使用腸細菌科菌株制備l－氨基酸的方法

專利名稱：使用腸細菌科菌株制備l－氨基酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種使用腸細菌科(Enterobacteriaceae)的重組微生物制備L-氨基酸、特別是L-蘇氨酸的方法，其中yibD所示開放讀框(ORF)是增強的、特別是過表達的，本發明還涉及所述微生物。
背景技術：
L-氨基酸，特別是L-蘇氨酸用于人類藥品及制藥工業，用于食品業，特別用于動物營養。
已知L-氨基酸是通過發酵腸細菌菌株，尤其大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)和粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)而生產的。由于L-氨基酸的極其重要性，已持續進行改良生產方法的嘗試。方法的改良可涉及有關發酵技術的措施，如攪拌和供氧，或營養培養基的組分，如發酵期間的糖濃度，或產物形式的加工方法，例如通過離子交換層析，或微生物本身的固有生產性質。
為改良這些微生物的生產性質，可使用誘變、選擇及突變體選擇等方法以獲得對抗代謝物例如蘇氨酸類似物α-氨基-β-羥基戊酸(AHV)有抗性的菌株，或者對于調節重要性代謝物是營養缺陷的、及產生L-氨基酸例如L-蘇氨酸的菌株。
一段時間以來，重組DNA技術的方法也已經用于生產L-氨基酸的腸細菌科菌株的改良，通過擴增各個氨基酸生物合成基因并研究對生產的作用而進行。關于大腸桿菌和沙門氏菌的細胞和分子生物學的綜述見于Neidhardt(ed)Escherichia coli and Salmonella，Cellular and Molecular Biology，2nd Edition，ASM Press，Washington，D.C.，USA(1996)。
發明目的本發明人提供了改良通過發酵制備L-氨基酸、特別是L-蘇氨酸的新方法。
發明概述本發明提供了腸細菌科的重組微生物，其含有增強的或過表達的、編碼稱作推定的糖基轉移酶的多肽的yibD開放讀框或者編碼其基因產物的核苷酸序列，且所述微生物以改良的方式生產L-氨基酸，特別是L-蘇氨酸。
在所有情況中，對于yibD ORF未重組的及含有未增強的yibDORF的微生物作為對比的出發點。
這些微生物特別包括腸細菌科的微生物，其中編碼一種多肽的多核苷酸是增強的，所述多肽的氨基酸序列與選自包括SEQ ID No4和SEQ ID No6的組中的氨基酸序列至少90％、特別是至少95％、優選至少98％或者至少99％、特別優選99.7％、非常特別優選100％相同。
優選與SEQ ID No4或SEQ ID No6的序列相同的氨基酸序列。
所述微生物含有增強的或過表達的選自如下的多核苷酸a)具有SEQ ID No3或SEQ ID No5所示核苷酸序列的多核苷酸；b)具有在遺傳密碼簡并范圍內相應于SEQ ID No3或SEQ IDNo5的核苷酸序列的多核苷酸；
c)具有在嚴格條件下與互補于SEQ ID No3或SEQ ID No5的序列雜交的序列的多核苷酸序列；d)具有含有中性有義突變的SEQ ID No3或SEQ ID No5序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼推定的糖基轉移酶。
本發明還提供了一種使用腸細菌科的重組微生物制備L-氨基酸，特別是L-蘇氨酸的發酵方法，所述微生物特別已經生產L-氨基酸并且其中至少稱作yibD的開放讀框(ORF)或者編碼其基因產物的核苷酸序列是增強的。
優選應用所述的微生物。
當下文提及術語“L-氨基酸”或“氨基酸”是指選自如下的一或多種氨基酸，包括其鹽L-天冬酰胺、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-高絲氨酸。特別優選L-蘇氨酸。
文中術語“增強”描述了微生物中由適當的DNA編碼的一或多種酶或蛋白質的胞內活性或濃度的增加，例如通過使基因或ORF的拷貝數增加至少1個拷貝、將強啟動子與所述基因功能性連接，或者使用編碼具有高活性的適當的酶/蛋白質的基因、等位基因或ORF進行，任選組合這些措施。
開放讀框(ORF)是指編碼或者可以編碼根據現有技術不能確定其功能的蛋白質/多肽或者核糖核酸的核苷酸序列的節段(segment)。在確定所研究的核苷酸序列節段的功能后，其通常被稱作基因。等位基因一般是指給定基因的另一種形式。通過核苷酸序列中的差異區別這些形式。
由核苷酸序列即ORF、基因或等位基因編碼的蛋白質或者編碼的核糖核酸一般稱作基因產物。
通過增強措施，特別是過表達，基于野生型蛋白質或者所述適當酶或蛋白質未重組的微生物或親代菌株中所述蛋白質的活性或濃度，適當蛋白質的活性或濃度一般增加至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，直至最大1000％或2000％。未重組的微生物或親代菌株是指對其進行本發明的措施的微生物。
本發明提供了通過發酵腸細菌科的重組微生物制備L-氨基酸的方法，其中a)將產生所需L-氨基酸的微生物在所需L-氨基酸被富集在培養基或者細胞中的條件下在培養基中培養，其中yibD開放讀框或編碼基因產物的核苷酸序列或者等位基因是增強的、或者特別是過表達的及b)分離所需L-氨基酸，發酵肉湯的成分和/或生物量的全部或部分(≥0-100％)，任選被保留在分離的產物中或者被完全除去。
本發明還提供了具有增強或者過表達的稱作yibD的開放讀框(ORF)的微生物，特別是重組微生物，其可以從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜，任選淀粉或任選纖維素或者從甘油和乙醇中生產L-氨基酸。所述微生物是選自埃希氏菌(Escherichia)屬歐文氏菌屬(Erwinia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)和沙雷氏菌屬的腸細菌科代表性菌株。優選埃希氏菌屬和沙雷氏菌屬。在埃希氏菌屬和沙雷氏菌屬中可以提及的分別是大腸桿菌菌種及粘質沙雷氏菌菌種。
重組微生物一般是通過轉化、轉導或接合，或者組合這些方法，使用含有所需的ORF、所需的基因、這種ORF或基因或其一部分的等位基因和/或其增強該ORF或基因表達的啟動子而產生。這種啟動子可以是通過增強所述基因或ORF上游的固有調節序列突變的啟動子，或者是已與該基因或ORF融合的有效啟動子。
埃希氏菌屬、特別是大腸桿菌菌種的合適菌株、特別是生產L-蘇氨酸的菌株的例子是-大腸桿菌H4581(EP 0 301 572)-大腸桿菌KY10935(Bioscience，Biotechnology andBiochemistry 61(11)1877-1882(1997)-大腸桿菌VNIIgenetika MG442(US-A-4278,765)-大腸桿菌VNIIgenetika M1(US-A-4,321,325)-大腸桿菌VNIIgenetika 472T23(US-A-5,631,157)-大腸桿菌BKIIM B-3996(US-A-5,175,107)-大腸桿菌kat 13(WO 98/04715)-大腸桿菌KCCM-10132(WO 00/09660)。
沙雷氏菌屬、特別是粘質沙雷氏菌菌種的生產L-蘇氨酸的合適菌株的例子是-粘質沙雷氏菌HNr21(Applied and Environmental Microbiology38(6)1045-1051(1979))-粘質沙雷氏菌TLr156(Gene 57(2-3)151-158(1987))-粘質沙雷氏菌T-2000(Applied Biochemistry and Biotechnology37(3)255-265(1992))腸細菌科生產L-蘇氨酸的菌株優選具有選自如下的一或多種遺傳或表型特征α-氨基-β-羥戊酸抗性，硫賴氨酸(thialysine)抗性，乙硫氨酸抗性，α-甲基絲氨酸抗性，二氨基琥珀酸抗性，α-氨基丁酸抗性，疏螺旋體素抗性，環戊烷羧酸抗性，利福平抗性，纈氨酸類似物例如纈氨酸氧肟酸抗性，嘌呤類似物例如6-二甲基氨基嘌呤抗性，需要L-甲硫氨酸，任選部分及可補償地需要L-異亮氨酸，需要內消旋-二氨基庚二酸，含有蘇氨酸的二肽營養缺陷，L-蘇氨酸抗性，蘇氨酸萃余物抗性，L-高絲氨酸抗性，L-賴氨酸抗性，L-甲硫氨酸抗性，L-谷氨酸抗性，L-天冬氨酸抗性，L-亮氨酸抗性，L-苯丙氨酸抗性，L-絲氨酸抗性，L-半胱氨酸抗性，L-纈氨酸抗性，氟丙酮酸敏感性，缺陷的蘇氨酸脫氫酶，任選蔗糖利用能力，蘇氨酸操縱子的增強，高絲氨酸脫氫酶I-天冬氨酸激酶I的增強，優選反饋抗性形式，高絲氨酸激酶的增強，蘇氨酸合酶的增強，天冬氨酸激酶的增強，任選反饋抗性形式，天冬氨酸半醛脫氫酶的增強，磷酸烯醇丙酮酸羧酶的增強，任選反饋抗性形式，磷酸烯醇丙酮酸合酶的增強，轉氫酶的增強，RhtB基因產物的增強，RhtC基因產物的增強，YfiK基因產物的增強，丙酮酸羧化酶的增強，及乙酸形成的弱化。
