酶的除去方法和使用該方法的磷脂的堿交換方法或水解方法

專利名稱：酶的除去方法和使用該方法的磷脂的堿交換方法或水解方法
技術領域：
本發明涉及將磷脂的改性或合成磷脂的制造中使用的酶從反應液中分離·除去的方法、以及使用該方法的磷脂的堿交換方法(即堿交換方法)和磷脂的水解方法。
背景技術：
磷脂的水解或堿交換反應，通常在酶的存在下，在適當的溶劑中進行。在這些反應中，通常，通過加熱等使酶失活，從而使反應停止。例如，在特開平2-273536號公報中，公開了利用脂肪酶或磷脂酶A2(以下稱為PLA2)對磷脂酸衍生物進行處理，通過部分水解來制造溶血磷脂的方法。在該方法中，在適當的時間對反應混合物進行加熱，使酶失活，將反應中止。在特開2001-186898號公報中，公開了使用磷脂酶D(以下稱為PLD)在酰基甘油磷脂和絲氨酸之間進行磷脂酰基交換反應，制造磷脂酰絲氨酸的方法。在該方法中，在反應后，例如通過加熱或醇變性(alcohol denaturation)等處理，使酶失活。在特開2003-319793號公報中，公開了使用PLD的酰基甘油磷脂的磷脂酰基交換反應。在該反應中，在上述交換反應后，通過加熱等處理，使PLD失活。
但是，根據特開昭63-233750號公報，由于磷脂酶耐熱性強，所以，例如，即使在95℃下進行30分鐘左右加熱處理也不會充分失活。由于磷脂酶沒有充分失活，所以，例如，有可能產生與磷脂共存的油脂等被水解而產生異臭等品質上的問題。該文獻進一步記載有在使加熱溫度為100℃以上、例如約120℃下使其失活時，存在容易引起磷脂或由磷脂酶的處理而產生的游離脂肪酸的劣化的問題。為了解決這樣的問題，在特開昭63-233750號公報中公開了在用磷脂酶對含有磷脂的原料進行處理之后，用蛋白酶對該磷脂酶進行處理，接著加熱該蛋白酶以使其失活的方法。
此外，在特開2003-93086號公報中，暗示了蛋白質、肽、酶等能夠成為變態反應(allergy)的原因。在該公報中進一步記載有在特開昭63-233750號公報中記載的方法中，作為分解生成物的肽和蛋白酶以原樣殘留，會引起變態反應等，很明顯會在安全上存在問題。為了解決這樣的問題，在特開2003-93086號公報中，公開了用磷脂酶對含有磷脂的原料進行處理，接著用蛋白酶進行處理，接著除去蛋白質、肽和酶的方法。作為除去蛋白質等的方法，例示有使用助濾劑的過濾、使用吸附劑的處理等。據記載，使用完的吸附劑，可以通過使用助濾劑的過濾而除去。該方法能夠除去蛋白質等，但是，需要反應后的過濾、吸附等處理，所以存在工序復雜化的問題。
此外，在特開2002-193982號公報中，公開了在酶反應液中添加極性有機溶劑，利用水提取從有機溶劑中的磷脂酰絲氨酸溶液中除去親水性雜質、蛋白質和無機鹽的方法。據記載，利用該方法，磷脂酰絲氨酸溶液中的PLD的活性可達到檢出極限(0.1IU/g)以下，但對于該溶液中的蛋白含量，完全沒有記載。

