Ogura胞質雄性不育蕓苔屬植物的改良的育性恢復及方法

專利名稱：Ogura胞質雄性不育蕓苔屬植物的改良的育性恢復及方法
技術領域：
本發明涉及用于Ogura胞質雄性不育蕓苔屬植物的新育性恢復基因座。
背景技術：
油籽油菜(歐洲油菜，Brassica napus)，也稱作canola(每年一季春季型)或冬油籽油菜(每年兩季型)，源于甘藍(B.oleracea)和蕓苔(B.campestris)的種間雜交。蕓苔屬植物的種間育種是普遍的。一般地，冬季型油籽油菜生長在歐洲西北部，而春季型主要生長在加拿大、中國、印度、澳大利亞和南美。
油籽油菜正在成為日益重要的作物，其因食用油和工業油用途以及其富含蛋白質的籽粉而得到重視。因種子中存在稱作芥子油苷類(GSL)的含硫化合物，妨礙了人們對油菜籽粉在動物營養方面的應用的廣泛接受性。由于芥子油苷類在油的提取和消化過程中會在酶切割作用下導致產生反營養的(antinutritional)分解產物，故芥子油苷類在蕓苔屬植物種子中是不希望有的。盡管在20世紀70年代早期通過引入具有占總脂肪酸譜百分比不足2％的芥子酸(單零品質，single zeroquality)的油籽油菜品種開發了優良的食用油，但高蛋白粉中芥子油苷類的持續存在仍然是進一步擴大市場的主要限制因素。
目前，歐洲法律設定的無GSL油籽油菜品種的最大閾值是在9％濕度下每克(g)種子25μmol總芥子油苷(GSL)(EU法令2294/92)。加拿大種植的雙低春canola品種需要具有每克空氣干燥的無油粉小于30μmol芥子油苷類的GLS水平。歐洲和加拿大普遍種植的雙零油籽油菜品種的GSL水平不同，顯著低于閾值水平，處在官方閾值水平的60％或甚至更低。目前，種子具有低GSL含量的、基于Ogura雜種系統的雜種蕓苔屬植物表達較差的農藝性狀，例如較低的種子產量、不良的疾病抗性和倒伏易感性。
細胞質雄性不育(CMS)或細胞核雄性不育(NMS)蕓苔屬植物作為雌性親本。SI植物由于遺傳組成而不能自花傳粉，CMS和NMS雌性植物不能產生花粉。因此，所有這些植物均必須由雄性親本異花傳粉。許多CMS系統用于蕓苔屬植物的雜種種子生產Polima(pol)，nap，tournefortii，Kosena，和Ogura(ogu)。(見例如Ogura(1968)Mem.Fac.Agric.Kagoshima Univ.639-78；Makaroff(1989 Journalof Biol.Chem.26411706-11713；美國專利號5,254,802)。被認為是最有用的ogu系統所基于的是使用來源于蘿卜(Raphanussativus)細胞質的雄性不育決定子(malesterility determinant)。由Ogura CMS雌性蕓苔屬植物與正常雄性蕓苔屬植物雜交產生的F1種子將是雄性不育的。換言之，從F1種子長成的植物將不產生花粉。為了產生雄性能育的F1代植物，在F1雜種的雄性親本中必須存在恢復基因。
法國Rennes的Institut National de la Recherche Agronomique(INRA)將育性恢復基因座由蘿卜轉移到蕓苔屬CMS植物中(Pelletier等，1987，Proc 7th.Int.Rapessed Conf.Poznan，Poland113-119)。WO92/05251以及Delourme等((1991)Proc.8th.Int.Rapeseed Conf.Saskatoon，加拿大1506-1510)描述了來源于蘿卜的恢復基因(Rf)。攜帶此Rf基因的最初恢復近交系和雜種表達升高水平的芥子油苷并且結籽減少(Pellan-Delourme和Renard，1988 Genome 30234-238，Delourme等，1994 Theor.Appl.Genet.88741-748)。在Ogu Rf雜種植物的種子中，甚至當雌性親本已經降低了芥子油苷含量時，芥子油苷水平仍升高。在圍繞Rf基因的蘿卜染色體區域的重組在蕓苔屬植物中被抑制，因此在該區域中難于獲得不同的重組事件。Rf基因和芥子油苷基因座之間的連鎖已經被打破(WO 98/27806)。然而，打破芥子油苷基因和恢復基因之間的連鎖并且仍保持品系的穩定性和生產高價值商業雜種種子的優良配合力(combining ability)是困難的。因此，需要開發解開恢復基因與芥子油苷基因間的連鎖并保持蕓苔屬植物產生高價值商業雜種種子的能力的重組事件。

發明內容
本發明提供包含如下重組事件的蕓苔屬植物，所述重組事件由沿著核酸區段在來源于Ogura蘿卜(Raphanus sativus)的Ogura胞質雄性不育的育性恢復基因座與芥子油苷基因座之間發生斷裂和隨后重連接產生新核酸區段所導致，在本文中稱作BLR1重組事件。
在一個實施方案中，本發明涉及包含包括Ogura胞質雄性不育的育性恢復基因座的DNA片段的蕓苔屬植物，其中所述DNA片段能夠通過至少一個第2倉(bin)標記鑒定，但不能被至少一個第3倉標記檢測到。
在一個實施方案中，本發明涉及包含包括Ogura胞質雄性不育的育性恢復基因座的DNA片段的蕓苔屬植物，其中所述DNA片段能夠通過至少一個第2倉標記鑒定，但不能通過任何第3倉標記鑒定。
在一個實施方案中，本發明涉及包含包括Ogura胞質雄性不育的育性恢復基因座的DNA片段的蕓苔屬植物，其中所述DNA片段能夠通過所有的第2倉標記但不能通過任何第3倉標記鑒定。
在另一實施方案中，本發明涉及根據本發明的包含包括Ogura胞質雄性不育的育性恢復基因座的DNA片段的蕓苔屬植物，其中第2倉由選自下組的標記組成E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2，第3倉由選自OPY17、OPN20和E8M1-2的標記組成。
在再一實施方案中，本發明涉及根據本發明的蕓苔屬植物，其中上述標記在聚合酶鏈式反應中可以分別使用1159和1160；E 2和M14；E3和M1；E4和M14；E5和M1；E5和M4；E8和M14所代表的引物對進行擴增。上述引物分別地基本上由SEQ ID NO13(1159)、SEQ IDNO14(1160)、SEQ ID NO25(E2)、SEQ ID NO26(M4)、SEQ IDNO29(E3)、SEQ ID NO30(M1)、SEQ ID NO32(E4)、SEQ ID NO28(M14)、SEQ ID NO33(E5)和SEQ ID NO37(E8)中的核苷酸序列表征。
在一個特定實施方案中，本發明涉及根據本發明的蕓苔屬植物，其中所述標記在聚合酶鏈式反應中可以分別使用PR0004F和PR0004R；1135和1136；及E8和M1所代表的引物對進行擴增。以上引物分別地基本上由SEQ ID NO19(PR0004F)、SEQ ID NO20(PR0004R)、SEQID NO3(1135)、SEQ ID NO4(1136)、SEQ ID NO37(E8)和SEQID NO30(M1)中給出的核苷酸序列表征。
另一實施方案中，本發明涉及包含包括恢復基因的DNA片段的本發明蕓苔屬植物，其中所述DNA片段是BLR1重組事件。
在一個特定實施方案中，本發明蕓苔屬植物是自交(inbred)植物。
在再一特定實施方案中，本發明蕓苔屬植物是雜種植物。
另一實施方案中，本發明涉及本發明蕓苔屬植物，所述植物包含包括Ogura胞質雄性不育的育性恢復基因座的DNA片段，其中所述DNA片段是BLR1事件并且所述BLR1重組事件可以從蕓苔屬自交系BRL-038獲得，所述自交系BLR-038的種子樣品已經保藏在NCIMB，保藏號NCIMB 41193。
在再一實施方案中，本發明涉及檢測包含Ogura胞質雄性不育的育性恢復基因座的蕓苔屬植物的方法，包括步驟a)從蕓苔屬植物獲得樣品；b)在所述樣品中檢測能夠使用第2倉標記但不能被第3倉標記鑒定的DNA片段。
一個實施方案中，本發明涉及檢測包含恢復基因的蕓苔屬植物的方法，包括步驟a)從蕓苔屬植物獲得樣品；b)在所述樣品中i)通過使用至少一個第2倉標記，但不能通過至少一個第3倉標記；ii)通過使用至少一個第2倉標記，但不能通過任何第3倉標記；iii)通過使用所有第2倉標記，但不能通過任何第3倉標記檢測到DNA片段。
另一實施方案中，根據本發明檢測蕓苔屬植物的方法還包括步驟c)選擇含有所述DNA片段的所述蕓苔屬植物或其部分。
另一實施方案中，根據本發明檢測蕓苔屬植物的方法還包括步驟d)使包含所述DNA片段的所述蕓苔屬植物自交。
再一實施方案中，根據本發明檢測蕓苔屬植物的方法還包括步驟e)使所述蕓苔屬植物與另一蕓苔屬植物雜交。
一個實施方案中，本發明涉及根據本發明檢測蕓苔屬植物的方法，其中所述DNA片段包含BLR1重組事件。