已經發現在yibD基因或開放讀框(ORF)或其等位基因過表達后，腸細菌科的微生物改良生產L-氨基酸，特別是L-蘇氨酸。
大腸桿菌該基因或開放讀框(ORF)的核苷酸序列屬于現有技術范疇，也可取自Blattner等公布的大腸桿菌基因組序列(Science 2771453-1462(1997))。己知N末端氨基酸甲硫氨酸可以通過宿主特異性酶(甲硫氨酸氨基肽酶)而裂解掉。
同樣從也屬于腸細菌科的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)中已知yibD ORF的核苷酸序列。
大腸桿菌K12的yibD ORF通過如下數據描述名稱開放讀框功能推定的糖基轉移酶描述yibD開放讀框編碼40.5kDa蛋白質；等電點為9.4；yibDORF位于染色體上，例如在大腸桿菌K12 MG1655的情況中位于編碼假想蛋白的yibQ開放讀框與編碼蘇氨酸脫氫酶的tdh基因的基因間區域。
參考文獻Blattner et al.，Science 277(5331)，1453-1474(1997)
登錄號AE000439另一種基因名稱b3615核苷酸序列可取自國立醫學圖書館(National Library ofMedicine)的國家生物技術信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI))))(Bethesda，MD，USA)的數據庫；歐洲分子生物學實驗室的核苷酸序列數據庫(EMBL，Heidelberg，Germany或Cambridge，UK)或者日本的DNA數據庫(DDBJ，Mishima，Japan)。
為了更加清楚，大腸桿菌yibD ORF的已知序列示于SEQ IDNo3，鼠傷寒沙門氏菌的yibD ORF的已知序列示于SEQ ID No5。由這些讀框編碼的蛋白質示于SEQ ID No4和SEQ ID No6。
根據本發明可以使用所引用的參考文獻中描述的開放讀框。也可以使用得自遺傳密碼的簡并性或者中性有義突變的基因或者開放讀框的等位基因。優選使用內源基因或者內源開放讀框。
術語“內源基因”或者“內源核苷酸序列”是指一個物種群中存在的基因、開放讀框或等位基因或核苷酸序列。
含有中性有義突變的yibD ORF的等位基因包括導致其編碼的蛋白質中有至多40個、至多30個、或者至多20個、優選至多10或至多5個、特別優選至多3個、或者至多2個或者至少1個保守氨基酸置換。
在芳香族氨基酸的情況中，保守置換是指苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸的彼此互換。在疏水性氨基酸的情況中，保守置換是指亮氨酸，異亮氨酸和纈氨酸的彼此互換。在極性氨基酸的情況中，保守置換是指谷氨酰胺和天冬酰胺的彼此互換。在堿性氨基酸的情況中，保守置換是指精氨酸，賴氨酸和組氨酸的彼此互換。在酸性氨基酸的情況中，保守置換是指天冬氨酸和谷氨酸的彼此互換。在含有羥基的氨基酸的情況中，保守置換是指絲氨酸和蘇氨酸的彼此互換。
同樣，可以使用編碼所述蛋白質變體的核苷酸序列，其另外在N或C末端延長或縮短至少1個氨基酸。這種延長或縮短不超過50，40，30，20，10，5，3或2個氨基酸或者氨基酸殘基。
合適的等位基因還包括編碼其中插入或缺失至少一個氨基酸的的蛋白質的那些基因。這種稱作indels的改變的最大數目可涉及2，3，5，10或20個氨基酸，但不超過30個氨基酸。
合適的等位基因還包括通過雜交，特別是在嚴格條件下，使用SEQ ID No3或SEQ ID No5或其一部分，特別是編碼區或與其互補的序列可獲得的那些基因。
通過雜交鑒別DNA序列的指導可見于Boehringer MannheimGmbH(Mannheim，Germany，1993)的“The DIG System User’sGuide for Filter Hybridization”及Liebl等(International Journal ofSystematic Bacteriology 41255-260(1991))所述。雜交在嚴格條件下發生，也就是說只有其中探針和靶序列(即用探針處理的多核苷酸)是至少80％相同的雜交體形成。已知雜交的嚴格性，包括洗滌步驟，可通過改變緩沖液成分、溫度和鹽濃度而影響或決定。雜交反應通常在與洗滌步驟相比相對低的嚴格條件下進行(HybaidHybridisation Guide，Hybaid Limited，Teddington，UK，1996)。
可以在大約50℃-68℃的溫度應用相應于5×SSC緩沖液的緩沖液進行雜交反應。探針也可以和與其序列低于80％相同的多核苷酸雜交。這種雜交體不太穩定，在嚴格條件下通過洗滌除去。這可以例如通過如下而實現使鹽濃度降低至2×SSC及任選隨后為0.5×SSC(The DIG System User′s Guide for Filter Hybridisation，Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany，1995)，溫度設為大約50℃-68℃，大約52℃-68℃，大約54℃-68℃，大約56℃-68℃，大約58℃-68℃，大約60℃-68℃，大約62℃-68℃，大約64℃-68℃，或大約66℃-68℃。優選大約64℃-68℃或者大約66℃-68℃的溫度范圍。任選可以使鹽濃度降低至相應于0.2×SSC或0.1×SSC的值。通過使雜交溫度從50℃逐步(每步大約1-2℃)升高至68℃，可以分離與所應用的探針的序列或者與SEQ ID No3或SEQID No5所示核苷酸序列例如至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％相同的多核苷酸片段。關于雜交的進一步指導可以試劑盒形式商購(例如DIG Easy Hyb，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，Catalogue No.1603558)。
例如可以通過增加基因、開放讀框或等位基因的表達或者增強蛋白質的催化性質而實現增強。可任選組合這兩種措施。
過表達可以例如通過增加適當基因或開放讀框的拷貝數或者突變結構基因上游的啟動子和調節區或者核糖體接合位點而實現。摻入結構基因上游的表達盒以同樣方式發揮作用。誘導型啟動子另外可以在經發酵生產L-蘇氨酸期間增加表達；使用用于基因表達的啟動子可以造成另外的暫時基因表達，這也是有利的。延長mRNA壽命的措施也改良表達。另外，酶活性也通過防止酶蛋白的降解而增強。所述ORF、基因或基因構建體可以存在于不同拷貝數目的質粒中，或者可以整合進染色體中并擴增。或者，所述基因的過表達也可以通過改變培養基的成分和培養技術而實現。
過表達的方法在現有技術領域中充分描述，例如由Makrides etal.(Microbiological Reviews 60(3)，512-538(1996))所描述。使用載體增加拷貝數至少1個。質粒例如US 5,538,873所述那些質粒可以用作載體。噬菌體，例如EP 0332448所述的噬菌體mu或者噬菌體lambda(λ)也可以用作載體。拷貝數的增加也可以通過在染色體的另外位點摻入另外的拷貝而實現，例如摻入噬菌體λ的att位點中(Yuand Court，Gene 223，77-81(1998))。US 5,939,307描述了通過摻入表達盒或者啟動子，例如將tac啟動子、trp啟動子、lpp啟動子或者噬菌體λ的PL啟動子和PR-啟動子摻入例如染色體蘇氨酸操縱子的上游來增加表達。噬菌體T7的啟動子，gearbox啟動子或者nar啟動子可以同樣方式使用。這種表達盒或啟動子也可以用于過表達質粒結合的基因，如EP 0 593 792所述。通過使用lacIQ等位基因也可對質粒結合的基因的表達加以控制(Glascock and Weickert，Gene 223，221-231(1998))。另外，啟動子的活性可以通過插入和/或缺失而置換一或多個核苷酸，從而修飾其序列而增加。另外的暫時基因表達可以例如Walker et al.(Journal of Bacteriology 1811269-80(1999))所述，通過使用生長期依賴性fis啟動子而實現。
