Try-MEM中的LLC-MK2/F7/A細胞以1ml/孔覆層，37℃，5％CO2下培養(yǎng)。自此24小時后，回收1ml培養(yǎng)液，加入1ml新的Try-MEM，37℃，5％CO2下培養(yǎng)。48小時后回收1ml培養(yǎng)液，加入1ml新的Try-MEM，37℃，5％CO2下培養(yǎng)。72小時后回收1ml培養(yǎng)液，在回收的培養(yǎng)液中加入133μl7.5％BSA(最終濃度1％BSA)，于-80℃保存直至測定CIU。
如下所述，通過對GFP表達細胞的計數(shù)實施CIU的測定(GFP-CIU)。CIU測試的2-3天前在12孔板上接種LLC-MK2細胞。兩天前時，以1.5×105細胞/孔的比例，以1ml/孔加入了10％FBS的MEM培養(yǎng)基接種，在三天前時，以8.0×104細胞/孔的比例，以1ml/孔加入了10％FBS的MEM培養(yǎng)基接種。在CIU測試當(dāng)天用不含血清的MEM清洗一次后，用MEM培養(yǎng)基制備覆層后第24，48，72小時回收的培養(yǎng)液的1/10稀釋系列，37℃感染1小時后，用MEM培養(yǎng)基清洗一次，添加1ml MEM培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)2天后，用熒光顯微鏡觀察細胞，對適度稀釋的孔的GFP陽性細胞計數(shù)。其結(jié)果是，覆層后72小時后，回收了1×106-1×107GFP-CIU/ml的病毒載體(圖16)。
這種pCAGGS-T7法，在使用293T細胞作為質(zhì)粒的導(dǎo)入細胞時，通過磷酸鈣法也可以成功回收SeV18+GFP/ΔF。其效率與TransIT-LT1等同(圖17)。
pCAGGS-T7法的細胞種類的研究為了研究這種pCAGGS-T7法在293T之外的細胞中是否也可以回收仙臺病毒載體，嘗試在LLC-MK2，BHK-21，BHK/T7或293T細胞系中是否也可以回收。在轉(zhuǎn)染前將各種細胞接種于6孔板中(LLC-MK2細胞5×105細胞/孔，BHK-21細胞2.5×105細胞/孔，BHK/T7細胞2.5×105細胞/孔，293T細胞1×106細胞/孔)。轉(zhuǎn)染按以下述方式進行。在30μl Opti-MEM中混合15μl TransIT-LT1(Mirus)，室溫下培養(yǎng)10-15分鐘。這期間制備DNA溶液。在20μl Opti-MEM中分別溶解0.5μg pCAGGS-T7，0.5μgpCAGGS-NP，0.5μg pCAGGS-P4C(-)，2μg pCAGGS-L(TDK)，0.5μgpCAGGS-F5R，2μg SeV/ΔF-GFP(但是，使用BHK/T7細胞時不添加pCAGGS-T7)。10-15分鐘后，混合TransIT-LT1溶液和DNA溶液，室溫下靜置15分鐘。這期間除去細胞的培養(yǎng)基，輕柔地以1ml/孔添加新的加入了10％FBS的D-MEM。15分鐘后，在DNA-TransIT-LT1混合物中加入500μlOpti-MEM(GIBCO)，將其全部添加到細胞中，然后培養(yǎng)。37℃，5％CO2下培養(yǎng)72小時后，除去培養(yǎng)液，用以1×106細胞/ml懸浮于Try-MEM中的LLC-MK2/F7/A細胞以1ml/孔覆層，37℃，5％CO2下培養(yǎng)。自此24小時后，回收1ml培養(yǎng)液，加入1ml新的Try-MEM，37℃，5％CO2下培養(yǎng)。48小時后回收1ml培養(yǎng)液，加入1ml新的Try-MEM，37℃，5％CO2下培養(yǎng)。72小時后回收1ml培養(yǎng)液，在回收的培養(yǎng)液中加入133μl 7.5％BSA(最終濃度1％BSA)，于-80℃保存直至測定CIU。以n＝3進行。其結(jié)果是，從檢測的所有細胞種類中回收載體。載體的回收效率的順序為BHK/T7細胞＞BHK-21細胞＞293T細胞＞LLC-MK2細胞(圖18)。此外，由于BHK/T7細胞株中沒有被pCAGGS-T7轉(zhuǎn)染，表明T7表達株中可以使用CA啟動子，可以回收F缺失型SeV/ΔF-GFP。
可誘導(dǎo)表達含有弗林蛋白酶識別序列的F蛋白的包裝細胞的克隆對于人細胞HeLa細胞，嘗試制備包裝細胞。轉(zhuǎn)染中可以使用LipofectAMINE PLUS試劑(Invitrogen，Groningen，Netherlands)按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范中記載的方法進行。也就是用以下的方法進行。以2×105細胞/皿將HeLa細胞接種于6孔板中，在含有10％FBS的D-MEM中培養(yǎng)24小時。將1.5μg pCALNdLw-Zeo-F(furin)或pCALNdLw-Zeo-F(5R)稀釋于不含F(xiàn)BS和抗生素的D-MEM中(總量為94μL)，攪拌后添加6μL LipofectAMINE PLUS試劑，再次攪拌，于室溫下放置15分鐘。放置后，添加預(yù)先用不含F(xiàn)BS和抗生素的D-MEM稀釋的4μl LipofectAMINE PLUS試劑(總體積為100μl)，室溫放置15分鐘，放置后，添加1mL不含F(xiàn)BS和抗生素的D-MEM后，在經(jīng)PBS清洗一次的HeLa細胞中添加該轉(zhuǎn)染混合液。37℃，5％CO2下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時后，不除去轉(zhuǎn)染混合液，添加1mL含有20％FBS的D-MEM，培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)后，用胰蛋白酶剝離，在96孔板中以約5細胞/孔或25細胞/孔的比例稀釋，在含有500μg/mL的Zeocin(Gibco-BRL，Rockville，MD)并加入了10％FBS的D-MEM中，培養(yǎng)約2周。在6孔板中擴大培養(yǎng)從單一的細胞擴增的克隆。對這樣制備的克隆進行分析。