另一實施方案中，本發明涉及根據本發明檢測蕓苔屬植物的方法，其中步驟b)中所述第2倉標記包含選自E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2的標記。
一個特定實施方案中，本發明涉及根據本發明檢測蕓苔屬植物的方法，其中步驟b)中所述第2倉標記與選自E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2的標記部分同源。
另一實施方案中，本發明涉及根據本發明檢測蕓苔屬植物的方法，還包括步驟f)在所述樣品中檢測能夠使用引物1159和1160通過PCR擴增獲得但不能通過引物PR0004F和PR0004R擴增的DNA片段，并且其中所述標記分別地基本上由SEQ ID NO13(1159)、SEQ ID NO14(1160)和SEQ ID NO19(PR0004F)、SEQ ID NO20(PR0004R)中給出的核苷酸序列表征。
一個實施方案中，本發明涉及用于檢測BLR1重組事件的存在的標記組合，所述組合包含至少一個第2倉標記和至少一個第3倉標記。
另一實施方案中，本發明涉及根據本發明的用于檢測BLR1重組事件的存在的標記組合，其中所述標記組合包含至少一個選自E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2的第2倉標記和至少一個選自OPY17、OPN20和E8M1的第3倉標記，或者包含一個或多個與這些標記中的任何一個部分同源的標記的標記組合。
一個實施方案中，本發明涉及篩選蕓苔屬植物以確定該植物是否包含BLR1重組事件的方法，所述方法包括從所述蕓苔屬植物提取DNA，在引物1159、1160、PR0004F和PR0004R表示的DNA片段存在下將提取物進行聚合酶鏈式擴增反應，并確定通過引物1159和1160從提取的DNA擴增了DNA片段以及缺乏從提取的DNA擴增對應于引物PR0004F和PR0004R的DNA片段。
一個實施方案中，本發明涉及用于產生能育F1雜種蕓苔屬植物的方法，包括步驟使包含BLR1重組事件的蕓苔屬雄性能育植物與蕓苔屬CMS雄性不育植物雜交以產生F1雜種種子。
另一實施方案中，本發明涉及用于產生能育F1雜種蕓苔屬植物的方法，包括步驟a)確定包含BLR1重組事件的雄性能育恢復系親本中以及任選地雌性的雄性不育CMS親本中的總芥子油苷含量，b)使雌性和雄性親本雜交以產生F1雜種種子。
在再一實施方案中，本發明涉及產生能育F1雜種蕓苔屬植物的方法，包括步驟a)在雄性能育恢復系親本的種子或植物中通過標記分析，檢測BLR1重組事件；b)使雌性和雄性親本雜交以產生F1雜種種子。
在一個本發明特定實施方案中，通過確定雄性能育恢復系親本中的總芥子油苷和通過標記分析，在恢復系親本的種子或植物中檢測雄性恢復基因的存在。
另一實施方案中，根據本發明用于產生能育F1雜種蕓苔屬植物的方法包括種植所述F1雜種種子的額外步驟。
另一實施方案中，根據本發明用于產生能育F1雜種蕓苔屬植物的方法包括收獲從來自所述F1種子的植物生長的F2種子。
在另一實施方案中，根據本發明用于產生能育F1雜種蕓苔屬植物的方法包括在來自F1雜種植物的F2種子中確定總芥子油苷含量的額外步驟。
一個實施方案中，本發明涉及通過本發明方法產生的雜種F1蕓苔屬植物。
在再一實施方案中，本發明涉及包含BLR1重組事件的蕓苔屬植物，其中所述事件能夠從蕓苔屬自交系BLR-038獲得，所述自交系BLR-038的種子的樣品保藏在NCIMB，保藏號NCIMB 41193。
再一實施方案中，本發明涉及用于產生包含BLR1重組事件的蕓苔屬植物的方法，包括步驟獲得含有BLR1重組事件的蕓苔屬植物，使該植物與另一蕓苔屬植物雜交，獲得通過該雜交產生的雜種種子，和種植所述雜種種子以產生含有BLR1重組事件的蕓苔屬植物。
一個實施方案中，本發明涉及用于檢測BLR1重組事件的試劑盒，其包含a)擴增第2倉標記的第一對引物；和b)不擴增第3倉標記的第二對引物。
一個實施方案中，本發明涉及包含BLR1重組事件的蕓苔屬植物。
再一實施方案中，本發明涉及根據本發明的蕓苔屬植物，其中BLR1重組事件能夠從蕓苔屬自交系BLR-038獲得。
另一實施方案中，本發明涉及根據本發明的蕓苔屬植物，其中所述植物是歐洲油菜(Brassica napus)、蕓苔(Brassica campestris)、甘藍(Brassica oleracea)、Brassica nigra、Brassica carinata或屬于十字花科(Brassicacea)的任何其它物種。
另一實施方案中，本發明涉及根據本發明的蕓苔屬植物，其中所述植物是所述物種的有性或無性重組(recombination)或克隆。
再一實施方案中，本發明涉及根據本發明的蕓苔屬植物，所述植物包含等于或低于雙低蕓苔屬植物品種的芥子油苷水平的總芥子油苷水平。
本發明提供包含本文中稱作BLR1重組事件的獨特重組事件(該重組事件由沿著核酸區段(nucleic acid segment)在恢復基因座和芥子油苷基因座間的斷裂導致)的蕓苔屬植物。本發明蕓苔屬植物表達由于蘿卜恢復基因表達所致的育性恢復以及不高于雙低自由傳粉品種中正常GSL含量的GSL含量。蕓苔屬自交系BLR-038(保藏號NCIMB-41193)是含有BLR1重組事件的植物的一個例子。使用本領域技術人員已知的以及本文簡要描述的育種技術，使自交系BLR-038和含有BLR1重組事件的其它自交系與雄性不育自交系雜交，產生表達低GSL含量和優良農藝性狀的雜種。更一般地，本發明還包括將本發明BLR1重組事件從一種蕓苔屬植物轉移至相同或不同亞種的另一種蕓苔屬植物。本發明的再一方面是試劑盒和方法，其包括標記和使用規定倉(bin)的標記來選擇含有BLR1重組事件的蕓苔屬植物。
含有以BLR1重組事件為例的重組事件(該重組事件由來源于Ogura蘿卜的恢復基因座和芥子油苷基因座之間沿核酸區段的斷裂和隨后的重連接產生新核酸區段所導致)并表達因蘿卜恢復基因的表達所致的育性恢復和不高于雙低自由傳粉品種中正常GSL含量的GSL含量的本發明植物，可以通過使用下述育種策略而獲得(關于BLR1重組事件——Ogura蘿卜恢復基因座的重組——的育種史的詳情，見表1)。CMS自交系例如R30195系可以和含有恢復基因的雄性自交系如R40自交系(Delournme等，1999；http://www.regional.org.au/au/gcirc/4/383.htm)雜交而產生F1雜種，其中所述自交系R40含有通過法國Rennes的Institut National de la Recherche Agronomique(INRA)從蘿卜轉移至蕓苔屬CMS植物的恢復基因(Pelletier等，1987，Proc7th.Int.Rapeseed Conf.，Poznan，Poland113-119)。R40是從原始雜交(Fu 58.Darmor B1F1×Rest.Darmor B1F1)×Bienvenu開始通過自交產生的F6代子代。由CMS自交系和含有恢復基因的雄性自交系雜交(例如，雜交R30195×含有CMS恢復基因的R40)產生的F1雜種，基于雄性能育性(在開花時確定)進行選擇。F1雜種植物(例如F1雜種92HR013)與非CMS非恢復系雙零品質繁殖系如繁殖系93B-1-3雜交。種植通過與非CMS非恢復系雙零品質繁殖系(例如93B-1-3)的雜交產生的能育植物的種子，所得CMS恢復系植物可以再次與相同的或另外的雙低品質繁殖系如繁殖系92/19047雜交。由此雜交產生的品系進行幾次自交(從1995至2002年進行的自交顯示在表1中)。
在所有地塊(plot)中，均可以觀察到雄性可育性的分離，意味著所有的地塊均含有雜合和純合的保持系和恢復系植物。因為所有雜交均最初在Ogura CMS細胞質中進行而該細胞質在所有的后代中均得以保持，故證明保持系基因型是雄性不育的。可以使用塑料袋在開花前罩住花序，從而使植物自交。袋子優選在整個開花期都罩在植物上以避免異花傳粉。
在整個育種程序中監測蕓苔屬植物種子的芥子油苷(GSL)含量。芥子油苷含量以9％濕度下μmol/g種子表示。可以使用本領域現有技術，例如HPLC或近紅外反射光譜(NIRS)，進行芥子油苷分析。使用NIRS方法，可以分析未被破壞的蕓苔屬植物種子樣品的品質組分(qualitycomponent)油、蛋白質和芥子油苷。
本發明含有因核酸區段中位于恢復基因座和芥子油苷基因座之間的位點的斷裂所導致的獨特重組事件(例如本文中稱作BLR1重組事件的重組事件)的蕓苔屬植物，在來源于該植物的種子中的芥子油苷(GSL)含量等于或低于在雙低自由傳粉品種中正常發現的芥子油苷水平，優選地低于9％濕度下18μmol總芥子油苷(GSL)每克(g)種子、直至接近9％濕度下0μmol總芥子油苷(GSL)每克(g)種子的水平。