本領域技術人員可在一下文獻中發現相關的全面指導Changand Cohen(Journal of Bacteriology 1341141-1156(1978))，Hartleyand Gregori(Gene 13347-353(1981))，Amann and Brosius(Gene 40183-190(1985))，de Broer et al.(Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America 8021-25(1983))，LaVallieet al.(BIO/TECHNOLOGY 11187-193(1993))，PCT/US97/13359，Llosa et al.(Plasmid 26222-224(1991))，Quandt and Klipp(Gene 80161-169(1989))，Hamilton et al.(Journal of Bacteriology 1714617-4622(1989))，Jensen and Hammer(Biotechnology and Bioengineering58191-195(1998))和已知的遺傳學和分子生物學教科書。
可以使用在腸細菌中可復制的質粒載體，例如衍生自pACYC184(Bartoloméet al.；Gene 10275-78(1991))，pTrc99A(Amann et al.；Gene 69301-315(1988))的克隆載體或者pSC101衍生物(Vocke and Bastia；Proceedings of the National Academy ofSciences USA 80(21)6557-6561(1983))。在本發明的方法中可以使用用質粒載體轉化的菌株，所述質粒載體攜帶編碼yibD ORF或其基因產物或等位基因的至少一個核苷酸序列。
術語“轉化”是指分離的核酸被宿主(微生物)攝取。
也可以通過序列置換(Hamilton et al.；Journal of Bacteriology1714617-4622(1989))、接合或轉導，將影響適當基因或開放讀框表達的突變轉移至不同菌株中。
關于遺傳學和分子生物學概念的更詳細的解釋見于熟知的遺傳學和分子生物學教科書，例如Birge(Bacterial and BacteriophageGenetics，4th ed.，Springer Verlag，New York(USA)，2000)或者Berg，Tymoczko and Stryer(Biochemistry，5th ed.，Freeman andCompany，New York(USA)，2002)或者Sambrook et al.(MolecularCloning，A Laboratory Manual，(3 volume set)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor(USA)，2001)。
另外，對于使用腸細菌科的菌株生產L-氨基酸，特別是L-蘇氨酸，有益的是不但增強yibD開放讀框，而且增強已知蘇氨酸生物合成途徑的一或多種酶或者添補代謝的酶或者生產還原的煙堿腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶或者糖酵解酶或者PTS酶或者硫代謝的酶。一般優選使用內源基因。
因此，例如可以同時增強或者特別是過表達選自如下的一或多個基因●編碼天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶的thrABC操縱子的至少一個基因(US-A-4,278,765)，●谷氨酸棒桿菌的pyc基因，其編碼丙酮酸羧化酶(WO 99/18228)，●pps基因，其編碼磷酸烯醇丙酮酸合酶(Molecular and GeneralGenetics 231(2)332-336(1992))，●ppc基因，其編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(WO 02/064808)，●pntA和pntB基因，其編碼轉氫酶的亞基(European Journal ofBiochemistry 158647-653(1986))，●rhtB基因，其編碼賦予高絲氨酸抗性的蛋白質(EP-A-0 994 190)，●rhtC基因，其編碼賦予蘇氨酸抗性的蛋白質(EP-A-1 013 765)，
●谷氨酸棒桿菌的thrE基因，其編碼蘇氨酸輸出載體蛋白(WO01/92545)，●gdhA基因，其編碼谷氨酸脫氫酶(Nucleic Acids Research 115257-5266(1983)；Gene 23199-209(1983))，●pgm基因，其編碼葡糖磷酸變位酶(WO 03/004598)，●fba基因，其編碼果糖二磷酸醛縮酶(WO 03/004664)，●ptsHIcrr操縱子的ptsH基因，其編碼磷酸轉移酶系統PTS的磷酸組氨酸蛋白己糖磷酸轉移酶(WO 03/004674)，●ptsHIcrr操縱子的ptsI基因，其編碼磷酸轉移酶系統PTS的酶I(WO03/004674)，●ptsHIcrr操縱子的crr基因，其編碼磷酸轉移酶系統PTS的葡萄糖特異性IIA成分(WO 03/004674)，●ptsG基因，其編碼葡萄糖特異性IIBC成分(WO 03/004670)，●lrp基因，其編碼亮氨酸調節子的調節物(WO 03/004665)，●fadR基因，其編碼fad調節子的調節物(WO 03/038106)，●iclR基因，其編碼主要中間代謝(central intermediarymetabolism)的調節物(WO 03/038106)，●ahpCF操縱子的ahpC基因，其編碼烷基過氧化氫還原酶的小亞基(WO 03/004663)，●ahpCF操縱子的ahpF基因，其編碼烷基過氧化氫還原酶的大亞基(WO 03/004663)，●cysK基因，其編碼半胱氨酸合酶A(WO 03/006666)，●cysB基因，其編碼cys調節子的調節物(WO 03/006666)，●cysJIH操縱子的cysJ基因，其編碼NADPH亞硫酸還原酶的黃素蛋白(WO 03/006666)，●cysJIH操縱子的cysI基因，其編碼NADPH亞硫酸還原酶的血蛋白(WO 03/006666)，
●cysJIH操縱子的cysH基因，其編碼腺苷酰硫酸還原酶(WO03/006666)，●rseABC操縱子的rseA基因，其編碼具有抗sigmaE活性的膜蛋白(WO 03/008612)，●rseABC操縱子的rseC基因，其編碼sigmaE因子的全局調節物(global regulator)(WO 03/008612)，●sucABCD操縱子的sucA基因，其編碼2-酮戊二酸脫氫酶的脫羧酶亞基(WO 03/008614)，●sucABCD操縱子的sucB基因，其編碼2-酮戊二酸脫氫酶的二氫硫辛酸轉琥珀酸酶(dihydrolipoyl transsuccinase)E2亞基(WO03/008614)，●sucABCD操縱子的sucC基因，其編碼琥珀酰-CoA合成酶的β-亞基(WO 03/008615)，●sucABCD操縱子的sucD基因，其編碼琥珀酰-CoA合成酶的α-亞基(WO 03/008615)，●aceE基因，其編碼丙酮酸脫氫酶復合物的El成分(WO03/076635)，●aceF基因，其編碼丙酮酸脫氫酶復合物的E2成分(WO03/076635)，●rseB基因，其編碼sigmaE因子活性的調節物(MolecularMicrobiology 24(2)355-371(1997))，●大腸桿菌的開放讀框(ORF)yodA的基因產物(Accession NumberAE000288，國家生物技術信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)，DE10361192.4)，●大腸桿菌的開放讀框(ORF)yaaU的基因產物(Accession NumberAE005181，國家生物技術信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)，DE10361268.8)，