對于所得克隆，用Western印跡法半定量分析F蛋白的表達量。將個克隆接種于6孔板中，在幾乎融合的狀態(tài)下，按Saito等人的方法(Saito et al.，Nucl.Acids Res.233816-3821(1995)；Arai，T.et al.，J.Virol 72，1115-1121，(1998))，以moi＝5用經(jīng)含有5％FBS的MEM稀釋的表達Cre DNA重組酶的重組腺病毒(AxCANCre)感染。32℃培養(yǎng)2天后，除去培養(yǎng)上清，用PBS清洗一次，用細胞刮刀刮下并回收細胞。平均每一泳道施加該樣品量的1/10，進行SDS-PAGE后，通過進行利用抗F抗體(γ236Segawa，H.et al.，J.Biochem.123，1064-1072(1998))的Western印跡法，半定量分析細胞內(nèi)的F蛋白質(zhì)。按以下方法進行western印跡法。將從6孔板的1孔中回收的細胞于-80℃保存后，用100μL稀釋1x的SDS-PAGE用的試樣緩沖液(Red Loading BufferPack；New England Biolabs，Beverly，MA)，98℃加熱10分鐘。離心后，在SDS-PAGE凝膠(Multigel 10/20；Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd，Tokyo，Japan)中載入10μL上清。以15mA泳動2.5小時后，通過半干法以100mA經(jīng)1小時的轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Immobilon PVDF transfer membrane；Millipore，Bedford，MA)上。將轉(zhuǎn)移膜于4℃放置于封閉溶液(Block Ace；Snow BrandMilk Products Co.，Ltd，Sapporo，Japan)中1小時以上后，將其浸于含有10％BlockAce并以1/1000體積添加了抗F抗體的第一抗體溶液中，于4℃放置過夜。用含有0.05％Tween20的TBS(TBST)清洗3次，再用TBS清洗3次后，浸于含有10％Block Ace并以1/5000體積添加了結(jié)合HRP的抗小鼠IgG+IgM抗體(Goat F(ab′)2Anti-Mouse IgG+IgM，HRP；BioSource Int.，Camarillo，CA)的第二抗體溶液中，室溫下振蕩1小時。用TBST清洗3次，TBS清洗3次后，通過化學(xué)發(fā)光法(ECL Western印跡檢測試劑；Amershampharmacia biotech，Uppsala，Sweden)檢測。所得的克隆中，作為F蛋白的表達量比較多的克隆，對于導(dǎo)入了pCALNdLw-Zeo-F(furin)或pCALNdLw-Zeo-F(5R)的基因的細胞，分別獲得了31個克隆和23個克隆。
對于這些克隆，研究了F基因缺失型SeV(SeV/ΔF)的病毒實際的生產(chǎn)能力。首先，作為簡便的方法，以搭載了GFP基因的SeV/ΔF(SeV/ΔF-GFP)感染，研究其GFP熒光的幅度。具體的是，將各克隆的細胞接種于6孔板中，37℃下培養(yǎng)。通過上述方法(AxCANCre感染)誘導(dǎo)F蛋白的表達后，轉(zhuǎn)移到32℃下，感染1天后以Moi＝0.1用搭載了GFP基因的SeV/ΔF(SeV/ΔF-GFP)進行感染，隨時間變化在熒光顯微鏡下觀察GFP熒光的擴展。對于導(dǎo)入了pCALNdLw-Zeo-F(furin)或pCALNdLw-Zeo-F(5R)基因的克隆，觀察到GFP熒光的擴展的分別是8個克隆和12個克隆。對于這些克隆，研究它們的實際病毒生產(chǎn)能力。以moi＝0.5感染SeV/ΔF-GFP后，在10％FBS存在下或不存在FBS下于32℃培養(yǎng)，感染3天后研究培養(yǎng)上清中的病毒載體。所有的克隆中獲得了存在10％FBS情況下比不存在FBS情況下高10-20倍效價的載體。尤其是，克隆F5R2的情況中生產(chǎn)能力高，在10％FBS存在下回收3×106CIU/ml的SeV/ΔF-GFP。確認了即使在使用以往無法作為包裝細胞使用的HeLa細胞的情況下也可以生產(chǎn)SeV/ΔF，在不添加胰蛋白酶且有血清存在下成功生產(chǎn)了SeV/ΔF。
載體生產(chǎn)能力的提高雖然克隆F5R2的載體生產(chǎn)能力較高(3×106CIU/ml)，但是為了應(yīng)用于實際的載體生產(chǎn)中，需要進一步提高生產(chǎn)能力。對于F5R2中生產(chǎn)的SeV載體(SeV/ΔF-GFP)，通過western-印跡法研究了F蛋白的切割程度。這時，利用了抗F1抗體。抗F1抗體是新制備的多克隆抗體，其是從用F1蛋白質(zhì)的3種合成肽1-8(FFGAVIGT+Cys/序列號52)，27-39(EAREAKRDIALIK/序列號53)和285-297(CGTGRRPISQDRS/序列號54)的混合物免疫的兔血清中制備的抗體。抗F1抗體可以檢測F0和F1。以與實施例9相同的方法進行F蛋白的表達誘導(dǎo)和載體生產(chǎn)。此外，對于Western-印跡法，可以利用抗F1的多克隆抗體作為第一抗體，抗兔IgG抗體(anti-rabbit IgG(Goat)H+L conj.；ICN P.，Aurola，OH)作為第二抗體。F5R2中生產(chǎn)的SeV載體(SeV/ΔF-GFP)中F蛋白的檢測結(jié)果示于圖19。發(fā)現(xiàn)活化的F蛋白質(zhì)F1的比例較小。