發明內容
本發明人在使用酶的磷脂的水解反應或堿交換反應中，使用上述的各種方法實際地對酶失活進行研究。但是，在任一種方法中，雖然酶活性下降，但是均無法得到滿意的結果(參照以下的比較例1～7)。
因此，本發明人對從酶反應液中進一步有效地除去殘留酶活性的方法反復進行潛心研究，結果發現，通過用含有無機金屬鹽的、水和有機溶劑的混合溶劑對利用酶反應后的液體(以下稱為“酶反應液”)進行清洗，能夠有效地除去酶反應液中殘留的酶活性，并且能夠減少蛋白含量，從而完成本發明。
本發明提供一種從磷脂的水解反應或堿交換反應中使用的酶反應液中除去酶的方法，該方法包括利用含有無機金屬鹽的、水和有機溶劑的混合溶劑對該酶反應液進行處理，將該酶除去的工序。
此外，本發明還提供一種磷脂的堿交換方法，該方法包括使磷脂與選自醇類、糖類和含有羥基的環狀化合物中的具有醇式羥基的化合物，在能夠將磷脂中的堿轉移到該化合物中的酶的存在下發生反應，得到酶反應液的工序；和利用含有無機金屬鹽的、水和有機溶劑的混合溶劑對該酶反應液進行處理，將該酶除去的工序。
此外，本發明還提供一種磷脂的水解方法，該方法包括在水的存在下，使磷脂與能夠將磷脂水解的酶進行反應，得到酶反應液的工序；和利用含有無機金屬鹽的、水和有機溶劑的混合溶劑對該酶反應液進行處理，將該酶除去的工序。
在一個實施方式中，上述無機金屬鹽是選自氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、氯化鈣、和硫酸鎂中的至少一種金屬鹽。
在另一實施方式中，上述有機溶劑是極性溶劑。
此外，在另一實施方式中，上述極性有機溶劑是選自丙酮、乙醇、甲醇、異丙醇、和甘油中的至少一種溶劑。
此外，在一個不同的實施方式中，上述混合溶劑含有30～70容量％的水和70～30容量％的有機溶劑，該混合溶劑中含有5～25質量/容量％的上述無機金屬鹽。
具體實施例方式
以下，首先，說明利用酶進行的磷脂的堿交換方法和水解方法，接著，說明從它們的酶反應液中除去酶的方法。
A.利用酶的磷脂的堿交換方法本發明的磷脂的堿交換方法，包括使磷脂與選自醇類、糖類、和具有羥基的環狀化合物中的受體醇，在能夠將磷脂的堿轉移到該醇化合物中的酶的存在下進行反應，得到酶反應液的工序；和利用含有無機金屬鹽的、水和有機溶劑的混合溶劑對該酶反應液進行處理，將該酶除去的工序。在此，首先說明通過堿交換反應得到酶反應液的工序。
A-1原料磷脂作為本發明中使用的磷脂(原料磷脂)，沒有特別的限制，可舉出磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酸(PA)、和磷脂酰甘油(PG)等。
作為原料磷脂，除了這樣精制的化合物以外，還可使用含有它們的化合物的蛋黃磷脂、大豆磷脂、菜籽磷脂、魚貝類磷脂等。例如，在蛋黃磷脂中，含有73.0％的PC、15.0％的PE、和0.6％的PI。此外，大豆磷脂中含有38.2％的PC、17.3％的PE、和16.0％的PI(均參照“新食品功能材料的開發”，太田明主編，CMC出版社，1996年)。因此，含有這些化合物的來自天然物質的磷脂，作為起始材料是有用的。
上述的蛋黃磷脂、大豆磷脂、菜籽磷脂、魚貝類磷脂等，也可以不進行高度精制。例如，即使在將除了磷脂以外還含有蛋白質、脂質、多糖、鹽等成分的粗提取物或粗精制物作為起始原料的情況下，只要以不阻礙酶反應的量含有這些成分，就可以作為原料磷脂使用。此外，通過化學作用或者酶作用合成的PC或PE等，也可以作為原料磷脂使用。
A-2具有醇式羥基的化合物本發明中使用的具有醇式羥基的化合物，在磷脂的堿交換中，被用作酰基甘油磷脂的磷脂酰基等堿部位的受體。作為具有醇式羥基的化合物，可舉出醇類、糖類、和具有羥基的環狀化合物等。
作為醇類，包括一元醇、多元醇(包括二元醇和三元醇，也指多元醇類)、含氮醇等。作為一元醇，可舉出甲醇、乙醇、丙醇等；作為多元醇，可舉出甘油、乙二醇、丙二醇等。抗壞血酸也被包含在醇類中。作為含氮醇，例如可舉出絲氨酸等氨基酸、1-氨基-2丙醇等。
作為糖類，包括葡萄糖等單糖、以蔗糖等二糖為首的低聚糖、N-乙酰基-D-氨基葡萄糖等。此外，還可舉出具有核糖或脫氧核糖等糖的腺苷、鳥苷、肌苷、黃苷、脫氧腺苷、脫氧鳥苷等核苷酸等。
作為具有羥基的環狀化合物，例如可舉出曲酸、熊果苷等。
A-3酶作為本發明的磷脂的堿交換方法中使用的酶，可舉出PLD等。
作為PLD，可舉出來自植物的PLD，例如來自甘藍或花生的PLD。此外，可舉出來自屬于鏈霉菌(Streptomyces)屬的微生物的PLD。其中，優選使用Streptomyces cinnamoneum生產的PLD。該微生物生產的PLD，分子量約54,000，最適pH約5～6，最適溫度約40～60℃(Chiaki Ogmo等，J.Biol.Chem.，125卷，263-269頁(1999))。
此外，使PLD的生產株的生產率提高后的變異株本身，和將從上述微生物分離出的PLD基因導入同種或不同種宿主中從而使PLD的生產率提高的重組微生物本身，以及來自它們的PLD，也可用于本發明。
A-4堿交換反應堿交換反應，通過使原料磷脂與具有醇式羥基的化合物(以下有時也稱為受體醇)在具有堿交換活性的酶(PLD)的存在下發生反應而進行。
原料磷脂與受體醇的摩爾比，沒有特別的限制，可以根據原料磷脂和受體醇的種類適當決定。通常，受體醇/原料磷脂(摩爾比)優選為0.001～200左右。例如，在PE的情況下，受體醇/PE(摩爾比)通常優選為0.01～100。
在堿交換反應中，酶的使用量沒有特別的限制，可以根據原料磷脂、受體、和酶的種類來決定。例如，在PLD的情況下，對于1g的PE，可以使用20～8000單位的范圍。其中，該酶活性的1單位，是以95％來自大豆的PC(磷脂提取物Phosphatide Extract，Soybean(Granules)Avanti Polar Lipid Inc.公司生產)作為基質，在基質濃度0.16％的40mM乙酸緩沖溶液(pH5.5、1mM的CaCl2、含有0.3％的Triton X-100)中、在37℃下進行反應時，1分鐘釋放1μmol膽堿的酶的量。