●malT基因，其編碼麥芽糖調節子的陽性轉錄激活物(Gene 42201-208(1986)，及●eno基因，其編碼烯醇化酶(The Journal of Biological Chemistry246(22)，6797-6802(1971))。
對于L-氨基酸、特別是L-蘇氨酸的生產，有益的是不但增強yibD開放讀框，而且弱化、特別是消除選自如下的一或多個基因或降低其表達●tdh基因，其編碼蘇氨酸脫氫酶(Journal of Bacteriology 1694716-4721(1987))，●mdh基因，其編碼蘋果酸脫氫酶(E.C.1.1.1.37)(Archives inMicrobiology 14936-42(1987))，●大腸桿菌的開放讀框(orf)yjfA的基因產物(Accession NumberAAC77180，國家生物技術信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)，WO 02/29080))，●大腸桿菌的開放讀框(orf)ytfP的基因產物(Accession NumberAAC77179，國家生物技術信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)，WO 02/29080))，●pckA基因，其編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(carboxykinase)(WO02/29080)，●poxB基因，其編碼丙酮酸氧化酶(WO 02/36797)，●dgsA基因，其編碼磷酸轉移酶系統的DgsA調節物(WO02/081721)，也稱作mlc基因，●fruR基因，其編碼果糖阻抑物(WO 02/081698)，也稱作cra基因，●rpoS基因，其編碼sigma38因子(WO 01/05939)，也稱作katF基因，及●aspA基因，其編碼天冬氨酸銨裂合酶(WO 03/008603)。
文中術語“弱化”是指降低或消除(switching-off)微生物中由適當的DNA編碼的一或多種酶/蛋白質的胞內活性或濃度，例如通過使用比在適當酶/蛋白質未重組的微生物或親代菌株中弱的啟動子、或者編碼具有低活性的適當酶/蛋白質的基因或等位基因、或者使適當的酶/蛋白質、開放讀框或者基因失活及任選組合這些措施進行。
弱化措施通常降低適當蛋白質的活性或濃度至野生型蛋白質或者適當酶/蛋白質未重組的微生物或親代菌株中所述蛋白質的活性或濃度的0-75％，0-50％，0-25％，0-10％或者0-5％。未重組的微生物或親代菌株是指對其進行本發明措施的微生物。
弱化例如可以通過降低或消除基因或開放讀框的表達或者酶蛋白的催化性質而實現。可任選組合這兩種措施。
可通過合適的培養技術，通過遺傳修飾(突變)基因表達的信號結構或者也可以通過反義RNA技術降低基因表達。基因表達的信號結構是例如阻抑物基因、激活物基因、操縱基因(operator)、啟動子、弱化子、核糖體結合位點、起始密碼子和終止子。本領域技術人員例如可從以下文獻中發現相關信息Jensen and Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58191-195(1998))，Carrier andKeasling(Biotechnology Progress 1558-64(1999))，Franch andGerdes(Current Opinion in Microbiology 3159-164(2000))及已知的遺傳學和分子生物學教科書，例如Knippers(″Molekulare Genetik″，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)或者Winnacker(From Genes to Clones，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)的教科書。
本領域已知導致酶蛋白催化性質修飾或降低的突變。可提及的例子是Qiu and Goodman(Journal of Biological Chemistry 2728611-8617(1997))，Yano et al.(Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 955511-5515(1998))和Wenteand Schachmann(Journal of Biological Chemistry 26620833-20839(1991))的文章。概括描述可見于已知的遺傳學和分子生物學教科書，例如Hagemann(″Allgemeine Genetik″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)的教科書。
可能的突變是轉換、顛換、插入和缺失至少1個堿基對/核苷酸。根據突變所致氨基酸置換對酶活性的作用，使用術語“錯義突變”或“無義突變”。錯義突變導致蛋白質中給定的氨基酸置換為另一個氨基酸，所述氨基酸置換特別是非保守的。這損害了蛋白質的功能性或活性，將其降低至0-75％，0-50％，0-25％，0-10％或者0-5％。無義突變在基因的編碼區中導致終止密碼子并因此導致翻譯過早終止。在基因中插入或缺失至少一個堿基對導致移碼突變，這樣導致摻入不正確的氨基酸或者翻譯過早終止。如果終止密碼子由于突變的結果在編碼區內形成，這樣也導致翻譯的過早終止。至少一或多個密碼子的缺失典型地也導致酶活性的完全喪失。
關于產生這種突變的指導為本領域所己知，可見于已知的遺傳學和分子生物學教科書，例如Knippers(″Molekulare Genetik″，6thedition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)；Winnacker(From Genes to Clones，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或者Hagemann(″Allgemeine Genetik″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
基因中合適的突變可以通過基因或等位基因置換而摻入合適的菌株中。
常用的方法是借助于條件性復制pSC 101衍生物pMAK705的基因置換，如Hamilton等所述(Journal of Bacteriology 171，4617-4622(1989))。也可以同樣使用本領域描述的其它方法，例如Martinez-Morales等(Journal of Bacteriology 181，7143-7148(1999))或Boyd等(Journal of Bacteriology 182，842-847(2000))。
也可以通過接合或者轉導將特定基因中的突變或者影響特定基因或開放讀框表達的突變移至不同菌株中。
不但增強yibD開放讀框而且消除非所需的副反應對于L-氨基酸、特別是L-蘇氨酸的生產是有益的(Nakayama″Breeding of AminoAcid Producing Microorganisms″，inOverproduction of MicrobialProducts，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds.)，Academic Press，London，UK，1982)。
根據本發明產生的微生物可通過分批法，補料分批法或重復補料分批法或者連續方法(DE102004028859.3或者US5,763,230)培養。已知的培養方法見Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einführung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或者Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))的教科書中所述。
所用培養基必須以適當地符合特定菌株的要求。關于不同微生物的培養基的闡述見于美國細菌學會的“Manual of Methods forGeneral Bacteriology”(Washington D.C.，USA，1981)。