為了獲得具有更高病毒生產(chǎn)能力的改變的F蛋白質(zhì)表達細胞，實施F5R2的細胞再克隆，選擇F1的切割頻率提高的細胞。獲得了32個克隆，通過仔細研究載體的生產(chǎn)能力發(fā)現(xiàn)，克隆F5R2-F22顯示出最高的生產(chǎn)能力。以MOI＝0.5感染SeV/ΔF-GFP后，在10％FBS存在下于32℃培養(yǎng)，研究培養(yǎng)上清中的SeV/ΔF-GFP的效價隨時間變化的結(jié)果示于圖20中。再克隆的F5R2-F22顯示出比親代細胞F5R2高10倍以上的生產(chǎn)能力，在感染第3天可以生產(chǎn)8×107CIU/ml的SeV/ΔF-GFP。對于這種細胞(克隆F5R2-F22)，通過利用抗F1抗體的Western-印跡法研究了生產(chǎn)的SeV載體(SeV/ΔF-GFP)中的F蛋白的切割程度。表明了對F1的切割程度比F5R2細胞高(圖21)。我們認為這有益于生產(chǎn)能力(＝感染性病毒粒子的生成)的提高。我們認為作為進一步提高生產(chǎn)能力的方法，例如，在細胞中導(dǎo)入人弗林蛋白酶基因或具有類似活性的蛋白質(zhì)的基因，可以使弗林蛋白酶樣活性提高。由于生產(chǎn)的SeV載體(SeV/ΔF-GFP)中的F蛋白質(zhì)量比較多，因此預(yù)計通過促進F0蛋白的切割，提高活性型F蛋白(F1蛋白)的比率，可以進一步提高生產(chǎn)能力。
工業(yè)上利用的可能性根據(jù)本發(fā)明的方法，在不使用病毒增殖原來需要的蛋白酶，也可以制備該病毒。通過使用病毒生產(chǎn)細胞內(nèi)源性表達的蛋白酶所識別的切割序列或通過使用對細胞極少產(chǎn)生有害作用的蛋白酶的切割序列，可以擴大用于病毒制備的細胞的選擇范圍，提高病毒制備效率。本發(fā)明的方法作為包括基因治療用載體在內(nèi)的所希望的基因?qū)胼d體的制備方法是有用的。
序列表<110>株式會社載體研究所(DNAVEC RESEARCH INC.)<120>病毒載體的制備方法<130>D3-A0401P<140>
<141>
<150>JP 2004-014654<151>2004-01-22<160>54<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的實例<400>1Pro Leu Gly Met Thr Ser1 5<210>2<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的實例<400>2Pro Gln Gly Met Thr Ser1 5<210>3<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的實例<400>3Pro Leu Gly Leu Trp Ala Arg1 5<210>4<211>8<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的實例<400>4Gly Pro Leu Gly Met Arg Gly Leu1 5<210>5
<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的實例<400>5Pro Gln Gly Leu Glu Ala Lys1 5<210>6<211>11<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的實例<400>6Arg Pro Lys Pro Val Glu Trp Arg Glu Ala Lys1 5 10<210>7<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>PLALWAR<400>7Pro Leu Ala Leu Trp Ala Arg1 5<210>8<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的實例<400>8Pro Leu Gly Met Trp Ser1 5<210>9<211>5<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的實例<400>9Pro Leu Gly Leu Gly1 5<210>10<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的實例
<400>10Val Phe Ser Ile Pro Leu1 5<210>11<211>5<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的實例<400>11Ile Lys Tyr His Ser1 5<210>12<211>8<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的實例<400>12Val Pro Met Ser Met Arg Gly Gly1 5<210>13<211>8<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的實例<400>13Arg Pro Phe Ser Met Ile Met Gly1 5<210>14<211>8<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的實例<400>14Val Pro Leu Ser Leu Thr Met Gly1 5<210>15<211>8<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的實例<400>15Ile Pro Glu Ser Leu Arg Ala Gly1 5
<210>16<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的實例<400>16Pro Leu Ala Tyr Trp Ala Arg1 5<210>17<211>367<212>DNA<213>巨細胞病毒<400>17actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca120ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt180caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg240ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag300tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt360accatgg 