在堿交換反應中，可以使用水類溶劑、有機溶劑、和水類溶劑與有機溶劑的混合溶劑作為反應用溶劑。所謂反應用水類溶劑，是指水和/或水性的緩沖溶液。作為水，優選使用離子交換水、精制水、或蒸餾水，但也可以使用自來水。作為水性的緩沖溶液，例如，優選使用pH4～6的乙酸緩沖溶液、pH7～8的磷酸緩沖溶液等。作為反應用有機溶劑，可舉出正庚烷、正己烷、石油醚等脂肪族烴；環戊烷、環己烷等環狀脂肪族烴；二乙醚、四氫呋喃等醚類；乙酸甲酯、乙酸乙酯等酯類；四氯化碳、氯仿等鹵化烴類。反應用有機溶劑，可以單獨使用，或者可以將2種以上混合使用。可以在這些反應用水類溶劑或反應用有機溶劑中，進一步并用促進堿交換反應的溶劑、例如丙酮等。
在反應中使用水類溶劑和有機溶劑的混合溶劑的情況下，混合比可以根據使用的有機溶劑的種類適當選擇。混合比率沒有特別的限制，通常，為了抑制作為副反應的磷脂的堿(磷脂酰基)的水解反應并有效地進行目標的堿(磷脂酰基)的交換反應，優選在反應體系內的水類溶劑的含量為10容量％以下進行。
上述酶反應中使用的磷脂的量，根據反應溶劑的容量，優選為1～50％(w/v)，更優選為5～30％(w/v)。磷脂的量超過50％(w/v)時，會有溶解有原料磷脂的溶液的粘度變高，導致反應效率降低的情況，相反，小于1％(w/v)時，一次處理能夠得到的磷脂的量非常少，處理效率變差。
堿交換反應的溫度，優選為10～70℃，更優選為25～50℃。反應所需時間，隨著酶的量和反應溫度而改變，大致為0.5～48小時。在本發明的方法中，考慮到磷脂的分散性，而且，考慮到反應用混合溶劑為水層和有機溶劑層的兩相系統的情況下的混合性，優選適當進行攪拌、振動等分散方法。
通過上述反應，進行磷脂的堿交換，生產出與受體醇的種類對應的磷脂。例如，在使用甘油作為醇的情況下，生產出磷脂酰甘油(PG)，在使用絲氨酸作為醇的情況下，生產出磷脂酰絲氨酸(PS)。
接著，從該酶反應液中除去酶、精制反應生成物，對于除去酶的工序，將在“D.從酶反應液中除去酶的方法”中說明。
B.利用酶的磷脂的水解反應本發明的磷脂的水解方法，包括在水的存在下，使磷脂與能夠將磷脂水解的酶進行反應，得到酶反應液的工序；和用含有無機金屬鹽的、水和有機溶劑的混合溶劑對該酶反應液進行處理，除去該酶的工序。在此，首先說明通過水解得到酶反應液的工序。
B-1原料磷脂水解中使用的原料磷脂可使用上述A-1中記載的磷脂。
B-2酶磷脂的水解中使用的酶，只要是能夠將磷脂的脂肪酸部位和/或堿部位水解的酶即可，沒有特別的限制。作為這樣的酶，可舉出脂肪酶、磷脂酶A1(以下稱為PLA1)、PLA2、磷脂酶B(以下稱為PLB)、磷脂酶C(以下稱為PLC)、PLD、鞘磷脂酶等。
作為PLD，可使用上述A-3中記載的PLD。
作為PLA2，可舉出來自動物的PLA2(例如，來自豬胰臟的PLA2)。此外，可舉出來自微生物的PLA2(例如，來自屬于鏈霉菌屬的微生物的PLA2)等。
作為PLA1、PLB、PLC、和脂肪酶，可舉出來自微生物的脂肪酶，例如來自屬于曲霉菌屬(Aspergillus)、鏈霉菌(Streptomyces)屬等的微生物的磷脂酶和脂肪酶。
此外，使上述酶的生產株的生產率提高后的變異株本身，和將從上述微生物分離出的酶的基因導入同種或不同種宿主中從而使該種酶的生產率提高的重組微生物本身，以及來自它們的酶，也可用于本發明。
B-3水解反應水解反應通過使水解酶與原料磷脂在水的存在下發生作用而進行。對于磷脂的水解反應中的磷脂與水的摩爾比，沒有特別的限制。相對于1摩爾的磷脂，適宜使用0.01～100倍摩爾的水。
在水解反應中，酶的使用量沒有特別的限制，可以根據原料磷脂和酶的種類適當決定。例如，在PLD的情況下，與上述的A-4同樣，例如，相對于1g的PE，可以使用20～8000單位的范圍。
在PLA2的情況下，例如，相對于1g的PE，可以使用20～8000單位的范圍。PLA2的1單位，是以來自大豆的糊狀卵磷脂(P-3644Sigma PC含量40％)作為基質，在基質濃度1.25％的25mM Tris-HCl緩沖溶液(pH8.0、2.5mM的CaCl2、含有0.002％的Triton X-100)中、在37℃下進行反應時，1分鐘釋放1μmol脂肪酸的酶的量。
在脂肪酶的情況下，相對于1g的PE，可以使用20～50000單位的范圍。脂肪酶的1單位，是以將橄欖油、2％PVA和MaIlvaive緩沖溶液(pH7.0)按照容量比2∶3∶1混合、乳化后的物質作為基質，相對于4ml基質，混合1ml脂肪酶稀釋液，在37℃下反應60分鐘時，釋放出相當于1μmol油酸的酸的酶量。
作為水解反應中使用的反應溶劑，可以使用與上述A-4的堿交換反應中記載的物質相同的水類溶劑、或者水類溶劑與有機溶劑的混合溶劑。若考慮磷脂在水中的溶解性，則優選使用水類溶劑與有機溶劑的混合溶劑。此外，作為水類溶劑，優選使用pH7～9的Tris-HCl緩沖溶液等。
在使用水類溶劑與有機溶劑的混合溶劑的情況下，混合比可以根據使用的有機溶劑的種類適當選擇。水類溶劑與有機溶劑的容量比沒有特別的限制，從促進水解反應的方面考慮，優選使反應體系內的水類溶劑的含量為10容量％以上。
上述酶反應中使用的磷脂的量，根據反應溶劑的容量，優選為1～50％(w/v)，更優選為5～30％(w/v)。磷脂的量超過50％(w/v)時，會有溶解有原料磷脂的溶液的粘度變高，導致反應效率降低的情況，相反，小于1％(w/v)時，一次處理能夠得到的磷脂的量非常少，處理效率變差。
水解反應的溫度因使用的酶的物理化學性質而不同。例如，在使用來自動物的PLA2的情況下，優選為10～70℃、更優選25～50℃。反應所需時間，隨著目標反應、酶的量和反應溫度而改變，大致為0.5～48小時。在本發明的方法中，考慮到磷脂的分散性，而且，考慮到使用水類溶劑和有機溶劑的混合溶劑的情況下的水類溶劑和有機溶劑的混合性，優選適當進行攪拌、振動等分散方法。