可使用的碳源是糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和任選纖維素，油和脂肪，如大豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸，如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇，如甘油和乙醇，及有機酸如乙酸。這些物質可單獨或混合使用。
可使用的氮源是有機氮化合物，如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽汁，玉米浸液(corn steep liquor)，大豆粉和尿素，或無機化合物，如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨或混合使用。
可使用的磷源是磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應鈉鹽。培養基另外還必須含有為生長所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質之外，可使用生長必需物質如氨基酸和維生素。此外，可將適當前體加入培養基中。可以一次向培養基中添加所有所述補料物質或在培養期間適當補加。
發酵通常在pH5.5-9.0進行，特別是在pH6.0-8.0進行。可以適當使用堿性化合物如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸控制培養物的pH值。抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫產生。加入適當的選擇性作用物質例如抗生素至培養基中可保持質粒的穩定性。將氧氣或含氧混合氣，例如空氣充入培養物中以保持有氧條件。培養溫度通常在25℃～45℃，優選30℃-40℃。持續培養直至L-氨基酸或L-蘇氨酸的形成達到最大量。此目的通常在10～160小時范圍內達到。
L-氨基酸可以通過陰離子交換層析隨后茚三酮衍生化作用進行分析，如Spackman等(Analytical Chemistry，30，1190-1206，(1958))所述，或者可以通過反相HPLC進行，如Lindroth等(AnalyticalChemistry 511167-1174(1979))所述。
本發明的方法用于經發酵生產L-氨基酸，例如L-蘇氨酸，L-異亮氨酸，L-纈氨酸，L-甲硫氨酸，L-高絲氨酸，L-色氨酸和L-賴氨酸，特別是L-蘇氨酸。
如下微生物根據布達佩斯條約保藏在德國微生物保藏中心(DSMZ，Braunswick，Germany)●大腸桿菌菌株E.coli MG442，保藏號DSM 16574。
本發明借助于如下實施例得以更詳細地說明。
用于大腸桿菌的基本培養基(M9)和完全培養基(LB)由J.H.Miller(A Short Course in Bacterial Genetics(1992)，Cold Spring HarborLaboratory Press)描述。從大腸桿菌中分離質粒DNA及所有限制、連接、Klenow處理和堿性磷酸酶處理技術均根據Sambrook等(Molecular Cloning-A Laboratory Manual(1989)，Cold Spring HarborLaboratory Press)所述方法進行。除非特別說明，則大腸桿菌的轉化通過Chung等(Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 862172-2175(1989))所述方法進行。
菌株制備和轉化的保溫溫度為37℃。
實施例1表達質粒pTrc99AyibD的構建將大腸桿菌K12的yibD基因使用聚合酶鏈反應(PCR)和合成的寡核苷酸擴增。大腸桿菌K12 MG1655(登錄號AE000439，Blattner etal.(Science 2771453-1474(1997))的yibD ORF的核苷酸序列作為起始物質合成PCR引物(MWG Biotech，Ebersberg，Germany)。對引物的序列加以修飾以提供限制酶的識別位點。對于yibD-ex1引物選擇SacI識別序列，對于yibD-ex2引物選擇HindIII識別序列，所述序列在下列核苷酸序列中以下劃線標示yibD-ex15′-GATCTAGAGCTCGTCAGGATAACTTCAGAGG-3′(SEQ ID No.1)yibD-ex25′-GATCTAAGCTTAGCCCGAAGCGGCGAAGTTTA-3′(SEQ ID No.2)用于PCR的大腸桿菌K12 MG1655的染色體DNA使用QiagenGenomic-tips 100/G(QIAGEN，Hilden，Germany)根據廠商指導進行分離。使用特異性引物在標準PCR條件(Innis et al.(1990)PCRProtocols.A Guide to Methods and Applications，Academic Press)下使用Vent DNA聚合酶(New England BioLabs GmbH，Frankfurt，Germany)可以擴增大約為1114bp的DNA片段(SEQ ID No3)。
將擴增的yibD片段與載體pCR-Blunt II-TOPO(Zero TOPO TACloning Kit，Invitrogen，Groningen，The Netherlands)根據廠商指導進行連接，并轉化進大腸桿菌菌株TOP10中。在補加50μg/ml卡那霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質粒的細胞。在分離質粒DNA之后，將該載體在用酶PvuI和HindIII/SacI切割后，在0.8％瓊脂糖凝膠中檢測，稱作pCRBluntyibD。
然后將載體pCRBluntyibD用酶HindIII和SacI切割，在0.8％瓊脂糖中分離后，從凝膠中分離(QIAquick Gel Extraction Kit，QIAGEN，Hilden，Germany)yibD片段并與已經用酶HindIII和SacI消化的載體pTrc99A(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)連接。將大腸桿菌菌株XL1Blue MRF′(Stratagene，La Jolla，USA)用該連接混合物轉化，并在補加50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質粒的細胞。
在通過用酶PvuI對照切割，分離質粒DNA之后，可表明成功克隆。
該質粒稱作pTrc99AyibD(

圖1)。
實施例2用菌株MG442/pTrc99AyibD制備L-蘇氨酸生產L-蘇氨酸的大腸桿菌菌株MG442在專利US-A-4,278,765中描述，根據布達佩斯條約以保藏號CMIM B-1628保藏在俄羅斯國立工業微生物保藏中心(VKPM，俄羅斯莫斯科)及以保藏號DSM 16574保藏在德國微生物保藏中心(DSMZ，Brunswick，Germany)。
將菌株MG442用實施例1所述的表達質粒pTrc99AyibD和載體pTrc99A轉化，在補加50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質粒的細胞。這個程序產生了菌株MG442/pTrc99AyibD和MG442/pTrc99A。然后在具有如下成分的基本培養基上增殖選擇的各個菌落3.5g/l Na2HPO4·2H2O，1.5g/l KH2PO4，1g/l NH4Cl，0.1g/l MgSO4·7H2O，2g/l葡萄糖，20g/l瓊脂，50mg/l氨芐青霉素。在于100ml錐形瓶中10ml分批培養物中檢測L-蘇氨酸的形成。為此，接種含有如下成分的10ml預培養培養基2g/l酵母提取物，10g/l(NH4)2SO4，1g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4·7H2O，15g/l CaCO3，20g/l葡萄糖，50mg/l氨芐青霉素，并在37℃以180rpm在KühnerAG(Birsfelden，Switzerland)的ESR培養箱中保溫16小時。將這些預培養物250μl移至10ml生產培養基中(25g/l(NH4)2SO4，2g/lKH2PO4，1g/l MgSO4·7H2O，0.03g/l FeSO4·7H2O，0.018g/lMnSO4·1H2O，30g/l CaCO3，20g/l葡萄糖，50mg/l氨芐青霉素)，在37℃保溫48小時。以相同方式研究原始菌株MG442中L-蘇氨酸的形成，但是培養基中不加入氨芐青霉素。在保溫后，培養懸浮液的光密度(OD)使用Dr.Lange(Düsseldorf，Germany)的LP2W光度計在660nm測定波長測定。