在本發明的一個特定實施方案中，GSL含量為9％濕度下0.5至18μmol總芥子油苷(GSL)每克(g)種子，尤其是9％濕度下2至15μmol總芥子油苷(GSL)每克(g)種子，更尤其是9％濕度下3至14μmol總芥子油苷(GSL)每克(g)種子，特別是9％濕度下3.5至10μmol總芥子油苷(GSL)每克(g)種子的GSL含量。在本發明一個特定實施方案中，GSL含量為9％濕度下3.6至6.0μmol，特別是3.6至4.2μmol總芥子油苷(GSL)每克(g)種子。
本發明蕓苔屬植物表現出因蘿卜恢復基因的表達所致的育性恢復和不高于正常雙低自由傳粉品種(在油中具有低芥子酸以及在油提取后剩余的固體粉中具有低GSL的品種)的GSL含量。蕓苔屬自交系BLR-038(保藏號NCIMB-41193)是含有本發明BLR1重組事件的植物的一個例子。使用本領域技術人員已知的和本文中簡要描述的育種技術，可以使BLR1重組事件漸滲入能夠和自交系BLR-038雜交的任何蕓苔屬植物中。自交系BLR-038和含有本發明BLR1重組事件的其它植物可以與雄性不育自交系，尤其是表達低GSL含量和/或有利的農藝性質例如對植物病原體的高抗性、良好的站立性(standability)、高油含量、高產量等的自交系雜交，以產生具有低GSL含量和優良農藝性狀的雜種。更一般地，本發明還包括將本發明的BLR1重組事件由一個蕓苔屬植物轉移至另一個蕓苔屬植物。本發明還包括使用標記輔助的選擇方法選擇含有BLR1重組事件的蕓苔屬植物。
在一個實施方案中，本發明公開了揭示攜帶Ogura Rf易位(translocation)和純合隱性(rfrf)塊(bulk)的植物間多態性的標記。這些標記允許比較含有獨特重組事件——由核酸區段中位于來源于Ogura蘿卜的恢復基因座和芥子油苷基因座之間的位點的斷裂和隨后的重連接產生新重組事件所致——的蕓苔屬植物例如蕓苔屬自交系BLR-038和已公開的恢復自交系例如Pioneer雜種(ATCC 209002，97839，97838，209001)，以及含有I NRA發布的恢復基因座的SERASEM的商業雜種Lutin。這些標記根據其在各種植物材料上的擴增譜分倉，導致4個不同種類的標記。在本申請中，倉(bin)指側翼為斷裂點的核酸或染色體區段，其中所述倉能夠通過在包圍該倉的斷裂點之間作圖并且根據它們沿著核酸區段的定位進行分組的一組標記進行鑒定和由該組標記代表。含有第4倉(bin 4)標記的品系含有最長的片段。片段長度隨著倉編號的減小而減小。
第1倉(bin 1)含有選自E5M16-1、E5M4-3、E6M 3-2和E8M14-1的AFLP標記或與這些標記之任一具有部分同源性的標記。
第2倉(bin 2)含有選自E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2的AFLP標記或與這些標記之任一具有部分同源性的標記。
第3倉(bin 3)含有AFLP標記E8M1-2，或與這些標記之任一具有部分同源性的標記。
第4倉(bin 4)含有選自E2M13-1、E2M14-1、E3M12-1和E6M3-1的AFLP標記或與這些標記之任一具有部分同源性的標記。
在一個實施方案中，本發明涉及含有包括恢復基因的蘿卜DNA片段的蕓苔屬植物，其中所述DNA片段能夠使用至少一個第2倉標記而不能使用第3倉標記進行鑒定。
在再一實施方案中，本發明涉及含有包括恢復基因的蘿卜DNA片段的蕓苔屬植物，其中所述DNA片段能夠使用所有的第2倉標記而不能使用第3倉標記進行鑒定。
尤其是，本發明涉及含有包括Ogura胞質雄性不育的育性恢復基因座的蘿卜DNA片段的蕓苔屬植物，其中所述DNA片段能夠通過至少一個第2倉標記的存在加以鑒定，但不能被至少一個第3倉標記鑒定，并且其中所述DNA片段是本發明的BLR1重組事件。
“至少一個第2倉標記”可以是選自由E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2組成的組的一個、兩個、三個、四個、五個、六個或所有標記，包括該組中不同個數標記的所有可能排列組合。
“至少一個第3倉標記”可以是選自由OPY17、OPN20和E8M1-2組成的組的一個、兩個或所有標記，包括該組中不同個數標記的所有可能排列組合。
本發明范圍內還包括至少一個第2倉組標記和至少一個第3倉組標記的所有可能組合。
在再一實施方案中，本發明涉及選自E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2的第2倉標記，和/或選自OPY17、OPN20和E8M1-2的第3倉標記，包括各組(倉)內和/或兩組(倉)間的一個或多個標記的所有可能組合。
尤其是，本發明涉及選自E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2的標記，該標記可以在聚合酶鏈式反應中使用分別由1159(SEQ ID NO13)和1160(SEQ ID NO14)；E2(SEQID NO25)和M4(SEQ ID NO26)；E3(SEQ ID NO29)和M1(SEQID NO30)；E4(SEQ ID NO32)和M14(SEQ ID NO28)；E5(SEQID NO33)和M1(SEQ ID NO30)；E5(SEQ ID NO33)和M4(SEQID NO26)和E8(SEQ ID NO37)和M14(SEQ ID NO28)所代表的引物對擴增。上述引物以及在此提供的特定引物組合也是本發明的一部分。
本發明還包括選自OPY17、OPN20和E8M1-2的標記，該標記在聚合酶鏈式反應中可以使用分別由PR0004F(SEQ ID NO19)和PR0004R(SEQ ID NO20)；1135(SEQ ID NO3)和1136(SEQ ID NO4)；E8(SEQ ID NO37)和M1(SEQ ID NO30)所代表的引物對擴增。上述引物以及在此提供的特定引物組合也是本發明的一部分。
在再一實施方案中，本發明涉及檢測含有來自蘿卜的恢復基因的蕓苔屬植物的方法，包括步驟從蕓苔屬植物獲得植物樣品，在樣品中檢測能夠使用至少一個第2倉標記鑒定但不能被至少一個第3倉標記檢測的DNA片段。
在再一實施方案中，本發明涉及檢測含有來自蘿卜的恢復基因的蕓苔屬植物的方法，包括步驟從蕓苔屬植物獲得植物樣品，在樣品中檢測能夠被第2倉標記檢測但不能被第3倉標記檢測的DNA片段。該方法還包括選擇含有該DNA片段的蕓苔屬植物或其部分，以及使含有該DNA片段的蕓苔屬植物自交。在本發明一個特定實施方案中，該DNA片段含有BLR1重組事件。
尤其是，本發明涉及檢測含有包含來自蘿卜的恢復基因的DNA片段，尤其是包含BLR1重組事件的DNA片段的蕓苔屬植物的方法，其中所述第2倉標記包含選自E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2的至少一個標記。
本發明包括檢測蕓苔屬植物的方法，其中所述第2倉標記與選自E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2的標記部分同源。
本發明方法包括步驟在植物樣品中檢測能夠通過PCR擴增使用引物1159(SEQ ID NO13)和1160(SEQ ID NO14)獲得的DNA片段，其中該DNA片段不能被引物PR0004F(SEQ ID NO19)和PR0004R(SEQ ID NO20)擴增。
本發明還包括用于檢測BLR1重組事件的存在的標記組合，該組合包含至少一個第2倉標記和至少一個第3倉標記。
本發明還包括選自E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2的一個或多個第2倉標記或者與這些標記之任一部分同源的標記和選自OPY17、OPN20和E8M1的一個或多個第3倉標記或者與這些標記之任一部分同源的標記的組合。
本文還提供能夠使育種者確定包含Ogura Rf基因的蕓苔屬植物的基因型的標記。由此育種者可以通過使用兩個標記對，尤其是兩個SCAR標記對(其一與恢復基因(“Rf”)連鎖，另一與恢復基因的缺乏(“rf”)連鎖，見例如CA 2,206,673中的描述)的組合，在分離群體的各株植物中區分純合和雜合Ogura恢復系。