通過上述反應，進行磷脂的水解，從磷脂酰膽堿(PC)生產出溶血磷脂酰膽堿(LPC)，從磷脂酰乙醇胺(PE)生產出溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)，或者從PC或PE生產出磷脂酸(PA)。
接著，從該酶反應液中除去酶、精制反應生成物，對于除去該酶的工序，將在以下的“D.從酶反應液中除去酶的方法”中說明。
C.酶除去前的酶反應液的處理上述A.堿交換方法或B.水解方法中得到的酶反應液，是(1)含有有機溶劑的體系或(2)水體系中的任一個。分別在各體系中，對酶除去前的酶反應液的處理，記載如下。
(1)含有有機溶劑的體系在酶反應液僅為有機溶劑的體系的情況下，可以直接進行酶除去。
在酶反應液為有機溶劑和水類溶劑的混合溶劑體系的情況下，有機溶劑和水類溶劑可以分離時，優選預先除去水類溶劑。但是，在機溶劑和水類溶劑不能較好地分離的情況下，或者有機溶劑和水類溶劑成為乳化狀態的情況下，可以不除去水類溶劑而直接進行酶除去。
(2)水體系在酶反應液是水體系的情況下，優選添加提取用有機溶劑、進行溶劑分餾、除去分餾出的水類溶劑。在此，提取用有機溶劑可以使用作為上述A-4中記載的反應用有機溶劑而列舉的有機溶劑。但是，在該情況下，在提取用有機溶劑與水類溶劑的分離較差時，或提取用有機溶劑與水類溶劑成為乳化狀態時，也可以不除去水類溶劑而直接進行酶除去。
D.從酶反應液中除去酶的方法從上述C.中得到的酶反應液中除去酶的方法，包括用含有無機金屬鹽的、水和有機溶劑的混合溶劑(以下，簡稱為清洗用混合溶劑)，對酶反應液進行處理，將酶除去的工序。
上述C.中得到的酶反應液中，含有酶、原料磷脂、反應生成物、以及水類溶劑和/或有機溶劑。本發明的特征在于，通過使用含有無機金屬鹽的、水和有機溶劑的混合溶劑對這些酶反應液進行處理，將酶除去。
D-1.無機金屬鹽作為本發明中使用的無機金屬鹽，可舉出一價金屬的無機鹽、二價金屬的無機鹽或多價金屬的無機鹽。
作為一價金屬的無機鹽，優選使用堿金屬的無機鹽、無機銨鹽等。作為堿金屬，優選使用鈉(Na)、鉀(K)、鋰(Li)，最優選鈉。作為與堿金屬或氨形成鹽的無機化合物，優選使用鹽酸、硫酸、碳酸等。作為一價的無機金屬鹽，例如，優選使用氯化鈉(NaCl)、硫酸鈉(Na2SO4)、氯化鉀(KCl)、硫酸鉀(K2SO4)等。
作為二價或多價的無機金屬鹽，可使用堿土類金屬等。優選使用鎂(Mg)、鈣(Ca)等，作為它們的無機金屬鹽，例如，可使用氯化鎂(MgCl2)、硫酸鎂(MgSO4)、氯化鈣(CaCl2)、硫酸鈣(CaSO4)等。
無機金屬鹽可以單獨使用，或者可以將2種以上組合使用。
D-2清洗用有機溶劑在酶的除去中使用的有機溶劑(清洗用有機溶劑)，只要具有極性，就沒有特別的限制。優選使用醇(尤其是低級醇)、丙酮等。作為低級醇，可使用碳原子數1～7的醇，尤其優選使用甲醇、乙醇、異丙醇和甘油。
有機溶劑可以單獨使用，或者可以將2種以上組合使用。
D-3含有無機金屬鹽的、水和有機溶劑的混合溶劑(清洗用混合溶劑)通常，水和有機溶劑按照容量比1∶9～9∶1的比例、優選3∶7～7∶3的比例、更優選4∶6～6∶4的比例混合。
無機金屬鹽在該混合溶劑中含有3～25質量/容量％(以下記為w/v％)、優選5～20w/v％、更優選5～10w/v％此外，該清洗用混合溶劑的制作方法沒有特別的限制。例如，可以預先調制適當濃度的無機金屬鹽水溶液、再與適當量的有機溶劑混合進行調制。或者，可以在水和有機溶劑的混合溶劑中添加適當量的無機金屬鹽。具體地說，例如，可舉出丙酮與含有15w/v％的NaCl的水溶液的1∶1(v/v)混合溶液(含有7.5w/v％的NaCl的50v/v％丙酮-水混合溶劑)等。同樣，可舉出含有7.5w/v％的NaCl的50v/v％乙醇-水混合溶劑、含有7.5w/v％的NaCl的50v/v％異丙醇-水混合溶劑、含有7.5w/v％的NaCl的50v/v％甲醇-水混合溶劑等。不言而喻，這些僅是例示。
D-4酶反應液的處理所謂酶反應液的處理，是指利用清洗用混合溶劑對上述C.中得到的酶反應液進行清洗。在將該酶反應液與清洗用混合溶劑充分混合后，通過靜置或離心分離，將清洗用混合溶劑分離、除去，由此進行清洗。
清洗用混合溶劑可以添加上述C.中得到的酶反應液的容積的1/10以上的比例。若考慮到處理效率，則使用的清洗用混合溶劑的量，優選為酶反應液的容積的3/10～3/1(v/v)，更優選為5/10～1/1(v/v)。
清洗后，回收含有磷脂的有機溶劑相。根據需要，可以利用清洗用混合溶劑反復進行處理。
利用清洗用混合溶劑對酶反應液進行的處理，除了上述那樣在酶反應物中添加預先調制的混合溶劑的方法以外，也可以采用將無機金屬鹽、水、和有機溶劑按照上述規定的添加量直接添加到酶反應物中的方法。這些成分的添加順序沒有特別的限制。或者，可以在酶反應物中加入含有規定量的無機金屬鹽的水溶液和有機溶劑。即，只要最終酶反應物中含有上述規定量的混合溶劑即可。
此外，在酶反應液本身含有作為清洗用混合溶劑的組分的上述無機金屬鹽、水、或極性溶劑時，可以利用其作為清洗用混合溶劑的組成物。
在由該清洗得到的含有磷脂的有機溶劑相中含有作為清洗用溶劑組分的無機金屬鹽的情況下，通過進一步用水和極性有機溶劑的混合液進行清洗，能夠容易地除去該無機金屬鹽。
E.反應生成物的回收利用本領域技術人員通常使用的方法，從上述D.中得到的含有磷脂的有機溶劑相中回收目標生成物。例如，可通過利用能夠溶解反應生成物的有機溶劑進行提取、接著在減壓下除去有機溶劑等方法進行回收，根據需要，可進行精制。得到的生成物，完全不含有反應中使用的酶，或者酶含量極低，所以可穩定地保存。
實施例以下，通過實施例進一步具體地說明本發明，但本發明不限定于這些實施例。