367<210>18<211>1248<212>DNA<213>Gallus gallus<400>18tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 60ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg120ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg180cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc240ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg gagtcgctgc gacgctgcct300tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg ccccggctct gactgaccgc360gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct ccgggctgta attagcgctt420ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa agccttgagg ggctccggga480gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gggtgcgtgc gtgtgtgtgt gcgtggggag540cgccgcgtgc ggctccgcgc tgcccggcgg ctgtgagcgc tgcgggcgcg gcgcggggct600ttgtgcgctc cgcagtgtgc gcgaggggag cgcggccggg ggcggtgccc cgcggtgcgg660ggggggctgc gaggggaaca aaggctgcgt gcggggtgtg tgcgtggggg ggtgagcagg720gggtgtgggc gcgtcggtcg ggctgcaacc ccccctgcac ccccctcccc gagttgctga780gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt ggcgcggggc tcgccgtgcc840gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg gggccgcctc gggccgggga900gggctcgggg gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc ggctgtcgag gcgcggcgag960ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg cagggacttc ctttgtccca 1020aatctgtgcg gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc ccctctagcg ggcgcggggc 1080gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag ggccttcgtg cgtcgccgcg 1140ccgccgtccc cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg cggggggacg gctgccttcg 1200ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg accggcgg1248<210>19<211>95<212>DNA<213>Oryctolagus cuniculus<400>19cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg 60ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattc95<210>20<211>1744<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>CA啟動子的實例<400>20actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca120ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt180caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg240ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag300tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt360accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca420cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg480gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg540agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg600cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcggggag tcgctgcgac660gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac720tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt780agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc840tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg900tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg960cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1020ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 