這些標記可以通過實施兩個PCR反應鑒定，一個PCR反應涉及能夠與“Rf”標記雜交的引物對，例如引物對1137(SEQ ID NO5)和1138(SEQ ID NO6)；一個PCR反應涉及能夠與“rf”標記雜交的標記，例如引物對PR0001F1(SEQ ID NO40)和PR0001R1(SEQ ID NO41)。在“Rf”基因純合的植物中，所述PCR反應僅僅鑒定出與“Rf”基因連鎖的標記。在“rf”基因純合的植物中，所述PCR反應僅僅鑒定出與“rf”基因連鎖的標記。在同時存在“Rf”基因和“rf”基因的雜合植物中，所述PCR反應將給出代表“Rf”和“rf”標記的條帶。
所述PCR反應可以是單元PCR反應，其中各DNA樣品分開處理；或者是多元PCR反應，其中兩組引物對在單一一個PCR反應中一起使用。
本發明還包括篩選蕓苔屬植物群體以確定是否其含有包含BLR1重組事件的植物的方法，包括從蕓苔屬植物提取DNA，在引物1159、1160、PR0004F、PR0004R存在下將蕓苔屬植物提取物進行聚合酶鏈式擴增反應，和確定通過引物1159和1160從提取的DNA進行的DNA片段擴增以及缺乏通過引物PR0004F和PR0004R從提取的DNA進行的DNA片段擴增，由此說明存在BLR1重組事件。
本發明包括試劑盒和方法，其涉及第2倉中的一個或多個標記以及第3倉中的一個或多個標記用于在植物或植物部分中檢測BLR1重組事件的存在。根據本發明，含有BLR1重組事件的植物材料能夠使用至少一個第2倉標記而不能使用至少一個第3倉標記進行鑒定。
本發明還包括使BLR1重組事件漸滲的方法，包括步驟獲得包含BLR1重組事件的蕓苔屬植物，例如蕓苔屬自交系BLR-038(保藏號NCIMB 41193，保藏日2003年8月28日)，使該植物與另一蕓苔屬植物雜交，產生雜種種子和選擇含有BLR1重組事件的雜種種子。
特別是，包含BLR1重組事件的蕓苔屬植物，例如2003年8月28日以保藏號NCIMB 41193保藏的蕓苔屬自交系BLR-038，與優質冬油籽油菜繁殖系(用作回歸親本)雜交。在這些雜交中，蕓苔屬自交系用作雌性以維持CMS細胞質。
所得F1植物與回歸親本雜交以置換更多的蕓苔屬自交系基因組，尤其是80％至99.5％的基因組，更尤其是90％至99％的基因組，特別是95％至98％的基因組。在每一代中，必須確定恢復基因是否存在。由于每一代中的CMS細胞質，可以容易地例如通過育性評分來檢測恢復基因存在與否。
在最后一代回交后，需要自交步驟。在以后后代中，使用本發明描述的分子標記選擇具有純合恢復基因的植物。這些植物是恢復系，可以用于產生雜種種子。
獲得恢復系的一種不同方式是例如使含有BLR1重組事件的繁殖系，例如蕓苔屬自交系BLR-038雜交。使能育F1植物自交。在F2代中，在溫室中通過使用標記分析諸如之前本文中描述的標記分析，檢測純合恢復系植物，并使純合植物自交。
將純合F2植物的F3后代種植在大田中以僅僅在期望的純合恢復系植物中進行選擇。然后將F3植物自交。重復此自交過程，直到對于用作雜種組分(hybrid component)而言，該品系具有足夠的同質性。
使用幾種CMS Ogura雄性不育系作為雌性親本，以及使用一組包含本發明BLR1重組事件的遺傳上不同的F3代或其后世代的自交植物作為雄性親本，進行測交。在溫室中播種后代，并在開花期計數能育和不育植物。含有BLR1重組事件的植物也可以使用本文所述試劑盒和方法進行選擇。
在再一實施方案中，本發明還涉及包含BLR1重組事件的蕓苔屬植物，其中所述事件能夠從蕓苔屬自交系BLR-038獲得，所述近交系BLR-038的種子樣品以保藏號NCIMB 41193保藏在NCIMB。
一個實施方案中，本發明涉及產生能育F1雜種蕓苔屬植物的方法，包括步驟使包含BLR1重組事件的蕓苔屬雄性能育植物與蕓苔屬CMS雄性不育植物雜交以產生F1能育種子，還包括步驟種植所述F1雜種種子，還包括步驟收獲從來自所述F1種子的植物生長的F2種子；本發明包括通過此方法產生的F1雜種蕓苔屬植物。
由于雄性不育的雌性CMS A系不能自花授粉，故其必須通過所述A系與保持系B系的雜交來維持，其中所述B系是雄性能育的并且與A系在遺傳上一致。該雜交的結果是雄性不育的CMS A系。恢復系R系可以通過自交維持。
恢復系R系與雄性不育CMS A系雜交，產生在A系上生成的F1種子。可以商業銷售F1種子用于產生F2種子。本發明F2種子具有低芥子油苷水平，尤其是9％濕度下低于18μmol總芥子油苷(GSL)每克(g)種子、直至9％濕度下接近0μmol總芥子油苷(GSL)每克(g)種子的GSL水平。
保藏蕓苔屬自交系BLR-038的種子樣品于2003年8月28日保藏在NCIMB，Ltd(23 St Machar Drive，Aberdeen AB24 3RY，Scotland，UK)，保藏號為NCIMB 41193。
實施例以下實施例旨在舉例說明本發明的應用。以下實施例不旨在完全地定義或以其它方式限制本發明的范圍。
實施例1蕓苔屬自交系BLR038的育種史和GSL表征表1描述本發明含有BLR1重組事件的植物的育種史，其中所述BLR1重組事件是Ogura蘿卜(Raphanus sativus)恢復基因座的重組。在1992年，CMS自交系R30195與含有INRA的恢復基因的雄性自交系R40雜交，產生F1雜種。R40是從原始雜交(Fu 58.Darmor B1F1×Rest.Darmor B1F1)×Bienvenu開始通過自交產生的F6代后代。基于雄性能育性(這在開花時確定)選擇由R30195×R40雜交產生的含有CMS-恢復基因的F1雜種。F1雜種植物(92HR013)與非CMS、非恢復系雙零品質繁殖系93B-1-3雜交。1994年，栽培通過與93B-1-3雜交產生的能育植物的種子，所得CMS恢復系植物與雙低品質繁殖系92/19047雜交。由此雜交產生的品系從1995至2002年進行幾次自交，這顯示在表1中。在所有地塊(plot)中，均觀察到了雄性育性的分離，意味著所有的地塊均含有雜合和純合的保持系和恢復系植物。因為所有雜交均最初在Ogura CMS細胞質中進行而該細胞質在所有的后代中均得以保持，故證明保持系基因型是雄性不育的。使用塑料袋在開花前罩住花序，從而使植物自交。袋子在整個開花期都罩在植物上以避免異花傳粉。
在自交系BLR-038的整個開發過程中，監測蕓苔屬植物種子的GSL含量。芥子油苷含量以9％濕度下μmol/g種子表示。使用近紅外反射光譜，進行了芥子油苷分析。使用此方法，可以分析未被破壞的蕓苔屬植物種子樣品的品質組分(quality component)油、蛋白質和芥子油苷。在FOSS NIR系統5000-c型上進行此分析。芥子油苷分析描述在P.Williams和D.Sobering，(1992)Hildrum K.，Isaksson T.，NaesT.和Tandberg A.(編)Near Infra-red Spectroscopy.Bridging thegap between Data Analysis and NIR Applications.HorwoodChichester，UK41-46。
1999年，F6代的一株植物22044-3具有17.3μmol/g種子的GSL含量，而其姐妹植物的種子具有22.5-23.8μmol/g的GSL含量。植物22044-3自交產生F7代植物。6797-2植物的種子具有11.4μmol/g的GSL含量，而其姐妹植物具有24.6-25.7μmol/g的GSL含量。將從種植6797-2種子得到的植物進行自交。在2001年，在F8代，從此自交得到的植物沒有一株的種子具有高于14.3μmol/g的GSL含量。植物21615-7的種子具有僅7.0μmol/g的GSL含量。來自21615地塊中的植物的種子的平均表現為10.7μmol/g，這比同時生長在德國的同一實驗大田試驗中的最低其它參照恢復系低至少7μmol，并比非恢復系品種Express和Laser的標準地塊低了5μmol以上。在F9代，通過21615-5的純合后代的自交，產生BLR-038。
表1

·*n.d.＝未測定的·**溫室數據表2顯示地塊01-21615的幾個單株植物的分離比例。Rf傳粉者植物(21615-01，21615-05，21615-06，21615-08)是Rf基因純合的(RfRf)。從純合Rf傳粉者和CMS雌性品系的雜交產生F1雜種。這些雜交顯示大約100％的雄性育性傳遞。
表2