<分析方法>
(反應的確認)在以下的調制例中，利用以下方法確認反應的進行。取一部分反應液，在減壓下蒸餾除去全部溶劑，將干燥物溶解在氯仿∶乙腈＝7∶3的混合物中，利用下述條件的高速液相色譜法(以下稱為HPLC法)檢測生成物的PS和PA、LPA。
使用的柱GL Sciences制Unisil Q NH2(內徑4.6mm×25cm)移動相乙腈∶甲醇∶10mM磷酸二氫銨＝619∶291∶90(v/v/v)流速1.3ml/min柱溫度37℃檢測UV205nm(酶活性的定義和測定方法)以下的調制例和研究例中使用的酶活性，分別如下述進行定義。此外，取一部分磷脂，在減壓下蒸餾除去全部溶劑，利用下述方法測定得到的卵磷脂，以每1g卵磷脂的活性來表示殘留酶活性。
磷脂酶D(PLD)以95％來自大豆的磷脂酰膽堿(PC)(磷脂提取物PhosphatideExtract，Soybean(Granules)，Avanti Polor Lipid Inc.生產)作為基質，在基質濃度0.16質量％的40mM乙酸緩沖溶液(pH5.5、1mM的CaCl2、含有0.3％的Triton X-100)中、在37℃下進行反應，測定酶活性，以1分鐘釋放1μmol膽堿的酶的量作為1U。
磷脂酶A2(PLA2)以來自大豆的糊狀卵磷脂(P-3644 Sigma PC含量40％)作為基質，在基質濃度1.25wt％的25mM Tris-HCl緩沖溶液(pH8.0、2.5mM的CaCl2、含有0.002％的Triton X-100)中、在37℃下進行反應。以1分鐘釋放1μmol脂肪酸的酶的量作為1U。
脂肪酶以將橄欖油、2％PVA和McIlvaine緩沖溶液(pH7.0)按照容量比2∶3∶1混合·乳化后的物質作為基質，相對于4ml基質，混合1ml脂肪酶稀釋液，在37℃下反應60分鐘。以釋放出相當于1μmol油酸的酸的酶量作為1U。
蛋白酶在5ml的0.6％乳酪蛋白(pH7.5、0.04M磷酸緩沖溶液)中加入1ml的酶溶液，在30℃下反應10分鐘。以每分鐘釋放相當于1μg酪氨酸的Folin顯色(Folin’s color)作為TCA可溶性成份的活性作為1U。
(殘留蛋白質的定量)在減壓下除去溶劑后，使磷脂餾分(fraction)溶解在氯仿中，進行離心分離，將蛋白質作為氯仿不溶物回收。回收的蛋白質再用氯仿清洗數次后，在減壓下除去氯仿，供給蛋白質定量。蛋白質的定量使用Protein Quantification Kit-Wide range(Dojindo MolecularTechnologies，Inc.)以牛血清清蛋白作為標記物進行定量。
<反應液的調制>
(調制例1堿交換反應后的酶反應液的調制)將卵磷脂(SLP-PI粉末，辻制油生產)和絲氨酸溶解在己烷/丙酮/0.2M乙酸緩沖溶液(pH4.0)以78/14/8(容量比)的比例混合的兩相系統的混合溶劑中，使得卵磷脂∶絲氨酸＝1∶7～1∶10(重量比)，添加PLD(PLD Nagase(Nagase ChemteX公司生產))，在30℃下一邊攪拌一邊反應5小時，生成磷脂酰絲氨酸(PS)。此外，反應的進行由上述的HPLC法確認。
反應結束后，靜置，分離成有機溶劑相和水相兩相，回收含有PS的有機溶劑。以下，將含有該PS的有機溶劑稱為磷脂餾分I。
(調制例2水解反應后的酶反應液的調制-1)將卵磷脂(Ultralec PADM公司生產)以5～25％分散在0.2M乙酸緩沖溶液(pH5.5)中，添加PLD(PLD Nagase(Nagase ChemteX公司生產))，在50℃下一邊攪拌一邊反應16小時，生成磷脂酸(PA)。以下，將含有該PA的水類溶劑稱為磷脂餾分II。此外，反應的進行由上述的HPLC法確認。
(調制例3水解反應后的酶反應液的調制-2)取上述調制例2中得到的磷脂餾分II的一部分，添加該磷脂餾分的2倍容量的庚烷/丙酮＝1∶2(v/v)的混合溶劑，攪拌后，除去水類溶劑，回收含有PA的有機溶劑相。以下，將含有該PA的水類溶劑稱為磷脂餾分III。
(調制例4水解反應后的酶反應液的調制-3)在上述調制例3中得到的磷脂餾分III中，加入0.1M的Tris-HCl(pH8.0，含有40mM CaCl2)作為水類溶劑，添加PLA2(PLA2 Nagase(Nagase ChemteX公司生產))，在30℃下一邊攪拌一邊反應16小時，生成溶血磷脂酸(LPA)。此外，反應的進行由上述的HPLC法確認。反應結束后，靜置，分離水類溶劑，回收含有LPA的有機溶劑相。以下，將含有該LPA的有機溶劑相稱為磷脂餾分IV。
(調制例5水解反應后的酶反應液的調制-4)在上述調制例3中得到的磷脂餾分III中，加入0.1M的Tris-HCl(pH8.0，含有40mM CaCl2)作為水類溶劑，添加脂肪酶(LilipaseA-10(Nagase ChemteX公司生產))，在30℃下一邊攪拌一邊反應16小時，生成LPA。此外，反應的進行由上述的HPLC法確認。反應結束后，靜置，分離水類溶劑，回收含有LPA的有機溶劑相。以下，將含有該LPA的有機溶劑相稱為磷脂餾分V。
(調制例6蛋白酶處理后的酶反應液的調制)在含有生成物PA和酶PLD的磷脂餾分II中，以每1g卵磷脂20U添加蛋白酶(商品名Bioprase conc.(Nagase ChemteX公司生產))，在60℃下攪拌1小時后，回收含有PA的水類溶劑。以下，將含有該PA的水類溶劑稱為磷脂餾分VI。
各磷脂餾分(I～VI)中的殘留PLD活性和殘留PLA2活性為每1g卵磷脂10～60U。以后，使用上述的磷脂餾分I～VI，實施以下的比較例和研究例。
<利用現有方法進行的酶失活的研究>
(比較例1利用加熱處理進行的PLD除去的研究)將上述調制例1中得到的磷脂餾分I在表1記載的溫度下進行15小時加熱處理，測定PLD的殘留活性。其中，PLD的殘留活性利用上述的方法測定。將結果示于表1。
表1