然后在滅菌過濾的培養上清中使用Eppendorf-BioTronik(Hamburg，Germany)氨基酸分析儀經離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定形成的L-蘇氨酸的濃度。
實驗結果示于表1。
表1

附圖簡述圖1含有yibD ORF的質粒pTrc99AyibD圖譜。
長度數據是大約值。所用縮寫和名稱具有如下含義●bla編碼氨芐青霉素抗性的基因●lac Iqtrc啟動子的阻抑蛋白基因
●trctrc啟動子區域，IPTG-誘導型●yibDyibD基因的編碼區●5S5S rRNA區域●rrnBTrRNA終止子區域限制酶的縮寫具有如下含義●PvuI來自普通變形菌(Proteus vulgaris)的限制性核酸內切酶序列表<110>德古薩股份公司<120>使用腸細菌科菌株制備L-氨基酸的方法<130>030375 BT<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>31<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(31)<223>yibD-exl<400>1gatctagagc tcgtcaggat aacttcagag g31<210>2<211>32<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(32)<223>yibD-ex2<400>2gatctaagct tagcccgaag cggcgaagtt ta 32<210>3<211>1114<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
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<220>
<221>CDS<222>(45)..(1079)<223>yibD coding region<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(31)<223>Primer yibD-exl<220>
<221>primer_bind<222>(1083)..(1114)<223>Primer yibD-ex2<400>3gatctagagc tcgtcaggat aacttcagag gtcgtcggta attt atg atg aac agc56Met Met Asn Ser1acc aat aaa ctt agt gtt att att ccg tta tat aat gcg ggc gat gat104Thr Asn Lys Leu Ser Val Ile Ile Pro Leu Tyr Asn Ala Gly Asp Asp5 10 15 20ttc cgc act tgt atg gaa tct tta att acg caa acc tgg act gct ctg152Phe Arg Thr Cys Met Glu Ser Leu Ile Thr Gln Thr Trp Thr Ala Leu25 30 35gaa atc att att att aac gat ggt tca acg gat aat tct gtt gaa ata200Glu Ile Ile Ile Ile Asn Asp Gly Ser Thr Asp Asn Ser Val Glu Ile40 45 50gca aag tat tac gca gaa aac tat ccg cac gtt cgt ttg ttg cat cag248Ala Lys Tyr Tyr Ala Glu Asn Tyr Pro His Val Arg Leu Leu His Gln55 60 65gcg aat gct ggc gca tcg gtg gcg cgt aat cgt ggg att gaa gtg gca296Ala Asn Ala Gly Ala Ser Val Ala Arg Asn Arg Gly Ile Glu Val Ala70 75 80acg ggc aaa tat gtc gct ttt gtc gat gct gac gat gaa gtc tat ccc344Thr Gly Lys Tyr Val Ala Phe Val Asp Ala Asp Asp Glu Val Tyr Pro85 90 95 100acc atg tac gaa acg ctg atg acc atg gcg tta gag gac gac ctc gac392Thr Met Tyr Glu Thr Leu Met Thr Met Ala Leu Glu Asp Asp Leu Asp105 110 115gtg gcg cag tgc aac gct gac tgg tgt ttt cgt gaa acg gga gaa acc440Val Ala Gln Cys Asn Ala Asp Trp Cys Phe Arg Glu Thr Gly Glu Thr120 125 130tgg caa tcc atc ccc acc gat cgc ctt cgc tca acc ggc gta tta acc488Trp Gln Ser Ile Pro Thr Asp Arg Leu Arg Ser Thr Gly Val Leu Thr135 140 145ggc ccg gac tgg ctg cgg atg ggg ctt tct tcg cgc cgt tgg act cac536Gly Pro Asp Trp Leu Arg Met Gly Leu Ser Ser Arg Arg Trp Thr His
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Ala Gly Asp Asp Phe Arg Thr Cys Met Glu Ser Leu Ile Thr Gln Thr20 25 30Trp Thr Ala Leu Glu Ile Ile Ile Ile Asn Asp Gly Ser Thr Asp Asn35 40 45Ser Val Glu Ile Ala Lys Tyr Tyr Ala Glu Asn Tyr Pro His Val Arg50 55 60Leu Leu His Gln Ala Asn Ala Gly Ala Ser Val Ala Arg Asn Arg Gly65 70 75 80Ile Glu Val Ala Thr Gly Lys Tyr Val Ala Phe Val Asp Ala Asp Asp85 90 95Glu Val Tyr Pro Thr Met Tyr Glu Thr Leu Met Thr Met Ala Leu Glu100 105 110Asp Asp Leu Asp Val Ala Gln Cys Asn Ala Asp Trp Cys Phe Arg Glu115 120 125Thr Gly Glu Thr Trp Gln Ser Ile Pro Thr Asp Arg Leu Arg Ser Thr130 135 140Gly Val Leu Thr Gly Pro Asp Trp Leu Arg Met Gly Leu Ser Ser Arg145 150 155 160Arg Trp Thr His Val Val Trp Met Gly Val Tyr Arg Arg Asp Val Ile165 170 175Val Lys Asn Asn Ile Lys Phe Ile Ala Gly Leu His His Gln Asp Ile180 185 190Val Trp Thr Thr Glu