實施例2通過AFLP分析表征蕓苔屬自交系BLR-038對由原始Ogura恢復基因易位(translocation)發生分離的25株個體組成的群體，使用由來源于RAPD標記OPY17的兩個專有SCAR標記組成的共顯性PCR試驗，進行基因型分型，其中所述SCAR標記與恢復基因座處于互引相或互斥相。純合隱性(rf/rf)植物和恢復系(RfRf和Rfrf)植物分別混合在一起，并用于鑒定推測與Rf基因連鎖的AFLP標記。這些標記允許將BLR-038與Pioneer雜種209002、97839、97838、209001以及與含有法國Rennes的Institut National de laRecherche Agronomique(INRA)發布的恢復基因座(Pelletier等，1987，Proc 7th.Int.Rapeseed Conf.，Poznan，Poland113-119)的SERASEM雜種Lutin進行比較。AFLP分析基本上如Vos等(1995)Nucleic Acids Research 23(21)4407-4414所描述的進行。
首先，樣品BLR-038、209002、97839、97838、209001和雜種Lutin各500ng DNA在40μl 1×TA緩沖液(10mM Tris-乙酸、10mM MgAc、50mM KAc、1mM DTT、2μg BSA和EcoRI和Trul I(MBI Fermentas，Lithuania)各5u)中消化。EcoRI在以下稱作E，而TrulI——MseI的同切口限制內切酶——稱作M。以下序列為E和M的銜接子EcoRI-銜接子5’-CTCGTAGACTGCGTACC SEQ ID NO21CATCTGACGCATGGTTAA-5’ SEQ ID NO22MseI-銜接子5’-GACGATGAGTCCTGAGSEQ ID NO23TACTCAGGACTCAT-5’ SEQ ID NO24消化后，將含有1×連接緩沖液(40mM Tris-HCl(pH 7.8)、10mMMgCl2、10mM DTT、0.5mM ATP、1u T4 DNA連接酶、0.1μM E銜接子和1.0μM M銜接子，Vos等(1995)描述的序列)的10μl連接溶液直接加入該DNA消化物中，溫育，隨后在1×TE緩沖液中稀釋10倍。為了增加模板DNA的量，預先用各具有1個額外的選擇性核苷酸的引物，即，E+1和M+1，擴增稀釋的連接反應物。用于此預先擴增反應的引物由與銜接子相同的序列組成，除了在其3’末端有1個核苷酸延伸。引物E+A與EcoRI銜接子雜交并帶有一個額外的A，引物M+C與MseI銜接子雜交并帶有一個額外的C。20μl的反應溶液含有5μl模板DNA(10倍稀釋的連接反應物)、1×PCR緩沖液II(10mM Tris-HCl，pH 8.3)、50mM KCl、0.2mM dNTP、1.5mM MgCl2、0.4u Taq聚合酶和(E+A)-引物及(M+C)-引物各0.3μM。此預先擴增反應在Perkin-Elmer/Cetus 9600或MJ Research PTC-100熱循環儀中使用以下溫度曲線進行20個循環——94℃ 30s、56℃ 30s和72℃ 60s。
在選擇性擴增前，在含有1×激酶緩沖液(50mM Tris-HCl(pH7.6)、10mM MgCl2、5mM DTT、0.1mM亞精胺、0.1mM EDTA、1.7μM(E+3)引物(DNA Technologies)、0.2u/μl T4多核苷酸激酶和2μCi/μl μ-33P[ATP]的溶液中末端標記(E+3)-引物。使用以下溫度曲線進行選擇性擴增12個循環——94℃ 30s、65℃(以每循環0.7℃降低至56℃)30s、72℃ 60s；之后23個循環——94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 60s。20μl反應溶液含有5μl預先擴增的模板DNA、0.5μl標記的(E+3)-引物、1×PCR緩沖液II(Advanced Biotechnologies)、1.5mM MgCl2、0.2mM dNTP、0.25μM(M+3)-引物(DNA Technologies)和0.4u Taq聚合酶。擴增后，將20μl甲酰胺上樣緩沖液(98％甲酰胺、10mM EDTA、二甲苯腈藍和溴酚藍各0.1％)加入，樣品在95℃變性3min。擴增的片段在由19∶1丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺(Bis)溶液、1×TBE緩沖液、0.10％TEMED和0.03％APS組成的5％聚丙烯酰胺膠上分離。用于35cm凝膠的定制凝膠裝置(CBS Scientific Co.，USA)用于所有分析中。凝膠在110W預先運行30分鐘，之后上樣3μl樣品，在110W運行3小時。電泳后，凝膠轉移至3MM紙上，在凝膠干燥器上80℃過夜干燥，對膠片進行曝光1-2天。
表3(SEQ ID NO25至37)及序列表中顯示的所有E+3引物(長度24nt)均在22位帶有A，而所有M+3引物(長度21nt)均在19位帶有C，這對應于所述預先擴增引物上的延伸。在預先擴增引物上的延伸是隨機的，其添加的目的是降低模板的復雜性。并非擴增全基因組，而是僅僅擴增隨后在使用E+3和M+3引物的最終擴增中用作模板的部分。E+A和M+C預擴增引物分別與E+3和M+3引物相比，除了短兩個核苷酸外，是相同的。可以理解，本領域技術人員能夠通過在銜接子M和E上產生其它的隨機生成的延伸而開發出其它引物。這些新引物中的一些將擴增位于所述來源于Ogura蘿卜的核酸區段上的其它核酸區段或標記，并將被歸類于所述四個倉之一中。本領域技術人員將意識到，這些其它的引物和標記屬于本發明的范圍內。
總共篩選了48種引物組合，包括在專利申請WO98/56948中被證實給出多態性條帶的7個引物對。僅僅存在于Ogura Rf塊(bulk)而不存在于純合隱性塊(rf/rf)中的條帶才被考慮用于比較蕓苔屬自交系BLR-038和Pioneer和INRA發布的雜種。
表3顯示了所有揭示了Ogura Rf易位塊和純合隱性(rfrf)塊之間的多態性的AFLP標記。根據標記在各種植物材料上的擴增譜，將這些標記分倉。結果在表4中示意性給出，揭示出4類不同標記。條帶的存在表示為‘1’，缺乏則表示為‘0’。倉(bin)指根據標記沿著核酸區段的定位而集合在一起的一組標記。AFLP標記E5M16-1、E5M4-3、E6M3-2和E8M14-1屬于笫1倉(bin 1)，其中這些標記在所有樣品Lutin、P209001、P97838、P97839、BLR-038和P209002中均得到擴增。ALFP標記E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2、E8M14-2屬于第2倉(bin 2)，其中第2倉標記擴增Lutin、P209001、P97838、P97839、BLR-038，但不擴增P209002。AFLP標記E8M1-2屬于第3倉(bin 3)，其中第3倉標記擴增Lutin、P209001、P97838和P97839，但不擴增BLR-038和P209002。AFLP標記E2M13-1、E2M14-1、E3M12-1和E6M3-1屬于第4倉(bin 4)標記，其中第4倉標記擴增Lutin和P209001，但不擴增P97838、P97839、BLR-038和P209002。
實施例3使用SCAR標記表征蕓苔屬自交系BLR-038對與Ogura恢復基因處于互引相的RAPD、AFLP和SCAR標記(公開在專利申請CA2,206,673)的擴增產物的核苷酸序列，設計引物對OPC2(SEQ ID NO2和7)、OPN20(SEQ ID NO3和8)、OPF10(SEQID NO4和10)、OPH3(SEQ ID NO9)、OPH15(SEQ ID NO11)、E36×M48AIII((SEQ ID NO12)、E35×M62A V(SEQ ID NO13)、E33×M47A 1(SEQ ID NO14)和E38×M60A 1(SEQ ID NO15)。除了這些標記外，還對RAPD標記OPH11的核苷酸序列設計引物，該RAPD標記OPH11被證實與Ogura基因座所起源的蘿卜屬中的育性恢復有關(登錄號AB051636)。所分析的所有引物的序列以及預期的擴增產物的大小都列在表3中。使用標準PCR方案，采用引物組合，包括來源于RAPD標記OPY17的專有SCAR標記，分析了原始Ogura易位、BLR038、Pioneer雜種209002、97839、97838、209001和雜種Lutin。PCR后，通過瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴增產物。參見表4，SCAR標記OPF10、OPC2和E35M62是第1倉的標記。屬于第1倉的標記在上面作了討論，其特征在于擴增樣品Lutin、P209001、P97838、P97839、BLR-038和P209002。SCAR標記E33M47屬于第2倉。第2倉標記的特征在于擴增樣品Lutin、P209001、P97838、P97839和BLR-038，但不擴增P209002。兩個SCAR標記OPY17和OPN20屬于第3倉，特征在于擴增樣品Lutin、P209001、P97838和P97839，但不擴增BLR-038和P209002。第4倉SCAR標記例如OPH15和E36M48擴增Lutin和P209001，但不擴增P97838、P97839、BLR-038和P209002。