從表1的結果可知，通過15小時的加熱處理，PLD活性下降，但是，活性殘留一半以上。由此可推測，PLD在卵磷脂存在下對熱非常穩定。此外，通過加熱，PS的酸值和過氧化物值上升，生成的PS被熱分解。因此可知，加熱處理不可能是PLD失活的有效手段。
(比較例2利用蛋白酶處理進行的PLD除去的研究-1)將表2記載的各種蛋白酶以每1g卵磷脂20U的比例加入磷脂餾分I中，在60℃下一邊攪拌1小時一邊進行反應，殘留PLD活性利用上述的方法測定。將結果示于表2。
表2

從表2的結果可知，在有機溶劑中進行蛋白酶處理的情況下，PLD的活性幾乎不降低。
(比較例3利用蛋白酶處理進行的PLD除去的研究-2)可以認為，由于上述比較例2的蛋白酶處理在有機溶劑中進行，所以，利用蛋白酶的PLD蛋白質的水解反應沒有進行。因此，取一部分磷脂餾分I，在減壓下除去有機溶劑后，使其分散在水中，再次進行利用蛋白酶的處理(蛋白酶的添加量每1g卵磷脂5U，60℃，1小時)。將結果示于表3。使用的蛋白酶的活性，利用上述的方法測定。
表3