1080gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag 1140ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1200ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1260ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1320cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1380tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1440gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1500cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1560gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1620gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1680tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattcgg cttgatcgaa gcttgcccac 1740catg1744<210>21<211>34<212>DNA<213>噬菌體P1<400>21ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat 34<210>22<211>34<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>22gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc 34<210>23<211>10<212>RNA<213>人工的<220>
<223>仙臺病毒(Sendai virus)S序列的實例(w＝a或c；v＝a或c或g)<400>23ucccwvuuwc10<210>24<211>10<212>RNA<213>人工的
<220>
<223>仙臺病毒S序列的實例<400>24ucccaguuuc10<210>25<211>10<212>RNA<213>人工的<220>
<223>仙臺病毒S序列的實例<400>25ucccacuuac10<210>26<211>10<212>RNA<213>人工的<220>
<223>仙臺病毒S序列的實例<400>26ucccacuuuc10<210>27<211>10<212>DNA<213>人工的<220>
<223>仙臺病毒S序列的實例<400>27agggtcaaag10<210>28<211>10<212>DNA<213>人工的<220>
<223>仙臺病毒S序列的實例<400>28agggtgaatg10<210>29<211>10<212>DNA<213>人工的<220>
<223>仙臺病毒S序列的實例<400>29agggtgaaag10<210>30<211>9<212>RNA
<213>人工的<220>
<223>仙臺病毒E序列的實例<400>30auucuuuuu9<210>31<211>9<212>DNA<213>人工的<220>
<223>仙臺病毒E序列的實例<400>31taagaaaaa9<210>32<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>32cattttggca aagaattgat taattcgag 29<210>33<211>47<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>33tcacagcacc caagaatctc ttctggcgag caccggcatt ttgtgtc 47<210>34<211>47<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>34gacacaaaat gccggtgctc gccagaagag attcttgggt gctgtga 47<210>35<211>42<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>35gatcgtaatc acagtctctc gagagttgta ccatctacct ac42<210>36<211>52
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>36tcacagcacc gaagaatctc ctccggcgac gaccggcatt ttgtgtcgta tc 52<210>37<211>52<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>37gatacgacac aaaatgccgg tcgtcgccgg aggagattct tcggtgctgt ga 52<210>38<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>38aaatcctgga gtgtctttag agc 23<210>39<211>54<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>39tctcgagtcg ctcggtacga tggccaagtt gaccagtgcc gttccggtgc tcac 54<210>40<211>85<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>40aatgcatgat cagtaaatta caatgaacat cgaaccccag agtcccgctc agtcctgctc 60ctcggccacg aagtgcacgc agttg 85<210>41<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>41ccggaattca acaaatggcc gggttgttga gcaccttcga 40