表3


表4
實施例4用于檢測BLR1重組事件的試劑盒和方法從大約1cm2的蕓苔屬植物葉組織中使用Wizard Magnetic 96DNA植物系統(Promega)分離總DNA。在一個實施方案中，本發明的Multiplex PCR試劑盒和方法檢測相應于OPY17(第3倉)和E33M47(第2倉)的PCR擴增產物的存在與否。
向反應混合物中加入4種引物PR0004F、PR0004R、1159和1160(表4)，濃度各7.5pmol。除了多元性質外，此PCR反應的組成是本領域中標準的，使用來自Invitrogen的Platinum Taq聚合酶。擴增條件如下94℃初始變性5分鐘，之后35個循環——94℃ 30秒、57℃ 30秒和72℃ 90秒。PCR擴增產物在2.0％瓊脂糖凝膠上分離。
作為PCR反應的結果，當引物擴增出相應于E33M47的140bp產物但不擴增出相應于OPY17的300bp產物時，可以確立存在BLR1重組事件。還證明，PCR反應針對原始Ogura恢復基因易位片段以及衍生的重組事件Pioneer 97838、97839、209001和來自INRA的Lutin事件，擴增了OPY17和E33M47。另一方面，Pioneer重組事件209002顯示出無E33M47和OPY17擴增產物。這些結果說明，選擇性擴增來自第2倉和第3倉的標記(例如E33M47和OPY17)的引物可以成功地用于單個多元PCR試驗中以在植物材料中區分和鑒定BLR1重組事件。
可以理解，本發明的試劑盒和方法可以合并第3倉的一個或多個標記以及第2倉的一個或多個標記，以檢測植物中BLR1重組事件的存在。本發明范圍內包括根據本文描述的方法開發和使用屬于第1、2、3或4倉之一的其它標記。
實施例5恢復系(restorer)的改良蕓苔屬自交系BLR-038(2003年8月28日保藏，保藏號NCIMB41193)，與高性能冬油籽油菜繁殖系(用作回歸親本)雜交。在這些雜交中，自交系BLR-038用作雌性以維持CMS細胞質。所得F1植物與回歸親本雜交以置換更多的自交系BLR-038基因組。由于每一代中的CMS細胞質，可以通過育性評分來檢測恢復基因的存在與否。在F2代中，在溫室中通過所述的標記分析檢測到純合的恢復系植物，并自交。將該純合F2植物的F3后代種植在大田中，以便僅僅在期望的純合恢復系植物中進行選擇。這有助于克服通過測交證實的純合子代數量的減少。然后將F3植物自交。使用幾種CMS Ogura雄性不育系，并使用一組遺傳不同的F4代或之后世代的自交植物作為包含本發明BLR1重組事件的雌性親本，進行測交。在溫室中播種后代，并在開花期間計數能育和不育植物。含有BLR1重組事件的植物也可以使用本文所述試劑盒和方法進行選擇。
實施例6雜種開發使用CMS Ogura和恢復系，應用常規雜種生產方案。如上所述，雄性不育的雌性CMS A系不能自花傳粉，因此通過其與保持系B系——該系為雄性能育且與A系具有遺傳一致性——的雜交來維持。此雜交的結果是雄性不育CMS A系。恢復系R系可以通過自交維持。
恢復系R系與雄性不育CMS系雜交，產生在A系上生成的F1種子。
可以商業銷售此F1種子用于生產F2種子。本發明的F2種子具有低的芥子油苷水平，如表5中所示。表5顯示了使用蕓苔屬自交系BLR-038向三種不同的CMS近交系傳粉，以產生三種不同的雜種。通過授精的CMS植物產生的F2種子的GSL含量顯示出實質性地低于常規Ogura恢復系雜種的GSL含量，與常規的非恢復系例如EXPRESS和SMART的期望GSL水平相當。
實施例7從雜交cms系×BLR01系產生雜種BLR-038系(2003年8月28日保藏，保藏號NCIMB 41193)和專有繁殖系01 25853-03雜交。在溫室中使F1代植物自交。在大田中播種F2代，并在下一年的春季使用由兩個SCAR標記組成的共顯性PCR試驗通過兩個標記分析F2代植物，其中所述兩個SCAR標記與恢復基因座處于互引相或互斥相。將鑒定的純合恢復系植物中的一些與雄性不育系RNX 4801一起移栽到種子繁殖隔離地中。通過一張網隔離具有兩個親本的地塊以避免異花傳粉。從雄性不育的雌性親本收獲了760g雜種種子，并播種在7號位產量試驗田中以確定完全恢復的BLR雜種的產量、農藝和品質參數。
實施例8確定Ogura Rf基因型確定植物例如來自Ogura-cms系和Ogura恢復系的雜交的F2植物，是否是純合的恢復系、純合的保持系或雜合的恢復系的一種可能方案是，用恢復基因座的分子標記和非恢復基因座的分子標記檢查該植物。對于此檢查，將四種引物PR0001F1(SEQ ID NO40)、PR0001R1(SEQ ID NO41)、1137(SEQ ID NO5)和1138(SEQ ID NO6)加入反應混合物中，濃度各為7.5pmol。除了多元性質外，該PCR反應的組成是本領域中標準的，使用Invitrogen的Platinum Taq聚合酶。擴增條件如下94℃初始變性5分鐘，之后35個循環——94℃ 30秒、℃ 30秒和72℃ 90秒。PCR擴增產物在2.0％瓊脂糖凝膠上分離。
如果僅存在大約760bp的一個PCR產物，則該植物是純合的恢復系植物。如果僅存在大約420bp的一個PCR產物，則該植物是保持系。如果同時存在兩個PCR產物(420bp和760bp)，則該植物是雜合的恢復系植物。
或者，可以根據CA2,206,673中描述的，使用點印跡檢測試驗。
表5

為了清楚和理解的目的，前面的發明已經通過舉例說明和實施例進行詳細描述。然而，明顯地，可以在本發明范圍內進行某些改變和修飾，例如單基因修飾和突變、體細胞克隆變體、選自本自交系的大植物群體的變異個體等，本發明的范圍僅僅受到后附權利要求的范圍的限制。
序列表<110>Syngenta Participations AG<120>Ogura胞質雄性不育蕓苔屬植物的改良的育性恢復及方法<130>70279WOPCT<150>GB 0402106.9<151>2004-01-30<160>41<170>Patentln version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物1127<222>(1)..(20)<400>1ggggaaggaa ggaaggactc 20<210>2<211>21<212>DNA
<220>
<223>引物1128<222>(1)..(21)<400>2tcaggttcac acagcagcat a21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物1135<400>3ataggttcct ggcagagatg 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物1136<400>4atagcagtca gaaaccgctc 20<210>5<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物1137<400>5ctgatgaatc tcggtgagac 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物1138<400>6ccgtatgcct tggttatctc 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物1218<400>7tctgtaaatc ctttccaccc 20<210>8<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物1219<400>8aaaaaagcac ccgagaatct 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物1222<400>9gcgtgatgat ctgttgagaa 20<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物1223<400>10ggatttgtgg gattggaaa 19<210>11<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物1224<400>11gaggttcagg aatgctgttt 20<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物1225<400>12gctcctgtta gtgactcttc a21<210>13<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物1159<400>13taacaaaata gagggagagg atg 23<210>14<211>23