在該條件的蛋白酶處理中，PLD失活大約一半左右，可知不能得到充分的PLD失活效果。
(比較例4利用丙酮處理進行的PLD除去的研究)在磷脂餾分I中添加丙酮，使PLD變性·凝集，過濾后，測定殘留PLD活性。將結果示于表4。
表4

從表4的結果可知，通過丙酮處理，PLD活性稍微降低。增加丙酮的量時，PLD處于降低的趨勢。但是，添加磷脂餾分I的容量的6/10量以上的丙酮時，由于原料卵磷脂沉淀，所以不優選。此外，通常酶本身對丙酮等有機溶劑的耐性低，但從該結果可推測，在卵磷脂的存在下，PLD的溶劑耐性提高。
(比較例5利用NaCl水溶液清洗進行的PLD除去的研究)用NaCl水溶液對磷脂餾分I進行清洗后，測定殘留PLD活性。將NaCl水溶液的濃度和使用量、以及結果示于表5。所謂清洗是指在磷脂餾分I中加入NaCl水溶液后，進行攪拌使得充分混合后，通過離心分離或靜置將水相分離并除去。在以下的研究例中，清洗也是進行同樣的操作。
表5

接著，改變15％(w/v)NaCl水溶液(以下有時簡稱15％NaCl)的pH進行清洗，測定殘留PLD活性。15％NaCl的使用量為磷脂餾分I的1/10(v/v)。將結果示于表6。
表6

進一步，在增加15％NaCl的清洗次數的情況下，測定殘留PLD活性。使用量為磷脂餾分I的1/10(v/v)。將結果示于表7。
表7

從表5～7的結果可知，使用NaCl水溶液進行的清洗，能夠使PLD活性降低至大約一半的量。但是，改變pH或增加清洗次數，未觀察到顯著的PLD除去效果。
(比較例6利用吸附劑進行的PLD除去的研究)在磷脂餾分I中加入吸附劑進行處理后，測定殘留PLD活性。每1ml磷脂餾分I加入0.1g吸附劑，在室溫下接觸1小時，通過過濾除去吸附劑。此外，為了比較，也同時使用磷脂餾分I的1/10(v/v)量的15％(w/v)NaCl實施磷脂餾分I的清洗。將結果示于表8。此外，表8中的NaCl水溶液清洗+硫酸鎂或NaCl水溶液清洗+活性白土，是指在用磷脂餾分I的1/10(v/v)量的15％(w/v)NaCl對磷脂餾分I進行清洗后，使用硫酸鎂或活性白土進行吸附處理。
表8

從表8的結果可知，在吸附劑處理中，沒有觀察到PLD的活性顯著降低，與15％NaCl清洗為相同程度。在活性白土處理中，PLD活性降低至大約25％左右，可認為比NaCl清洗更有效。但是，即使并用NaCl清洗和活性白土處理，也觀察不到PLD的活性進一步降低。
(比較例7利用含水有機溶劑清洗進行的PLD除去的研究)使用表9記載的極性有機溶劑與水的混合溶劑對磷脂餾分I進行清洗后，測定PLD活性。清洗用的混合溶劑量為磷脂餾分I的6/10(v/v)。此外，為了比較，也同時使用磷脂餾分I的1/10(v/v)量的15％(w/v)NaCl實施磷脂餾分I的清洗。將結果示于表9。
表9

使用67％丙酮、67％異丙醇、67％乙醇和67％甲醇進行的處理，比NaCl處理有效果，但沒有觀察到PLD的活性充分降低。
如以上的比較例1～7的結果所示，確認現有的方法非常難以使PLD充分失活。因此，通過以下的研究例，說明為了解決該問題的新的酶活性除去方法。
<新方法的開發>
(研究例1清洗處理的組合)利用表10記載的溶劑的組合對磷脂餾分I進行清洗后，測定殘留PLD活性。清洗用的溶劑量為磷脂餾分I的6/10(v/v)。將結果示于表10。
表10

從表10的結果可知，在使用將15％的NaCl水溶液與極性溶劑等量混合后的溶劑(含有7.5％NaCl的50％丙酮或異丙醇或乙醇或甲醇或甘油)進行清洗時，PLD達到檢出限度以下。與此相對，在NaCl清洗后使用含水丙酮或含水乙醇進行清洗時，PLD活性只不過降低至33％～40％。從該結果可知，使用含有無機金屬鹽的、水與有機溶劑的混合溶劑進行的清洗，對PLD的除去有效。此外，PLD的檢出限度為每1g卵磷脂0.01U。
(研究例2利用NaCl以外的金屬鹽進行的PLD的除去的研究)使用含有NaCl以外的金屬鹽的50％丙酮對磷脂餾分I進行清洗后，測定殘留PLD活性。清洗用的溶劑量為磷脂餾分I的6/10(v/v)。將結果示于表11。
表11

表11的結果顯示，使用Na2SO4、KCl、CaCl2和MgSO4代替NaCl作為無機金屬鹽，與NaCl同樣，也能夠除去PLD。
(研究例3；利用含有無機金屬鹽的含水極性溶劑進行的清洗的最優化)根據上述研究例的結果，對于極性溶劑濃度、無機金屬鹽濃度、和相對于磷脂餾分I的使用量，研究最佳的處理條件。在本研究中，使用丙酮作為極性溶劑，使用NaCl作為無機金屬鹽。將結果示于表12。
表12

※1清洗溶劑/磷脂餾分I的量(v/v)
在表12的結果中，隨著清洗使用的混合溶劑的量增加，殘留PLD活性降低。此外，在使用磷脂餾分I的容量的6/10(v/v)量的混合溶劑進行清洗時，NaCl濃度越高，殘留酶的除去效率越好，在鹽濃度相同的情況下，丙酮濃度高的，殘留酶的除去效率好。
(研究例4殘留蛋白質的確認)利用其容量的6/10(v/v)量的混合溶劑、即含有7.5％NaCl的50％丙酮對磷脂餾分I進行1～3次反復清洗后，測定磷脂餾分I中的殘留蛋白質量。其中，蛋白質的定量使用上述記載的方法進行。將結果示于表13。
表13