<210>42<211>42<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>42ccggaattcc tagattcctc ctatcccagc tactgctgct cg42<210>43<211>50<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>43ctagctagcc caccatggat caagatgcct tcattctaaa agaagattct50<210>44<211>50<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>44ctagctagcc tagttggtca gtgactctat gtcctcttct acgagttcca50<210>45<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>45ggccgcgtcg acatcgatgc tagcctcgag ccgcggtac39<210>46<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>46cgcggctcga ggctagcatc gatgtcgacg c31<210>47<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>47cttaactatg cggcatcaga gc 22
<210>48<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>48gccgattcat taatgcagct gg 22<210>49<211>37<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>49ctataggaaa ggaattccta tagtcaccaa acaagag 37<210>50<211>38<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>50gatgagtccg tgaggacgaa actataggaa aggaattc 38<210>51<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>51gcgggccctc tcttgtttgg tctgatgagt ccgtgaggac 40<210>52<211>9<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>52Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr Cys1 5<210>53<211>13<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>53
Glu Ala Arg Glu Ala Lys Arg Asp Ile Ala Leu Ile Lys1 5 10<210>54<211>13<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>54Cys Gly Thr Gly Arg Arg Pro Ile Ser Gln Asp Arg Ser1 5 10
權(quán)利要求
1.一種制備依賴于蛋白酶對病毒蛋白質(zhì)的切割而增殖的病毒的方法，該方法包括在如下物質(zhì)存在的情況下產(chǎn)生該病毒的步驟(i)經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)，其中該病毒蛋白質(zhì)的該蛋白酶切割序列被改變?yōu)槠渌鞍酌傅那懈钚蛄校?ii)所述其它蛋白酶，其中所產(chǎn)生的病毒含有被切割的所述經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)，不含有編碼所述經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中記載的方法，其中所制備的病毒保持有編碼具有野生型切割序列的所述病毒蛋白質(zhì)的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中記載的方法，其中所制備的病毒是缺失了編碼所述病毒蛋白質(zhì)的基因的非傳播性病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中記載的方法，其中所述其它蛋白酶是在生產(chǎn)病毒的細胞中內(nèi)源性表達的蛋白酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中記載的方法，其中所述其它蛋白酶是弗林蛋白酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1中記載的方法，其中所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg。
7.根據(jù)權(quán)利要求1中記載的方法，其中所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Arg-Arg-Arg。