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物1160<400>14caagattata gctacctaac agg 23<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物16-1<400>15tgttcagcat ttagtttcgc cc 22<210>16<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物16-2<221>Misc_feature<400>16
ttgttcagtt ccaccaccag cc 22<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物26-1<400>17gctcacctca tccatcttcc tcag 24<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物26-2<400>18ctcgtccttt accttctgtg gttg 24<210>19<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PR0004F
<400>19acgtggtgag gacatgccct ttctg25<210>20<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PR0004R<400>20ctggtgtatt ctacctcatc attaaa 26<210>21<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>EcoRI-銜接子 正向引物<400>21ctcgtagact gcgtacc 17<210>22<211>18<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>EcoRI-銜接子 反向引物<400>22aattggtacg cagtctac18<210>23<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MseI-銜接子 正向引物<400>23gacgatgagt cctgag 16<210>24<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MseI-銜接子 反向引物<400>24tactcaggac tcat14
<210>25<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物E2<400>25ctcgtagact gcgtaccaat taac 24<210>26<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物M4<400>26gacgatgagt cctgagtaca t21<210>27<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物M13<222>(1)..(21)
<400>27gacgatgagt cctgagtact a21<210>28<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物M14<400>28gacgatgagt cctgagtact c21<210>29<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物E3<400>29ctcgtagact gcgtaccaat taag 24<210>30<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物M1<400>30gacgatgagt cctgagtaca a21<210>31<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物M12<400>31gacgatgagt cctgagtacg t21<210>32<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物E4<400>32ctcgtagact gcgtaccaat taat 24<210>33<211>24
<212>DNA<213>人工序列<400>33ctcgtagact gcgtaccaat taca 24<210>34<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物M16<400>34gacgatgagt cctgagtact t21<210>35<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物E6<400>35ctcgtagact gcgtaccaat tacc 24<210>36<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物M3<400>36gacgatgagt cctgagtaca g21<210>37<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物E8<400>37ctcgtagact gcgtaccaat tact 24<210>38<211>626<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>標記<400>38gacgtggtga taaaagcgga gaagatggca tccctatgct actgaagatt ccacgcatgt 60
tcgatccgtg gggaggctac agcattattg gattcggtga tattcttttg cccggtttgc 120taatcgcatt tgctctcagg tccaaaaacc tttttttatc atctcagagt ttcctttcac 180cgagttccaa gttttcctaa catttgtttc ttctttgcag atatgactgg ttagctaaca 240agactcttcg aaccggctat tttatatggg cgatggttgc ttacggatta ggtaaaaaaa 300tcacacacaa atccgcataa tctcactggt gtattctacc tcatcattaa aaccatttga 360aaacctcgca ggtcttttga ttacttacgt ggctctaaac ctaatggatg gacacggcca 420accagcattg ctctacattg tcccttttac tctcggttag ctggaaaatc tctctctctt 480attcctctct ataacggcat tgaatgagta ttgagagaaa tctcgtgatg aaaaatatag 540gaacgatgct tacactagct cgaaaacgag acgacctttg gactctatgg acgaaagagc 600cagaaagggc atgtcctcac cacgtc 626<210>39<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RAPD引物Y17<400>39gacgtggtga 10<210>40<211>18
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PR0001F1<400>40gacgtggtga acaagatg18<210>41<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PR0001R1<400>41acgtggtgat aataaattgg c2權利要求