如表13所示，可以確認，通過反復實施1～3次的利用含有無機金屬鹽的含水有機溶劑進行的清洗，蛋白質達到檢出限度以下。這意味著，不僅防止由殘留酶引起的磷脂變性，而且對減少變態反應性也是有用的。
如以上的研究例1～4的結果，新開發的利用含有無機金屬鹽的含水極性溶劑進行的清洗方法，能夠有效地除去殘留PLD活性，能夠使蛋白質降低至檢出限度以下，所以，確認對殘留PLD活性的除去和精制是有效的方法。
<對水解反應和其它酶的應用>
(研究例5來自水解反應酶液的殘留酶活性除去的研究)磷脂餾分II和III中含有生成物PA和酶PLD。磷脂餾分IV中含有生成物LPA與酶PLD和PLA2。磷脂餾分V中含有生成物PA與酶PLD和脂肪酶。磷脂餾分VI中含有生成物PA與PLD和蛋白酶。因此，對從這些磷脂的水解物精制生成物的方法、即除去生成物中殘留的酶的方法進行研究。為了參考，也使用由堿交換反應得到的磷脂餾分I。
添加磷脂餾分I和III～V的6/10(V/V)量的含有15w/v％NaCl的50％丙酮，與上述研究例3同樣地進行清洗處理。此外，磷脂餾分II和VI，由于是含有PA的水類溶劑，所以，分別添加磷脂餾分的容量的7.5％(w/v)NaCl與2倍量(v/v)的丙酮和等量(v/v)的庚烷并攪拌，進行與研究例3同樣的處理，同時進行PA的提取和清洗。此外，PLD、PLA2、脂肪酶、和蛋白酶的各殘留活性，利用上述的方法測定。將結果示于表14。
表14

表14的結果顯示，所有的酶在所有反應形式(堿交換反應或水解反應)和所有的反應體系(使用有機溶劑的反應或水類反應)中，通過含有NaCl的含水丙酮的清洗處理，達到檢出限度以下。此外，使用的酶的檢出限度，每1g卵磷脂，PLD為0.01U、PLA2為20.1U、脂肪酶為1U、蛋白酶為1U。由此可知，來自由磷脂的水解反應得到的酶反應液的殘留酶活性的除去或為了使這些酶失活而添加有蛋白酶的酶反應液，與堿交換酶反應液同樣能夠使用本發明的方法。特別地，對于磷脂餾分II和IV，PLD為檢出限度以下，所以，表示能夠同時進行從水溶液的提取和清洗，此外顯示，分別添加構成清洗用混合溶劑的物質后進行混合也是有效的。這表明，在酶反應液中含有構成清晰用混合溶劑的有機溶劑、水或無機金屬鹽時，將它們作為清洗溶劑組分，添加需要量的有機溶劑、水和無機金屬鹽的不足部分并攪拌，進行與研究例3同樣的處理，由此能夠除去以PLD為首的磷脂的堿交換反應或水解反應中使用的酶或者除去用于使這些酶失活的酶的活性。
根據以上的研究結果，本發明的方法，與酶的種類無關，都可以利用。此外，本發明的方法能夠應用于堿交換反應和水解反應，反應體系不論是含有有機溶劑的體系還是不含有機溶劑的體系(水類)，都能夠應用。本發明的方法，由于能夠從上述各種反應體系中除去含有酶的蛋白質等的雜質，所以，作為酶的除去方法和磷脂的精制方法，可認為是通用性高的方法。
產業上的可利用性根據本發明，在使用酶的磷脂的堿交換反應或水解反應中，可以不使用加熱等方法而簡單地除去酶反應液和反應生成物中含有的酶和蛋白質。因此，可容易地制造引起變態反應的可能性降低、維持為高品質、并且保存穩定性優異的各種磷脂。這樣的高品質的磷脂可以用于以食品用途為首的各種產業領域。
權利要求
1.一種從磷脂的水解反應或堿交換反應中使用的酶反應液中除去酶的方法，其特征在于，包括利用含有無機金屬鹽的、水和有機溶劑的混合溶劑對該酶反應液進行處理，將該酶除去的工序。
2.一種磷脂的堿交換方法，其特征在于，包括使磷脂與選自醇類、糖類和含有羥基的環狀化合物中的具有醇式羥基的化合物，在能夠將磷脂中的堿轉移到該化合物中的酶的存在下發生反應，得到酶反應液的工序；和利用含有無機金屬鹽的、水和有機溶劑的混合溶劑對該酶反應液進行處理，將該酶除去的工序。
3.一種磷脂的水解方法，其特征在于，包括在水的存在下，使磷脂與能夠將磷脂水解的酶進行反應，得到酶反應液的工序；和利用含有無機金屬鹽的、水和有機溶劑的混合溶劑對該酶反應液進行處理，將該酶除去的工序。
4.如權利要求1～3中任一項所述的方法，其特征在于所述無機金屬鹽是選自氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、氯化鈣、和硫酸鎂中的至少一種金屬鹽。
5.如權利要求1～4中任一項所述的方法，其特征在于所述有機溶劑是極性溶劑。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于所述極性有機溶劑是選自丙酮、乙醇、甲醇、異丙醇、和甘油中的至少一種溶劑。
7.如權利要求1～6中任一項所述的方法，其特征在于所述混合溶劑含有30～70容量％的水和70～30容量％的有機溶劑，該混合溶劑中含有5～25質量/容量％的無機金屬鹽。
全文摘要
本發明提供一種從磷脂的水解反應或堿交換反應中使用的酶反應液中除去酶的方法。本發明的方法包括利用含有無機金屬鹽的、水和有機溶劑的混合溶劑對該酶反應液進行處理，將該酶除去的工序。根據本發明，可以不使用加熱等方法而簡單地除去反應生成物中含有的酶，所以，可容易地制造引起變態反應的可能性降低、維持為高品質、并且保存穩定性優異的各種磷脂。
文檔編號C12N9/16GK1934263SQ20058000853
公開日2007年3月21日 申請日期2005年3月18日 優先權日2004年3月18日
發明者劉曉麗, 谷脅成幸 申請人:長瀨化成株式會社