8.根據(jù)權(quán)利要求1中記載的方法，其中所述病毒為負鏈RNA病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8中記載的方法，其中所述負鏈RNA病毒為副粘病毒科病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求8中記載的方法，其中所述負鏈RNA病毒為仙臺病毒。
11.一種載體，該載體編碼經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)，在該經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)中，蛋白酶切割序列被改變?yōu)槠渌鞍酌傅那懈钚蛄校龅鞍酌盖懈钚蛄惺瞧湓鲋骋蕾囉谠摰鞍酌笇Σ《镜鞍踪|(zhì)的切割的病毒中病毒蛋白質(zhì)的蛋白酶切割序列，其中，該載體是在該病毒的生產(chǎn)細胞中無法增殖的病毒載體或非病毒載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11中記載的載體，其為質(zhì)粒。
13.根據(jù)權(quán)利要求11中記載的載體，其中所述經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)可以通過重組酶誘導(dǎo)表達。
14.根據(jù)權(quán)利要求13中記載的載體，其中所述重組酶為Cre或Flp。
15.根據(jù)權(quán)利要求11中記載的載體，其中所述其它蛋白酶為在生產(chǎn)病毒的細胞中內(nèi)源性表達的蛋白酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求11中記載的載體，其中所述其它蛋白酶是弗林蛋白酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求11中記載的載體，其中所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg。
18.根據(jù)權(quán)利要求11中記載的載體，其中所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Arg-Arg-Arg。
19.根據(jù)權(quán)利要求11中記載的載體，其中所述病毒蛋白質(zhì)為負鏈RNA病毒的F蛋白質(zhì)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19中記載的載體，其中所述負鏈RNA病毒為副粘病毒科病毒。
21.根據(jù)權(quán)利要求19中記載的載體，其中所述負鏈RNA病毒為仙臺病毒。
22.含有權(quán)利要求11中記載的載體的哺乳動物細胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求22中記載的細胞，其中所述細胞為生產(chǎn)依賴于蛋白酶對病毒蛋白質(zhì)的切割而增殖的病毒。
24.根據(jù)權(quán)利要求22中記載的細胞，其中所述編碼經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的基因整合于該細胞的染色體中。
25.根據(jù)權(quán)利要求22中記載的細胞，其為人類細胞。
26.一種經(jīng)修飾的病毒，是依賴于蛋白酶對病毒蛋白質(zhì)的切割而增殖的病毒的經(jīng)修飾的病毒，其中含有該病毒蛋白質(zhì)的由該蛋白酶識別的切割序列被改變?yōu)槠渌鞍酌傅那懈钚蛄械慕?jīng)修飾的蛋白質(zhì)，且不含有編碼所述經(jīng)修飾的病毒蛋白質(zhì)的基因。
27.根據(jù)權(quán)利要求26中記載的經(jīng)修飾的病毒，所制備的病毒保持有編碼具有野生型切割序列的所述病毒蛋白質(zhì)的基因。
28.根據(jù)權(quán)利要求26中記載的經(jīng)修飾的病毒，所述病毒是缺失了編碼所述病毒蛋白質(zhì)的基因的非傳播性病毒。
29.根據(jù)權(quán)利要求26中記載的經(jīng)修飾的病毒，所述其它蛋白酶是在生產(chǎn)病毒的細胞中內(nèi)源性表達的蛋白酶。
30.根據(jù)權(quán)利要求26中記載的經(jīng)修飾的病毒，所述其它蛋白酶是弗林蛋白酶。
31.根據(jù)權(quán)利要求26中記載的經(jīng)修飾的病毒，所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg。
32.根據(jù)權(quán)利要求26中記載的經(jīng)修飾的病毒，所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Arg-Arg-Arg。
33.根據(jù)權(quán)利要求26中記載的經(jīng)修飾的病毒，所述病毒為負鏈RNA病毒。
34.根據(jù)權(quán)利要求33中記載的經(jīng)修飾的病毒，所述負鏈RNA病毒為副粘病毒科病毒。
35.根據(jù)權(quán)利要求33中記載的經(jīng)修飾的病毒，所述負鏈RNA病毒為仙臺病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供一種制備依賴于蛋白酶對病毒蛋白質(zhì)的切割而增殖的病毒的方法，而該方法不依賴于所述蛋白酶。本發(fā)明的病毒的制備方法，其特征在于在蛋白酶的切割序列被修飾為其它蛋白酶的切割序列的病毒蛋白質(zhì)的存在下生產(chǎn)病毒。通過將蛋白酶的切割序列取代為病毒產(chǎn)生細胞內(nèi)源性表達的蛋白酶的切割序列，可以有效地產(chǎn)生病毒載體。通過本發(fā)明中的方法，可以使用較廣范圍的細胞制造高效價的病毒。
文檔編號C12N15/64GK1934257SQ20058000918
公開日2007年3月21日 申請日期2005年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月22日
發(fā)明者井上誠, 伴浩志, 飯?zhí)镎虏? 長谷川護 申請人:株式會社載體研究所