Phe Met Phe Asn Ala Leu Arg Ala Arg Tyr Thr195 200 205Glu Gln Ser Leu Tyr Lys Tyr Tyr Leu His Asn Thr Ser Val Ser Arg210 215 220Leu His Arg Gln Gly Asn Lys Asn Leu Asn Tyr Gln Arg His Tyr Ile225 230 235 240Lys Ile Thr Arg Leu Leu Glu Lys Leu Asn Arg Asn Tyr Ala Asp Lys245 250 255Ile Met Ile Tyr Pro Glu Phe His Gln Gln Ile Thr Tyr Glu Ala Leu260 265 270Arg Val Cys His Ala Val Arg Lys Glu Pro Asp Ile Leu Thr Arg Gln275 280 285Arg Met Ile Ala Glu Ile Phe Thr Ser Gly Met Tyr Lys Arg Leu Ile290 295 300Thr Asn Val Arg Ser Val Lys Val Gly Tyr Gln Ala Leu Leu Trp Ser305 310 315 320Phe Arg Leu Trp Gln Trp Arg Asp Lys Thr Arg Ser His His Arg Ile325 330 335
Thr Arg Ser Ala Phe Asn Leu Arg340<210>5<211>1035<212>DNA<213>Salmonella typhimurium<220>
<221>CDS<222>(1)..(1035)<223>yibD-Orf<400>5atg aaa aat agt aaa acc aaa gtg agt atc att gtc ccg tta tat aat48Met Lys Asn Ser Lys Thr Lys Val Ser Ile Ile Val Pro Leu Tyr Asn1 5 10 15gcg gga gcg gat ttt aat gct tgc atg gcg tcg tta atc gcg caa acg96Ala Gly Ala Asp Phe Asn Ala Cys Met Ala Ser Leu Ile Ala Gln Thr20 25 30tgg tcg gcg ctg gaa att att att gtg aat gat gga tcg acg gat cat144Trp Ser Ala Leu Glu Ile Ile Ile Val Asn Asp Gly Ser Thr Asp His35 40 45tcc gtt gag ata gca aaa cat tac gcg gaa cat tac cca cat gtt cga192Ser Val Glu Ile Ala Lys His Tyr Ala Glu His Tyr Pro His Val Arg50 55 60ctg ctt cat cag gcc aat gct ggc gca tct gtc gcc cgt aat ctt ggc240Leu Leu His Gln Ala Asn Ala Gly Ala Ser Val Ala Arg Asn Leu Gly65 70 75 80ctg caa gcg gcg acc ggc gat tat gtc gcc ttt gtc gat gcg gat gac288Leu Gln Ala Ala Thr Gly Asp Tyr Val Ala Phe Val Asp Ala Asp Asp85 90 95cag gtc tac ccg aag atg tat gaa acg ctg atg act atg gcg ctt aac336Gln Val Tyr Pro Lys Met Tyr Glu Thr Leu Met Thr Met Ala Leu Asn100 105 110gat gat ctg gac gtt gcg cag tgt aat gcg gac tgg tgc gtc cga aaa384Asp Asp Leu Asp Val Ala Gln Cys Asn Ala Asp Trp Cys Val Arg Lys115 120 125acc ggg cac gcc tgg caa tct att ccg acc gat cgt ctg cgt tcc acc432Thr Gly His Ala Trp Gln Ser Ile Pro Thr Asp Arg Leu Arg Ser Thr130 135 140ggg gta tta agc gga ccg gat tgg ttg cgt atg gcg ttg gcc tcg cgg480Gly Val Leu Ser Gly Pro Asp Trp Leu Arg Met Ala Leu Ala Ser Arg145 150 155 160cgc tgg acg cat gtt gtc tgg atg ggc gtt tat cga cgt gcg tta att528
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Trp Ser Ala Leu Glu Ile Ile Ile Val Asn Asp Gly Ser Thr Asp His35 40 45Ser Val Glu Ile Ala Lys His Tyr Ala Glu His Tyr Pro His Val Arg50 55 60Leu Leu His Gln Ala Asn Ala Gly Ala Ser Val Ala Arg Asn Leu Gly65 70 75 80Leu Gln Ala Ala Thr Gly Asp Tyr Val Ala Phe Val Asp Ala Asp Asp85 90 95Gln Val Tyr Pro Lys Met Tyr Glu Thr Leu Met Thr Met Ala Leu Asn100 105 110Asp Asp Leu Asp Val Ala Gln Cys Asn Ala Asp Trp Cys Val Arg Lys115 120 125Thr Gly His Ala Trp Gln Ser Ile Pro Thr Asp Arg Leu Arg Ser Thr130 135 140Gly Val Leu Ser Gly Pro Asp Trp Leu Arg Met Ala Leu Ala Ser Arg145 150 155 160Arg Trp Thr His Val Val Trp Met Gly Val Tyr Arg Arg Ala Leu Ile165 170 175Thr Asp Asn Asn Ile Thr Phe Val Pro Gly Leu His His Gln Asp Ile180 185 190Leu Trp Ser Thr Glu Val Met Phe Asn Ala Thr Arg Val Arg Tyr Thr195 200 205Glu Gln Ser Leu Tyr Lys Tyr Phe Leu His Asp Asn Ser Val Ser Arg210 215 220Leu Gln Arg Gln Gly Asn Lys Asn Leu Asn Tyr Gln Arg His Tyr Ile225 230 235 240Lys Ile Thr Arg Leu Leu Glu Lys Leu Asn Arg Asp Tyr Ala Arg Arg245 250 255Ile Pro Ile Tyr Pro Glu Phe Arg Gln Gln Ile Thr Trp Glu Ala Leu260 265 270Arg Val Cys His Ala Val Arg Lys Glu Pro Asp Ile Leu Thr Arg Gln275 280 285Arg Met Ile Ala Glu Ile Phe Thr Ser Gly Met Tyr Arg Arg Met Met290 295 300Ala Asn Val Arg Ser Ala Lys Ala Ala Tyr Gly Thr Leu Leu Trp Ser305 310 315 320Phe Arg Leu Trp Gln Trp Arg Asp Lys Thr Leu Ser His Arg Arg Met325 330 335Ala Arg Lys Ala Leu Asn Leu Ser340