1.含有包括Ogura細胞質雄性不育的育性恢復基因座的DNA片段的蕓苔屬植物，其中所述DNA片段能夠通過至少一個第2倉標記鑒定，但不能被至少一個第3倉標記檢測到。
2.含有包括Ogura細胞質雄性不育的育性恢復基因座的DNA片段的蕓苔屬植物，其中所述DNA片段能夠通過至少一個第2倉標記鑒定，但不能通過任何第3倉標記鑒定。
3.根據權利要求2的含有包括Ogura細胞質雄性不育的育性恢復基因座的DNA片段的蕓苔屬植物，其中所述DNA片段能夠通過所有的第2倉標記鑒定，但不能通過任何第3倉標記鑒定。
4.根據權利要求1-3任一項的蕓苔屬植物，其中第2倉由標記E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2組成。
5.根據權利要求1-3任一項的蕓苔屬植物，其中第3倉由標記OPY17、OPN20和E8M1-2組成。
6.根據權利要求4的蕓苔屬植物，其中所述標記在聚合酶鏈式反應中使用分別由1159和1160；E2和M4；E3和M1；E4和M14；E5和M1；E5和M4；E8和M14表示的引物對擴增。
7.根據權利要求5的蕓苔屬植物，其中所述標記在聚合酶鏈式反應中使用分別由PR0004F和PR0004R；1135和1136；及E8和M1表示的引物對擴增。
8.根據權利要求1-7任一項的蕓苔屬植物，其中所述DNA片段是BLR1重組事件。
9.根據權利要求1-8任一項的蕓苔屬植物，其中所述植物是自交植物。
10.根據權利要求1-8任一項的蕓苔屬植物，其中所述植物是雜種植物。
11.根據權利要求8的蕓苔屬植物，其中所述BLR1重組事件能夠從蕓苔屬自交系BLR-038獲得，自交系BLR-038的種子樣品已經以保藏號NCIMB 41193保藏在NCIMB。
12.檢測包含恢復基因的蕓苔屬植物的方法，包括步驟a)從蕓苔屬植物獲得樣品；b)在所述樣品中i)通過至少一個第2倉標記，但不能通過至少一個第3倉標記；ii)通過至少一個第2倉標記，但不能通過任何第3倉標記；iii)通過所有的第2倉標記，但不能通過任何第3倉標記檢測到DNA片段。
13.根據權利要求12的檢測蕓苔屬植物的方法，還包括選擇含有所述DNA片段的所述蕓苔屬植物或其部分。
14.根據權利要求12的檢測蕓苔屬植物的方法，還包括步驟使含有所述DNA片段的所述蕓苔屬植物自交。
15.根據權利要求12的檢測蕓苔屬植物的方法，還包括步驟使所述蕓苔屬植物與另一蕓苔屬植物雜交。
16.根據權利要求12-15之任一項的選擇蕓苔屬植物的方法，其中所述DNA片段包含BLR1重組事件。
17.根據權利要求12的選擇蕓苔屬植物的方法，其中所述第2倉標記包含E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2或E8M14-2。
18.根據權利要求12的選擇蕓苔屬植物的方法，其中所述第2倉標記與E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2或E8M14-2部分同源。
19.根據權利要求12的檢測蕓苔屬植物的方法，還包括步驟在所述樣品中檢測能夠使用引物1159和1160通過PCR擴增獲得的DNA片段，而且所述DNA片段不被引物PR0004F和PR0004R擴增。
20.用于檢測BLR1重組事件的存在的標記組合，包含第2倉標記和第3倉標記。
21.根據權利要求18的用于檢測BLR1重組事件的存在的標記組合，其中所述第2倉標記包含標記E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2或E8M14-2，且其中所述第3倉標記包含OPY17、OPN20或E8M1，或者與這些標記之任一具有部分同源性的標記。
22.用于篩選蕓苔屬植物以確定其是否含有BLR1重組事件的方法，包括從所述蕓苔屬植物提取DNA，在引物1159、1160、PR0004F和PR0004R代表的DNA片段存在下將該提取物進行聚合酶鏈式擴增反應，和確定通過引物1159和1160從提取的DNA發生了DNA片段擴增以及從提取的DNA缺乏相應于引物PR0004F和PR0004R的DNA片段的擴增。
23.產生能育F1雜種蕓苔屬植物的方法，包括步驟a)在含有BLR1重組事件的雄性能育恢復系親本中，以及任選地也在雌性的雄性不育CMS親本中，確定總芥子油苷含量；b)使雌性和雄性親本雜交以產生F1雜種種子。
24.用于產生能育F1雜種蕓苔屬植物的方法，包括步驟a)在雄性能育的恢復系親本的種子或植物中，通過標記分析檢測BLR1重組事件；b)使雌性和雄性親本雜交以產生F1雜種種子。
25.根據權利要求23-24之任一項的方法，包括額外步驟在所述恢復系親本的種子或植物中通過標記分析檢測DNA片段。
26.根據權利要求23-25之任一項的產生能育F1雜種蕓苔屬植物的方法，包括額外步驟種植所述F1雜種種子。
27.根據權利要求23-26之任一項的產生能育F1雜種蕓苔屬植物的方法，包括額外步驟收獲從來自所述F1種子的植物生長出來的F2種子。
28.根據權利要求27的方法，包括額外步驟在來源于F1雜種植物的F2種子中測定總芥子油苷含量。
29.通過權利要求23-28之任一項的方法產生的雜種F1蕓苔屬植物。
30.包含BLR1重組事件的蕓苔屬植物，其中所述事件能夠從蕓苔屬自交系BLR-038獲得，自交系BLR-038的種子樣品已經以保藏號NCIMB 41193保藏在NCIMB。
31.用于產生包含BLR1重組事件的蕓苔屬植物的方法，包括步驟獲得含有BLR1重組事件的蕓苔屬植物，使該植物與另一蕓苔屬植物雜交，獲得由該雜交產生的雜種種子，和種植該雜種種子以產生含有BLR1重組事件的蕓苔屬植物。
32.用于檢測BLR1重組事件的試劑盒，包括a)擴增第2倉標記的第一對引物；和b)不擴增第3倉標記的第二對引物。
33.包含BLR1重組事件的蕓苔屬植物。
34.根據權利要求29的蕓苔屬植物，其中所述BLR1重組事件能夠從蕓苔屬自交系BLR-038獲得。
35.根據權利要求1-11、29、30、33和34之任一項的蕓苔屬植物，其中所述植物是歐洲油菜(Brassica napus)、蕓苔(Brassicacampestris)、甘藍(Brassica oleracea)、Brassica nigra、Brassicacarinata或屬于十字花科(Brassicacea)的任何其它物種。
36.根據權利要求35的蕓苔屬植物，其中所述植物是所述物種的有性或無性重組或克隆。
37.根據權利要求1-11、29、30和33-35之任一項的蕓苔屬植物，所述植物包含等于或低于雙低蕓苔屬植物品種的芥子油苷水平的總芥子油苷水平。
38.包含重組事件的蕓苔屬植物，其中所述重組事件由沿著核酸區段在來源于Ogura蘿卜的Ogura細胞質雄性不育的育性恢復基因座和芥子油苷基因座間的斷裂、以及隨后的重連接產生新核酸區段所導致，所述植物表現出由于蘿卜恢復基因表達所致的育性恢復活性以及不高于雙低自由傳粉品種中正常發現的GSL含量，但優選為9％濕度下每克(g)種子0.5至18μmol總芥子油苷(GSL)，尤其是9％濕度下每克(g)種子2至15μmol總芥子油苷(GSL)，更尤其是9％濕度下每克(g)種子3至14μmol總芥子油苷(GSL)，但特別是9％濕度下每克(g)種子3.5至10μmol總芥子油苷(GSL)的GSL含量。
39.根據權利要求38的蕓苔屬植物，其中GSL含量為9％濕度下每克(g)種子3.6至6.0μmol，但特別是3.6至4.2μmol總芥子油苷(GSL)。
全文摘要
本發明涉及包含獨特重組事件的蕓苔屬植物，該重組事件源于來自Ogura蘿卜(Raphanus sativus)的核酸片段在育性恢復基因座和芥子油苷基因座之間的位置斷裂并隨后重新連接以產生新的重組事件BLR1。BLR1重組事件表達由源于蘿卜的育性恢復基因的表達所致的育性恢復以及不高于正常雙低開放傳粉品種的GSL含量。蕓苔屬植物自交系BLR－038，保藏號NCIMB－41193，是含有BLR1重組事件的植物的一個例子。使用本領域技術人員已知的育種技術，可以將BLR1重組事件漸滲入不同的蕓苔屬植物遺傳背景中。例如，蕓苔屬植物自交系BLR－038或含有BLR1重組事件的其它蕓苔屬植物可以與雄性不育自交系雜交，以產生表達低GSL含量和優良農藝性狀的雜種。
文檔編號C12Q1/68GK1913773SQ200580003519
公開日2007年2月14日 申請日期2005年1月28日 優先權日2004年1月30日
發明者S·C·普萊內斯, G·R－K·施蒂弗, K·布魯默曼, J·J·L·吉倫 申請人:辛根塔參與股份公司