權利要求
1.重組的腸細菌科微生物，其含有增強的或過表達的、稱作推定的糖基轉移酶的yibD ORF，并以改良的方式生產L-氨基酸。
2.權利要求1的微生物，其中一種多核苷酸被增強，所述多核苷酸編碼一種氨基酸序列與選自包括SEQ ID No4和SEQ ID No6的組中的氨基酸序列至少90％相同的多肽。
3.權利要求2的微生物，其含有一種過表達的或增強的相應于yibD ORF并選自如下一組的多核苷酸a)具有SEQ ID No3或SEQ ID No5核苷酸序列的多核苷酸；b)具有在遺傳密碼簡并范圍內相應于SEQ ID No3或SEQ IDNo5的核苷酸序列的多核苷酸；c)具有在嚴格條件下與互補于SEQ ID No3或SEQ ID No5的序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸；d)具有含有中性有義突變的SEQ ID No3或SEQ ID No5序列的多核苷酸。
4.權利要求2的微生物，其中所述多肽具有與選自包括SEQ IDNo4和SEQ ID No6的組中的序列至少95％相同的氨基酸序列。
5.權利要求2的微生物，其中所述多肽具有與SEQ ID No4或SEQ ID No6所示序列100％相同的氨基酸序列。
6.權利要求1-5任一項的微生物，其中它們是用含有yibDORF、這個ORF的等位基因或其部分、和/或啟動子的載體通過轉化、轉導或接合或者組合這些方法產生的。
7.權利要求1-6任一項的微生物，其中yibD ORF或所述等位基因的拷貝數增加至少1個。
8.權利要求7的微生物，其中yibD ORF的拷貝數增加至少1個是通過將ORF或等位基因整合進微生物的染色體中而實現的。
9.權利要求7的微生物，其中yibD ORF的拷貝數增加至少1個是通過染色體外復制載體實現的。
10.權利要求1或2的微生物，其中通過如下方法實現增強a)突變yibD ORF上游的啟動子和調節區或者核糖體結合位點，或者b)將表達盒或啟動子摻入yibD ORF的上游。
11.權利要求1或2的微生物，其中yibD ORF是在增強該基因表達的啟動子的控制下。
12.權利要求1-11任一項的微生物，其中基于針對yibD ORF未重組的微生物或親代菌株中yibD基因產物的活性或濃度，yibD ORF的增強使該基因產物(蛋白質)的濃度或活性增加至少10％。
13.權利要求1-12任一項的微生物，其中所述微生物選自埃希氏菌屬、歐文氏菌屬、普羅威登斯菌屬和沙雷氏菌屬。
14.權利要求13的微生物，其中所需的L-氨基酸生物合成途徑的其它基因被另外增強，或特別是過表達。
15.權利要求1-14任一項的微生物，其中所述微生物生產L-蘇氨酸。
16.通過發酵腸細菌科的重組微生物制備L-氨基酸的方法，其中a)將產生所需的L-氨基酸的微生物在所需的L-氨基酸被富集在培養基或者細胞中的條件下培養，所述微生物中yibD ORF、或者編碼其基因產物的核苷酸序列、或等位基因是增強的、或者特別是過表達的；及b)分離所需的L-氨基酸，發酵肉湯的成分和/或全部或部分生物量(＞0-100％)被保留在分離的產物中或被完全除去。
17.權利要求16的方法，其中應用權利要求1-15任一項的微生物。
18.權利要求16或17的方法，其中為制備L-蘇氨酸，發酵其中選自如下的一或多個基因另外被同時增強、或者特別是過表達的腸細菌科微生物18.1編碼天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶的thrABC操縱子的至少一個基因；18.2谷氨酸棒桿菌的pyc基因，其編碼丙酮酸羧化酶；18.3pps基因，其編碼磷酸烯醇丙酮酸合酶；18.4ppc基因，其編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；18.5pntA和pntB基因，其編碼嘧啶轉氫酶亞基；18.6rhtB基因，其編碼賦予高絲氨酸抗性的蛋白質；18.7rhtC基因，其編碼賦予蘇氨酸抗性的蛋白質；18.8谷氨酸棒桿菌的thrE基因，其編碼蘇氨酸輸出載體蛋白；18.9gdhA基因，其編碼谷氨酸脫氫酶；18.10pgm基因，其編碼葡糖磷酸變位酶；18.11fba基因，其編碼果糖二磷酸醛縮酶；18.12ptsH基因，其編碼磷酸組氨酸蛋白己糖磷酸轉移酶；18.13ptsI基因，其編碼磷酸轉移酶系統的酶I；18.14crr基因，其編碼葡萄糖特異性IIA成分；18.15ptsG基因，其編碼葡萄糖特異性IIBC成分；18.16lrp基因，其編碼亮氨酸調節子的調節物；18.17fadR基因，其編碼fad調節子的調節物；18.18iclR基因，其編碼主要中間代謝的調節物；18.19ahpC基因，其編碼烷基過氧化氫還原酶的小亞基；18.20ahpF基因，其編碼烷基過氧化氫還原酶的大亞基；18.21cysK基因，其編碼半胱氨酸合酶A；18.22cysB基因，其編碼cys調節子的調節物；18.23cysJ基因，其編碼NADPH亞硫酸還原酶的黃素蛋白；18.24cysI基因，其編碼NADPH亞硫酸還原酶的血蛋白；18.25cysH基因，其編碼腺苷酰硫酸還原酶；18.26rseA基因，其編碼具有抗-sigmaE活性的膜蛋白；18.27rseC基因，其編碼sigmaE因子的全局調節物；18.28sucA基因，其編碼2-酮戊二酸脫氫酶的脫羧酶亞基；18.29sucB基因，其編碼2-酮戊二酸脫氫酶的二氫硫辛酸轉琥珀酸酶E2亞基；18.30sucC基因，其編碼琥珀酰-CoA合成酶的β-亞基；18.31sucD基因，其編碼琥珀酰-CoA合成酶的α-亞基；18.32aceE基因，其編碼丙酮酸脫氫酶復合物的E1成分；18.33aceF基因，其編碼丙酮酸脫氫酶復合物的E2成分；18.34rseB基因，其編碼sigmaE因子活性的調節物；18.35大腸桿菌的開放讀框(ORF)yodA的基因產物；18.36大腸桿菌的開放讀框(ORF)yaaU的基因產物；18.37malT基因，其編碼麥芽糖調節子的陽性轉錄激活物；和18.38eno基因，其編碼烯醇化酶。
19.權利要求16-18任一項的方法，其中應用其中降低所需L-氨基酸形成的代謝途徑至少被部分弱化的微生物。
20.權利要求19的方法，特征在于為了制備L-蘇氨酸，發酵其中選自如下的一或多個基因另外同時被弱化、或者特別是被消除或降低其表達的腸細菌科微生物20.1tdh基因，其編碼蘇氨酸脫氫酶；20.2mdh基因，其編碼蘋果酸脫氫酶；20.3大腸桿菌的開放讀框(ORF)yjfA的基因產物；20.4大腸桿菌的開放讀框(ORF)ytfP的基因產物；20.5pckA基因，其編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；20.6poxB基因，其編碼丙酮酸氧化酶；20.7dgsA基因，其編碼磷酸轉移酶系統的DgsA調節物；20.8fruR基因，其編碼果糖阻抑物；20.9rpoS基因，其編碼sigma38因子；及20.10aspA基因，其編碼天冬氨酸銨裂合酶。
21.權利要求16-20任一項的方法，其中制備的L-氨基酸選自包含L-天冬酰胺、L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-高絲氨酸的組中。
22.權利要求21的方法，其中制備的L-氨基酸選自包含L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-高絲氨酸、L-色氨酸和L-賴氨酸的組中。
全文摘要
本發明涉及一種通過發酵腸細菌科的重組微生物制備L－氨基酸的方法，其中a)將產生所需的L－氨基酸的微生物在所需的L－氨基酸被富集在培養基或者細胞中的條件下培養，所述微生物中yibDORF或編碼其基因產物的核苷酸序列或等位基因是增強的、特別是過表達的，及b)分離所需L－氨基酸，發酵肉湯的成分和/或全部或部分(≥0至100％)生物量任選地被保留在分離的產物中或者被完全除去。
文檔編號C12N15/54GK1918283SQ200580004082
公開日2007年2月21日 申請日期2005年1月27日 優先權日2004年2月6日
發明者梅希特西爾德·里平, 尼克爾·杜施 申請人:德古薩股份公司